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Cancer Research

उपसंस्कृति और एसोफेजेल एडेनोकार्सिनोमा Organoids के क्रायोप्रिजर्वेशन: एकल सेल पाचन के लिए पेशेवरों और विपक्ष

Published: July 6, 2022 doi: 10.3791/63281
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1, 1
1Department of General, Visceral, Cancer and Transplantation Surgery, University Hospital Cologne, 2Institute of Pathology, University Hospital Cologne
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल उपसंस्कृति के तरीकों का वर्णन करता है और एसोफेजेल एडेनोकार्सिनोमा ऑर्गेनोइड्स के क्रायोप्रिजर्वेशन के साथ और एकल सेल पाचन के बिना शोधकर्ताओं को अपने प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर उपयुक्त रणनीतियों को चुनने में सक्षम बनाता है।

Abstract

उपयुक्त ट्रांसलेशनल अनुसंधान मॉडल की कमी प्राथमिक बीमारी को प्रतिबिंबित करने के लिए प्राथमिक बीमारी को प्रतिबिंबित करने के लिए एसोफैगल एडेनोकार्सिनोमा (ईएसी) में एक बड़ी बाधा है। रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स (पीडीओ) हाल ही में विभिन्न प्रकार के कैंसर में एक उल्लेखनीय प्रीक्लिनिकल मॉडल के रूप में उभरे हैं। हालांकि, ईएसी पीडो विकसित करने के लिए अभी भी सीमित प्रोटोकॉल उपलब्ध हैं। एक बार पीडीओ स्थापित होने के बाद, प्रसार और क्रायोप्रिजर्वेशन आगे डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए आवश्यक हैं। यहां, ईएसी पीडो उपसंस्कृति और क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए दो अलग-अलग तरीकों को मानकीकृत किया गया है, यानी, एकल सेल पाचन के साथ और बिना। दोनों विधियां मज़बूती से उचित सेल व्यवहार्यता प्राप्त कर सकती हैं और एक विविध प्रयोगात्मक सेटअप के लिए लागू होती हैं। वर्तमान अध्ययन से पता चला है कि एकल सेल पाचन के साथ EAC PDOs subculturing सेल संख्या नियंत्रण, समान घनत्व, और एक खोखली संरचना की आवश्यकता वाले अधिकांश प्रयोगों के लिए उपयुक्त है जो आकार ट्रैकिंग की सुविधा प्रदान करता है। हालांकि, एकल सेल-आधारित विधि संस्कृति में धीमी वृद्धि के साथ-साथ जमे हुए स्टॉक से फिर से खेती के बाद भी दिखाती है। इसके अलावा, एकल कोशिका पाचन के साथ subculturing एक खोखले कोर के साथ खोखले संरचनाओं के गठन की विशेषता है। इसके विपरीत, एकल सेल पाचन के बिना ईएसी पीडीओ को संसाधित करना क्रायोप्रिजर्वेशन, विस्तार और हिस्टोलॉजिकल लक्षण वर्णन के लिए अनुकूल है। इस प्रोटोकॉल में, एकल सेल पाचन के साथ और बिना ईएसी पीडीओ के उप-खेती और क्रायोप्रिजर्वेशन के फायदे और नुकसान का वर्णन किया गया है ताकि शोधकर्ताओं को अपने ऑर्गेनोइड्स को संसाधित करने और जांच करने के लिए एक उपयुक्त विधि चुनने में सक्षम बनाया जा सके।

Introduction

एसोफेजेल कैंसर (ईसी) दुनिया भर में कैंसर से मृत्यु का दसवां सबसे आम और छठा प्रमुख कारण है। एसोफेजेल एडेनोकार्सिनोमा (ईएसी) ईसी के प्रमुख हिस्टोलॉजिक उपप्रकारों में से एक है और मुख्य रूप सेपश्चिमी देशों में होता है। हाल के दशक में, जर्मनी सहित कई विकसित देशों में ईएसी की घटनाओं में काफी वृद्धि हुईहै। कैंसर की आक्रामकता और ट्यूमर के विकास के शुरुआती चरण के दौरान लक्षणों की कमी के कारण, ईएसी रोगियों में समग्र पूर्वानुमान खराब है, जो लगभग 20% 2,4,5 की 5 साल की जीवित रहने की दर दिखाता है।

बीसवीं शताब्दी के उत्तरार्ध से, ईएसी के जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए कई मॉडल स्थापित किए गए हैं। क्लासिक मानव ईएसी सेल लाइनें जो 1990 के दशक में स्थापित की गई थीं,ईएसी ट्यूमर जीव विज्ञान, ट्यूमर आनुवांशिकी के साथ-साथ एंटी-ट्यूमर रणनीतियों के बारे में हमारे ज्ञान का विस्तार करती हैं, और आमतौर पर ईएसी अनुसंधान में उपयोग की जाती हैं। इसके अलावा, कुछ शोध समूहों ने ईएसी या बैरेट के एसोफैगस के पशु मॉडल को सफलतापूर्वक विकसित किया है, जो जानवरों को ज्ञात जोखिम कारकों जैसे सर्जिकल या भड़काऊ दृष्टिकोण 7,8,9 के माध्यम से गैस्ट्रोओसोफेगल रिफ्लक्स जैसे ज्ञात जोखिम कारकों से अवगत कराते हैं। इसके अलावा, रोगी-व्युत्पन्न (पीडीएक्स) मॉडल जो ईएसी प्राथमिक कैंसर के ऊतकों को चमड़े के नीचे या ऑर्थोटोपिक रूप से इम्यूनोडेफिसिएंट चूहों में संलग्न करते हैं, को मानव ईएसी ट्यूमर जैविक व्यवहार और ट्यूमर पर्यावरण10,11,12 का अनुकरण करने के लिए विकसित किया गया था। हालांकि, इन मॉडलों के बावजूद नैदानिक अनुप्रयोगों में सुधार और ईएसी और प्रगति के पीछे आणविक तंत्र की हमारी समझ के बावजूद, इन शोध मॉडलों से मनुष्यों के लिए परिणामों को एक्सट्रपलेशन करने के लिए अभी भी एक बड़ी चुनौती है।

रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स (पीडीओ) एक 3 डी संस्कृति प्रणाली में उगाए जाते हैं जो विट्रो में मानव विकास और अंग पुनर्जनन की नकल करता है। रोगियों के प्राथमिक ऊतक से उत्पन्न, पीडीओ मानव ट्यूमर की आणविक और फेनोटाइपिक विशेषताओं को दोहराते हैं और दवा के विकास और व्यक्तिगत कैंसर उपचार13,14 में आशाजनक अनुप्रयोगों को दिखाते हैं। अपने युग्मित ट्यूमर ऊतक के साथ ईएसी पीडीओ के दस मामलों की तुलना करके, ईएसी पीडीओ को प्राथमिक ट्यूमर के साथ समान हिस्टोपैथोलॉजिकल विशेषताओं और जीनोमिक परिदृश्य को साझा करने, इंट्रा-ट्यूमर विषमता को बनाए रखने और विट्रो15 में कुशल दवा स्क्रीनिंग की सुविधा प्रदान करने की सूचना दी जाती है। ईएसी पीडीओ का उपयोग रोगी-व्युत्पन्न कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट्स (सीएएफ) के साथ ईएसी ट्यूमर कोशिकाओं की बातचीत का अध्ययन करने में भी किया गया था, जो ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट अनुसंधान16 के क्षेत्र में एक शक्तिशाली अनुप्रयोग का संकेत देता है। दुर्भाग्य से, ईएसी पीडो के विकास और प्रचार के लिए सीमित प्रोटोकॉल उपलब्ध हैं। यहां, EAC PDOs को विस्तार से उप-संस्कृति और संरक्षित करने के लिए दो अलग-अलग तरीकों का वर्णन किया गया है: एकल सेल पाचन के साथ और बिना। ईएसी पीडीओ और उनके अनुप्रयोगों के रखरखाव के लिए मानकीकृत तरीके शोधकर्ताओं को अपने ईएसी पीडीओ अनुसंधान में विभिन्न उद्देश्यों के लिए उपयुक्त तरीकों का चयन करने के लिए समर्थन कर सकते हैं।

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Protocol

एक स्थापित और अच्छी तरह से बढ़ती पीडीओ संस्कृति इस प्रोटोकॉल में वर्णित एक सफल उपसंस्कृति और क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए आधार का प्रतिनिधित्व करती है। यहां, ईएसी पीडीओ को ईएसी रोगियों के प्राथमिक ट्यूमर ऊतक से उत्पन्न किया गया था, जो कारकाशेवा टी ए एट अल17 द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके किया गया था। EAC ऊतकों को BioMaSOTA के अनुमोदन के तहत बायोबैंक से एकत्र किया गया था (कोलोन विश्वविद्यालय की नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित, आईडी: 13-091)।

नोट: EAC PDOs को एक HUMIDIFIED इनक्यूबेटर में 37 °C और 5% CO2 पर एक PDO संस्कृति माध्यम (तालिका 1) का उपयोग करके सुसंस्कृत किया गया है। निम्नलिखित चरणों में, उपसंस्कृति की दो विधियों का विस्तार से वर्णन किया गया है। पीडीओ को तीन एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स (ईसीएम) जेल गुंबदों के बीजारोपण घनत्व के साथ उप-खेती करने के लिए एक 12-अच्छी तरह से प्लेट की सिफारिश की जाती है, क्योंकि यह विभिन्न उद्देश्यों के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से और उचित मात्रा में पीडीओ के लचीले उपयोग की अनुमति देता है। पीडीओ को संभालते समय एक एसेप्टिक तकनीक अनिवार्य है।

1. पहले से तैयारी

  1. प्लेट के पूर्ण वार्मिंग को सुनिश्चित करने के लिए उपसंस्कृति से पहले रात भर में 37 डिग्री सेल्सियस सीओ 2 इनक्यूबेटर में रखकर12-अच्छी तरह से प्लेट को पूर्व-गर्म करें। यदि उपलब्ध हो, तो वर्तमान पीडीओ संस्कृति के साथ एक प्लेट से खाली कुओं का उपयोग करें।
    नोट: लचीला उपसंस्कृति योजना के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 1-2 ताजा प्लेटों के निरंतर भंडारण की सिफारिश की जाती है।
  2. -20 डिग्री सेल्सियस (निरंतर भंडारण अनुशंसित) पर एक विस्तृत छिद्र के साथ प्री-कूल 1,000 μL और 200 μL युक्तियाँ। 4 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व शांत सेंट्रीफ्यूज।
  3. घूर्णन इनक्यूबेटर का तापमान 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें (यदि एकल सेल पाचन किया जाता है)।
  4. बर्फ पर 1 ज के लिए ECM जेल की एक उपयुक्त मात्रा को तरल पदार्थ के लिए इनक्यूबेट करें। बर्फ पर सेल वसूली समाधान रखें।

