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Il campo della biologia strutturale si è sviluppato in un potente sistema di comprensione della biologia attraverso i dettagli atomici delle strutture biomolecolari, arricchendo la nostra comprensione dei percorsi biochimici e delle basi molecolari delle malattie e offrendo uno strumento indispensabile per la ricerca traslazionale.
Nel corso degli anni, la biologia strutturale è andata ben oltre la fornitura di strutture statiche, per riferire anche sulle interazioni molecolari, sia in soluzione che in cellule, esaminando scale temporali e dinamiche. Le informazioni possono essere ottenute per spiegare i processi su diverse scale dimensionali, vale a dire, dagli atomi e dalle singole molecole a intere particelle virali e cellule. Diverse tecnologie forniscono un insieme sinergico di approcci sperimentali, inclusi metodi di scattering basati su raggi X, neutroni o elettroni, ad esempio la cristallografia a raggi X (MX) o la diffusione a raggi X a piccolo angolo (SAXS); risonanza magnetica nucleare (NMR) allo stato solido e in soluzione; e ricostruzione di singole particelle mediante microscopia crioelettronica (cryo-EM). Metodi come la tomografia crio-EM, la tomografia a raggi X crio-soft e la risonanza magnetica nucleare in-cell si aggiungono a questo arsenale di approcci per studiare i sistemi macromolecolari, soprattutto in connessione con altri strumenti di imaging. Insieme ad altri metodi biofisici che forniscono informazioni complementari sulle affinità e sulle scale temporali dell'interazione molecolare, la biologia strutturale integrativa offre oggi un pacchetto formidabile per comprendere la vita e sviluppare farmaci, farmaci biologici (anticorpi, nanocorpi, vaccini), biomateriali e altri agenti biologici, come gli enzimi che possono essere utilizzati per degradare la plastica e aiutare l'ambiente.
All'inizio, la Commissione Europea (CE) ha riconosciuto i benefici che la ricerca sulla biologia strutturale ha per la società e dagli anni '80 l'Europa ha investito fortemente nell'apertura gratuita di costose apparecchiature di biologia strutturale alla più ampia comunità scientifica. Questa democratizzazione dell'accesso a strutture multimilionarie è stata una forza trainante e una pietra miliare per lo sviluppo internazionale dell'area della biologia strutturale. Ciò ha posto l'Europa all'avanguardia nel settore, consentendo così un forte settore industriale e contribuendo alle economie locali.
La CE vanta una lunga e impressionante tradizione di accesso e formazione di ricercatori esterni nelle tecnologie della biologia strutturale. A seguito del successo del programma iNEXT (Infrastructure for NMR, EM and X-rays for Translational research) che ha consentito l'accesso gratuito alla biologia strutturale a strutture di fascia alta e a tutti i ricercatori europei fino alla fine del 2019, il progetto Horizon2020 iNEXT-Discovery è iniziato a febbraio 2020 per un altro periodo di quattro anni di accesso completamente finanziato alle infrastrutture di biologia strutturale. Parallelamente, Instruct-ERIC è un punto di riferimento del Forum strategico europeo sulle infrastrutture di ricerca, costituendo una roccaforte sostenibile nella biologia strutturale per le comunità scientifiche europee e internazionali. Insieme, aspirano a coinvolgere gli scienziati della vita e altri nella ricerca sulla biologia strutturale, e per questo offrono l'accesso ad alcune delle migliori competenze, tecnologie e strutture di biologia strutturale in tutto il mondo, sia ai ricercatori del mondo accademico che a quello dell'industria. Insieme ad altri partner, organizzano anche workshop e corsi di formazione pratica.
