Summary
Dieser Artikel berichtet über eine in vivo Hemmung von CENP-E durch abdominale Chirurgie und Hodeninjektion von GSK923295, einem wertvollen Modell für die männliche meiotische Teilung. Mit Hilfe der Immunfluoreszenz-, Durchflusszytometrie- und Transmissionselektronenmikroskopie-Assays zeigen wir, dass die CENP-E-Hemmung zu Chromosomenfehlstellungen und Genominstabilität in Mausspermatozyten führt.
Abstract
Bei Eukaryoten ist die Meiose essentiell für die Stabilität des Genoms und die genetische Vielfalt bei der sexuellen Fortpflanzung. Experimentelle Analysen von Spermatozyten in Hoden sind entscheidend für die Untersuchung der Spindelbildung und der Chromosomensegregation bei der männlichen meiotischen Teilung. Die Spermatozyten der Maus sind ein ideales Modell für mechanistische Untersuchungen der Meiose, jedoch fehlen die effektiven Methoden für die Analyse von Spermatozyten. In diesem Artikel wird eine praktikable und effiziente Methode zur in vivo Hemmung von Kinesin-7 CENP-E in Mausspermatozyten vorgestellt. Es wird ein detailliertes Verfahren zur Hodeninjektion eines spezifischen Inhibitors GSK923295 durch abdominale Operationen an 3 Wochen alten Mäusen vorgestellt. Darüber hinaus wird hier eine Reihe von Protokollen für die Gewebeentnahme und -fixierung, die Hämatoxylin-Eosin-Färbung, die Immunfluoreszenz, die Durchflusszytometrie und die Transmissionselektronenmikroskopie beschrieben. In dieser Arbeit stellen wir ein in vivo Inhibitionsmodell mittels Bauchchirurgie und Hodeninjektion vor, das eine leistungsfähige Technik zur Untersuchung der männlichen Meiose sein könnte. Wir zeigen auch, dass die CENP-E-Inhibition zu einer Chromosomenfehlstellung und einem Metaphasenarrest in primären Spermatozyten während der Meiose I führt. Unsere In-vivo-Inhibitionsmethode wird mechanistische Studien der Meiose erleichtern, als nützliche Methode für genetische Modifikationen der männlichen Keimbahnen dienen und ein Licht auf zukünftige klinische Anwendungen werfen.
Introduction
Die Meiose ist eines der wichtigsten, hochrigide, evolutionär konservierten Ereignisse in eukaryotischen Organismen und ist essentiell für die Gametogenese, die sexuelle Fortpflanzung, die Integrität des Genoms und die genetische Vielfalt 1,2,3. Bei Säugetieren durchlaufen die Keimzellen nach einer einzigen DNA-Replikationsrunde zwei aufeinanderfolgende Zellteilungen, Meiose I und II. Im Gegensatz zu den Schwesterchromatiden in der Mitose paaren sich duplizierte homologe Chromosomen und trennen sich während der Meiose in zwei Tochterzellen I 4,5. Bei der Meiose II ziehen sich die Schwesterchromatiden auseinander und trennen sich, um haploide Gameten ohne DNA-Replikation zu bilden6. Fehler in einer der beiden meiotischen Teilungen, einschließlich Defekte in der Spindelanordnung und Fehlsegregation der Chromosomen, können zum Verlust von Gameten, Sterilität oder Aneuploidie-Syndromen führen 7,8,9.
Zunehmende Studien haben gezeigt, dass die Motoren der Kinesinfamilie eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Chromosomenausrichtung und -trennung, der Spindelmontage, der Zytokinese und des Zellzyklusfortschritts sowohl in mitotischen als auch in meiotischen Zellen spielen10,11,12. Kinesin-7 CENP-E (Zentromerprotein E) ist ein Plus-End-gerichteter Kinetochor-Motor, der für die Chromosomenkongression, den Chromosomentransport und -ausrichtung sowie die Regulierung des Spindelmontage-Checkpoints in der Mitose 13,14,15,16,17,18 erforderlich ist. Während der Meiose führt die CENP-E-Hemmung durch den spezifischen Inhibitor GSK923295 zu Zellzyklusarrest, Chromosomenfehlausrichtung, Spindeldesorganisation und Genominstabilität in spermatogenen Zellen19. Die Lokalisationsmuster und die Dynamik von CENP-E an den Zentromeren sich teilender Spermatozyten deuten darauf hin, dass CENP-E mit Kinetochorproteinen für die sequentielle Assemblierung von Zentromeren während der Meiose interagiertI 20,21. In Eizellen ist CENP-E für die Chromosomenanpassung und den Abschluss der Meiose I13,22,23 erforderlich. Die Injektion von Antikörpern oder Morpholinos von CENP-E führt zu falsch ausgerichteten Chromosomen, abnormaler Kinetochororientierung und Meiose-I-Arrest sowohl in Maus- als auch in Drosophila-Oozyten 23. Verglichen mit der essentiellen Rolle von CENP-E in der Mitose sind die Funktionen und Mechanismen von CENP-E in der Meiose noch weitgehend unbekannt. Detaillierte Mechanismen von CENP-E bei der Chromosomenkonstitution und Genomstabilität in männlichen meiotischen Zellen müssen noch geklärt werden.
Die Spermatogenese ist ein komplexer und langwieriger physiologischer Prozess, der sequentielle Proliferation der Spermatogonien, Meiose und Spermiogenese umfasst. Daher ist es außerordentlich schwierig, den gesamten Prozess in vitro in Säugetieren und anderen Spezies zu reproduzieren24,25. In vitro ist es nicht möglich, eine Differenzierung der Spermatozyten nach dem Pachytenstadium zu induzieren. Studien zur männlichen meiotischen Unterteilung beschränkten sich im Allgemeinen auf experimentelle Analysen der frühen meiotischen Prophase25,26. Trotz vieler technologischer Bemühungen, einschließlich der Kurzzeitkultur von Spermatozyten27,28 und Organkulturmethoden25, gibt es nur wenige effektive Methoden, um die männliche meiotische Teilung zu untersuchen. Darüber hinaus führt die genetische Deletion essentieller Gene in der Regel zu Entwicklungsstillstand und embryonaler Letalität. Zum Beispiel können sich Mausembryonen, denen CENP-E fehlt, nicht einnisten und können sich nicht über die Implantation hinausentwickeln 29, was ein Hindernis für mechanistische Studien von CENP-E in der Meiose darstellt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Etablierung eines praktikablen und praktikablen Systems zur Untersuchung der männlichen meiotischen Teilung das Forschungsfeld der Meiose erheblich voranbringen kann.