2. कटाई organoids

  1. सीओ2इनक्यूबेटर से बढ़ते पीडीओ के साथ प्लेट को हटा दें।
  2. एक वैक्यूम पंप का उपयोग करके एस्पिरेट पुराने माध्यम।
    नोट: गुंबदों को छूने से बचें।
  3. अच्छी तरह से में बर्फ-ठंडे सेल रिकवरी समाधान (500 μL / गुंबद) की एक उपयुक्त मात्रा जोड़ें।
  4. एक विस्तृत छिद्र के साथ 1,000 μL युक्तियों का उपयोग करके ईसीएम जेल गुंबदों को छोटे टुकड़ों में विभाजित करने के लिए कई बार ऊपर और नीचे पिपेटिंग करके ईसीएम जेल को विघटित करें।
  5. पीडीओ, ईसीएम जेल और सेल रिकवरी समाधान के मिश्रण को अधिकतम दो कुओं (छह गुंबदों) से मिलाएं और इसे 5 एमएल कम बाइंड ट्यूब में स्थानांतरित करें (उपसंस्कृति के लिए अधिक कुओं का उपयोग किए जाने के मामले में दूसरी ट्यूब का उपयोग करें)।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, यदि ईसीएम जेल पूरी तरह से भंग नहीं किया गया था, तो पीडीओ, ईसीएम जेल और सेल रिकवरी समाधान के मिश्रण में सेल रिकवरी समाधान का एक अतिरिक्त 1.5 मिलीलीटर जोड़ें।
  6. 20 मिनट के लिए बर्फ पर चरण 2.5 में मिश्रण युक्त ट्यूब को इनक्यूबेट करें, ईसीएम जेल के द्रवीकरण को सुनिश्चित करने के लिए ट्यूब को पांच बार उलटकर हर 5 मिनट में मिलाएं।
  7. 4 ° C पर 4 मिनट के लिए 500 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
  8. यदि centrifugation के बाद एक दृश्यमान और स्थिर गोली है, तो चरण 2.10 के साथ आगे बढ़ें। अन्यथा, चरण 2.9 के साथ जारी रखें।
  9. यदि कोई दृश्यमान गोली नहीं है और पीडीओ अभी भी जेल चरण में फंस गए हैं, तो ईसीएम जेल-पीडीओ-सॉल्यूशन युक्त चरण तक पहुंचने तक वैक्यूम पंप के साथ supernatant को सावधानीपूर्वक हटा दें और बर्फ-कोल्ड सेल रिकवरी समाधान के 3 एमएल जोड़ें।
    1. ट्यूब को कुछ बार उलटें और एक और 10 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें। समय-समय पर ट्यूब को उलटकर मिलाएं।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिनट के लिए 500 x g पर सेंट्रीफ्यूज और चरण 2.10 के साथ जारी रखें।
  10. एक वैक्यूम पंप या एक 1,000 μL पिपेट का उपयोग करके supernatant को ध्यान से छोड़ दें। जितना संभव हो सके supernatant को हटाने की कोशिश करें।
    नोट: ट्यूब की कम बाइंड सतह के कारण, गोली हमेशा की तरह स्थिर नहीं होगी।
  11. बर्फ पर पीडीओ गोली स्टोर करें और विभिन्न उद्देश्यों के आधार पर चरण 3 (पाचन के बिना) या चरण 4 (एकल सेल पाचन के साथ) के साथ आगे बढ़ें।

3. पाचन के बिना subculturing

नोट: इस विधि का उद्देश्य PDOs के आकार और घनत्व को बढ़ाना है। बड़ा आकार और उच्च घनत्व एम्बेडिंग प्रक्रिया, हिस्टोलॉजिकल लक्षण वर्णन और पीडीओ विस्तार की सुविधा प्रदान करता है। पीडीओ स्प्लिट अनुपात (पीडीओ के घनत्व के आधार पर, 1: 3 और 1: 6 के बीच एक अनुपात की सिफारिश की जाती है) के आधार पर, तरल ईसीएम जेल की उचित मात्रा में चरण 2.8 से गोली को फिर से निलंबित करें।

  1. -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से एक विस्तृत छिद्र के साथ पूर्व-ठंडा 200 μL और 1,000 μL युक्तियों को निकालें और उन्हें एक साफ बेंच पर रखें।
  2. पूर्व ठंडा 1,000 μL युक्तियों का उपयोग कर ईसीएम जेल में चरण 2.11 से गोली resuspend. यह सुनिश्चित करने के लिए लगभग 10 बार ऊपर और नीचे पिपेटिंग करके मिलाएं कि पीडीओ क्लम्पिंग नहीं कर रहे हैं और ईसीएम जेल में समान रूप से वितरित किए जाते हैं।
    नोट: 50 μL ECM जेल / हमेशा आवश्यकता से अधिक एक गुंबद के लिए गणना करें (उदाहरण के लिए, नौ गुंबदों (यानी, तीन कुओं) के लिए, तरल ईसीएम जेल (450 + 50 μL अतिरिक्त) के 500 μL में गोली को फिर से निलंबित करें। Resuspension के दौरान बुलबुले के उत्पादन से बचने के लिए प्रयास करें!
  3. गुंबदों को सीडिंग करने से ठीक पहले इनक्यूबेटर से पहले से गर्म 12-अच्छी तरह से प्लेट को हटा दें।
  4. गर्म प्लेट में 50 μL ECM जेल युक्त बीज गुंबद (तीन गुंबद / ईसीएम जेल गुंबदों में pipetting बुलबुले से बचें.
  5. प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2इनक्यूबेटर में वापस रखें और ईसीएम जेल को मजबूत करने के लिए 20-30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  6. गुंबदों को परेशान किए बिना ध्यान से पहले से गर्म पीडीओ माध्यम (तालिका 1) जोड़ें।
  7. 7-14 दिनों के लिए पीडीओ को तब तक संस्कृति करें जब तक कि आवश्यक घनत्व और आकृति विज्ञान न हो।

4. एकल सेल पाचन के साथ subculturing

नोट:: निम्न चरणों का उद्देश्य प्रति गुंबद PDOs की संख्या को बढ़ाने के लिए है। एकल सेल पाचन सेल संख्या नियंत्रण और पीडीओ विस्तार की सुविधा प्रदान करता है।

