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Neuroscience

마우스 중추 신경계의 조직학적 분석을 위한 중력 공급 심질 관류 방법

Published: January 21, 2022 doi: 10.3791/63386
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, State University of New York Upstate Medical University, 2Department of Neurology, State University of New York Upstate Medical University, 3Department of Neuroscience and Physiology, State University of New York Upstate Medical University

Summary

마우스 중추 신경계의 조직학적 분석을 위한 편리한 중력 공급 관류 방법이 제시된다. 인산화된 α시누클레인의 면역형광 검출은 파킨슨병의 마우스 모델에서 입증된다. 이 연구는 또한 심질 관류, 해부, 조직 동결 / 임베딩 및 냉동 절개 단계를 포괄적으로 설명합니다.

Abstract

마우스에서 분리 된 뇌 및 척수 표본의 조직 학적 분석은이 모델 시스템에서 병리학 평가를위한 일반적인 관행입니다. 이러한 섬세한 조직의 형태를 유지하기 위해, 마취된 동물에서 심장의 캐뉼레이션(transcardial perfusion)을 통해 파라포름알데히드와 같은 화학적 고정제를 투여하는 것이 일상적이다. 마우스 심장의 심막 관류는 전통적으로 연동 펌프 또는 공기 압력의 사용에이 과정에 필요한 식염수 및 고정 솔루션을 모두 제공하는 데 의존해 왔습니다. 이러한 방법에 쉽게 접근 할 수있는 대안으로,이 작업은 대부분의 하드웨어 상점에서 사용할 수있는 재료를 사용하는 향수 전달의 중력 공급 방법의 사용을 보여줍니다.

이 새로운 관류 방법을 검증하기 위해이 연구는 뇌와 척수 모두에서 인산화 된 α 시누클레인의 민감한 검출에 필요한 모든 후속 단계를 보여줍니다. 이 단계에는 고정 된 뇌 및 척수 조직의 해부, 조직의 신속한 동결 / 임베딩 및 냉동 절제, 면역 형광 염색이 포함됩니다. 이 방법은 고정제의 전신 전달을 초래하기 때문에, 조직학적 분석을 위해 다른 비신경 조직을 제조하는데 사용될 수도 있다.

Introduction

마우스 중추 신경계 (CNS)에서 병리학의 조직 학적 특성화는 신경 퇴행 연구에 사용되는 일상적인 기술입니다. 신경 조직이 사망 후 급속히 분해됨에 따라, 파라포름알데히드와 같은 화학적 고정제를 CNS 조직에 전달하여 형태 1,2를 보존하는 것이 일반적입니다. 화학적 고정은 고정 용액과의 전신 관류를 통해 또는 조직의 분리 및 고정 용액 ( "드롭 고정"이라고 함)에 침지함으로써 수행 될 수 있습니다. 관류는 낙하 고정이 깊은 CNS 구조물 3,4,5 내로의 고정 용액의 신속한 침투를 허용하지 않을 수 있기 때문에 고정 전달의 바람직한 방법이다. 또한, 척추 기둥으로부터 고정되지 않은 척수를 제거하는 것이 어렵기 때문에, 관류를 통한 고정 용액의 전달은 척수 현미경 및 총체적 해부학의 현장 보존을 허용하고 조직을 경직시켜 제거 시 손상을 최소화한다.

고정에 필요한 버퍼 및 고정 용액의 전달은 일반적으로 상업적으로 이용 가능한 펌프 또는 공기 압력을 사용하여 수행됩니다. 퍼퓨세이트의 중력 전달은 다음과 같은 이유로 펌프 전달에 대한 대안으로서 작용할 수 있다: (1) 펌프 또는 공기 압력 전달은 경우에 따라 사용자가 관류 전반에 걸쳐 시스템 내의 압력을 수동으로 유지하도록 요구할 수 있다. 방향제의 중력 전달은 사용자의 개입 없이 유지될 수 있다. (2) 중력 전달 향수 장치는 표준 과학 공급 업체로부터 사용 가능한 재료를 얻음으로써 사용자에게 저렴한 비용으로 구축 할 수 있습니다. 이 작업은 세척 병과 비닐 튜브를 사용하여 간단한 중력 관류 장치를 구성하는 방법을 설명합니다. 파킨슨 병의 마우스 모델을 사용하여,이 연구는 냉동 절편을 위해 분리하기 전에 뇌와 척수 조직을 관류하는이 시스템의 효능을 보여줍니다. 이 연구는 동물에서 고정 된 조직을 해부하고, 조직을 신속하게 동결 / 내장 및 냉동 절제하고, 간접 면역 형광 현미경을 통해 뇌와 척수 모두에서 인산화 된 α 시누클레인의 존재를 감지하는 데 필요한 모든 단계, 기술 및 물질을 종합적으로 설명합니다.

Protocol

이 프로토콜에 제시된 데이터 및 실험 단계는 C57BL/6J 마우스를 사용하여 생성되었다. 동물과 관련된 모든 방법은 뉴욕 주립 대학 Upstate Medical University Institutional Animal Care and Use Committee의 승인을 받았습니다.

1. 관류장치 및 해부플랫폼 구축

  1. 그림 1에서 볼 수 있듯이, 두 개의 500mL 세척병에서 날카로운 면도날로 이 플러시를 스크류 온 캡의 안쪽으로 절단하여 내부 빨대를 다듬습니다. 각 버퍼 병의 바닥에 4cm x 4cm 사각형 구멍을 자릅니다. 구부러진 스테인레스 스틸 미세 주걱을 통과 할 수 있도록 각 병의 바닥에 작은 구멍을 자릅니다.
  2. 미세 주걱에 "S"모양의 굴곡을 만들어 버퍼 병을 매달기위한 후크로 사용할 수 있도록하십시오. 구부러진 미세 주걱을 완충 병의 적절한 구멍에 넣으십시오.
  3. 25cm 길이의 튜브 두 개를 자르고 외부 병 짚 배출구와 단단히 연결하십시오. 이 튜브의 끝을 Y 커넥터와 함께 결합하십시오. 2m의 튜빙을 자르고 Y 커넥터의 자유 끝에 결합하십시오.
  4. 1 mL 주사기에서 플런저를 제거하고 주사기를 주사기 팁으로부터 약 6 cm 떨어진 곳에 절단하였다. 먼저 면도날로 플라스틱을 채점한 다음 주사기 플라스틱을 날카롭게 스냅하여 주사기를 자릅니다.
  5. 주사기의 절단면을 플라스틱 튜브의 자유 끝에 삽입하십시오. 밀봉을 단단히 밀봉할 수 있도록 충분한 깊이로 삽입하십시오.
    참고: 관류 장치 내의 모든 연결부는 누출을 피하기 위해 충분히 단단해야 합니다. 느슨한 연결의 경우, 필요한 경우 단단한 씰을 보장하기 위해 작은 스테인레스 스틸 호스 클램프를 원하는 대로 접합부에 배치하고 조일 수 있습니다.
  6. 하나의 버퍼 병을 PFA 로, 한 병을 PBS (버퍼)로 라벨링하십시오. 병 개구부에서 길이의 약 1/3분 의 1을 측정하고이 시점에서 병 둘레 주위에 선을 그려 향수 용액의 적절한 충전 수준을 나타냅니다.
  7. 곧게 펴고 튜브의 둘레 주위에 들어갈 수 있는 큰 종이 클립에 루프를 만듭니다. 이 루프를 주사기에 바로 근접한 튜브 주위에 놓습니다.
  8. 적절한 크기의 스티로폼 블록을 유리 트레이에 넣으십시오. 종이 클립의 끝을 스티로폼 블록에 넣어 튜브를 부착합니다.
  9. 종이 타월을 사용하여 유리 트레이의 앞쪽 끝을 약 2cm 정도 올립니다.
    참고: 이렇게 하면 마우스를 Trendelenburg 위치(뒤로 기울기)의 약 20°에 배치하여 해부 중 다이어프램을 보다 쉽게 시각화하고 관류 중 유체의 배수를 촉진합니다.