Der kleinzelldurchlässige Inhibitor ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung von Kinesinmotoren bei Zellteilungs- und Entwicklungsprozessen. Der allosterische Inhibitor GSK923295 bindet spezifisch an die motorische Domäne von CENP-E, blockiert die Freisetzung von ADP (Adenosindiphosphat) und stabilisiert schließlich die Wechselwirkungen zwischen CENP-E und Mikrotubuli30. In dieser Studie wird ein in vivo Inhibitions-Mausmodell durch Bauchchirurgie und Hodeninjektion von GSK923295 vorgestellt. Die Hemmung von CENP-E führt zu einer Fehlstellung der Chromosomen in der Metaphase I der primären Spermatozyten. Darüber hinaus führt die CENP-E-Hemmung zu einem meiotischen Arrest der Spermatozyten und zur Störung der Spermatogenese. Es wird eine Reihe von Protokollen für die Analyse von Spermatozyten beschrieben, die zur Beobachtung von meiotischen Spindelmikrotubuli, homologen Chromosomen und subzellulären Organellen in Spermatozyten angewendet werden können. Unsere In-vivo-Inhibitionsmethode ist eine effektive Methode zur Untersuchung der meiotischen Teilung und Spermatogenese.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden vom Animal Care and Use Committee der Fujian Medical University geprüft und genehmigt (Protokollnummer SYXK 2016-0007). Alle Mausversuche wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien der Care and Use of Laboratory Animals der National Institutes of Health (NIH-Veröffentlichungsnummer 8023, überarbeitet 1978) durchgeführt.
1. Konstruktion von GSK923295-vermittelten CENP-E-Inhibitionsmausmodellen
- Sterilisieren Sie die chirurgischen Instrumente bei 121 °C für 30 min. Bestrahlen Sie die chirurgische Ultra-Clean-Werkbank 2 h lang mit UV-C (UVC). Wiegen Sie die 3 Wochen alten männlichen ICR-Mäuse (Institute of Cancer Research), die für die Experimente verwendet wurden, und berechnen Sie die erforderliche Anästhesiedosis.
- Betäuben Sie Mäuse durch Verabreichung einer Kombination aus Ketamin (100 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) durch intraperitoneale Injektion. Überprüfen Sie die Narkosetiefe der Mäuse durch eine Kombination aus Maushornhautreflex, nozizeptivem Reflex, Atmung sowie Muskeltonus. Vergewissern Sie sich, dass die Mäuse tief betäubt sind.
Anmerkungen: Legen Sie das Tier auf ein Heizkissen, um es während der Operation thermisch zu unterstützen. - Binden Sie die Mausgliedmaßen zusammen und befestigen Sie sie auf der Wachsschale. Geben Sie einen Tropfen Tierarztsalbe auf die Mäuseaugen, um Trockenheit während der Narkose zu vermeiden. Rasieren Sie die Bauchhaare der Maus vom Unterbauch bis zum Hodensack mit einem experimentellen Tierrasierer. Sichern Sie den Operationsbereich mit einem sterilen Tuch.
- Desinfizieren Sie den Bauchbauch mit einem Betadine-Peeling, gefolgt von dreimal 75 % Ethanol. Öffnen Sie die Bauchhöhle mit einem sterilen Skalpell und machen Sie eine <5 mm große Öffnung.
- Klemmen Sie die Haut mit sterilen chirurgischen Klammern ab und ziehen Sie das Nebenhodenfettpolster mit einer sterilen Präparierzange ab, um die Hoden mit einer sterilen Pinzette zu lokalisieren. Fixieren Sie den Hoden mit einer sterilen Pinzette unter einem Stereoskop und injizieren Sie langsam 10 μl GSK923295 in einer Endkonzentration von 10 μM mit 10 μl rheodyne30 in Samenkanälchen. Für den Aufbau der Kontrollgruppe werden 10 μl 1%ige DMSO-Lösung (Dimethylsulfoxid)/PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) injiziert.
Anmerkungen: Lagern Sie die GSK923295 Lösung in einer Konzentration von 10 mM bei -80 °C. Lösen Sie 0,1 μl 10 mM GSK923295 in 100 μl PBS-Lösung, um die 10 μM GSK923295 Lösung herzustellen. - Schieben Sie den Hoden mit einer sterilen chirurgischen Zange sanft zurück in die Bauchhöhle. Peritoneum und Haut werden separat mit zwei bis vier Stichen mit der Nahtlinie mit einem Durchmesser von 0,1 mm vernäht.
- Beschriften Sie nach der Bauchoperation eine 3 x 3 mm große Stelle auf dem Rücken des Tieres mit einem Permanentmarker, setzen Sie die Maus zurück in den Futterkäfig und sorgen Sie für eine saubere und erregerfreie Umgebung mit ausreichend Futter und Wasser.
- Halten Sie die Umgebung durch die gefilterte Luft, die sterilisierten Lebensmittel und das Wasser in einem sterilen Zustand. Kümmere dich um das Tier, bis es wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um das Brustbein aufrecht zu halten. Bei postoperativer Analgesie ist 3 Tage lang alle 12 Stunden eine Dosis Buprenorphin (0,1 mg/kg) subkutan zu verabreichen. Stellen Sie sicher, dass die Maus nicht in die Gesellschaft anderer Tiere zurückgebracht wird, bis sie sich vollständig erholt hat.