  1. 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए और 20 μL DNase I (तीन गुंबदों के पाचन के लिए) के 2 मिलीलीटर मिश्रण द्वारा पाचन माध्यम तैयार करें।
  2. पूर्व-गर्म 0.25% ट्रिप्सिन-EDTA + DNase I की एक उपयुक्त मात्रा के साथ चरण 2.11 से गोली को फिर से निलंबित करें और 1,000 μL पिपेट का उपयोग करके ऊपर और नीचे पाइपिंग करके इसे लगभग 10 बार मिलाएं (सामान्य 1,000 μL युक्तियों का उपयोग करें)।
  3. एक न्यूनतम 28 आरपीएम की रोटेशन गति के साथ एक घूर्णन इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. सोयाबीन ट्रिप्सिन इनहिबिटर (एसटीआई, टेबल 2) समाधान (0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए के प्रति 2 एमएल) के 6 एमएल युक्त एक 15 एमएल ट्यूब तैयार करें।
  5. पाचन के बाद, पीडीओ को बाधित करने के लिए 1,000 μL पिपेट के साथ कुछ बार पचे हुए पीडीओ को अच्छी तरह से मिलाएं।
  6. पाचन प्रक्रिया को रोकने के लिए एसटीआई समाधान युक्त 15 एमएल ट्यूब में पचे हुए पीडीओ को स्थानांतरित करें।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिनट के लिए 500 x g पर सेंट्रीफ्यूज। एक वैक्यूम पंप या एक 1,000 μL पिपेट का उपयोग करके supernatant को ध्यान से छोड़ दें। बेसल माध्यम के 1 मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें (तालिका 3)।
  8. एक स्वचालित सेल काउंटर या हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके सेल एकाग्रता और व्यवहार्यता निर्धारित करें।
  9. बीज पीडीओ को 12-अच्छी तरह से प्लेट में पचाता है जिसमें प्रति गुंबद 2 x 104 कोशिकाएं होती हैं।
    1. सीडिंग के लिए नियोजित गुंबदों के अनुसार सेल संख्या की गणना करें और उन्हें एक ताजा 1.5 मिलीलीटर कम बाइंड ट्यूब में स्थानांतरित करें।
      नोट:: एक गुंबद अधिक के लिए परिकलित करें (+ 2 x 104 कक्ष अतिरिक्त). उदाहरण के लिए, एक अच्छी तरह से तीन गुंबदों को सीडिंग करने के लिए, 8 x 104 (2 x 104 * 3 + 2 x 104 अतिरिक्त) कोशिकाएं लें।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिनट के लिए 500 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
    3. यदि कोई दिखाई देने वाला गोली नहीं है, तो यह जानने के लिए सेंट्रीफ्यूज के अंदर ट्यूब के अभिविन्यास को याद रखें कि गोली कहां स्थित है।
    4. ध्यान से एक 1,000 μL पिपेट का उपयोग कर supernatant त्याग. गोली को परेशान किए बिना जितना संभव हो सके supernatant को हटा दें।
    5. एक 1,000 μL पिपेट का उपयोग करके गोली के लिए ईसीएम जेल की उचित मात्रा जोड़ें, जिसमें पूर्व-ठंडा 1,000 μL चौड़ा छिद्र टिप (50 μL / गुंबद + 50 μL अतिरिक्त) है।
    6. चरण 3.3-3.7 का पालन करें।

5. पचा और पचा नहीं पीडीओ के क्रायोप्रिजर्वेशन

नोट: एकल सेल पचाया और undigested PDOs जमे हुए बैकअप शेयरों की तैयारी के लिए उपयुक्त हैं। ध्यान दें कि एकल सेल जमे हुए स्टॉक से फिर से खेती किए गए पीडीओ को पुनर्प्राप्त करने और एक निश्चित आकार तक पहुंचने के लिए लंबे समय की आवश्यकता होती है।

  1. अपाच्य पीडीओ का क्रायोप्रिजर्वेशन।
    1. चरण 2.8 से गोली के साथ क्रायोप्रिजर्वेशन प्रक्रिया शुरू करें। गोली को फिर से निलंबित करने और इसे क्रायोजेनिक शीशी में स्थानांतरित करने के लिए ठंडे ठंड माध्यम के 500 μL का उपयोग करें।
      नोट: प्रति शीशी दो गुंबदों को स्टोर करें।
    2. एक उपयुक्त सेल फ्रीजिंग कंटेनर का उपयोग करके -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रात भर पीडीओ को फ्रीज करें।
  2. एकल कोशिका का क्रायोप्रिजर्वेशन पीडीओ को पचाता है
    1. पीडीओ की कटाई और पचाने के बाद, चरण 4.8 से क्रायोप्रिजर्वेशन शुरू करें।
    2. एक क्रायोजेनिक शीशी को संग्रहीत करने के लिए, 4-5 x 105 कोशिकाओं को एक ताजा 1.5 एमएल कम बाइंड ट्यूब में स्थानांतरित करें।
      नोट: तीन गुंबदों / शीशी स्टोर करें।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिनट के लिए 500 x g पर सेंट्रीफ्यूज। एक 1,000 μL पिपेट का उपयोग करके supernatant को सावधानीपूर्वक छोड़ दें। गोली को परेशान किए बिना जितना संभव हो सके supernatant को हटा दें।
    4. ठंड माध्यम (500 μL / शीशी) की एक उचित मात्रा में गोली को फिर से निलंबित करें और इसे क्रायोजेनिक शीशी में स्थानांतरित करें।
    5. एक उपयुक्त सेल फ्रीजिंग कंटेनर का उपयोग करके -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रातभर पीडीओ को फ्रीज करें और उन्हें दीर्घकालिक भंडारण के लिए -150 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर या तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित करें।