A causa della pandemia di Covid19, i viaggi verso le strutture di ricerca iNEXT-Discovery e Instruct-ERIC sono stati in gran parte compromessi, impedendo essenzialmente opportunità di formazione pratica. Per compensare parzialmente questo problema, iNEXT-Discovery e Instruct-ERIC hanno entrambi organizzato una serie di webinar (https://inext-discovery.eu/events/what-can-inext-discovery-do-for-us, https://instruct-eric.eu/content/instructeric-webinar-series-structure-meets-function), nonché questo numero speciale di Methods del Journal of Visualized Experiments. Qui troverete descrizioni dettagliate non solo per molte delle nostre procedure di accesso tradizionali, ma anche per le routine specializzate che sono in fase di sviluppo nel campo della biologia strutturale integrativa. Sebbene i nostri metodi siano descritti in dettaglio in questo numero, alcuni richiedono competenze e attrezzature difficili da stabilire a livello locale. Le strutture di Instruct-ERIC e iNEXT-Discovery sono a disposizione per fornire questi metodi, compresa la produzione delle biomolecole necessarie per gli studi strutturali, con l'aiuto e la supervisione di personale locale altamente qualificato.
Metodi migliorati per la determinazione delle strutture macromolecolari
Nell'ultimo decennio, la crio-EM si è sviluppata in una tecnologia molto popolare per determinare strutture complesse macromolecolari. Il team dell'Università di Leeds (Regno Unito) fornisce una panoramica di tutte le fasi coinvolte nell'analisi EM a singola particella, concentrandosi sulle variabili che possono essere ottimizzate durante il flusso di lavoro e la risoluzione dei problemi comuni1. Con il funzionamento del microscopio online da parte di utenti esterni che sta diventando standard, sono necessari protocolli per un efficiente funzionamento remoto e di imaging. Con l'analisi di singole particelle, i campioni vetrificati vengono visualizzati per produrre filmati che mostrano le particelle in orientamenti casuali. Un flusso di lavoro di elaborazione delle immagini identifica i parametri per la ricostruzione del campione in studio. Il software Scipion di CSIC (ES) fornisce tutti gli strumenti per creare questo flusso di lavoro, consentendo anche una semplice tracciabilità dei risultati2.
La raccolta di dati di diffrazione a raggi X su campioni cristallini molto piccoli offre grandi opportunità di ricerca e sfide tecniche. Il team di Diamond (Regno Unito) presenta l'uso di strumenti crio-EM per preparare centinaia di microcristalli su una singola griglia con un liquido circostante minimo su un supporto a basso rumore, prima di raccogliere i dati in un ambiente di beamline dedicato che include un vuoto nel percorso dei raggi X prima e dopo il campione3. La raccolta seriale di dati a raggi X nei sincrotroni è anche una chiave per lo studio di altri sistemi cristallini difficili. In un altro contributo, Diamond mostra istruzioni passo-passo, figure e video per la raccolta dei dati utilizzando una varietà di sistemi di erogazione dei cristalli, attraverso una serie di esempi4.
Moderna biologia strutturale integrativa nella scoperta di farmaci
La cristallografia a raggi X è ben consolidata per la scoperta di farmaci basata su frammenti ed è già comunemente utilizzata per identificare risultati che possono essere sviluppati senza problemi sui candidati principali. I team di Diamond5, Helmholtz-Zentrum Berlin (DE) e MAX IV (SE)6 e dell'unità EMBL Grenoble (FR)7 descrivono i loro ultimi sviluppi nell'automazione dei flussi di lavoro per un'efficiente cristallizzazione del target, l'ammollo dei frammenti, il montaggio dei cristalli, lo screening dei frammenti guidato dalla cristallografia e la deposizione della struttura. Le loro pipeline sono abbastanza automatizzate e vengono utilizzate da ricercatori esterni in tutto il mondo. Sono stati applicati a più di 100 bersagli (spesso in remoto) per identificare i risultati per un'ulteriore progettazione di composti e lo sviluppo di lead assistiti da struttura.