HINWEIS: Die Mäuse werden postoperativ versorgt und geben der Wunde bei Bedarf eine Lokalanästhesie mit 0,5 % Lidocain, um die postoperativen Schmerzen zu lindern.
2. Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung und Histopathologie
- Vier Tage nach der Bauchoperation werden die Mäuse mit CO 2 mit einer Durchflussrate von 2 l/min in einer CO2 -Kammer eingeschläfert. Bestätigen Sie den Tod durch Zervixluxation als bestätigende Methode der Euthanasie. Verwenden Sie eine chirurgische Schere, um den Hodensack zu öffnen und die Hoden mit einer Pinzette zu entfernen. Sammeln Sie Mäusehoden 4 Tage nach GSK923295 Injektion und fixieren Sie sie 12 h lang in 30 ml 10%iger Formaldehydlösung bei Raumtemperatur.
- Für die Gradientendehydratisierung wird die Probe nacheinander in 40 ml 70%igem Ethanol für 1 h, in 40 ml 85%igem Ethanol für 1 h, in 40 ml 95%igem Ethanol für 1 h und in 40 ml 100%igem Ethanol für 1 h inkubiert.
- Die Probe wird in 40 ml Xylol für 40 min und dann in 40 ml Paraffin für 1 h bei 65 °C inkubiert. Legen Sie die Taschentücher auf den Boden der Einbettbox. Das geschmolzene Paraffin in die Einbettbox geben. Kühlen Sie das Gewebe für eine vollständige Erstarrung bei 4 °C für 6 h ab.
- Fixieren Sie die Proben auf der Halterung des Ultramikrotoms, halten Sie den Winkel zwischen den Proben und der Messeroberfläche bei 5-10° und stellen Sie die Schichtdicke auf 5 μm ein. Die 5 μm dicken Schnitte werden mit einem Ultramikrotom präpariert, die Objektträger im Wasserbad bei 40 °C ausgebreitet und 12 h bei 37 °C in einem Objektträgertrockner getrocknet.
- Inkubieren Sie die Objektträger in 200 ml Xylol für 40 min, in 200 ml 100 % Ethanol für 6 min, in 200 ml 95 % Ethanol für 2 min, in 200 ml 90 % Ethanol für 2 min, in 200 ml 80 % Ethanol für 2 min und in 200 ml 70 % Ethanol für 2 min. beziehungsweise.
- Spülen Sie die Objektträger 5 Minuten lang in destilliertem Wasser ab und färben Sie sie 6 Minuten lang bei Raumtemperatur mit der Mayer'schen Hämatoxylinlösung.
HINWEIS: Mayer-Hämatoxylinlösung: 0,011 mol/l Hämatoxylin, 6,7 % wasserfreies Ethanol, 0,646 mol/l Aluminiumkaliumsulfat und 0,003 mol/l Natriumjodat. - Spülen Sie die Objektträger 5 Minuten lang unter fließendem Wasser ab und inkubieren Sie sie 2 Minuten lang mit destilliertem Wasser.
- Inkubieren Sie die Objektträger 3 s lang in 1%igem Ethanolhydrochlorid und spülen Sie sie dann 2 Minuten lang unter fließendem Wasser ab.
- Färben Sie die Probe 15 s lang mit 1 % Eosin und inkubieren Sie sie dann 5 s lang mit 95 % Ethanol, 2 Minuten mit 100 % Ethanol und 40 Minuten lang mit Xylol.
- Versiegeln Sie die Objektträger mit 15 μl neutralem Gummi und dem 24 x 50 mm großen Deckglas.
3. Immunfluoreszenz und konfokale Mikroskopie
- Sammeln Sie die 5 μm dicken Paraffinschnitte von Maushoden für Immunfluoreszenz. Inkubieren Sie die Objektträger 40 min lang in Xylol, 6 min in 100 % Ethanol, 2 min in 95 % Ethanol, 2 min in 90 % Ethanol, 2 min in 80 % Ethanol und 2 min in 70 % Ethanol. Spülen Sie die Objektträger 5 Minuten lang in destilliertem Wasser und spülen Sie die Objektträger 5 Minuten lang mit 0,01 M PBS ab.
- Legen Sie die Objektträger in die Antigen-Retrieval-Lösung (0,01 M Citratpuffer) und kochen Sie sie unter hohem Druck mit einem Schnellkochtopf für 4 Minuten zur Antigen-Entnahme. Kühlen Sie die Objektträger auf natürliche Weise auf Raumtemperatur ab. Zweimal 5 Minuten mit destilliertem Wasser und 5 Minuten mit PBS abspülen.
HINWEIS: 0,01 M Citratpuffer (pH 6,0): 2,1 mmol/L Zitronensäure, 11,6 mmol/L Trinatriumcitratdihydrat. - Permeabilisieren Sie die Zellen, indem Sie die Objektträger 10 Minuten lang in 500 μl 0,25 % TritonX-100/PBS inkubieren. Spülen Sie die Objektträger dreimal 5 Minuten lang mit PBS ab.
- Zur Antigenblockierung inkubieren Sie die Proben 1 h lang mit 300 μl 3 % Rinderserumalbumin (BSA)/PBST (0,1 % Tween-20 in PBS). Inkubieren Sie die Proben mit den Primärantikörpern in 3% BSA/PBST für 16 h bei 4 °C. Legen Sie die Objektträger in eine befeuchtete Box, um ein Austrocknen der Taschentücher zu verhindern. Erwärmen Sie die Objektträger 30 Minuten lang auf Raumtemperatur.
- Verwerfen Sie den primären Antikörper und spülen Sie die Objektträger dann dreimal 5 Minuten lang in PBST aus. Verdünnen Sie die Sekundärantikörper in 3 % BSA/PBST. Inkubieren Sie die Proben mit Sekundärantikörpern für 1-2 h bei 37 °C. Spülen Sie die Proben fünfmal 5 Minuten lang in PBST.