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Representative Results

यह प्रोटोकॉल उपसंस्कृति और एकल सेल पाचन के साथ और बिना ईएसी पीडीओ के क्रायोप्रिजर्वेशन सहित प्रक्रियाओं को प्रस्तुत करता है।

चित्रा 1 दो अलग-अलग उपसंस्कृति रणनीतियों के प्रतिनिधि चरण-विपरीत चित्रों को दिखाता है। EAC PDOs subculturing के लिए उपयुक्त घनत्व तक पहुंच गया (चित्रा 1, बाएं)। एकल सेल पाचन के बिना उप-खेती को तुलनीय घनत्व तक पहुंचने में कम समय लगता है और मुख्य रूप से कॉम्पैक्ट संरचनाओं (चित्रा 1, शीर्ष पंक्ति) की ओर जाता है। इसके विपरीत, एकल सेल पचाए गए पीडीओ एक खोखले कोर (चित्रा 1, निचली पंक्ति) के साथ खोखले संरचनाओं को दिखाते हैं। चित्रा 2 हेमेटोक्सिलिन-ईओसिन (एच एंड ई) धुंधला और इम्युनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) को कॉम्पैक्ट और खोखले संरचनाओं के साथ पैराफिन-एम्बेडेड ईएसी पीडीओ के धुंधला दिखाता है। पैन-साइटोकेराटिन (पैन-सीके) उपकला ट्यूमर कोशिकाओं की पहचान करने में सक्षम बनाताहै। साइटोकेराटिन 7 (सीके 7) ग्रंथियों के विभेदित ट्यूमर कोशिकाओं19 पर प्रकाश डालता है। कॉम्पैक्ट संरचना (शीर्ष पंक्ति) मुख्य रूप से अपाच्य संस्कृति में मौजूद है, जबकि खोखली संरचना (नीचे की पंक्ति) उस संस्कृति में प्रमुख है जो एकल कोशिका पाचन से गुजरती है।

चित्रा 3 कॉम्पैक्ट संरचना और खोखले संरचना के साथ युग्मित ईएसी ऊतक और पीडीओ के इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएचसी) धुंधला दिखाता है। Ki67 उच्च सेलुलर प्रसार20 के साथ सेल आबादी पर प्रकाश डाला गया है। Ki67 (लाल) और पैन-सीके (हरा) इसी तरह ईएसी प्राथमिक ऊतक, ईएसी पीडीओ कॉम्पैक्ट संरचना और ईएसी पीडीओ खोखले संरचना के बीच वितरित किए गए थे। चित्रा 4 एकल सेल-आधारित क्रायोप्रिजर्वेशन (बाएं) और अपाच्य पीडीओ-आधारित क्रायोप्रिजर्वेशन (दाएं) के साथ जमे हुए स्टॉक से वसूली के पहले दिन ईएसी पीडो की रूपात्मक विशेषताओं को दर्शाता है।

चित्रा 5 एकल सेल पाचन के साथ और बिना ईएसी पीडो की उपसंस्कृति प्रक्रिया के एक प्रवाह चार्ट को सारांशित करता है। संक्षेप में, एक अच्छी तरह से बढ़ते ईएसी पीडीओ पारित होने के लिए तैयार है। EAC PDOs काटा और गोली मार दी गई थी। एकल सेल पाचन के लिए, पीडीओ को एकल कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए 5-10 मिनट के लिए एंजाइमेटिक रूप से पचाया गया था, जो खोखले संरचनाओं में बढ़ने की संभावना थी जो सेल नंबर नियंत्रण, समान घनत्व और आकार ट्रैकिंग की आवश्यकता वाले प्रयोगों की सुविधा प्रदान करते थे। अपाच्य उपसंस्कृति के लिए, पीडीओ को एंजाइमेटिक रूप से बाधित किए बिना अधिक बढ़ती जगह हासिल करने के लिए विभाजित किया गया था, जो कॉम्पैक्ट संरचनाओं में बढ़ने की संभावना थी जो हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण, त्वरित विस्तार और क्रायोप्रिजर्वेशन से तेजी से वसूली की सुविधा प्रदान करते थे।

Figure 1
चित्रा 1: ईएसी पीडो की रूपात्मक विशेषताएं एक चरण-विपरीत माइक्रोस्कोप के तहत एकल सेल पाचन के साथ और बिना उपसंस्कृति उपसंस्कृति। EAC PDOs उपसंस्कृति (बाएं) से पहले एक निश्चित घनत्व तक बढ़ते हैं। एकल सेल पाचन के बिना ईएसी पीडीओ को उप-विकसित करने पर, पीडीओ धीरे-धीरे खोखले संरचनाओं से कॉम्पैक्ट संरचनाओं (दाएं, शीर्ष पंक्ति) में बढ़ते हैं, जबकि एकल कोशिकाओं से उगाए गए पीडीओ मुख्य रूप से खोखले संरचनाओं (दाएं, नीचे की पंक्ति) दिखाते हैं। चित्रों को 5x उद्देश्य का उपयोग करके उल्टे प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ लिया गया था। स्केल बार: 100 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: ईएसी पीडो की कॉम्पैक्ट संरचना और खोखली संरचना की हिस्टोलॉजिकल विशेषताएं। एच एंड ई धुंधला (बाएं), पैन-सीके धुंधला (मध्य), और कॉम्पैक्ट संरचना (शीर्ष पंक्ति) और खोखले संरचना (नीचे की पंक्ति) के सीके 7 धुंधला (दाएं)। चित्रों को 20x उद्देश्य का उपयोग करके उल्टे प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ लिया गया था। स्केल बार: 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: युग्मित ईएसी ऊतक और पीडीओ के इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री धुंधला। इम्युनोफ्लोरेसेंस (IF) युग्मित EAC ऊतक (शीर्ष पंक्ति), कॉम्पैक्ट संरचना (मध्य पंक्ति) और पैन-सीके (हरे), Ki67 (लाल), और DAPI (नीले) के साथ खोखले संरचना (नीचे की पंक्ति) के धुंधला। चित्रों को 20x उद्देश्य का उपयोग करके उल्टे स्वचालित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ लिया गया था। स्केल बार: 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: जमे हुए स्टॉक से वसूली के पहले दिन ईएसी पीडीओ की रूपात्मक विशेषताएं। एकल सेल-आधारित क्रायोप्रिजर्वेशन (बाएं) और पचा हुआ पीडीओ-आधारित क्रायोप्रिजर्वेशन (दाएं) से पुनर्प्राप्ति के चरण-विपरीत चित्र वसूली के पहले दिन। चित्रों को 5x उद्देश्य का उपयोग करके उल्टे प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ लिया गया था। स्केल बार: 100 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 5
चित्र5: एकल सेल पाचन के साथ और बिना EAC PDOs की उपसंस्कृति प्रक्रिया का प्रवाह चार्ट। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

