Summary
Kometanalysen är ett populärt sätt att upptäcka DNA-skador. Denna studie beskriver ett tillvägagångssätt för att köra glidbanor i representativa varianter av kometanalysen. Detta tillvägagångssätt ökade avsevärt antalet prover samtidigt som analyskörningstiden minskade, antalet glidmanipulationer och risken för skador på geler.
Abstract
Celler utsätts kontinuerligt för medel som härrör från de inre och yttre miljöerna, vilket kan skada DNA. Denna skada kan orsaka avvikande cellfunktion, och därför kan DNA-skador spela en avgörande roll i utvecklingen av, tänkbart, alla större mänskliga sjukdomar, t.ex. cancer, neurodegenerativ och hjärt-kärlsjukdom och åldrande. Encellig gelelektrofores (dvs. kometanalysen) är en av de vanligaste och känsligaste metoderna för att studera bildandet och reparationen av ett brett spektrum av typer av DNA-skador (t.ex. enkel- och dubbelsträngsbrott, alkali-labila platser, DNA-DNA-tvärbindningar och, i kombination med vissa reparationsenzymer, oxiderade puriner och pyrimidiner), både in vitro och in vivo system. Den låga provgenomströmningen för den konventionella analysen och mödosamma provupparbetning är dock begränsande faktorer för dess bredaste möjliga tillämpning. Med "poängsättningen" av kometer alltmer automatiserad är begränsningen nu möjligheten att bearbeta ett betydande antal kometbilder. Här har en HTP-variant (high-throughput) av kometanalysen (HTP-kometanalys) utvecklats, vilket avsevärt ökar antalet analyserade prover, minskar analysens körtid, antalet enskilda glidmanipulationer, reagenskrav och risk för fysisk skada på gelerna. Dessutom minskar elektroforestankens fotavtryck avsevärt på grund av glidbanornas vertikala orientering och integrerad kylning. Här rapporteras också ett nytt tillvägagångssätt för kylning av kometanalysglas, vilket bekvämt och effektivt underlättar stelningen av kometgelerna. Här har tillämpningen av dessa anordningar på representativa kometanalysmetoder beskrivits. Dessa enkla innovationer stöder i hög grad användningen av kometanalysen och dess tillämpning på studieområden som exponeringsbiologi, ekotoxikologi, biologisk övervakning, toxicitetsscreening / testning, tillsammans med förståelse av patogenes.
Introduction
Celler utsätts kontinuerligt för medel som härrör från de inre och yttre miljöerna, vilket kan skada DNA 1,2. Denna skada kan orsaka avvikande cellfunktion3, och därför kan DNA-skador spela en avgörande roll i utvecklingen av många stora mänskliga sjukdomar, t.ex. cancer, neurodegenerativ och hjärt-kärlsjukdom och åldrande4. Kometanalysen (även kallad encellig gelelektrofores) är en alltmer populär metod för att detektera och kvantifiera cellulär DNA-skada.
Som enklast upptäcker den alkaliska kometanalysen (ACA) strängbrott (SB; både enkla och dubbla), tillsammans med apuriniska / apyrimidiniska platser och alkali-labila ställen (ALS) som båda blir enkelsträngade brott under alkaliska förhållanden5. Den neutrala pH-kometanalysen kan utvärdera uppriktiga enkel- och dubbelsträngsbrott6. Dessutom kan ACA, i kombination med ett antal DNA-reparationsenzymer, detektera ett betydande antal typer av DNA-skador, t.ex. oxiderade puriner (identifierade genom användning av humant 8-oxoguanin-DNA-glykosylas 1; hOGG17); oxiderade pyrimidiner (med användning av endonukleas III; EndoIII) och cyklobutanpyrimidindimerer (med användning av T4-endonukleas V; T4endoV)8. Kometanalysen kan också användas för att utvärdera DNA-lesioner inducerade av tvärbindningsmedel, såsom cisplatin 9,10,11. Som indikeras av analysens formella namn, dvs. encellsgelelektrofores, är analysen beroende av att cellerna som analyseras är en enda cellsuspension; Oftast är dessa odlade celler men kan isoleras från helblod 12,13, eller helblod i sig kan användas 14,15. Alternativt kan en encellssuspension genereras från fasta vävnader.
Bortsett från några få undantag, framför allt CometChip-rapporterna från Engleward lab 16, har det övergripande kometanalysprotokollet inte förändrats dramatiskt från det som ursprungligen beskrevs av analysens uppfinnare (Östling och Johansson17 och Singh etal.18). Kometanalysen omfattar många steg (figur 1). Många av dessa steg involverar överföring av de tunna, cellinnehållande agarosgelerna, en bild i taget, och utgör därför en risk för skada eller förlust av gelén, vilket äventyrar experimentets framgång. Följaktligen kan kometanalysen vara tidskrävande, särskilt om ett betydande antal bilder körs. Vanligtvis körs högst 40 bilder i en stor (33 cm x 59 cm x 9 cm) elektroforestank, som sitter i en ännu större bricka som innehåller våt is för kylning. Det har nyligen rapporterats att analystiden kan förkortas till 1 dag genom att minska lysstegets varaktighet och inte torka bilderna före färgning19.