Figure 1
도 1: 조립된 관류 장치를 묘사한 도면. 약어: PBS = 포스페이트-완충 식염수; PFA = 파라포름알데히드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 파라포름알데히드(PFA) 용액의 제조

참고: PFA 용액은 관류 당일에 신선하게 준비해야 하며, 관류가 끝나면 숙련된 인력이 폐기하기 전에 지정된 폐기물 용기에 버려야 합니다. 이 프로토콜은 약 4마리의 마우스를 퍼퓨즈하기에 충분한 4% PFA 용액 1L를 만든다. PFA는 독성이 강하므로 분말 또는 액체 형태로 흡입이나 직접적인 피부 접촉을 피하기 위해주의를 기울여야합니다. 따라서 대부분의 준비 단계는 장갑, 프로텍토브 고글 및 흄 후드 아래의 실험실 코트를 착용하는 동안 수행됩니다.

  1. 증류수를 사용하여 1L 비커를 헹구고 약 800mL의 18mΩ 분자 생물학 등급H2O로 채웁니다.
  2. H2O의 비이커를 마이크로파에서 3분 동안 또는 수온이 65°C에 도달할 때까지 가열한다. 흄 후드에 보관 된 가열 / 교반 플레이트 위에 놓습니다.
  3. 교반 막대를 증류수로 헹구고 뜨거운 물에 넣으십시오. 교반기를 시작하고 핫 플레이트를 중간 열까지 돌립니다. 수온이 70 °C를 초과하지 않도록하십시오.
  4. 수술용 마스크, 장갑, 보호 고글 및 실험실 코트를 착용하고 PFA 분말 40g을 측정하십시오. 이 분말을 가열 된 물에 붓습니다.
  5. 전사 피펫을 사용하여 용액에 5M NaOH 몇 방울을 첨가하십시오. PFA 분말이 완전히 용해되도록 하십시오. 몇 분 후에 분말이 완전히 용해되지 않으면 필요에 따라 5M NaOH 방울을 첨가하십시오.
  6. 거의 모든 PFA가 용해되면 (약간 혼탁하게 보일 것입니다), 교반 / 가열을 중단하고 즉시 10x 인산염 완충 식염수 (PBS) 100 mL를 첨가하십시오. 마지막으로, 18 mΩ 분자 생물학 등급H2O. 비커를 플라스틱 랩으로 덮고 용액이 실온 (약 45 분)에 도달 할 때까지 -20 °C 냉동고에 놓습니다.
  7. 적절한 표준을 사용하여 pH 측정기를 교정하십시오. 비커가 교반 플레이트 상에 있는 동안, 용액의 pH를 측정하고 pH가 7.4에 도달할 때까지 HCl을 첨가한다. 필요한 경우 5 M NaOH를 첨가하여 pH가 너무 낮 으면 pH를 증가시킵니다.
  8. 진공 플라스크를 진공에 연결하고 플라스크에 여과지가 있는 깨끗한 세라믹 Büchner 깔때기를 놓습니다. 진공을 켜고 4% PFA 용액으로 채워진 전사 피펫을 사용하여 여과지를 적시다.
  9. 모든 용액이 여과될 때까지 4% PFA 용액을 여과지에 천천히 붓는다.
  10. 여과 된 용액을 깨끗하고 빛 보호 된 용기로 옮기고 사용 전까지 4 °C에서 보관하십시오 (24 시간 이상 보관하지 마십시오).

3. 심질 "펌프 프리"관류

  1. 흄 후드에 스티로폼 해부 블록을 유리 트레이에 놓습니다. 해부 블록에 수술 중 마우스를 제지하기위한 5-6 개의 짧은 바늘과 관류 튜브를지지하기위한 2 개의 긴 바늘이 있는지 확인하십시오.
  2. 관류 장치를 증류수를 사용하여 헹구십시오. 관류 장치를 매달기 전에 모든 물이 배수되도록 허용하십시오. 관류 병을 관류 된 동물 (20-30g 마우스의 경우) 1m 위에 걸어 놓습니다.
  3. 18 mΩ 분자 생물학 등급H2O로 희석된 10x PBS를 사용하여 1x PBS의 비멸균 용액을 제조하였다.
  4. 도 2에 도시된 바와 같이, 지혈제를 이용하여 관류 장치의 메인 라인을 클램프한다. PFA 라인을 다른 지혈제로 고정하십시오.
    참고 : 흐름을 완전히 방지하기 위해 여러 지혈구가있는 폐색이 라인 당 필요할 수 있습니다.
  5. 버퍼 용기를 실온에서 1x PBS로 채운다.
  6. 관류 장치의 주사기 단부를 비이커에 넣어 폐기물 버퍼를 모으고 본선을 폐색시키는 지혈제를 제거한다(그림 2, 왼쪽).
  7. PBS가 튜브의 벽을 격렬하게 두드리면서 갇힌 공기를 제거하면서 라인을 통해 흐르도록하십시오.
  8. 버퍼와 메인 라인에서 모든 공기가 제거되면 메인 라인에 지혈제를 배치하여 흐름을 막으십시오.
  9. PFA 라인에서 지혈제를 제거하고 PBS가 PFA 라인의 모든 기포를 두드리면서 PFA 병까지 역행 방식으로 흐르도록 합니다(그림 2, 중간). PBS가 병의 개구부 바로 위에서 보일 때까지 PBS를 PFA 라인 내로 계속 허용한다. PFA 병으로의 유동을 막기 위해 지혈제로 PFA 라인을 폐색시킨다.
  10. 나비 주입 바늘을 관류 주사기에 연결하고 PBS를 플러시 라인을 통해 (지혈제 메인 라인을 개방함으로써) 관류 주사기로부터 기포를 제거한다. 메인 라인 지혈제를 닫습니다.
  11. PBS 병이 이제 PBS로 가득 찬 약 1/3번째 인지 확인하십시오. 필요한 경우, 메인 라인을 통해 PBS를 플러시하거나 전체 용량의 1/3이 될 때까지 버퍼 병에 더 많은 PBS를 채웁니다.
  12. PBS, PFA 및 메인 라인에서 모든 기포가 제거되면 PFA 병을 실온에서 4% PFA 용액으로 채우고 병의 검은색 표시(약 1/3번째 전체)까지 채웁니다(그림 2, 오른쪽).