- Die Zellkerne werden mit 50 μL 4', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) für 5 min bei Raumtemperatur gefärbt. Montieren Sie das Deckglas mit dem lichtbeständigen Montagemedium und versiegeln Sie das Deckglas mit Nagellack.
- Beobachten und zeichnen Sie Fluoreszenzsignale in den Objektträgern mit einem Fluoreszenzmikroskop auf, das mit einem NA 40x/ 0,75 Objektiv ausgestattet ist.
4. Durchflusszytometrie
- Sammeln Sie Maushoden in 6 cm Petrischalen und schneiden Sie die Hoden mit einer chirurgischen Schere in 1 mm3 Stücke.
- Verdauen Sie die Hoden mit 1 ml 1%iger Kollagenase in einem 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen für 10 min bei 37 °C und zentrifugieren Sie dann die Proben 5 min lang bei 1.000 x g , um spermatogene Zellen auszufällen.
- Verwerfen Sie den Überstand und fügen Sie dann 1 ml 0,25%ige Trypsin-EDTA-Lösung (Ethylendiamintetraessigsäure) für 20 min bei 37 °C hinzu und zentrifugieren Sie dann die Proben 5 min lang bei 1.000 x g .
- Verwerfen Sie den Überstand und inkubieren Sie dann die ausgefällten Zellen mit 1 ml 70%igem kaltem Ethanol für mehr als 8 h bei 4 °C.
- Zentrifugieren Sie die Proben 5 Minuten lang bei 1.000 x g und sammeln Sie dann Zellsedimente. Färben Sie die spermatogenen Zellen mit 500 μl Propidiumiodid (PI)-Färbelösung (50 μg/ml PI, 100 μg/ml RNase A und 0,2 % Triton X-100 in PBS) bei 37 °C für 30 min.
Anmerkungen: Schütteln Sie das Zentrifugenröhrchen alle 5 Minuten vorsichtig, um Zellansammlungen zu vermeiden. - Filtern Sie die Proben mit einem 300-Maschensieb, um Zelltrümmer zu entfernen. Sammeln Sie die Zellen in einem Durchflussrohr und lagern Sie sie bei 4 °C.
- Detektion von Fluoreszenzsignalen und Lichtstreuung bei der Anregungswellenlänge von 488 nm mit einem Durchflusszytometer. Analysieren Sie den DNA-Gehalt und die Lichtstreuung mit der Modfit MFLT32-Software.
5. Transmissionselektronenmikroskopie
- Schneiden Sie die Hoden mit dem scharfen Skalpell in 1 mm 3 Stücke und inkubieren Sie die Proben schnell mit3 %iger Glutaraldehyd-1,5%iger Paraformaldehydlösung in 0,1 M PBS (pH 7,2) für 4 h bei 4 °C, um Veränderungen der Ultrastruktur zu vermeiden. Spülen Sie die Proben dreimal 5 min lang mit 0,1 M PBS ab.
Anmerkungen: Das Skalpell und die Schere sollten scharf sein und versuchen, künstliches Quetschen und Ziehen zu vermeiden. Die Bearbeitung der Proben sollte in der Fixierflüssigkeit erfolgen. - Die Proben werden in 1%iger Osmsäure-1,5%iger Kaliumferrocyanidlösung bei 4 °C für 1,5 h fixiert. Trocknen Sie das Wasser mit Filterpapier ab und spülen Sie die Proben dreimal 5 min lang mit 0,1 M PBS ab.
- Die Proben werden in 40 ml 50%igem Ethanol für 10 min bei 4 °C dehydriert. Inkubieren Sie die Proben in 40 ml gesättigtem Uranacetatfarbstoff mit 70 % Ethanol bei 4 °C für 12 h, in 40 ml 90 % Ethanol für 10 min bei 4 °C, in 40 ml 90%igem Ethanol-Aceton für 10 min bei Raumtemperatur und in 40 ml wasserfreiem Aceton für 10 min dreimal bei Raumtemperatur.
- Inkubieren Sie die Proben 1,5 h lang in einem wasserfreien Aceton-Epoxidharz-618-Einbettungsmittelgemisch (v/v = 1:1) und betten Sie die Proben dann 3 h lang in Epoxidharz-618-Einbettungsmittel bei 35 °C ein.
- Für die Harzpolymerisation inkubieren die Proben in Epoxidharz 618-Einbettungsmitteln bei 35 °C für 12 h, bei 45 °C für 12 h und dann bei 60 °C für 24 h.
- Setzen Sie die Proben und das Glasmesser ein und passen Sie dann die Abstände zwischen den Proben und dem Messer an. Präparation der 90 nm dicken ultradünnen Schnitte mit einem ultradünnen Mikrotom. Schneiden Sie die Proben mit konstanter Geschwindigkeit in Scheiben und legen Sie die Objektträger dann auf ein Nickelgitter. Legen Sie die Objektträger bei Raumtemperatur in eine Petrischale.
- Färben Sie die Objektträger 10 Minuten lang mit 2%igem Uranylacetat und dann die Proben 10 Minuten lang mit 2%igem Bleicitrat. Spülen Sie die Objektträger mit destilliertem Wasser ab. Trocknen Sie die Objektträger 24 Stunden lang bei Raumtemperatur.
- Beobachten Sie die Objektträger und nehmen Sie Elektronenbilder bei 70-100 kV mit einem Transmissionselektronenmikroskop auf.
