Caratterizzazione tridimensionale dei siti di contatto interorganelle negli epatociti mediante microscopia elettronica a sezione seriale

Sommario

Un protocollo semplice e completo per acquisire dettagli tridimensionali dei siti di contatto della membrana tra organelli negli epatociti dal fegato o cellule in altri tessuti.

Abstract

La microscopia elettronica a trasmissione è stata a lungo considerata il gold standard per la visualizzazione dell'ultrastruttura cellulare. Tuttavia, l'analisi è spesso limitata a due dimensioni, ostacolando la capacità di descrivere completamente l'ultrastruttura tridimensionale (3D) e la relazione funzionale tra gli organelli. La microscopia elettronica volumetrica (vEM) descrive una raccolta di tecniche che consentono l'interrogazione dell'ultrastruttura cellulare in 3D a mesoscala, microscala e risoluzioni su scala nanometrica.

Questo protocollo fornisce un metodo accessibile e robusto per acquisire dati vEM utilizzando la trasmissione a sezione seriale EM (TEM) e copre gli aspetti tecnici dell'elaborazione dei campioni fino alla ricostruzione 3D digitale in un unico flusso di lavoro semplice. Per dimostrare l'utilità di questa tecnica, viene presentata la relazione ultrastrutturale 3D tra il reticolo endoplasmatico e i mitocondri e i loro siti di contatto negli epatociti epatici. I contatti interorganelle svolgono ruoli vitali nel trasferimento di ioni, lipidi, sostanze nutritive e altre piccole molecole tra gli organelli. Tuttavia, nonostante la loro scoperta iniziale negli epatociti, c'è ancora molto da imparare sulle loro caratteristiche fisiche, dinamiche e funzioni.

I contatti interorganelle possono mostrare una gamma di morfologie, che variano nella vicinanza dei due organelli l'uno all'altro (in genere ~ 10-30 nm) e l'estensione del sito di contatto (dai contatti puntati ai contatti 3D più grandi simili a cisternali). L'esame dei contatti stretti richiede l'imaging ad alta risoluzione e la sezione seriale TEM è adatta per visualizzare l'ultrastrutturale 3D dei contatti interorganelle durante la differenziazione degli epatociti, nonché le alterazioni dell'architettura degli epatociti associate a malattie metaboliche.

Introduzione

Dalla loro invenzione nel 1930, i microscopi elettronici hanno permesso ai ricercatori di visualizzare i componenti strutturali di cellule e tessuti ^1,2. La maggior parte delle indagini ha fornito informazioni 2D, poiché la costruzione di modelli 3D richiede una scrupolosa raccolta di sezioni seriali, fotografia manuale, elaborazione negativa, tracciamento manuale e la creazione e l'assemblaggio di modelli 3D da lastre di vetro, plastica o polistirolo ^3,4. Quasi 70 anni dopo, ci sono stati notevoli progressi in numerosi aspetti del processo, dalle pres....

Protocollo

Tutti gli animali sono stati alloggiati in conformità con le linee guida del Ministero degli Interni del Regno Unito e la raccolta dei tessuti è stata effettuata in conformità con l'Animal (Scientific Procedures) Act del Regno Unito del 1986.

1. Fissazione e preparazione del campione

1. Sezionare il tessuto epatico in pezzi di dimensioni appropriate, circa 8 mm x 8 mm x 3 mm, e posizionare i pezzi in soluzione salina calda tamponata con fosfato (PBS, 37 °C).
2. Iniettare la temperatura ambiente (20-25 °C) fissativo (1,5% glutaraldeide in 1% di saccarosio, 0,1 M di cacodilato di sodio) nei pezzi di fegato e tra....

Risultati

Per questa tecnica, le regioni di interesse vengono selezionate in base all'obiettivo della ricerca biologica e identificate prima del taglio e del sezionamento del tessuto incorporato. Allo stesso modo, la dimensione della faccia del blocco può essere dettata dalla domanda di ricerca; in questo caso, il campione è stato tagliato per lasciare una faccia di blocco di circa 0,3 mm x 0,15 mm (Figura 4A). Ciò ha permesso di creare due griglie di 9 sezioni seriali per griglia, fornendo 18 sezioni.......

Discussione

In questo protocollo è descritta una tecnica vEM accessibile per visualizzare la struttura e le interazioni degli organelli in 3D. La morfologia dei contatti interorganelle negli epatociti è presentata come un caso di studio qui. Tuttavia, questo approccio è stato applicato anche per studiare una varietà di altri campioni e aree di ricerca, tra cui le interazioni cellula-endotelio di Schwann nei nervi periferici⁴⁵, la biogenesi del corpo di Weibel Palade nelle cellule endoteliali^.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,22 µ m filtro per siringa	Sarstedt	83.1826.001
Vassoi in alluminio	Agar Scientific	AGG3912
Amira v6	ThermoFisher		https://www.thermofisher.com
Cloroformio	Fisher	C/4960/PB08
DDSA/Dodecenil Anidride succinica	TAAB	T027	Epon ingrediente
Coltello diamantato	DiaTOME	ultra 45 gradi;
DMP-30/2,4,6-tri (Dimetilamminometil) fenolo	TAAB	D032	Epon ingrediente
Dumont Pinzette N5	Agar Scientific	AGT5293
Fiji
https://imagej.net/ Fiji TrakEM2 plugin			https://imagej.net/
Formaldeide 36% soluzione	TAAB	F003
Formvar Griglia a fessura rivestita	Fatto in casa		Alternativa: EMS diasum (FF2010-Cu)
Flacone in vetro con asta applicatore	Medisca	6258
Fiale in vetro	Fisher Scientific	15364769
Soluzione di gluteraldeide al 25%	TAAB	G011
MNA/Anidride metilnadica	TAAB	M011	Ingrediente Epon
Tetrossido di osmio 2% soluzione	TAAB	O005
Ferricianuro di potassio	Sigma-Aldrich	P-8131
Ossido di propilene	Fisher Scientific	E/0050/PB08
Adesivo riutilizzabile	Blue Tack
piombo	TAAB	L037	Colorazione per sezioni
Cacodilato di sodio	Sigma-Aldrich	C-0250	a fare 0,1 M Caco tampone
Super Colla	RS Componenti	918-6872	Colla cianoacrilata, Passaggio 1.3
TAAB 812 Resina	TAAB	T023	Epon ingrediente
Acido tannico	TAAB	T046
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
Resina epossidica bicomponente	RS Componenti	132-605	Alternativa: Passaggio 2.13
Ultramicrotomo	Leica	UC7
Microtomo vibrante	Leica		100 µ m fette spesse, taglio 0,16 mm/s con ampiezza di 1 mm.
Weldwood Cemento a contatto originale	DAP	107	Adesivo a contatto: Passaggio 3.1.4