Figure 2
도 2: 관류 수술을 위한 관류 장치의 제조. 먼저 PFA 라인 지혈제를 닫고 PBS 라인과 메인 라인의 지혈제를 엽니 다. PBS를 채우고 PBS 라인 및 메인 라인에서 거품을 제거하십시오. 다음으로, PFA 라인에서 지혈제를 열고 메인 라인의 지혈제를 닫음으로써 PBS로 PFA 라인을 채 웁니다. PFA 라인에서 기포를 제거합니다. 마지막으로, PBS가 PFA 병의 개구부에 도달하면 PFA 라인의 지혈제를 닫으십시오. PFA 병의 1/3번째 PFA를 채 웁니다. PBS 병의 PBS 수준이 1/3번째 가득 찼 는지 확인하고 필요한 경우 메인 라인 지혈제를 열어 PBS로 채우거나 PBS를 배출하십시오. 약어: PBS = 포스페이트-완충 식염수; PFA = 파라포름알데히드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

  1. 다음 도구를 물로 청소하고 70 % 에탄올로 청소하여 생존 할 수 있도록 준비하십시오 : 큰 가위, 미세 해부 가위, 피부 포셉, 미세한 배상 곡선 포셉.
  2. 먼지가없는 물티슈를 50 mL 원뿔형 튜브에 넣어 마취를 준비하십시오. 흄 후드에서 먼지가없는 물티슈를 이소플루란으로 완전히 담그고 열린 튜브를 500mL 비이커에 거꾸로 놓습니다. 비이커의 바닥에 액체 이소플루란이 존재하지 않는지 확인하고 마우스를 비이커에 넣기 전에 액체 이소플루란을 버리십시오.
  3. 마우스를 비이커에 놓고 플라스틱 랩을 개구부 위에 올려 놓고 마취를 시작하십시오.
  4. 마우스가 호흡을 멈출 때까지 마취를 시행하십시오 (약 1 분 및 30 초).
  5. 호흡이 멈췄을 때, 즉시 비이커에서 마우스를 제거하고 50 mL 원뿔형 튜브의 캡을 교체하십시오.
  6. 마우스가 발가락 핀치 반사를 사용하여 충분히 마취되었는지 확인하십시오. 동물이 충분히 마취되지 않은 경우, 단계 3.15에 기재된 바와 같이 이소플루란을 추가로 투여한다.
  7. 빠르게 작동하여 마우스를 스티로폼 블록 위에 놓고 네 개의 짧은 바늘 (예 : 22G 주사기 바늘)을 사용하여 발을 바깥쪽으로 고정하십시오.
  8. 피부 포셉으로 복부 피부를 들어 올리고 큰 가위를 사용하여 복벽을 자르십시오. 복부 장기가 절단되지 않도록하십시오!
  9. 복부 절단을 간쪽으로 우월하게 계속하십시오. 전방 복벽에서 간을 분리하고 횡격막 쪽으로 우월하게 초기 절개를 계속하십시오. 이 절개를 횡격막보다 약 1cm 열등하게 멈추십시오. 간이 잘리지 않도록주의하십시오!
  10. 다이어프램의 오른쪽과 왼쪽을 향해 횡방향으로 초기 절개를 계속하여 "Y"모양의 절개를 만듭니다 (그림 3A).
  11. 절개가 횡격막에 도달하면 미세한 해부 가위를 사용하여 횡격막에 구멍을 뚫고 동물의 오른쪽에있는 갈비뼈를 자르십시오. 갈비뼈를 오른쪽 겨드랑이의 절반 정도를 자릅니다.
  12. 횡격막의 왼쪽을 통해 거의 왼쪽 겨드랑이까지 비슷하지만 더 긴 절개를하십시오.
  13. 가슴 벽을 반사하고 스티로폼 블록에 고정하십시오.
  14. 필요한 경우 심장 주위의 지방을 해부하여 좌심실을 노출시킵니다. 우심실과 비교할 때 상대적으로 밝은 색을 기준으로 좌심실을 확인하십시오.
  15. 좌심실을 확인한 후 미세한 곡선 포셉으로 가벼운 압력을 사용하여 심장을 일정하게 유지하십시오. PBS가 바늘을 통해 흐를 수 있도록 메인 라인 지혈제를 엽니 다. 즉시 좌심실을 관통하고 바늘이 심실에 0.5cm 이상 삽입되지 않도록하십시오. 필요한 경우 바늘을 약간 철회하십시오.
    참고 : 좌심실에 바늘을 정확하게 배치하는 것은 바늘 튜브로 혈액의 역행 흐름으로 표시됩니다. 바늘이 심실에 너무 깊이 삽입되지 않도록하는 것이 중요합니다. 이것은 폐정맥을 통한 역행 흐름을 초래하거나 심실 중격을 관통 할 수 있습니다.
  16. 두 개의 큰 18G 바늘을 사용하여 스티로폼으로 만든 X 에 나비 튜브를 놓습니다.
    참고 : 이것은 관류 중에 심장 내에서 나비 바늘의 움직임을 피하기 때문에 중요합니다.
  17. 열등한 베나 카바가 간을 빠져 나올 때 확인하고 미세한 해부 가위를 사용하여 횡단합니다 (그림 3B). 또는 가위로 오른쪽 아트리움을 엽니 다.
  18. PBS 관류가 시작될 수 있도록 메인 라인을 즉시 엽니다(그림 3C).
  19. PBS가 스티로폼 블록에서 배수되어 아래의 유리 트레이로 배출되는지 확인하십시오. 이런 일이 발생하지 않으면 트레이 또는 Styrofoak 블록의 각도를 재조정하여 유리 트레이로 유체가 배출되도록 하십시오.
  20. 열등한 정맥 카바에서 유출되는 액체가 무혈이 될 때까지 PBS 관류를 계속한다 (대략 3 분).
    참고 : 심장에 바늘을 올바르게 배치하면 간에서 혈액이 시각적으로 제거되어 빨간색에서 짚 색으로 변합니다. 이것이 발생하지 않으면 주입 바늘을 좌심실 내에 재배치하여 해결할 수 있습니다. 관류의 질을 평가하기 위해 복부 꼬리 기초에서 작은 절개를 할 수 있습니다. 적절한 관류는 꼬리 염기 절개로부터 흐르는 명확한 PBS를 초래할 것이다.
  21. 신속하게 작업하고, 지혈제로 PBS 라인을 폐색하고 PFA 라인을 엽니 다.
  22. 꼬리가 말리기 시작할 때까지 PFA가 몇 분 동안 관류되도록 허용하십시오. 꼬리가 말리기 시작하면 50 분 타이머를 시작하십시오. PFA 관류 5 분 후에 꼬리가 말리지 않으면 PFA 관류를위한 50 분 타이머를 시작하십시오.
  23. 관류 전반에 걸쳐 병의 PFA 수준을 지속적으로 모니터링하여 레벨이 너무 낮게 떨어지지 않도록하십시오. 레벨이 병 뚜껑 위로 2cm 아래로 떨어지면 병에 PFA를 더 채 웁니다.