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Representative Results
Es ist uns gelungen, ein in vivo CENP-E Inhibitionsmodell von Maushoden durch abdominale Chirurgie und Hodeninjektion von GSK92329519 zu konstruieren. Die wichtigsten technischen Schritte dieses Verfahrens sind in Abbildung 1 dargestellt. Nach einer Hodeninjektion von GSK923295 für 4 Tage wurden die Hoden für weitere Analysen entnommen. In der Kontrollgruppe war die spermatogene Welle in den Samenkanälchen regelmäßig und organisiert (Abbildung 2A). In der GSK923295-Gruppe war jedoch die spermatogene Welle in den Samenkanälchen verändert, und die metaphasenarretierten primären Spermatozyten waren nach CENP-E-Hemmung signifikant erhöht (Abbildung 2B-D). Wichtig ist, dass mehrere homologe Chromosomen nach der CENP-E-Hemmung nicht an der Äquatorplatte ausgerichtet waren (Abbildung 2B-D). Darüber hinaus führte die CENP-E-Hemmung auch zu einem Anstieg der Metaphase-I-Spermatozyten in Samenkanälchen (Abbildung 2E,F,G). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die CENP-E-Hemmung zu einer Chromosomenfehlstellung in primären Spermatozyten während der Meiose I führt, was darauf hindeutet, dass CENP-E für den Chromosomenkongress und die Ausrichtung der Spermatozyten in der Meiose verantwortlich ist.
Um diese Ergebnisse weiter zu validieren, führten wir die Immunfluoreszenz-Assays durch, um die spermatogenen Zellen in Samenkanälchen nachzuweisen. Wir fanden heraus, dass die reguläre spermatogene Welle, die in der Kontrollgruppe gezeigt wurde, in der GSK923295-Gruppe offensichtlich verändert war und unregelmäßig wurde (Abbildung 3). Die meiotische Spindel der sich teilenden Spermatozyten wurde mit Anti-α-Tubulin-Antikörpern markiert, und das transversale Filament der synaptonemalen Komplexe in den Spermatozyten wurde mit dem Antikörper anti-synaptonemal complex protein 3 (SYCP3) markiert (Abbildung 3A). Die SYCP3-positiven Zellen pro Samentubulus nahmen nach CENP-E-Inhibition ab (Abbildung 3B). Währenddessen waren die SYCP3-Punkte pro Metaphasenzelle nach CENP-E-Inhibition nicht gestört (Abbildung 3C). Darüber hinaus waren auch die SYCP3-Strecken pro Zelle in den GSK92395 Gruppen nicht betroffen (Abbildung 3D). Auffällig ist, dass die Abstände der Spindelpole in Metaphase-I-Spermatozyten nach CENP-E-Inhibition vergrößert waren (Abbildung 3E,F). Diese immunfluoreszierenden Ergebnisse deuten darauf hin, dass CENP-E für Chromosomenfehlstellungen und die Prozesse der Spermatogenese erforderlich ist und für die Aufrechterhaltung der bipolaren Spindel und die Organisation der meiotischen Spindel unerlässlich ist.
Um Zellpopulationen in Maushoden zu untersuchen, haben wir die Hoden verdaut und PI-Färbungs- und Durchflusszytometrie-Assays durchgeführt (Abbildung 4). Die wichtigen technischen Vorgänge sind in Abbildung 4A-C dargestellt. Die spermatogenen Zellen bestehen aus mehreren Zellpopulationen, darunter die Spermatogonien, primäre Spermatozyten, sekundäre Spermatozyten, Spermatiden und Spermatozoen. Die DNA-Gehalte dieser spermatogenen Zellen wurden in Abbildung 4A dargestellt. Wir konnten zeigen, dass die CENP-E-Hemmung zu einer Abnahme der haploiden Zellen von 42,95 ± 1,09 % in der Kontrollgruppe auf 38,26 ± 1,86 % in der GSK923295 Gruppe führte (Abbildung 4B-D). Das Verhältnis der diploiden Zellen und der Aneuploidiezellen wurde nach CENP-E-Inhibition nicht signifikant beeinflusst (Abbildung 4E,F). Darüber hinaus steigen die Verhältnisse der tetraploiden Zellen von 17,76 ± 1,52 % in der Kontrollgruppe auf 28,88 ± 2,05 % in der GSK923295 Gruppe (Abbildung 4G). Zusammenfassend zeigen wir, dass die Zellpopulationen der spermatogenen Zellen nach CENP-E-Inhibition leicht verändert sind. Die CENP-E-Hemmung führt zu einer Abnahme der haploiden Zellen und einer Zunahme der tetraploiden Zellen, was darauf hindeutet, dass die CENP-E-Hemmung mit einem Metaphasenarrest in den sich teilenden Spermatozyten einhergeht.
Des Weiteren haben wir die submikroskopische Struktur der spermatogenen Zellen mittels Transmissionselektronenmikroskopie beobachtet (Abbildung 5). Die Chromatinorganisation, das endoplasmatische Retikulum und die Mitochondrien der Spermatozyten wurden in Abbildung 5 dargestellt. Wir fanden heraus, dass die Organisation der spermatogenen Zellen in der GSK923295-Gruppe leicht gestört war (Abbildung 5).