भंडार अंतिम एकाग्रता 50 mL
बेसल माध्यम (तालिका 3 देखें) 24 mL
WNT-3A वातानुकूलित माध्यम 12 mL
R-Spondin1 Cultrex R-Spondin कोशिकाओं से वातानुकूलित माध्यम 12 mL
N-2 100x 1x 500 μL
B-27 50x 1x 1 मिलीलीटर
एन-एसिटाइलसिस्टीन 0.5 मीटर 1 mM 100 μL
CHIR-99021 5 mM 0.5 μM 5 μL
पुनः संयोजक मानव एपिडर्मल विकास कारक (EGF) 100 μg/mL 250 ng/mL 125 μL
A83-01 25 mM 0.5 μM 1 μL
SB202190 10 mM 1 μM 5 μL
गैस्ट्रिन 100 μM 0.1 μM 50 μL
निकोटिनामाइड 1 मीटर 20 μM 1 मिलीलीटर
Gentamicin 50 mg/mL 10 μM 5 μL
पेनिसिलिन/ 100x 1x 500 μL
एम्फोटेरिसिन बी 250 μg/mL 0.60% 300 μL
अच्छी तरह से ताजा जोड़ें:
नोगिन 100 μg/mL 50 μL
Y-27632 10.5 mM 50 μL
प्राथमिक ऊतक से नए PDOs की स्थापना या जमे हुए स्टॉक से पुनर्प्राप्त करते समय जोड़ें
FGF-10a 100 μg/mL 100 ng/mL 50 μL

तालिका 1: ईएसी पीडीओ संस्कृति माध्यम की तैयारी।

सोयाबीन ट्रिप्सिन इनहिबिटर (एसटीआई) 12.5 मिलीग्राम
DPBS के साथ 50 mL करने के लिए समायोजित करें
0.2 μm बाँझ फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर

तालिका 2: सोयाबीन ट्रिप्सिन इनहिबिटर (एसटीआई) समाधान की तैयारी।

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) आयतन अंतिम एकाग्रता
उन्नत DMEM/ 48.2 मिलीलीटर
HEPES (1 मीटर) 500 μL 10 mM
एल-ग्लूटामाइन (100X) 500 μL 1X
पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (100X) 500 μL 1X
एम्फोटेरिसिन बी 300 μL 0.60%
Gentamicin (50 mg/mL) 5 μL 5 μg/mL

तालिका 3: बेसल माध्यम की तैयारी।

एकल कोशिका पाचन
पेशेवरों विपक्ष
कक्ष संख्या नियंत्रण एम्बेडिंग के दौरान नाजुक
व्यवहार्यता जाँच मार्गों के बीच लंबे समय की आवश्यकता होती है
उदाहरण के लिए लागू, ड्रग स्क्रीनिंग, फ्लो साइटोमेट्री जमे हुए स्टॉक से लंबे समय तक वसूली का समय
एकल कोशिका पाचन के बिना
पेशेवरों विपक्ष
हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए आकृति विज्ञान फायदेमंद है संख्या की तुलना में आकार में अधिक पीडीओ का विस्तार
एम्बेडिंग प्रक्रिया में उच्च स्थिरता विश्लेषण के लिए लागू नहीं है जहां एकल सेल निलंबन अनिवार्य है
जमे हुए शेयरों से त्वरित वसूली सेल नंबर नियंत्रण और आकार ट्रैकिंग की कमी