Figure 3
그림 3: 심질 관류를 묘사한 다이어그램. (A) 복벽이 먼저 절단되고, 그 다음에 "Y"를 형성하는 겨드랑이를 향해 두 개의 측면으로 향하는 절개가 뒤따른다. (B) 흉강에 들어가서 심장을 노출시킨 후, 바늘을 좌심실로 전달한다. 다음으로, IVC 또는 우심방이 횡단되어 향수가 신체를 통해 순환 된 후에 향수를 배출 할 수 있습니다. IVC는 다이어프램보다 우월하게 절단됩니다. (C) 향수의 투여 절차. 약어 = IVC = 열등한 베나 카바. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

  1. 50 분이 경과 한 후, 지혈제로 메인 라인을 폐색하고 좌심실에서 바늘을 뽑으십시오.
    참고: 전체 마우스는 이 시점에서 뻣뻣하고, 이제 4°C에서 하룻밤 사이에 4% PFA의 라벨링된 용기에 넣을 수 있다. 이 단계에서는 CNS 조직을 해부하고 하룻밤 사이에 개별적으로 고정시킬 수 있습니다. 이 작업에서는 4 °C에서 고정과 배치 사이의 간격이 단축되므로 전체 마우스를 고정에 배치합니다. 이것은 또한 밤새 고정이 완료되기 전에 동물을 미리 해부하는 경우 발생할 수있는 신경 조직의 기계적 왜곡을 피할 수 있습니다.

4. CNS 해부

  1. 물로 씻은 다음 70 % 에탄올로 해부를 위해 다음 도구를 준비하십시오 : 가위, 피부 포셉, 곡선 결합 포셉, 곡선 미세 포셉, 직선 미세 포셉, 미세 가위.
  2. 마우스 당 네 개의 튜브에 다음과 같이 라벨을 붙이고 멸균 20 % 수크로오스로 채 웁니다 : 마우스 ID, 뇌 1, 마우스 ID, 뇌 2, 마우스 ID, 요추, 마우스 ID, 자궁 경부.
  3. PFA 용액에서 마우스를 제거하고 종이 타월로 블롯하여 과량의 PFA를 제거하십시오.
  4. 큰 가위를 사용하여 목을 자르면 마우스 머리를 제거하십시오.
  5. 몸체를 PFA 용액에 넣으십시오. 두개골에서 뇌를 해부하기 위해 머리를 유지하십시오.
  6. 뇌를 해부하려면 두개골 피부를 앞으로 반사하여 두개골 전체를 노출시킵니다 (그림 4A).
  7. 두개골에 들어가기 위해 미세한 해부 가위를 사용하여 청각 운하로 얕게 자르십시오.
  8. 두개골이 두 청각 운하 사이의 끝까지 절단 될 때까지 횡단 부비동을 따라이 절단을 계속하십시오.
  9. 세로 균열을 따라 두개골의 가장 로스트랄 부분 (대략 눈 사이)까지 이전 컷에 수직으로 절단하십시오.
  10. 페네스티드 곡선 포셉을 사용하여 두개골을 옆으로 반사하여 전뇌를 노출시킵니다. 후각 전구를 포함한 전뇌 전체가 노출 될 때까지 두개골을 계속 제거하십시오.
  11. 후두부 뼈를 통해 절단하고 천천히 포라멘 매그넘쪽으로 잘라 두개골의 꼬리 영역을 해부하기 시작하십시오.
  12. 두개골의 두 조각을 옆으로 반사하여 소뇌와 뇌간을 caudally 노출시킵니다 (그림 4B).
  13. 초미세 곡선 포셉을 사용하여 후각 전구를 전방 두개골에서 분리하고 후각 전구에서 시작하여 두개골 기저부에서 뇌를 벗겨 내기 시작하십시오.
  14. 뇌가 두개골 기저부에서 벗겨 지므로 초미세 포셉을 사용하여 두개골 신경을 자르고 뇌를 제거하십시오.
  15. 손상되지 않은 뇌 전체가 제거될 때까지 두개골 기저부에서 뇌를 계속 떼어냅니다(그림 4C,D).
  16. 세로 균열을 따라 뇌를 반으로 잘라 오른쪽과 왼쪽 반구를 서로 분리합니다(그림 4E,F).
  17. 뇌 1 튜브에 하나의 반구를 놓고 뇌 2 튜브에 두 번째 반구를 놓습니다. 뇌 반구가 가라앉을 때까지 이 튜브를 4°C에 보관하십시오(대략 하룻밤 동안).

Figure 4
그림 4: 고정된 뇌의 제거 . (A) 두개골 꼭대기. (B) 두개골 내에 노출된 뇌. (C) 고립 된 뇌 (등쪽 측면). (D) 고립 된 뇌 (복부 측면). (E) 좌반구 (측면 측면). (F) 좌반구 (내측 양상). 스케일 막대 = 1cm(E 및 F). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

  1. 척수를 해부하려면 PFA에서 마우스 몸체를 제거하고 건조시킵니다.
  2. 마우스를 경향이있는 스티로폼 해부 블록에 놓고 네 개의 바늘을 사용하여 발을 블록에 고정하십시오.
  3. 마우스의 중간 선을 목에서 꼬리까지 아래로 잘라 전체 뒷면을 노출시켜 해부를 시작하십시오.
  4. 뒤쪽에 근육과 근막을 반사하여 척추 기둥의 후부 부분을 노출시킵니다.
  5. 대부분의 두개골 척추에서 시작하여 미세한 해부 가위를 사용하여 척수를 피하면서 라미나를 절단하십시오 (그림 5A).
  6. 초미세 곡선 포셉을 라미나 아래에 놓고 위쪽으로 당겨 척추를 골절시켜 척수를 노출시킵니다(그림 5B).
  7. 구부러진 포셉을 사용하여 골절 된 척추를 반사하고 척수의 가장 측면 영역을 노출시킵니다.
  8. 초미세 곡선 포셉을 라미나 아래에 놓고 척추를 파쇄하여 다음 척추에 대해이 과정을 계속하십시오. 전체 경추와 흉추가 노출될 때까지 척추 골절을 계속하십시오(그림 5C).
  9. 요추 척수가 끝날 때까지 척수를 계속 노출시킵니다(그림 5D).
  10. 날카로운 면도날을 사용하여 흉부 척수를 끝까지 자릅니다.
  11. 초미세 곡선 포셉을 사용하여 척추 신경을 척추 앞쪽에서 척수로 옆으로 횡단하여 척추 기둥에서 천천히 경추 척수를 분리합니다.
  12. 척추가 없을 때까지 자궁경부 척수를 계속 해부합니다(그림 5E). 자궁 경부 - 중흉부 척수를 자궁 경부라고 표시된 튜브에 넣으십시오. 자궁경부 척수가 가라앉을 때까지 이 튜브를 4°C에 보관하십시오(대략 하룻밤 사이).
  13. 4.22 단계부터 4.25 단계까지 완추 척추를 계속 골절시킵니다. cauda equina가 노출되면 날카로운 면도날을 사용하여 요추 척수 아래 1cm 아래의 척수를 자릅니다 (그림 5F).
  14. 4.26-4.27 단계에 설명 된대로 척추에서 요추 척수를 해부하십시오. 요추 중간 cauda equina 척수를 요추라고 표시된 튜브에 넣으십시오. 요추 척수가 가라앉을 때까지 이 튜브를 4°C에 보관하십시오(대략 하룻밤).
  15. 모든 조직이 20 % 자당에 가라 앉았을 때, 가라 앉을 때까지 또는 3 일 동안 30 % 자당의 라벨이 붙은 튜브로 옮깁니다.
    참고 : 척추 조직은 종종 30 % 자당에서 가라 앉지 않습니다.