Abbildung 1: Etablierung eines in vivo Inhibitionsmodells von Maushoden durch abdominale Chirurgie und Hodenverabreichung. (A) Alle chirurgischen Instrumente, die in der Bauchchirurgie verwendet werden. 1) Präparierschere, 2) Nadelzange, 3) gerade Pinzette, 4) Pinzette, 5) Rheodyne, 6) 1 ml-Spritze, 7) Skalpell mit Griff Nr. 3 und Klinge Nr. 11, 8) Stylolith, 9) Rundstichnadeln, 1/2 0,6 x 14 mm, 1/2 0,7 x 17 mm, 10) Ethanoltupfer. (B) Nach Narkose wurden die Mäuse in Rückenlage auf eine Wachsschale gelegt, der Unterbauch wurde präpariert und mit 75%igem Ethanol desinfiziert. (C) In der Mitte des Unterbauchs wurde eine <5 mm große Öffnung gemacht. (D) Das Nebenhodenfettpolster wurde mit einer sterilen Präparierzange gezogen, um die Hoden zu lokalisieren. Dem Hoden wurden 10 μL GSK923295 mit einem 10 μL Rheodyn injiziert. (E) Das Bauchfell und die Haut wurden gleichzeitig mit zwei Stichen vernäht. (F) Die Wunde wurde mit 75%igem Ethanol desinfiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Die Hemmung von CENP-E führte zum Stillstand der Meiose I und zur Fehlstellung der Chromosomen in den Spermatozyten der Maus . (A) HE-Färbung der spermatogenen Zellen in der Kontrollgruppe. Die Pfeile zeigen die Spermatozyten an. (B) HE-Färbung der spermatogenen Zellen in der GSK923295-Gruppe. Den Hoden wurde 4 Tage lang GSK923295 in einer Endkonzentration von 10 μM injiziert. Die Pfeile deuten auf Chromosomenfehlstellungen in den Spermatozyten hin. Für alle Bilder, Maßstabsbalken, 10 μm. (C) Verhältnis der Metaphase-Spermatozyten in Samenkanälchen. Kontrolle, 13,43 ± 1,68%; GSK923295, 42,29 ± 3,94%. N = 1308 Zellen wurden analysiert. Gruppe = 4. Schüler-t-Test. Fehlerbalken, bedeutet ± SEM. ***, P < 0,001 . (D) Verhältnis der Samenkanälchen zu den sich teilenden Spermatozyten. Kontrolle, 5,38 ± 2,64%; GSK923295, 33,96 ± 3,87%. N = 151 Samenkanälchen wurden analysiert. Gruppe = 4. (E) Immunfluoreszenzbilder von Histon H3 (Phospho Ser 10) und TUBA4A in der Kontroll- und GSK923295-Gruppe. TUBA4A, rot; Histon H3 (Phospho Ser 10), grün; DAPI, blau. Maßstabsbalken, 10 μm. Das vergrößerte Kästchen wird vergrößert. (F) Die Quantifizierung der Anzahl der Metaphasenzellen in Samenkanälchen. Kontrolle, 11,45 ± 1,55; GSK923295, 18,91 ± 2,36. N = 11. (G,H) Zeilenscan-Analysen der Fluoreszenzintensitäten von Histon H3 und TUBA4A in Metaphase-I-Spermatozyten der Kontrollgruppe (G) und der GSK923295-Gruppe (H). TUBA4A, rot; Histon H3 (Phospho Ser 10), grün; DAPI, blau. Die X-Achse gibt den relativen Abstand an. Die Y-Achse zeigt die Fluoreszenzintensität an. Schüler-t-Test. Fehlerbalken, Mittelwert ± SEM. *, P < 0,05 ; ***, P < 0,001 . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Die CENP-E-Hemmung durch GSK923295 führte zur Desorganisation der Samenkanälchen und zur Störung der Spermatogenese . (A) Repräsentative Immunfluoreszenzbilder von SYCP3 und TUBA4A in der Kontroll- und GSK923295-Gruppe. SYCP3, rot; TUBA4A, grün; DAPI, blau. Maßstabsbalken, 10 μm. (B) SYCP3-positive Zellen pro Samenkanälchen in der Kontroll- und GSK923295-Gruppe. Kontrolle, 56,00 ± 5,43%; GSK923295, 39,00 ± 1,73%. N = 10. (C) Die Quantifizierung von SYCP3-Punkten pro Metaphase-Zellen. Kontrolle, 10.00 ± 1.02; GSK923295, 9,71 ± 0,86, N = 7. (D) Die Quantifizierung der SYCP3-Dehnungen pro Zelle in der Kontroll- und GSK923295-Gruppe. Kontrolle, 8,63 ± 0,22; GSK923295, 8,21 ± 0,21. N = 19. (E) Die Analyse des Abstands der Spindelpole in den Metaphase-I-Spermatozyten. Kontrolle, 8,20 ± 0,28 μm; GSK923295, 9,30 ± 0,29 μm. N = 30. (F) Immunfluoreszenzbilder von Samenkanälchen in der Kontroll- und GSK923295-Gruppe. Die Pfeile zeigen die Spermatozyten an. DAPI, grün; β-Tubulin, grün. Die vergrößerten Bilder des gestrichelten Kastens wurden im Zoom angezeigt. Für alle Bilder, Maßstabsbalken, 10 μm. Student's t-Test. Fehlerbalken, Mittelwert ± REM. ns, P > 0,05 ; **, P < 0,01 . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Durchflusszytometrische Analyse von spermatogenen Zellen in Maushoden. (A) Schematische Darstellungen der wichtigsten Schritte bei der Zellzyklusanalyse von spermatogenen Zellen der Maus. Die diploiden Spermatozyten durchlaufen die Meiose I und II, um die haploiden Spermatiden zu bilden. Der C-Wert gibt den DNA-Gehalt an. Der N-Wert (Ploidie) gibt die Anzahl der Chromosomensätze an. (B,C) Durchflusszytometrische Analyse der spermatogenen Zellen der Kontrollgruppe (B) und der GSK923295 Gruppe (C). Zur In-vivo-Hemmung von CENP-E wurde GSK923295 4 Tage lang in 3 Wochen alte männliche ICR-Maushoden in einer Endkonzentration von 10 μM injiziert. Für die Zellzyklusanalyse wurden n = 3.000 Zellen gemessen und analysiert. P4, die haploiden Zellen (1C). P5, die diploiden Zellen (2C). P6, die tetraploiden Zellen (4C). (D) Verhältnis der haploiden Zellen in der Kontroll- und GSK923295-Gruppe. Kontrolle, 42,95 ± 1,09%; GSK923295, 38,26 ± 1,86 %. N = 8. (E) Verhältnis der diploiden Zellen in der Kontroll- und GSK923295 Gruppe. Kontrolle, 20,10 ± 0,91%; GSK923295, 17,95 ± 0,81%. N = 8. (F) Verhältnisse der aneuploiden Zellen (2C ~ 4C) in der Kontroll- und GSK923295-Gruppe. Kontrolle, 3,41 ± 0,23%; GSK923295, 3,39 ± 0,25%. N = 8. (G) Verhältnis der tetraploiden Zellen in der Kontroll- und GSK923295 Gruppe. Kontrolle, 