La risonanza magnetica nucleare è anche comunemente utilizzata per lo screening di frammenti nelle campagne di sviluppo di farmaci, mirando a proteine o polinucleotidi, solubili o legati alla membrana. L'Università Goethe di Francoforte (DE) presenta pipeline di screening NMR ottimizzate, che riducono l'intervento manuale durante la sperimentazione e le analisi8. I loro scambiatori di campioni gestiscono centinaia di campioni NMR in un'unica corsa durante diversi giorni di sperimentazione ininterrotta e analisi automatizzata.
Inoltre, i metodi biofisici sono complementari ai raggi X e alla risonanza magnetica. Il team del Netherlands Cancer Institute (NL) presenta un flusso di lavoro che utilizza la calorimetria a scansione nanodifferenziale per saggi di spostamento termico per misurare le variazioni della temperatura di fusione target dopo l'aggiunta di frammenti9. I prerequisiti relativi alla qualità e alla concentrazione delle proteine sono seguiti da un protocollo analitico per la progettazione sperimentale, la raccolta dei dati e l'analisi.
Verso la biologia strutturale cellulare
La crio-tomografia elettronica è spesso il metodo di scelta per esaminare i complessi macromolecolari nelle cellule. Le immagini dei campioni vetrificati vengono acquisite a diversi angoli di inclinazione e viene ricostruito un tomogramma 3D, dal quale vengono estratti i sottovolumi per ottenere una risoluzione più elevata mediante la media dei sottotomogrammi. Poiché gli elettroni interagiscono fortemente con la materia, tali studi richiedono campioni di spessore inferiore a 200 nm. Il team CEITEC (CZ) presenta un protocollo10 per la preparazione di lamelle cellulari dopo il congelamento a tuffo. Anche se l'automazione nella crio-ET ha fatto progressi impressionanti, sono necessarie ore di raccolta dati prima che avvenga l'acquisizione della serie di inclinazione e i bersagli sono in genere ancora identificati dall'ispezione visiva della griglia. Un protocollo di automazione è stato preparato dall'EMBL Heidelberg (DE) per mappare le griglie e i quadrati della griglia, per selezionare i bersagli e per impostare l'acquisizione della serie di inclinazione11.
I sincrotroni ALBA (ES) e Diamond discutono insieme le insidie e i vantaggi di un'alternativa alla tomografia crio-EM che consente di esaminare cellule intatte, vale a dire la tomografia a raggi X crio-morbida (cryo-SXT)12. L'adattamento delle tecniche di super-risoluzione alle temperature criogeniche consente l'imaging correlato con cryo-ET e cryo-SXT. Inoltre, la microscopia a illuminazione criostrutturata ad alto rendimento (cryo-SIM) raddoppia la risoluzione della fluorescenza convenzionale, portando alla posizione specifica di molecole o strutture in campioni spessi. Questo può essere correlato con il crio-SXT per individuare caratteristiche specifiche all'interno del contesto cellulare13.
Il team dell'Università di Utrecht (NL) riporta la preparazione del campione e gli esperimenti NMR allo stato solido ad alta sensibilità che possono essere utilizzati per studiare sistemi fisiologici impegnativi, comprese le membrane naturali e i sistemi proteina-lipidi-glicano14. Inoltre, la soluzione in-cell NMR si sta evolvendo rapidamente per chiarire i processi funzionali. Il team CERM/CIRMMP (IT) descrive come assemblare e far funzionare i bioreattori che consentono il rifornimento di nutrienti e ossigeno per le cellule viventi all'interno della sonda NMR al centro di un magnete ad alto campo15. Ciò consente misurazioni estese ed esperimenti risolti nel tempo, ad esempio, per il monitoraggio delle interazioni intracellulari proteina-ligando.
Osservazioni conclusive
Questo numero di JoVE è interamente dedicato ai recenti sviluppi della biologia strutturale e alle applicazioni nelle infrastrutture di ricerca europee. Insieme, iNEXT-Discovery e Instruct-ERIC consentono agli specialisti di biologia strutturale, ma sempre più spesso anche agli scienziati della vita non specializzati e ad altri ricercatori, di perseguire i loro obiettivi di ricerca offrendo servizi all'avanguardia.