De nuvarande författarna har tidigare rapporterat ett nytt tillvägagångssätt för alkalisk kometanalys med hög genomströmning (HTP ACA), där flera (satser av 25) kometanalysmikroskopglas kan manipuleras samtidigt under hela kometanalysprocessen20,21,22. Detta patenterade tillvägagångssätt minimerar risken för skador på eller förlust av de provinnehållande gelerna genom att ta bort behovet av att manipulera mikroskopglasen individuellt och kan appliceras på alla varianter av kometanalysen, som använder mikroskopglas. De glidinnehållande ställen skyddar gelerna under manipulationerna, och följaktligen är provbearbetningen snabbare och effektivare. Bilderna kan också genomgå elektrofores i ställen, som hålls i vertikal, snarare än horisontell, orientering. Denna och integrerade kylning minskar avsevärt elektroforestankens fotavtryck och tar bort behovet av våt is. Sammantaget innebär detta en betydande förbättring jämfört med det konventionella förfarandet. Den utrustning som används illustreras i figur 2. De protokoll som beskrivs här, med hjälp av detta nya tillvägagångssätt, visar den representativa tillämpningen på odlade celler och helblod14 för detektion av alkali-labila platser (ALS), DNA-tvärbindningar (ICL) och substraten för olika DNA-reparationsenzymer.
Protocol
Kommersiellt tillgängliga blodprover användes i den aktuella studien. Vid vår institution krävs inte godkännande från den institutionella granskningsnämnden för användning av kommersiellt tillgängligt blod.
1. Beredning av material för kometanalysen
- Beredning av mikroskopglasen
- Häll 1% (w/v) normal smältpunkt agaros [upplöst i dubbeldestillerat vatten (ddH2O)] i ett 50 ml rör och mikrovågsugn för att lösa upp agarosen i ddH2O. Förvara vid 37 °C för att förhindra stelning före beläggningsglas. Om stelning skulle inträffa, kassera och förbered färskt.
- Pre-coat mikroskop glider genom att doppa glasen i 50 ml röret som innehåller 1% (w / v) normal smältpunkt agaros.
- Torka av baksidan av bilderna snabbt efter att du har doppat bilderna.
OBS: Underlåtenhet att torka av baksidan av bilderna ordentligt kommer att öka bakgrundsbruset på bilderna under analysen steg för mikroskop. - Märk den belagda bilden med en permanent markör i det nedre högra hörnet av den frostade delen (bild 3A). Detta visar vilken sida av bilden som är förbelagd.
- Låt agarosen stelna och torka över natten vid rumstemperatur.
- Vik in de torkade bilderna i silkespapper och förvara dem i en låda.
2. Beredning av prover
- Odlade celler
OBS: För det första, behandla celler med det eller de skadliga medlen innan kometanalysen påbörjas. Utför sedan följande.- Om cellerna är vidhäftande, trypsinisera cellerna för att frigöra dem från cellodlingskolven eller cellodlingens petriskålar, vid lämplig sammanflöde av celler. Neutralisera trypsin genom att tillsätta seruminnehållande media.
- Överför cellerna till ett 50 ml rör, centrifugera (t.ex. för HaCaTs, centrifugera vid 300 x g i 5 minuter vid rumstemperatur), ta försiktigt bort supernatanten och tillsätt 1 ml PBS till cellpelleten.
- Utför cellräkning.
- Överför 30 000 celler till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och centrifugera vid 7 607 x g i 5 minuter vid 4 °C.
- Ta försiktigt bort supernatanten och förvara cellpelleten på is i mörkret innan du utför kometanalysen.
OBS: Celler bör regelbundet testas för Mycoplasma-kontaminering innan de utför kometanalysen för att bland annat förhindra bildandet av artefaktiska DNA-skador och förändrad DNA-skaderespons, som rapporterats någon annanstans23. Centrifugeringsförhållandena kan ändras vid behov beroende på vilken celltyp som används.
- Beredning av odlade celler för reparationsanalys
- Odlingsceller i cellodlingskolven eller petriskålarna.
- Tvätta cellerna med 1 ml PBS två gånger innan cellerna behandlas med skadliga ämnen (t.ex. för BE-M17-celler, behandla med 50 μMH2O2i 20 min) på is för att förhindra att reparationen sker under behandlingen.
- Tvätta cellerna försiktigt med 1 ml PBS två gånger för att avlägsna eventuella kvarvarande skadliga ämnen.
- Återinför cellodlingsmediet och låt cellerna reparera under varierande varaktighet (t.ex. 0 min, 30 min, 2 h, 6 h, 24 h och 30 h) i en fuktad inkubator (37 ° C, 5% CO2).