Figure 5
그림 5 : 고정 척수 세그먼트 제거. (A) 자궁 경부 척추의 라미나로 초기 절단. (B) 개별 척추를 골절시키기 위해 구부러진 포셉의 배치. (C) 노출된 경추. (D) 노출된 자궁경부, 흉추, 요추. (E) 척추 신경을 절단 한 후 경추의 제거. (F) 성골 척추 절단. (G) 고립된 자궁경추. (H) 고립 된 요추. 스케일 막대 = 1cm(G 및 H). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

5. OCT 임베딩 및 조직 저장

  1. 각 마우스에 대해 네 개의 직사각형 모양의 냉동 몰드에 라벨을 붙입니다 : 마우스 ID, 오른쪽 반구, 임베딩 날짜; 마우스 ID, 좌반구, 임베딩 날짜; 마우스 ID, 자궁 경부, 임베딩 날짜; 마우스 ID, 요추, 포함 날짜.
  2. 스티로폼 용기를 설치하고 용기 위에 금속 컵을 걸어 놓습니다.
  3. 스티로폼 용기를 액체 질소의 절반 정도에 채 웁니다. 금속 컵을 신선한 2- 메틸 부탄으로 대략 반쯤 채 웁니다.
    참고 : 2- 메틸 부탄은 독성이 강하고 휘발성이 높으며 가연성입니다. 흄 후드에서 후속 단계를 수행하고 연소원에서 멀리 떨어져서 흡입을 피하기 위해주의를 기울여야합니다.
  4. 금속 컵을 액체 질소로 천천히 내리고 액체 질소가 금속 컵에 튀지 않도록하십시오.
  5. 2-메틸부탄이 얼기 시작하도록 허용하십시오. 2-메틸부탄이 얼고 있는 동안, 30% 수크로오스 용액에서 원하는 조직을 꺼내어 먼지가 없는 닦아내기로 닦아냅니다.
  6. 조직을 로스트랄 영역이 주형의 상단(라벨이 부착되지 않은) 부분을 향하도록 하는 cryomold에 놓습니다.
  7. 최적의 절단 온도 임베딩 매질(OCT)을 냉동 몰드 내의 조직 위에 드물게 붓고, 조직을 완전히 덮을 수 있을 정도만 사용한다. 과도한 OCT는 균열을 일으킬 수 있으므로 사용하지 마십시오. OCT에서 거품을 제거합니다.
  8. 냉동 2-메틸부탄이 금속 컵의 내부 표면을 완전히 덮었을 때, cryomold를 12 초 동안 위에 놓인 액상 2-메틸 부탄에 완전히 담그십시오. 12 초 후, cryomold를 라벨이 붙은 알루미늄 호일 사각형에 배수하고 전체 냉동 몰드를 감싼다. 즉시 포장 된 cryomold를 드라이 아이스에 놓고 해동을 피하십시오. 냉동 OCT/cryomold가 항상 드라이 아이스로 덮여 있는지 확인하십시오.
  9. 모든 조직에 대해 5.6-5.8단계를 반복합니다. 한 마리의 마우스용 티슈를 밀봉된 작은 비닐 봉지에 넣은 다음 냉동 안전 밀봉된 용기에 넣습니다. 이 용기를 절편이 절단될 때까지 -80°C 깊은 냉동고에 보관하십시오.

6. 냉동 절제술

  1. 냉동 절제하기 전에 냉동 챔버 온도와 시편 헤드가 적절한 설정으로 설정되어 있는지 확인하십시오.
    참고: -20°C의 챔버 온도, -20°C의 시편 헤드 온도 및 30μm의 단면 두께가 뇌 단면을 절단하는 데 사용됩니다. 척수 절편을 절단하기 위해, -23°C의 챔버 온도, -30°C의 시편 헤드 온도, 및 30 μm의 단면 두께가 사용된다. cryostat 설정 (특히 시편 헤드 온도)은 조직 품질 문제를 해결하기 위해 단면화 중에 조정되어야한다는 점에 유의해야합니다. 일반적으로 시편 헤드 온도는 조직 번짐에 대한 교정을 위해 낮아집니다. 반대로, 시편 헤드 온도는 과도한 조직 컬링을 교정하기 위해 증가합니다.
  2. -80°C 냉동고에서 원하는 OCT 블록을 제거하고 포장되지 않은 냉동 몰드/OCT 블록을 냉동 챔버에 놓습니다.
  3. OCT 블록이 30분 동안 챔버 온도에 적응하도록 허용하십시오.
  4. 척을 70% 에탄올로 닦고 먼지가 없는 물티슈로 닦아냅니다. 청소 된 척을 냉동 챔버에 놓고 척에 동전 크기의 OCT 원을 만드십시오. OCT가 얼어 붙도록 하십시오 (약 1-2 분).
  5. OCT가 얼어 붙었을 때, 완두콩 크기의 신선한 OCT 점을 척에 놓고 즉시 조직 OCT 블록을 척에 놓습니다. OCT가 완전히 얼기 전에 조직이 척에 완벽하게 수직인지 확인하십시오.
    참고 : 일반적으로 뇌의 가장 로스트랄 영역은 척쪽으로 배치되어 단면화가 꼬리 끝에서 시작됩니다. 척수의 경우, 일반적으로 가장 인과적 인 부위가 척에 배치되어 단면화가 로스트랄 끝에서 시작됩니다.
  6. OCT가 경화되었을 때, OCT 블록의 베이스 주위에 더 많은 OCT를 배치하여 단면화 동안 구조적 지지대 역할을 한다. 이 지지대가 약간 경화되면 척을 시편 헤드에 놓고 OCT 블록이 시편 헤드의 온도에 30분 동안 도달하도록 합니다.
  7. 마이크로톰 블레이드를 블레이드 홀더에 넣고 안티롤 플레이트를 청소하십시오. 안티롤 플레이트 거리를 조정하여 단면화 중에 조직이 플레이트 바로 아래를 통과하도록 합니다. 안티롤 플레이트의 올바른 위치에 대한 자세한 내용은 cryostat 설명서를 참조하십시오.
  8. OCT 블록이 시편 헤드 온도에 적응한 후, 조직에 도달할 때까지 OCT 블록을 트리밍하기 시작하십시오. 조직이 보이면 트리밍 에서 단면화 로 전환하고 30μm 절편을 절단하기 시작합니다. 안티롤 플레이트를 옆으로 옮기고 현미경 슬라이드를 사용하여 섹션을 집어 들으십시오.
  9. 절편의 해부학적 위치에 만족하거나 모든 조직이 절단될 때까지 절편을 계속 절단하고 수집한다. 슬라이드를 실온에서 1-3 일 동안 건조시킵니다. 건조 후 슬라이드를 슬라이드 박스에 넣고 이 상자를 밀봉된 비닐 봉지에 넣습니다. 슬라이드를 -80°C 깊은 냉동고에 배치하기 전에 마우스 ID 및 조직 정보로 백에 라벨링한다.