तालिका 4: एकल सेल पाचन के साथ और बिना ईएसी पीडीओ को उप-संस्कृति के लिए पेशेवरों और विपक्षों।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में, ईएसी पीडीओ के दो अलग-अलग उपसंस्कृति और क्रायोप्रिजर्वेशन विधियों का वर्णन किया गया है, यानी, एकल सेल पाचन के साथ और बिना। कई अध्ययनों ने एकल सेल पाचन15,17 के साथ ईएसी पीडो को पास करने की सिफारिश की, जो अधिकांश प्रयोगों के लिए फायदेमंद है जिसमें सेल नंबर नियंत्रण, समान घनत्व और एक खोखली संरचना की आवश्यकता होती है जो आकार ट्रैकिंग की सुविधा प्रदान करती है। हालांकि, एकल सेल-आधारित विधि को जमे हुए स्टॉक से पुनर्विकसिति और संस्कृति अवधि के दौरान कम कॉम्पैक्ट आकृति विज्ञान से पुनर्विकसिति के बाद धीमी वृद्धि की विशेषता है। अनुभव उपसंस्कृति प्रक्रिया के लिए लागू घनत्व तक पहुंचने के लिए एकल सेल-आधारित recultivation के लिए 2-3 सप्ताह इंगित करता है। इसके विपरीत, एकल सेल पाचन के बिना जमे हुए ईएसी पीडीओ एक छोटी अवधि (लगभग 1 सप्ताह) में एक ही आकार तक पहुंच सकते हैं। एक कारण अपेक्षाकृत लंबे समय (10 मिनट) के लिए ट्रिप्सिन पाचन से अतिरिक्त तनाव हो सकता है। इसलिए, 1: 1.5 के अनुपात में बिना पचे हुए ईएसी पीडीओ को संरक्षित करने की सिफारिश की जाती है (अपाच ईएसी पीडीओ के दो गुंबदों को फ्रीज करना और पुनर्विकसिति के लिए तीन गुंबदों में वापस सीडिंग करना)। इसके अलावा, पचाए गए ईएसी पीडीओ का उपयोग करने की सिफारिश कॉम्पैक्ट संरचना के कारण आईएचसी या आईएफ स्टेनिंग द्वारा त्वरित विस्तार और हिस्टोलॉजिकल लक्षण वर्णन के लिए की जाती है। दो उपसंस्कृति विधियों के पेशेवरों और विपक्षों को तालिका 4 में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है।

इस प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण चरणों पर ध्यान देने की आवश्यकता है। सबसे पहले, पीडीओ संस्कृति के लिए प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रात भर पहले से गर्म करने की आवश्यकता होती है ताकि ताजा बीज वाले ईसीएम जेल गुंबदों की ठोस प्रक्रिया सुनिश्चित की जा सके। विस्तारित सीडिंग अवधि से निपटने के दौरान प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर रखने के लिए एक गर्म प्लेट का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। दूसरे, महत्वपूर्ण पीडीओ हानि से बचने के लिए उपसंस्कृति प्रक्रिया के दौरान कम बाइंड ट्यूबों की आवश्यकता होती है। ईसीएम जेल हानि को रोकने के लिए, एक व्यापक बोर उद्घाटन के साथ युक्तियों को उपयोग से पहले -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में पूर्व-ठंडा किया जा सकता है। यहां, युक्तियों का व्यापक उद्घाटन कटाई चरण के दौरान पीडीओ संरचनाओं के नुकसान से बचा जाता है। इसके बाद, ईसीएम जेल के पूर्ण तरलीकरण को सुनिश्चित करने के लिए, पहले सेंट्रीफ्यूजेशन चरण से पहले बर्फ पर 20 मिनट के लिए पीडीओ को इनक्यूबेट करने की सिफारिश की जाती है। ध्यान दें कि सेंट्रीफ्यूज को तरल अवस्था में अवशिष्ट ईसीएम जेल रखने के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन चरणों के दौरान 4 डिग्री सेल्सियस पर सेट करने की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, एकल-सेल विधि के लिए, ट्रिप्सिन के बाद पीडीओ को अच्छी तरह से मिश्रण करने की सिफारिश की जाती है इनक्यूबेशन एसटीआई जोड़ने से पहले सेल क्लंप को तोड़ने के लिए एक सामान्य 1,000 μL टिप का उपयोग करके, सेल के नुकसान से बचने के लिए सेल स्ट्रेनर्स के साथ सेल निलंबन को सीधे फ़िल्टर करने के बजाय।

इस प्रोटोकॉल में कुछ संशोधन किए जा सकते हैं। सेल वसूली समाधान को कटाई चरण में ईसीएम जेल को भंग करने के लिए बर्फ-ठंडे डीपीबीएस द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है। हालांकि, अनुभवों ने सेल रिकवरी समाधान का उपयोग करके ईसीएम जेल को भंग करने की बेहतर क्षमता दिखाई। इसलिए, बर्फ-ठंडा DPBS बल्कि केवल एक वैकल्पिक बैकअप विधि के रूप में अनुशंसित है। यदि प्रयोगशाला एक घूर्णन इनक्यूबेटर से सुसज्जित नहीं है, तो ईएसी पीडो को 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में ट्रिप्सिन के साथ इनक्यूबेट किया जा सकता है, साथ ही हर 2-3 मिनट में ट्यूब को उलटकर मिश्रण किया जा सकता है। भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के साथ 10% डीएमएसओ का उपयोग जमे हुए पीडीओ स्टॉक तैयार करने के लिए ठंड माध्यम के विकल्प के रूप में किया जा सकता है। हालांकि, कम या कोई सीरम के साथ एक वाणिज्यिक ठंड माध्यम एक बेहतर पीडीओ वसूली के कारण पसंद किया जाता है।

इस प्रोटोकॉल में कुछ सीमाओं को संबोधित करने की आवश्यकता है। चूंकि इन विधियों का परीक्षण केवल ईएसी पीडीओ में किया गया है, इसलिए अन्य प्रकार के पीडीओ के लिए इस प्रोटोकॉल का आवेदन स्पष्ट नहीं है। यद्यपि एकल सेल पाचन के साथ और बिना पीडीओ को पास करने के लिए प्रक्रियाओं को अधिकांश ऑर्गेनोइडप्रकारों 21,22 के लिए मानकीकृत किया जाता है, फिर भी पुनरुत्पादन सुनिश्चित करने के लिए अन्य कैंसर प्रकारों पर वर्तमान प्रोटोकॉल का प्रयास करने की आवश्यकता है। इसके अलावा, एक 10 मिनट 0.25% ट्रिप्सिन इनक्यूबेशन पाचन के दौरान कोशिकाओं को तनाव दे सकता है; इसलिए, इनक्यूबेशन समय पूर्व-उपसंस्कृति पीडीओ स्थिति और व्यक्तिगत पीडीओ विविधता के आधार पर भिन्न हो सकता है। शुरुआती प्रयासों के दौरान, प्रत्येक ईएसी पीडीओ के लिए अलग-अलग ट्रिप्सिन इनक्यूबेशन बार सेट करने का सुझाव दिया जाता है।