- Samla vid varje tidpunkt 30 000 celler i 10% dimetylsulfoxid (DMSO) -innehållande cellodlingsmedium och förvara dem vid -80 ° C.
- Innan kometanalysen utförs ska cellerna tinas snabbt vid 37 °C i ett vattenbad och centrifugeras vid 7 607 x g i 5 minuter vid 4 °C.
- Ta bort supernatanten och förvara cellpelleten på is innan analysen utförs (dvs. från steg 3).
- Beredning av helblod
OBS: Följande metod drar nytta av att i) vara ett minimalinvasivt tillvägagångssätt för att ta ett blodprov, ii) inte kräver isolering av PBMC före kometanalysen och iii) tillåta att blodproverna (med en volym < 250 μl) lagras vid -80 °C i upp till 1 månad (även om nyare bevis tyder på att längre lagring är möjlig), utan behov av kryokonserveringsmedel och utan risk eller artefaktisk skadebildning14. Etiskt godkännande, eller motsvarande, kan behövas innan blodprover tas från patienter eller djur. Alternativt kan kommersiellt tillgängliga blodprover användas som i den aktuella studien. Vid vår institution krävs inte godkännande från den institutionella granskningsnämnden för användning av kommersiellt tillgängligt blod.- Överför med pipett helblodsprover (<250 μL) (materialtabell) till ett uppsamlingsrör som innehåller en minimal volym innehållande 0,4 mg EDTA (per 250 μl blod).
- Frys blodproverna vid -80 °C innan HTP-kometanalysen utförs.
- Tina lagrade blodprover (<250 μL) vid rumstemperatur, utan uppvärmning.
- Överför 5 μl av helblodet till mikrocentrifugrör innan kometanalysen utförs (se steg 3).
3. Celllys
OBS: Utför alla procedurer på is.
- Använd 12 000 celler eller 2,5 μl helblod per gel.
- Förbered 0,6% (w / v) låg smältpunkt agaros upplöst i PBS med en mikrovågsugn och placera i ett vattenbad vid 37 ° C för att förhindra att det stelnar.
- Märk den frostade änden av de förbelagda objektglasen med prövarens namn, datum och behandlingsinformation med hjälp av en permanent markör eller penna.
- Placera en kylplatta på en plan bänk och för in de två frysta kylpaketen i den glidande lådan under metallytan (som visas i figur 4)21.
- Placera objektglasen på kylplattan och låt glasen förkylas i 1–2 minuter innan de 0,6 % (w/v) gasalosinnehållande cellerna med låg smältpunkt tillsätts (steg 3.7).
OBS: Om du lämnar objektglasen på kylplattan i mer än 1-2 minuter kan kondens bildas på glidytan på grund av omgivande fuktighet. Detta kan göra den låga smältpunkten agarosgeler mindre stabila på bilderna. - Sprid pelleten (steg 2.2.7) genom virvelbildning. Se till att all supernatant har tagits bort från pelleten. Placera provrören (som innehåller de pelleterade cellerna) omedelbart tillbaka på is.
OBS: När du placerar de provinnehållande rören i centrifugen, placera dem med gångjärnet utåt så att pelleten kommer att samlas upp på denna sida av röret. Ibland är det svårt att se pelleten, och det är lätt att lossa den medan du tar bort supernatanten. Centrifugering med rörlocket i denna riktning gör att man kan veta var cellpelleten kommer att vara. - Återsuspendera cellpelleten med 200 μl 0,6% mageros med låg smältpunkt (LMP agaros) och blanda genom att pipettera upp och ner utan att skapa bubblor. Överför sedan snabbt 80 μL LMP-agarosinnehållande celler till en kyld bild och placera snabbt en täckskiva på gelén.
- Låt gelén stelna på kylplattan i 1-2 min.
- Under tiden förbereder du en 500 ml arbetslösning av lysbuffert (tabell 1) och häller den i lysskålen (figur 2).
- När gelerna har ställts in, ta bort täckglasen snabbt genom att försiktigt hålla glidningen mellan tummen och pekfingret och skjuta täckglaset från gelén.
- Placera de objektglas som innehåller proverna inuti glidbäraren (alla svarta "punktmärken" på objektsglasen ska vara vända i samma riktning när de placeras i en bärare) (figur 3B) och placera sedan glidbäraren inuti lysskålen (figur 2).
- Stäng locket på lysisskålen och förvara lysisskålen i kylen över natten vid 4 °C eller 30 min vid rumstemperatur, beroende på vad som bäst passar operatörens tidsplan19.
4. Elektrofores
- Ta försiktigt bort glidbäraren från lysskålen. Var försiktig så att du inte stör gelerna.
- Placera försiktigt glidhållaren i en diskbänk förinstallerad med iskall ddH2O och låt den stå i 30 minuter så att rutschkanorna är helt täckta med ddH2O.
- Sätt i ett fryst kylpaket inuti skjutlådan under elektroforestanken för att bibehålla optimal bufferttemperatur.