7. 면역형광염색

  1. 실온에서 1 시간 동안 슬라이드를 해동하십시오.
  2. 슬라이드를 수평 슬라이드 병에 넣고 절편을 PBS로 3회 세척하고 진탕기 상에서 실온에서 각각 10분 동안 세척한다.
  3. 블로킹 완충액(1x PBS 중 2% BSA + 0.3% 트리톤-X-100)을 준비한다. 슬라이드 당 약 1 mL를 사용하십시오.
  4. 바닥에 물을 추가하여 가습 챔버를 만듭니다. 슬라이드를 수평으로 위로 향하게 눕히고 건조되지 않도록 합니다. 블로킹 버퍼 1 mL를 각 슬라이드에 첨가하고, 실온에서 적어도 1시간 동안 인큐베이션한다.
  5. 일차 항체를 항체 완충액 (1x PBS 중 0.7% BSA + 0.3% Triton-X-100)으로 희석하여 일차 항체 용액을 제조하였다.
    주: 인산화된 α-시누클레인 항체의 경우, 1:500의 희석 계수가 사용되었다.
  6. 슬라이드 당 200-300 μL의 일차 항체 용액을 첨가하십시오. 항체를 분산시키기 위해 커버슬립으로 표지하고 4°C에서 밤새 인큐베이션한다.
  7. 다음날, 가습 챔버에서 슬라이드를 제거하고 커버슬립이 떨어지도록 1x PBS로 채워진 수직 코플린 병에 놓습니다. 각 슬라이드에 대해 개별적으로 이 작업을 수행하고 커버슬립을 제거할 때 조직 부분이 방해받지 않도록 주의하십시오.
  8. 슬라이드를 수평 슬라이드 병에 넣고 절편을 PBS로 3회 세척하고 진탕기 상에서 실온에서 각각 10분 동안 세척한다.
    참고 : 형광단의 광표백을 피하기 위해 모든 후속 단계를 수행 한 상태에서 수행해야합니다!
  9. 이차 항체를 항체 완충액에 희석하여 이차 항체 용액을 준비한다.
    참고: 인산화된 α-시누클레인의 검출을 위해, 항체 완충액 중 1:500의 희석 인자를 갖는 Alexa 488에 접합된 항토끼 이차 접합물(1x PBS 중 0.7% BSA + 0.3% Triton-X-100)을 사용하였다.
  10. 슬라이드를 가습 챔버에 수평으로 놓고 슬라이드 당 200-300 μL의 이차 항체 용액을 첨가하십시오. 항체를 분산시키기 위해 커버슬립으로 덮는다. 실온에서 적어도 2시간 동안 인큐베이션한다.
  11. 가습 챔버에서 슬라이드를 제거하고 커버슬립이 떨어지도록 1x PBS로 채워진 수직 코플린 병에 놓습니다. 각 슬라이드에 대해 개별적으로 이 작업을 수행하고 커버슬립을 제거할 때 조직 부분이 방해받지 않도록 주의하십시오.
  12. 슬라이드를 수평 슬라이드 병에 넣고 절편을 PBS로 3회 세척하고 진탕기 상에서 실온에서 각각 10분 동안 세척한다.
  13. 슬라이드의 측면을 수건으로 얼룩 말리고 과도한 PBS를 털어 내십시오.
  14. 각 슬라이드에 장착 매체 3방울을 추가합니다. 커버 슬립을 추가하고 공초점 현미경으로 이미징하기 전에 커버 슬립을 눌러 포셉 한 쌍으로 거품을 부드럽게 밀어 내십시오.

Representative Results

고품질 관류는 간, 척수 및 깊은 CNS 구조에 혈액이 없음으로 나타납니다 (그림 4C 및 그림 5G, H). 경막 아래 (예를 들어, 정맥 부비동 내) 또는 경막 교통과 두개골 사이의 보유 된 혈액은이 혈액이 뇌 실질 내에 있지 않기 때문에 문제가되지 않았습니다. 도 4A 에서 보이는 혈액은 두개골과 경막 물질 사이에 위치하며, 따라서 품질이 좋지 않은 관류에 문제가 있거나 암시적이지 않다. 신선한 뇌와 척수는 매우 부드럽고 취급 중에 쉽게 손상됩니다. 이에 비해 적절하게 고정 된 조직은 단단합니다. 이 관류 방법에 의해 조직의 질과 조직의 형태학의 보존을 평가하기 위해,이 연구는 15 개월 된 마우스와 인간 A53T α 시누클레인을 발현하는 7 개월 된 마우스의 중뇌 및 요추 척수에서 인산화 된 α-시누클레인의 검출을 입증합니다 (그림 6).

A53T 돌연변이는 상염색체 우성 파킨슨병(PD) 환자에서 과대대표된다. 더욱이, A53T 돌연변이를 갖는 인간 α-시누클레인은 마우스 6,7에서 발현될 때 인간 PD의 많은 특징을 재분석할 수 있다. 세린 129 잔기에서의 α-시누클레인의 인산화는 생체내 및 시험관내에서 α-시누클레인 응집을 유도하는 것으로 나타났다8. Lewey body는 PD 또는 Lewey body dementia9 환자에서 존재하는 고전적인 조직학적 발견이다. Lewey 바디에 존재하는 α-시누클레인의 대부분은 세린 12910,11에서 인산화된다. 결과적으로, 인산화된 α시누클레인의 축적은 PD 병리학의 조직학적 중증도의 마커로서 사용된다. 본 연구는 인산화된 α-시누클레인이 인간 A53T α-시누클레인을 발현하는 7개월 된 무증상 마우스에 비해 15.5개월 된 증상 마우스에서 상당히 높은 수준으로 축적된다는 것을 발견하였다. 이것은 척수의 전방 뿔과 이들 마우스의 중뇌에서 세포 병리학의 풍부함을 설명하는 보고서와 일치합니다. 6 이로부터, 여기에 설명된 단순화된 관류 방법은 하류 조직학적 특성화를 위한 CNS 조직의 고품질 고정을 제공한다는 결론이 내려진다.