17,76 ± 1,52%; GSK923295, 28,88 ± 2,05%. N = 8. Für alle Diagramme gilt der Student's t-Test . Fehlerbalken, Mittelwert ± SEM. ns, P > 0,05; *, P < 0,05; , P < 0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Elektronenmikroskopische Analyse der spermatogenen Zellen in der Kontroll- und GSK923295 Gruppe . (A) Repräsentative Bilder von Samenkanälchen in der Kontrollgruppe. Maßstabsbalken, 5 μm. (B) Das vergrößerte Bild des Zellkerns der Spermatozyten. Die Pfeile zeigen das homologe Chromatin der Spermatozyten an. Maßstabsbalken, 1 μm. (C) Das vergrößerte Bild des Zytoplasmas der Spermatozyten. Maßstabsbalken, 1 μm. (D) Repräsentative Bilder von Samenkanälchen in der GSK923295-Gruppe. Die Hoden wurden 4 Tage lang mit 10 μM GSK923295 behandelt. Maßstabsbalken, 5 μm. (E) Das vergrößerte Bild des Zellkerns der Spermatozyten in der GSK923295-Gruppe. Maßstabsbalken, 1 μm. (F) Das vergrößerte Bild des Zytoplasmas der Spermatozyten in der GSK923295-Gruppe. Maßstabsbalken, 1 μm. Für alle Graphen, sc, Spermatozyten; SD, Spermatid. ER, endoplasmatisches Retikulum; MT, Mitochondrien. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
In dieser Studie haben wir ein in vivo CENP-E Inhibitionsmodell von Maushoden unter Verwendung der abdominalen Chirurgie und der Mikroinjektion von GSK923295 etabliert. Die in dieser Studie verwendete Methode der Bauchchirurgie und Hodeninjektion hat die folgenden Vorteile. Erstens ist es nicht auf das Alter von Mäusen beschränkt. Experimentatoren können die Hodeninjektion in einem frühen Stadium durchführen, zum Beispiel bei 3 Wochen alten oder jüngeren Mäusen. Zweitens hat GSK923295 eine spezifische und hervorragende hemmende Wirkung auf CENP-E. Drittens ist diese Methode einfach zu bedienen und sehr gut reproduzierbar. Darüber hinaus bleibt die Integrität der Hoden erhalten, was sich für die Untersuchung von intaktem Gewebe im Kontext der Organe eignet.
Es gibt mehrere kritische Schritte in diesem Protokoll. Zum Beispiel ist es wichtig, während der Bauchchirurgie eine sterile Umgebung aufrechtzuerhalten, um postoperativen Infektionen vorzubeugen31. Darüber hinaus sollten bei Mäusen unterschiedlichen Alters oder unterschiedlichen Versuchstieren die Injektionsmengen entsprechend der Größe der Hoden und der Wirksamkeit der Arzneimittel angepasst werden19,32. Darüber hinaus ist die richtige Aufschlusszeit und mikroskopische Beobachtung für die Bestimmung einzelner Zellen und die anschließende Zellpopulationstestung während der Durchflusszytometrie erforderlich. Es gibt jedoch einige Einschränkungen in diesen Protokollen. Es ist schwierig, mit Hilfe der Bauchchirurgie ein Mausmodell zu konstruieren, wenn das Alter der Maus weniger als 2 Wochen beträgt. Die Hauptgründe sind, dass die Mäuse zu jung sind, die postoperative Ernährung schwierig ist und die Überlebensrate gering ist. Die in Tiermodellen verwendeten Arzneimittel sind flüssig und haben die Eigenschaften leicht durchdringender Zellmembranen 19,32,33, die für die Anwendungen dieser Verabreichungsmethode geeignet sind.
Das Verständnis der Meiose wird durch In-vitro-Zellkultur - und Gen-Knockout-Studien angeregt, ist jedoch in Säugetierspermatozyten nicht ohne weiteres anwendbar28. Das Hindernis für die mechanistischen Studien der männlichen Meiose war das Fehlen eines geeigneten Systems zur Manipulation und Beobachtung der sich teilenden Spermatozyten in der Meiose27. Die Maus ist ein hervorragender Modellorganismus bei der Erforschung zellulärer und molekularer Mechanismen der Meiose während der Spermatogenese. Die erste Welle von Mausspermatozyten beginnt die Meiose am 10. Tag postpartum (dpp) und entwickelt sich zu reifen Spermien bei 35 dpp, was ein Entwicklungszeitfenster für die Studien zur meiotischen Teilung und Spermatogenese bietet34.
Die Hodeninjektion, einschließlich der direkten Injektion durch den Hodensack und der Mikroinjektion über die Bauchchirurgie, ist eine nützliche Technik für die Untersuchung der Spermatogenese35,36. Die direkte Injektion durch den Hodensack ist schnell und einfach und verursacht nur ein geringes chirurgisches Trauma, das für Mäuse ab 4 Wochen geeignet ist, bei denen die Hoden zum Hodensack absteigen. Es ist jedoch nicht möglich, den Hodenhochstand der 3 Wochen alten oder jüngeren Mäuse zu injizieren. Die Mikroinjektion durch die intraperitoneale Chirurgie oder Hodensackchirurgie eignet sich für die Injektion des Hodenhochstandes, was kompetente chirurgische Fähigkeiten der experimentellen Bediener, ein Stereomikroskop und die chirurgische und Laborausrüstung erfordert. Je nach Injektionsstelle kann die Mikroinjektion in Samenkanälcheninjektion, Hodennetzinjektion und Hodeninterstitialinjektion unterteilt werden. Im Vergleich zu anderen injektionsbasierten Hodenmodellen kann die Injektion von Inhibitoren durch Bauchchirurgie die Funktionen von Proteinen effektiv hemmen und hat die Vorteile der Zellmembrandurchdringung, der einfachen Verfahren und der langfristigen Hemmung19,32. Die Methoden, die siRNAs, Antisense-Oligonukleotide oder Lentiviren verwenden, haben größere Einschränkungen in Bezug auf eine geringe Penetrationseffizienz der Zellmembranen, Off-Target-Nebenwirkungen und einen einfachen Abbau von siRNA oder Oligonukleotiden in vivo37,38,39,40.