- Tillsätt försiktigt iskall elektroforesarbetslösning (tabell 1) till elektroforestanken och överför glidbäraren till elektroforestanken. Orientera objektglasen så att deras tydliga delar med de cellinnehållande gelerna (dvs. INTE de frostat / märkningsändarna) pekar mot katoden (röd elektrod).
- Låt bilderna sitta i elektroforestanken i 20 minuter så att DNA slappnar av och varvar ner. Håll strömförsörjningen avstängd under detta steg.
- Om det behövs, sätt in ett nytt fryst kylpaket för att maximera kylningen.
- Utför elektrofores i 20 min vid 1,19 V/cm, eller vilka förhållanden som helst som har optimerats.
OBS: Optimering av elektrofores körförhållanden och volym av buffert rekommenderas för varje laboratorium24. Att endast använda en enda glidbärare under elektrofores orsakar ingen effekt av bilder på elektroforesbuffertens motstånd, och författarna såg ingen signifikant effekt på spänningen eller strömmen när antalet bilder ändrades. - Stäng av strömförsörjningen, ta försiktigt bort glidbäraren från elektroforestanken och låt den rinna av på silkespapper i 30 s.
- Placera glidbäraren i skålen som innehåller neutraliseringsbuffert (tabell 1). Låt den stå i 20 min.
- Ta bort glidbäraren från neutraliseringsskålen, lägg den i tvättfatet som innehåller iskall ddH2O och låt den stå i 20 minuter.
- Ta bort glidbäraren från vattnet och låt rutschkanorna torka i en kuvös vid 37 °C i 1 timme, eller vid rumstemperatur över natten, eller torka inte, beroende på operatörens schema19.
OBS: Om det inte finns någon torkning i steg 4.11, utför färgningssteget från 5.2.
5. Propidiumjodid (PI) färgning
- Överför glidbäraren till en tvättfat som innehåller iskall ddH2O för att rehydrera glasrutschkanorna och låt stå i 30 minuter.
- Placera glidbäraren i en färgform som innehåller 2,5 μg/ml propidiumjodidlösning.
OBS: Propidiumjodid är ljuskänslig, så hantera det i ett mörkt område. Det är också giftigt. - Stäng locket på färgningsskålen och inkubera det i 20 minuter i mörkret vid rumstemperatur.
- Överför glidbäraren till en separat skål och tvätta den med iskall ddH2O i 20 min.
- Ta bort glidbäraren från skålen och torka den helt i mörker, antingen i en 37 °C inkubator eller vid rumstemperatur, beroende på operatörens schema eller önskemål.
- När bilderna är helt torkade tar du bort dem från glidbäraren och förvarar dem i en bildruta i mörkret tills de är klara för bildanalys.
OBS: Bilderna förblir läsbara på obestämd tid och kan färgas om vid behov.
6. Enzymmodifierad alkalisk kometanalys
OBS: Den enzymmodifierade alkaliska kometanalysen använder ett enzymbehandlingssteg efter lys men före elektrofores. Enzymets aktivitet orsakar brott i DNA på platser som är substrat för enzymet. Innan denna analys utförs måste enzymkoncentrationen och varaktigheten av enzyminkubation optimeras.
- Efter celllysen (steg 3), tvätta glas två gånger med iskall ddH2O i 20 min vardera.
- Ta bort glidbäraren från vattnet och överför bilderna till en bricka fodrad med pappershanddukar.
- Tillsätt 80 μl av enzymet vid den optimerade koncentrationen (t.ex. 3,2 U/ml hOGG1 för BE-M17-celler, utspädd i enzymreaktionsbuffert) och täck med ett täckglas för att sprida enzymet över det gelinnehållande provet.
- Inkubera objektglasen vid 37 °C under optimerad varaktighet (t.ex. 45 minuter för hOGG1).
- Efter inkubation, ta bort täckglasen försiktigt och överför bilderna till bäraren.
OBS: Tvätta inte objektglasen efter enzymbehandling; Utför direkt elektrofores från steg 4.3.
7. DNA-intersträngtvärbindningar (ICL) -modifierad alkalisk kometanalys
OBS: Konceptet med denna variant av ICL-ACA är att närvaron av ICL i DNA kommer att fördröja den elektroforetiska migrationen av skadat DNA, inducerat efter exponering för en oxidativt genererad förolämpning. I detta fall, ju kortare kometsvans, desto större antal ICL25,26,27,28.
- Behandla celler med ett reagens som inducerar ICL (t.ex. cisplatin; se tilläggsfil).
- Exponera de behandlade cellerna med ett av följande medel för att inducera tillräckliga strängbrott för att skapa en kometsvans av lämplig storlek (~ 20% svans-DNA): väteperoxid (50 μMH2O2i 30 min), joniserande strålning (2-5 Gy) eller Ultraviolett B (UVB) (0,5 J / cm2).
- Dessutom producera en strängbrytande positiv kontroll genom att behandla en sats celler med samma medel och dos, som används i steg 7.2 (dvs. ingen behandling med ICL-inducerande medel).