अंत में, यह पहला प्रोटोकॉल है जो एकल सेल पाचन के साथ और बिना ईएसी पीडीओ के उपसंस्कृति और क्रायोप्रिजर्वेशन का वर्णन और चर्चा करता है। एकल सेल पाचन के साथ EAC PDOs subculturing समूहों के बीच तुलना प्रयोगों के लिए लागू होता है, जबकि undigested EAC PDOs हिस्टोलॉजिकल लक्षण वर्णन, क्रायोप्रिजर्वेशन और त्वरित विस्तार के लिए फायदेमंद होते हैं। यहां, ईएसी पीडो के नियमित रखरखाव को मानकीकृत किया गया है, जो शोधकर्ताओं को ईएसी ऑर्गेनोइड पीढ़ी के लिए उपयुक्त तरीकों को चुनने के लिए एक गाइड प्रदान करता है।

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Disclosures

लेखकों ने इस काम में हितों के किसी भी संघर्ष की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस काम को कोलन फॉर्च्यून प्रोग्राम / चिकित्सा के संकाय, कोलोन विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था। हम सुसान Neiss, Michaela Heitmann, और Anke Wienand-Dorweiler से तकनीकी सहायता का धन्यवाद करते हैं। Ningbo फैन को गुआंगज़ौ एलीट छात्रवृत्ति परिषद (GESC) द्वारा वित्तीय रूप से समर्थित किया गया था। लेखकों ने भाषाई संपादन में उनकी सहायता के लिए डॉ जोशुआ डी'रोजारियो को धन्यवाद दिया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
-20°C Freezer Bosch Economic
-80°C Freezer Panasonic MDF DU500VH-PE
Automated Cell counter Thermo Fisher AMQAX1000 Countess II
Biological Safety Cabinet Class II Thermo Scientific 51022482 Herasafe KS12
Centrifuge Heraeus 75003060 Megafuge 1.0R
CO2 Incubator Thermo Scientific 50116048 Heracell 150i
Inverted automated fluorescence microscope Olympus IX83
Inverted light microscope Leica DMIL LED Fluo
Pipette 1000 µL Eppendorf 3123000063 Research Plus
Pipette 200 µL Eppendorf 3123000039 Research Plus
Rotating Incubator Scientific Industries, sc. SI-1200 Enviro-genie
Shaker Eppendorf 5355 000.011 Thermomixer Comfort
Vacuum pump Vacuubrand 20727200 BVC control
Waterbath Medingen p2725 W22
Material
15 mL tube Sarstedt 62.554.502 Inc Screw cap tube PP 15 mL
Cryo vial 2 mL Sarstedt 72.379 CryoPure 2.0 mL tube
Low bind tube 1.5 mL Sarstedt 72.706.600 Micro tube 1.5 mL protein LB
Low bind tube 5 mL Eppendorf 0030 108.302 Protein LoBind Tube 5.0 mL
Pipette tip 200 µL Starlab E1011-8000 200 µL Graduated tip, wide orifice
Pipette tip 1000 µL Starlab E1011-9000 1000 µL Graduated tip, wide orifice
Pipette tip 1000 µL Sarstedt 70.3050 Pipette tip 1000 µL
Sterile filter 0.2 µm Sarstedt 83.1826.001 Filtropur 0.2 µm sterile filter
Tissue culture plate Sarstedt 83.3921 12 well-plate
Reagent/Chemical
A83-01 Tocris 2939
Advanced DMEM/F-12 Thermo Fisher Scientific 12634010
Amphotericin B Thermo Fisher Scientific 15290026
B-27 Thermo Fisher Scientific 17504001
Cell Recovery Solution Corning 354253
CHIR-99021 MedChemExpress HY-10182/CS-0181
DNase I grade II, from bovine pancreas Sigma-Aldrich 10104159001
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Thermo Fisher Scientific 14190094
Extracellular matrix (ECM) gel: Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix Corning 356231
FGF-10a Peprotech 100-26-100
Freezing medium: Recovery Cell Freezing Medium Thermo Fisher Scientific 12648010
Gastrin Sigma G9020
Gentamicin-25 (25 mg/ 500 µL) PromoCell C-36030
HEPES (1 M) Thermo Fisher Scientific 15630080
L-Glutamine 200 mM (100X) Thermo Fisher Scientific 25030024
N-2 Thermo Fisher Scientific 17502-048
N-Acetylcysteine Sigma A9165
Nicotinamide Sigma N0636-100
Noggin Peprotech 120-10C-50
Penicillin-Streptomycin 10,000 U/ mL (100X) Thermo Fisher Scientific 15140122
Recombinant human epidermal growth factor (EGF) Peprotech AF-100-15
R-Spondin1 conditioned medium from Cultrex R-Spondin Cells Biotechne 3710-001-01
SB202190 MedChemExpress 152121-30-7
Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) Sigma-Aldrich 93620-1G
Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red Thermo Fisher Scientific 25200056
Wnt-3A conditioned medium Wnt-3A expressing cell line was kindly provided by Prof. Hans Clevers' group
Y-27632 Sigma Y0503

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक 185
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Fan, N., Raatz, L., Chon, S. H.,… More

Fan, N., Raatz, L., Chon, S. H., Quaas, A., Bruns, C., Zhao, Y. Subculture and Cryopreservation of Esophageal Adenocarcinoma Organoids: Pros and Cons for Single Cell Digestion. J. Vis. Exp. (185), e63281, doi:10.3791/63281 (2022).

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