Die meiotische Teilung in lebenden Geweben ist komplexer als die unter Kulturbedingungen, bei denen die Gewebearchitektur, die Entwicklungssignale und Umweltfaktoren in vivo berücksichtigt werden sollten41. Frühere Studien haben gezeigt, dass Nährmedien und zellautonome Faktoren entscheidend für die Stimulation des Beginns der meiotischen Teilungsphase sind. So fördern beispielsweise der Phosphatase-Inhibitor Okadasäure (OA)42, das spermatozytenspezifische Histon HIST1H1T43, die Topoisomerase II 44 und der Metaphasen-fördernde Faktor (MPF)45 den G2/MI-Übergang in kultivierten Spermatozyten. Diese komplexen Kulturbedingungen und -faktoren tragen zu den Einschränkungen der Kurzzeitkultur von Spermatozyten bei.
Die direkte Injektion von Plasmid-DNA in Hoden wird erfolgreich beim hodenvermittelten Gentransfer und bei der Produktion transgener Mäuse eingesetzt 32,46. Die In-vivo-Elektroporation beinhaltet die Injektion eines DNA-Expressionsplasmids in das Lumen der Samenkanälchen und die anschließende Verwendung einer Reihe von elektrischen Impulsen, um die Permeabilität der Zellmembran zu ändern, die Effizienz der Transgenexpression zu verbessern und die genetische Modifikation zu verbessern 45,46,47,48,49. Unsere Methode konnte mit in vivo Elektroporation sowie fluoreszierenden markierten Proteinen und Gen-Editing-Werkzeugen kombiniert werden, was diesen Ansatz für die Analyse der männlichen meiotischen Teilung im physiologischen Kontext von Geweben und Organen leistungsfähiger macht.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken allen Mitgliedern des Cytoskeleton Laboratory an der Fujian Medical University für die hilfreichen Gespräche. Wir danken Jun-Jin Lin vom Public Technology Service Center der Fujian Medical University für die technische Unterstützung bei der Durchflusszytometrie. Wir danken Ming-Xia Wu und Lin-Ying Zhou vom Electron Microscopy Lab des Public Technology Service Center der Fujian Medical University für die technische Unterstützung bei der Elektronenmikroskopie. Wir danken Si-Yi Zheng, Ying Lin, Qi Ke und Jun Song vom Experimental Teaching Center of Basic Medical Sciences an der Fujian Medical University für ihre Unterstützung. Diese Studie wurde durch die folgenden Zuschüsse unterstützt: National Natural Science Foundation of China (Fördernummer 82001608), Naturwissenschaftliche Stiftung der Provinz Fujian, China (Fördernummer 2019J05071), Fujian Provincial Health Technology Project (Fördernummer 2018-1-69), Startup Fund for Scientific Research, Fujian Medical University (Fördernummer 2017XQ1001), Fujian Medical University High-Level Talents Anschubfinanzierungsprojekt für wissenschaftliche Forschung (Fördernummer XRCZX2017025) und Forschungsprojekt der Online-Ausbildung und des Unterrichts von Doktoranden der Chinesischen Medizin (Förderkennzeichen B-YXC20200202-06).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 1 ml Syringe | Several commercial brands available | Sterile. | |
| 1.5 mL Centrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Corning | 430828 | |
| 6 cm Petri dish | Corning | 430166 | |
| 95% Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009164 | |
| tubulin rabbit polyclonal antibody | Beyotime | AF0001 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| rabbit anti-Histone H3 (phospho S10) monoclonal antibody | Abcam | ab267372 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| rabbit anti-TUBA4A polyclonal antibody | Sangon Biotech | D110022 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| Anti-SYCP3 rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab175191 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| Adhesion microscope slides | CITOTEST | 188105 | |
| Alexa fluor 488-labeled goat anti-rabbit antibody | Beyotime | A0423 | Sencodary antibody. Use at 1:500. |
| Aluminium potassium sulphate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10001060 | |
| Anhydrous ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 100092690 | |
| Anti-fade mounting medium | Beyotime | P0131 | Prevent photobleching of flourescent signals. |
| BD FACS Canto II | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| Bovine Serum Albumin | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 69003435 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424BK745380 | |
| Chloral hydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80037516 | |
| Citric acid | Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd | 122670 | |
| Collagenase | Sangon Biotech | A004194-0100 | |
| Coverslips | CITOTEST | 10212020C | 20 × 20 mm. Thickness 0.13-0.16 mm. |
| DAPI | Beyotime | C1006 | |
| Dye vat | Several commercial brands available | 91347802 | |
| Eosin Y, alcohol soluble | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 71014460 | |
| Ether | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009318 | |
| Formaldehyde - aqueous solution | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10010018 | |
| GSK923295 | MedChemExpress | HY-10299 | |
| Hematoxylin, anhydrous | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 71020784 | |
| ICR mouse | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd | ||
| Image J software | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | Fluorescent image analysis. |
| Leica ultramicrotome | Leica | ||
| Leica EM UC-7 ultramicrotome | Leica | EM UC7 | |
| Modfit MFLT32 | Verity Software House | For analysis of flow cytometry results. | |
| Nail polish | Several commercial brands available | ||
| Neutral gum | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10004160 | |
| Nikon Ti-S2 microscope | Nikon | Ti-S2 | |
| Picric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | J60807 | |
| Rheodyne | Sangon Biotech | F519160-0001 | 10 μl rheodyne |
| Sliced paraffin | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 69019461 | |
| Sodium iodate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80117214 | |
| Surgical instruments | Several commercial brands available | For abdominal surgery. Sterilize at 121 °C, 20 min. | |
| Transmission electron microscope | FEI | Tecnai G2 | |
| Trisodium citrate dihydrate | Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd | 173970 | |
| Triton X-100 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 30188928 | Dilute in sterile PBS to make a 0.25% working solution. |
| Tween 20 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 30189328 | Dilute in sterile PBS to make a 0.1% working solution. |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80096618 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10023418 |
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