- Centrifugera cellerna vid 7 607 x g i 5 minuter, kassera supernatanten, tvätta cellpelleten tre gånger med 1 ml PBS och bearbeta som för den alkaliska kometanalysen (steg 3-5).
- Beräkna nivåer av DNA-tvärtvärsbindning med hjälp av formeln nedan.
OBS: MOTM (Mean Olive Tail Moment) är en kometanalysslutpunkt som ofta används vid beskrivningen av den ICL-modifierade kometanalysen och definieras som produkten av svanslängden och fraktionen av totalt DNA i svansen (dvs. svansmoment = svanslängd x % av DNA i svansen)29; TMdi: svansmoment för prover som behandlats med både tvärbindningsmedel ochH2O2(eller annan strängbrytarinducerare). TMcu: svansmoment för prover som inte behandlats med ett tvärbindningsmedel och inte behandlats medH2O2(ingen behandling), och TMci: svansmoment för prover som inte behandlats med ett tvärbindningsmedel men behandlats medH2O2.
8. Kometpoäng och dataanalys
OBS: Termen "komet" härrör från bilderna av skadade celler när de ses under ett mikroskop efter att analysen har utförts (figur 5). Under elektroforesförhållanden migrerar DNA i de oskadade cellerna till stor del inte, utan förblir i en sfäroid som kallas komet "huvud". Närvaron av strängbrott gör det emellertid möjligt för cellens DNA att migrera ut ur huvudet och bilda en "svans", vilket leder till ett utseende som en komet (figur 5). Ju mer DNA i svansen, desto mer skada är närvarande.
- Slå på fluorescensmikroskopet med PI (rött) filter (λ = 536/617 nm) och kometanalysprogramvaran.
- Tillsätt en droppe vatten med en Pasteur-pipett till gelén och täck med en täckglas.
- Placera bilderna i fluorescensmikroskopet och "poängsätt" kometerna.
OBS: Poängsättning är ett sätt på vilket kometer bedöms, för att bestämma mängden skada som finns i varje komet. I stort sett kan detta uppnås genom att använda två tillvägagångssätt, enligt användarens valda preferens, antingen med ögat (mäta storleken på kometer på en skala från noll till fyra) eller genom att använda fritt eller kommersiellt tillgänglig programvara30. I allmänhet bedömer båda metoderna storleken på kometsvansen, även om en mängd olika kometrelaterade slutpunkter kan bestämmas. Om du använder programvaran klickar du på mitten av komethuvudet och väntar tills programvaran upptäcker kometen automatiskt och bedömer sedan den valda slutpunkten (figur 5). - Poäng 50 kometer per gel och 100 kometer per prov (dvs. varje prov motsvarar olika DNA-skadliga behandlingar eller deras replikat).
- Replikera experimenten (n = 2) eller tredubbla experimenten (n = 3).
OBS: Om endast n = 2 replikatexperiment utförs kan statistisk analys inte utföras, men om n = 3, utför D'agostino-normalitetstestet. De flesta kometanalysdata klarar inte ett normalitetstest. Använd i så fall ett icke-parametriskt test (Kruskal-Wallis-test med Dunns test med flera jämförelser och Mann-Whitney testar signifikansen inställd på p < 0,05).
Representative Results
Optimering av elektroforesspänningen för HTP ACA
Humana keratinocyter (HaCaTs; Tabell över material) bestrålades med olika doser av ultraviolett A-strålning (UVA) (5 eller 10 J/cm2; Figur 6A), UVB (0,5 eller 1 J/cm2; Figur 6B), eller behandlad med 50 μMH2O2(figur 6C) för att framkalla skador. Tre olika spänningar i elektroforesen testades för att bestämma den optimala spänningen för elektrofores. Resultaten från alla tre DNA-skadliga behandlingar avslöjade att medan alla spänningar genererade linjära dossvar, erhölls det mest känsliga svaret med 1,19 V / cm. HaCaTs visade den högsta DNA-skadan vid baslinjen med 1,19 V/cm under elektrofores jämfört med 1 V/cm och 1,09 V/cm (figur 6A-C). Med 1,19 V/cm ses dessutom det största % svans-DNA:t, efter alla skadliga behandlingar (figur 6)31.
Detektion av DNA-skador i humant helblod med hjälp av Fpg modifierad HTP ACA
Humant wholdblod (Materialtabell) bestrålades med olika doser på 10 J/cm2 UVA för att framkalla skador. Fyra olika koncentrationer av Fpg (1, 2, 4 eller 8 U/ml) användes för att bestämma den optimala koncentrationen för enzymbehandling i HTP ACA. Resultaten visade att de optimala nivåerna av DNA-skador avslöjades med 4 U/ml Fpg (figur 7A). Representativa kometbilder från UVA-bestrålade blodprover (figur 7B).