Figure 6
도 6: 파킨슨병의 마우스 모델에서 중뇌 및 요추 척수 조직에서 인산화된 α-시누클레인에 대한 표지. 노화된(15.5개월령) 말기 마비된 마우스는 7개월 된 건강한 마우스와 비교된다. 두 마우스 모두 파킨슨병과 같은 병리를 유도하는 인간 α-시누클레인의 미스폴딩되기 쉬운 돌연변이 변이체(A53T)를 발현한다. 스케일 바 = 100μm(상부 패널) 및 50μm(하부 패널). 약어: α syn-A53T = α-시누클레인의 A53T 변이체; DAPI = 4',6-디아미디노-2-페닐인돌; PS129 = α-시누클레인의 인산화된 세린 129. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

이 연구는 심질 관류를 수행하는 중요한 단계를 설명합니다. 관류 장치(프로토콜 섹션 1)를 구성할 때, 지혈제에 의해 완전히 폐색될 수 있을 만큼 충분히 유연한 튜빙을 사용하는 것이 중요하다. 일부 뻣뻣한 튜빙은 지혈제에 의해 충분히 폐색되지 않을 수 있고, 초기 PBS 관류 동안 PFA가 메인 라인으로 누출되는 것을 여전히 허용할 수 있다. 4% PFA 용액을 제조할 때, pH가 생리학적인지 확인하는 것이 중요하다(7.4). PFA 용액의 제조는 그것을 65°C로 가열하는 것을 포함하기 때문에, 이것은 pH가 미터상에서 교정되는 온도이기 때문에 pH를 측정하기 전에 용액을 25°C까지 다시 냉각시켜야 한다.

복부에 초기 절개를 할 때 복부 장기의 열상을 피하기 위해주의를 기울여야합니다 (프로토콜 섹션 2). 횡격막 쪽으로 우월하게 해부 할 때, 간이 전방 복벽과 부착되는 것이 일반적이므로 간이 열상을 피하는 것이 중요합니다. 이를 극복하기 위해 간은 횡격막 쪽으로 절개를 계속하기 전에 전벽에서 조심스럽게 그리고 뻔뻔스럽게 해부됩니다. 횡격막을 통해 흉강에 들어갈 때는 심장, 큰 혈관 및 폐의 열상을 피하는 것이 중요합니다. 이를 피하기 위해 가위 팁은 흉곽과 피상적으로 그리고 급성 각도로 유지됩니다.

심장을 노출시키는 초기 해부에는 초기 절개에서 약 2 분이 걸립니다. 이 기간 동안 일부 공기가 나비 바늘의 끝으로 들어갈 것으로 예상됩니다. 이 공기를 마우스의 순환에 도입하면 품질이 떨어지는 관류가 발생합니다. 따라서 메인 라인이 열리고 PBS가 심장의 캐뉼레이션 직전에 바늘을 통해 플러시되어 기포를 제거하는 것이 중요합니다. 이상적으로는, 작은 PBS 트리클이 바늘 팁을 통해 흐르는 동안 심장은 캐뉼레이션되어 LV를 뚫을 때 공기가 완전히 없음을 보장합니다.

바늘이 LV에 들어갈 때, 바늘 끝을 우심실 (RV)에 도입 할 정도로 깊어서는 안됩니다. RV 또는 승모판 너머에 바늘을 배치하면 관류가 시작될 때 폐의 즉각적인 "인플레이션"이 발생합니다. 이것은 바람직하지 않으며, LV 배치를 보장하기 위해 바늘을 약간 뽑아야합니다. 바늘을 제대로 놓으면 폐는 관류 내내 평평하게 유지됩니다. 관류가 시작될 때, 동물의 열린 입에서 맑은 액체가 나오는 것이 때때로 관찰됩니다. 이것은 일반적으로 너무 높은 관류 압력 또는 심장 내 바늘의 잘못 배치 때문입니다. 저자들은 상승 된 관류 압력이 동맥 모세관 층에서 퍼퓨세이트의 혈관을 외부화하고 기관지 트리를 통해 식도와 구강으로 PBS의 역행 흐름을 초래한다고 추측합니다.

관류 압력은 PBS 병 내의 PBS 수준을 감소시키거나 PBS 병의 높이를 낮춤으로써 낮아져야 한다. 대안으로, 바늘이 좌심실에 너무 깊이 놓이면 승모판 밸브를 통과하여 향수를 좌심방으로 전달할 수 있습니다. 이것은 위에서 설명한 바와 같이 폐정맥을 통한 역행 유동 및 세동맥으로의 향수의 혈관외 유출을 초래할 수 있다. PBS를 사용한 순환계로부터의 혈액의 철저한 클리어런스는 후속 고정 관류시 혈관 폐색을 초래하는 혈액 성분의 고정-유도된 가교결합을 피하기 위해 특히 중요하다. 클리어런스는 복부 꼬리 기저부의 절개로부터 간 및 PBS 유동의 색 변화에 의해 효과적으로 평가된다. 혈액 클리어런스는 일반적으로 PBS와의 관류 3 분에 의해 완료된다; 그러나 짧은 시간에 클리어런스의 시각적 징후가 발생하면 3 분보다 빨리 고정이 발생합니다. 지연된 고정 관류가 CNS 미세 구조1에서 아티팩트로 이어지기 때문에 더 긴 클리어런스 시간은 권장되지 않습니다.

PFA가 투여 될 때, PFA 병에서 PFA 용액의 수준을 모니터링하는 것이 중요합니다. PFA 병의 입 위로 4cm 미만으로 떨어지면 PFA 병을 채우십시오. 관류가 완료된 후, 관류 장치는 증류수로 철저히 헹구어 야합니다. 이는 메인 라인의 잔류 PFA가 PFA로 초기 PBS 관류를 오염시키고 품질이 떨어지는 관류를 초래하기 때문에 중요합니다. 마지막으로, 25G 나비 바늘은 일반적으로 20-30g 범위의 평균 크기의 성인 마우스에 권장됩니다. 그러나, 더 크거나 작은 마우스는 최적의 유속을 제공하기 위해 고정 병의 조정 이외에 약간 더 크거나 더 작은 게이지 바늘을 필요로 할 수 있다.

CNS 해부 및 OCT 임베딩 (프로토콜 섹션 3)의 경우, 척수 조직이 30 % 수크로오스에 완전히 가라 앉지 않는 것이 일반적입니다. 따라서 이들 조직은 2일 동안 수크로오스에 방치된 후 가라앉는지 여부에 관계없이 OCT에 포매된다. OCT에서 조직을 동결시킬 때, 냉각된 2-메틸부탄에 넣으면 특정 조직이 갈라질 수 있습니다. 이것은 뇌에서 더 흔하며 일반적으로 너무 많은 OCT가 조직에 배치 될 때 발생합니다. 이를 피하려면 즉시 동결하기 전에 조직 표면을 덮기에 충분한 OCT 만 두십시오. 일부 프로토콜에서는 OCT에 완전히 몰두했음에도 불구하고 크래킹이 덜 일반적입니다. 이것은 일반적으로 드라이 아이스 냉각 2-메틸 부탄을 사용하거나 드라이 아이스 블록에 cryomold를 직접 배치 할 때와 같이 느린 동결 방법 때문입니다. 액체-질소-냉각된 2-메틸부탄은 동결 속도가 실질적으로 더 빠르고, 느린 동결 방법보다 조직 형태를 더 잘 보존할 수 있기 때문에 이 작업에서 바람직하다.