Detektion av DNA ICL i en representativ äggstockscancer cellinje med hjälp av ICL-modifierad HTP ACA
En äggstockscancer cellinje (SKOV-3; Tabell över material) behandlades med kombinationer av 200 μM cisplatin och/eller efterföljande behandling med 50 μMH 2O2i 30 min på is. Inga märkbara skador noterades i de oexponerade cellerna (figur 8A). Exponering för enbartH2O2genererade en signifikant MOTM (figur 8B). Däremot visade cellerna i vilka ICL inducerades en minskad MOTM (figur 8C)28.
Bildning och reparation av cisplatininducerad DNA ICL i en representativ cellinje för äggstockscancer
Den ICL-modifierade HTP ACA användes för att bestämma tidsförloppet för DNA ICL-bildning och reparation inducerad av cisplatin i en äggstockscancer cellinje (A2780; Tabell över material). Cellerna behandlades med 100 μM cisplatin i 1 timme och inkuberades sedan i cisplatinfria medier (RPMI 1640-medium kompletterat med 10% (v/v) fetalt bovint serum (FBS)) för en efterföljande tidskurs. Vid olika tidpunkter utfördes den ICL-modifierade HTP ACA för att fastställa nivåerna av ICL (Figur 9)28. Ingen ICL upptäcktes före cisplatinbehandling. Men efter en enda behandling med 100 μM cisplatin ökade ICL-nivåerna signifikant och nådde en topp på 12 timmar, varefter nivåerna sjönk tillbaka till noll efter 30 h.
Korrelation mellan DNA ICL och DNA-platinanivåer
Tre äggstockscancerceller behandlades med 100 μM cisplatin för att inducera olika nivåer av DNA-ICL, före analys av ICL-modifierad HTP ACA och induktivt kopplad masspektrometri (ICP-MS; se tilläggsfil för detaljer). Som visas i figur 10 inducerades olika nivåer av DNA-ICL i de tre cellinjerna, tillsammans med olika nivåer av Pt i DNA. En positiv korrelation (R2 = 0,9235) observerades mellan DNA ICL-nivåer och platinakoncentrationer, vilket indikerar sambandet mellan DNA-platinanivåer och motsvarande ICL28.
Basexcisionsreparation i Mycoplasma-infekterade och oinfekterade BE-M17-celler
Mykoplasmainfekterade och oinfekterade BE-M17-celler behandlades med 50 μMH2O2i 30 minuter och inkuberades med komplett medium (Dulbeccos modifierade Eagles medium kompletterat med 10% (v / v) FBS) under olika varaktigheter (0 min, 30 min, 1 h, 2 h, 6 h, 24 h eller 30 h) under vilka celler fick reparera. Vid varje tidpunkt samlades cellerna upp och frystes vid -80 °C, i ett 10% DMSO-innehållande medium, innan hOGG1-modifierad HTP ACA (steg 6) utfördes. Efter 30 min hade nivåerna av SB/ALS minskat till 21% TD (procentuellt svans-DNA) i de oinfekterade cellerna, medan de infekterade cellerna visade 49% TD (figur 11A). Efter ~15 timmar hade nivåerna av SB/ALS återgått till baslinjen i både infekterade och oinfekterade celler. För de oxiderade purinerna visade den oinfekterade BE-M17 initialt en liten ökning av skadorna innan den återvände till baslinjen inom 30 timmar (figur 11B). Däremot visade de infekterade cellerna en ihållande, signifikant ökning av oxiderade puriner, som förblev förhöjda och inte återgick till baslinjenivåerna även efter 30 timmar (figur 11B)23.
Figur 1: Översikt över det konventionella alkaliska kometanalysförfarandet . i) En encellssuspension av odlade celler eller ett prov av helblod blandas med 0,6 % (w/v) LMP-agaros. ii) Cell/agarosblandningen appliceras på förbelagda mikroskopglas och täcks med täckglas tills det stelnat. (iii) Cellerna lyseras med hjälp av en hög pH-lysbuffert över natten och bildar nukleoidkroppar innan (iv) tvättas medddH2O. (v) Det cellulära DNA:t varvar ner i den höga pH-elektroforesbufferten. Närvaron av strängbrytningar gör att DNA kan slappna av och varva ner, och under elektrofores dras DNA ut ur nukleoidkroppen och bildar en svans. Glasrutschkanorna dräneras sedan, torkas, vii) neutraliseras och viii) tvättas medddH2Oinnan (ix) torkas över natten. Objektglas rehydreras sedan (x) medddH2O, (xi) färgas, (xii) tvättas och slutligen (xiii) poängsätts och analyseras, vanligtvis med hjälp av fluorescerande mikroskopi och bildanalysprogramvara. Denna siffra återges från en tidigare publikation20. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: De material som ingår i kometelektroforessystemet med hög genomströmning. HTP elektrofores tank, HTP rack, och diskarna för lys, tvätt, neutralisering, och färgning visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Representativa bilder av en kometanalysglas och HTP-rack (mikroskopglasbärare). (A) För korrekt orientering känns den förbelagda ytan på mikroskopbilden igen av en svart prick i det högra hörnet av en mikroskopbild. (B) Bilden av HTP-racket illustrerar hur bilderna hålls i en snäv vertikal orientering, med flikar på bäraren för att fixera dess orientering i elektroforestanken. Varje bärare rymmer upp till 25 bilder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Representation av kylplattan med provglas och frysförpackningar på plats. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Skärmbild av representativa kometer tagna under poängsättningen. HaCaTs (A) utan behandling och (B) behandlas med 1 J/cm2 UVB innan HTP ACA utförs. De flesta programvarupaket kan beräkna en mängd olika kometslutpunkter, men de vanligaste är % svans-DNA (föredraget) eller svansmomentet baserat på dessa bilder (blå: huvudets början, grön: mitten av huvudet och lila: svansens ände). Skalstrecket är 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Representativa grafer som illustrerar effekten av elektroforesspänning på procentuellt svans-DNA, bestämt med hjälp av HTP ACA. Cellerna exponerades för (A) 5 eller 10 J/cm 2 UVA, (B) 0,5 eller 1,0 J/cm2 UVB, eller (C) 50 μMH2O2före HTP ACA, med elektroforesspänningen vid antingen 1, 1,09 eller 1,19 V/cm. Data representerar medelvärdet av 200 bestämningar från n = 2 dubbla experiment31. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Representativa graf- och kometbilder av humant blod som analyserats av fpg-modifierad HTP ACA. Humana blodprover bestrålades med 10 J/cm2 UVA eller skenbestrålades ("ctrl") på is före lyssteget. Olika koncentrationer av Fpg (1, 2, 4 eller 8 U/ml) användes för enzymbehandlingen före elektrofores. (A) Data representerar medelvärdet ± SEM på 300 bestämningar från n = 3-experiment. B) Representativa bilder av kometer för varje koncentration av Fpg i 10 J/cm2 UVA-bestrålade blodprover. Skalstrecket är 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8: Representativa kometbilder som illustrerar ICL-detektion efter cisplatinbehandling. (A) Kontrollceller utan behandling, (B) celler som endast behandlats medH2O2(50 μM), (C) celler som behandlats medH2O2(50 μM) och cisplatin (200 μM), vilket illustrerar att svansen är kortare än i (B), på grund av närvaron av ICL28. Skalstrecket är 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 9: Demonstration av kinetiken för cisplatininducerad ICL-bildning och reparation. A2780-celler behandlades med 100 μM cisplatin i odlingsmediet i 1 timme. Det cisplatininnehållande mediet avlägsnades sedan och cellerna odlades under olika tidpunkter innan de analyserades av ICL-modifierad HTP ACA. Data representerar medelvärdet ± SEM från n = 3 experiment28. P < 0,0001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 10: Korrelation mellan DNA ICL och platinakoncentration. DNA ICL bestämdes av ICL-modifierade HTP ACA och platinanivåer mättes av ICP-MS (med Single Quad-Kinetic Energy Discrimination, SQ-KED), i tre äggstockscancercellinjer. R2 = 0,9235. Se kompletterande fil för ICP-MS-metodik för att kvantifiera platinanivåer i DNA28. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 11: En representativ graf som illustrerar DNA-skador och reparation, bestämd av den hOGG1-modifierade kometanalysen, i Mycoplasma-infekterade kontra oinfekterade BE-M17-celler. Efter behandling med 50 μMH2O2i 30 min fick cellerna reparera under olika varaktigheter (0, 30 min, 1 h, 2 h, 6 h, 24 h eller 30 h). Den hOGG1-modifierade HTP ACA användes för att mäta (A) SB/ALS och (B) oxiderade puriner i infekterade (röda datapunkter) och oinfekterade (svarta datapunkter) BE-M17 celler. Data representerar medelvärdet av 200 bestämningar från n = 2 dubbla experiment. Denna siffra återges med tillstånd från en tidigare publikation23. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Reagens | Lagerlösning | Arbetslösning | |
| Lysis buffert | 100 mM Na 2 EDTA, 2,5 M NaCl och 10 mM Tris Bas i ddH2O; justera pH till 10 med 10 M NaOH | 1% Triton X-100 i lyslagerlösning | |
| Elektrofores buffert | 10 M NaOH och 200 mM Na 2 EDTA i ddH2O | 300 mM NaOH och 1 mM Na2EDTA; pH > 13 | |
| Neutraliseringsbuffert | 0,4 m Tris-bas iddH2O; justera pH till 7,5 med HCl | ||
| Färgning buffert | 1 mg/ml propidiumjodid | 2,5 μg/ml propidiumjodid iddH2O | |
Tabell 1: Sammansättning av reagenser som används i HTP ACA. Lager- och arbetskoncentrationerna av lys, elektrofores, neutralisering och färgningsbuffertar visas.