조직을 동결 절제할 때(프로토콜 섹션 4), 다수의 동결-해동 사이클을 피하는 것이 중요하다. 따라서 단일 OCT 블록에서 모든 섹션을 절단하여 선택한 영역을 해동하고 다시 얼리는 대신 분석을 위해 특정 뇌 영역을 얻는 것이 가장 좋습니다. 이것이 실행 가능하지 않은 경우, 몇 개의 섹션을 얻은 후, 사용자는 OCT 블록을 나중에 사용하기 위해 -80°C 깊은 냉동고에 1-2회 더 재동결 및 저장할 수 있다.

보다 전통적인 펌프 또는 퍼퓨세이트의 공기 압력 전달에 대한 이 방법의 주요 이점은 다음과 같다: (1) 관류 장치의 저렴한 비용 및 접근성. (2) 사용자는 관류 전반에 걸쳐 관류 장치에서 수동으로 압력을 유지할 필요가 없다. (3) 주사기 전달과 같은 관류를위한 다른 저비용 대안보다 낮고 일관된 관류 압력. Bernoulli의 방정식을 사용하여, 여기에 건설 된 중력 공급 관류 장치는 향수 병이 바늘에 대해 1m의 고도에 배치 될 때 약 73mm Hg의 관류 압력을 유지할 것이라고 계산됩니다. 이것이 이들 동물의 수축기 혈압보다 현저히 낮다는 것을 감안할 때, 이러한 관류 압력은 혈관 파열(12)을 피하기 위해 충분히 낮을 가능성이 높다.

저자들은 지금까지 파킨슨 병의 마우스 모델에서 인산화 된 α 시누클레인의 존재를 검출하기 위해이 관류 시스템을 성공적으로 사용했습니다. 이 시간 동안, 이러한 관류 방법에 대한 상당한 한계는 펌프 관류 전달 방법과 함께 존재하지 않는 것이 발생하지 않았다. 이 기술의 주요 한계는 관류 대 낙하 고정의 시간이 많이 걸리는 특성입니다. 이 기술은 관류가 CNS 구조에 대한 고정성의 더 깊은 침투를 초래하기 때문에 고정을 떨어뜨리는 것이 바람직하다. 이 기술의 두 번째 한계는 흉강으로 들어간 후 심장을 신속하게 캐뉼레이션해야하기 때문에 수행하는 데 약간의 수술 기술이 필요하다는 것입니다. 그러나 경험을 통해 숙련 된 사용자는 복부를 처음 절개 한 후 1 분 이내에 일상적으로 심장을 수축시킬 수 있습니다.

Disclosures

저자들은 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

Acknowledgments

저자들은 Xiaowen Wang, Liam Coyne 및 Jason Grullon이이 프로토콜을 개발하는 데 도움을 준 것에 감사드립니다. 이 작업은 NIH 보조금 AG061204 및 AG063499에 의해 지원되었습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Methylbutane (Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific 03551-4
Andwin Scientific Tissue-Tek O.C.T Compound Fisher Scientific NC1029572
Artman Instruments 4.5" Straight Castroveijo Spring Action Scissors Amazon B0752XHK2X "fine scissors"
BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles, 18 G Fisher Scientific 14-826-5D
BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles, 22 G Fisher Scientific 14-826B
Corning PES Syringe Filters Fisher Scientific 09-754-29
Cytiva HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Fisher Scientific SH30258
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-432-22
Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder Fisher Scientific BP9703100
Fisherbrand Curved Medium Point General Purpose Forceps Fisher Scientific 16-100-110 "curved fenestrated forceps"
Fisherbrand Curved Very Fine Precision Tip Forceps Fisher Scientific 16-100-123 "curved fine forceps"
Fisherbrand Disposable Graduated Transfer Pipettes Fisher Scientific 13-711-9AM
Fisherbrand High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps Fisher Scientific 12-000-122 "straight fine forceps"
Fisherbrand Micro Spatulas with Rounded Ends Fisher Scientific 21-401-5
Fisherbrand Porcelain Buchner Funnels with Fixed Perforated Plates Fisher Scientific FB966J
Fisherbrand Premium Cover Glass, 24 x 50 Fisher Scientific 12-548-5M
Fisherbrand Premium Tissue Forceps 1X2 Teeth 5 in. German Steel Fisher Scientific 13-820-074 "skin forceps"
Fisherbrand Reusable Heavy-Wall Filter Flasks Fisher Scientific FB3002000
Fisherbrand Standard Dissecting Scissors Fisher Scientific 08-951-20 "dissecting scissors"
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use Fisher Scientific 14-955-464
Fisherbrand Straight Locking Hemostats Fisher Scientific 16-100-115
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Fisherbrand Vinyl Tubing and Connector Kits, 1/4 in. Fisher Scientific 14-174-1C
Fisherbrand Wet-Strengthened Qualitative Filter Paper Circles Fisher Scientific 09-790-12F
Fisherbrand Y Connector with 1/4 in. ID - Polypropylene - QC Fisher Scientific 01-000-686
Garvey Economy Single Edge Cutter Blade Amazon B001GXFAEQ
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight 488 ThermoFisher Scientific 35552
Ideal Clamp Stant High-Pressure Clamps Fisher Scientific 14-198-5A "hose clamps"
IMEB, Inc Sakura Accu-Edge Low Profile Microtome Blades, Dispoisable Fisher Scientific NC9822467
Kawasumi 25 Gauge Standard Winged Blood Collection Set Fisher Scientific 22-010-137 "butterfly needle"
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply Fisher Scientific 06-666
Molecular Probes ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI Fisher Scientific P36962
Nalgene Narrow-Mouth Right-to-Know LDPE Wash Bottles ThermoFisher Scientific 2425-0506 "buffer bottles"
PAP pen abcam ab2601
Paraformaldehyde Granular Electron Microscopy Systems 19210
Pyrex Glass Drying Dishes, 34.9 x 24.9 x 6 cm Fisher Scientific 15-242D
Recombinant Anti-Alpha-synuclein (phospho S129) antibody [EP1536Y] abcam ab51253
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich 221465-2.5kg
Stainless Steel Drinking Cup 18-oz amazon B0039PPO9U
Sucrose for Molecular Biology CAS: 57-50-1 Us Biological S8010
Triton X-100 Us Biological T8655
Vetone Fluriso Isoflurane USP MWI Animal Health 502017

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References

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마우스 중추 신경계의 조직학적 분석을 위한 중력 공급 심질 관류 방법
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Rana, A., Massa, P. T., Chen, X. J.… More

Rana, A., Massa, P. T., Chen, X. J. A Gravity-Fed Transcardial Perfusion Method for Histologic Analysis of the Mouse Central Nervous System. J. Vis. Exp. (179), e63386, doi:10.3791/63386 (2022).

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