Kompletterande fil. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Denna studie visar mångsidigheten som tillhandahålls av den nuvarande utrustningen, som kan användas för att uppnå hög genomströmning med en mängd representativa, vanliga varianter av kometanalysen (dvs. alkalisk, enzymmodifierad, blod och ICL, och andra varianter kommer också att vara lämpliga). Dessutom medför detta tillvägagångssätt flera fördelar 20,21: (a) analyskörningstiden minskar på grund av manipulering av flera bilder parallellt (hanteringstiden minskar med60%); b) risken för skador på geler och därmed risken för försöket minskar, c) Reagensbehovet minskar (t.ex. elektroforesbehållarens volym är mindre än den konventionella tanken). d) antalet rutschkanor som körs ökas. En tank kan ge en 20% ökning av antalet körda bilder jämfört med en enda konventionell tank; emellertid kan flera elektroforestankar köras eller slavas (dvs. flera tankar som styrs av en enda strömförsörjning), parallellt från samma strömförsörjning, och kräver fortfarande ett bänkavtryck som är mindre än en enda konventionell tank med isbricka; och (e) tankens fotavtryck minskar på grund av vertikal orientering av glidbanor och integrerad kylning (sparar labbutrymme); HTP-tanken består av en högpresterande keramisk kylbas med en glidlåda som kan passa ett fryst kylpaket för att bibehålla optimal bufferttemperatur utan att behöva utföra processen i ett kylrum.
Dessutom rymmer kylplattan som utvecklats av oss 26 kometglas, möjliggör snabb stelning av den låga smältpunkten agaros på kometanalysglasen och underlättar en enkel hämtning av objektglasen efter att agarosgelén har stelnat. Ovanstående innovationer gör kometanalysprocessen enklare och enklare.
Medan andra metoder med hög genomströmning har utvecklats (t.ex. 12-gelkometanalys, CometChip eller 96 minigelformat)25, föredrar många forskare att använda de konventionella mikroskopglasen (som inkluderar de kommersiellt tillgängliga förbelagda bilderna eller andra specialiserade bilder). Det nuvarande tillvägagångssättet kan rymma alla typer av mikroskopglas, vilket gör att experiment med dessa bilder kan skalas upp genom snabbare bildbearbetning och hantering. Som nämnts ovan ger HTP-kometsystemet många fördelar, men det finns en anmärkningsvärd begränsning: det nuvarande tillvägagångssättet ger endast en 20% ökning av antalet prover som körs, jämfört med en konventionell horisontell tank (även om bearbetning av bilder är mycket snabbare). CometChip- och 96 mini-gel-formaten kör ett större antal prover. Hittills vet vi inte om det nuvarande tillvägagångssättet kan rymma CometChip- eller 96 mini-gelformat, även om vi förutspår att det kommer att göra det. Som nämnts ovan kan antalet prover ökas ytterligare genom att slava tankar till en enda strömförsörjning. Som med alla tillvägagångssätt finns det fortfarande en chans att förlora eller skada gelerna medan du laddar prover och analyserar dem under mikroskopet, men detta beror mer på operatörsfel, och chanserna för detta minimeras med det nuvarande tillvägagångssättet.
Användningen av HTP-kometsystemet kan i hög grad hjälpa till att analysera DNA-skador, underlätta användningen av kometanalysen i ett brett spektrum av applikationer, såsom molekylär epidemiologi, manlig reproduktionsvetenskap, genotoxikologiska studier och miljötoxikologi. Detta gäller särskilt för de användare som vill ha alla fördelar med förbättrad genomströmning och användarvänlighet utan att gå bort från de välbekanta, kostnadseffektiva, konventionella mikroskopglasen.
Disclosures
Dr. Cooke och Dr. Karbaschi är uppfinnare på tre beviljade patent relaterade till de tekniker som beskrivs här.
Acknowledgments
Det arbete som rapporteras i denna publikation stöddes delvis av National Institute of Environmental Health Sciences vid National Institutes of Health under prisnummer: 1R41ES030274. Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis den officiella uppfattningen från National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22 x 22 mm glass coverslips | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA | 631-0124 | |
| A2780 | ECACC, Louis, MO, USA |
93112519 | |
| Concentrated nitric acid (OptimaTM grade) | Fisher Scientific Fair Lawn, NJ, USA | A467-250 | |
| Fluorescence microscope equipped with a camera | Zeiss, Jena, Germany | ||
| Fresh human whole blood | Zen Bio Inc | SER-WB10ML | Commercial human whole blood sample |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, San Diego, California | Data analysis software | |
| HTP Comet Assay system | Cleaver Scientific | COMPAC- 50 | |
| Human Keratinocyte (HaCaTs) | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA | Discontinued | Can be purchased from another company ADDEXBIO TECHNOLOGIES Cat# T0020001 |
| Hydrogen peroxide (H2O2) 30% in water |
Fisher Scientific, Hampton, NH, USA | BP2633-500 | |
| ICP-MS iCAP RQ ICP-MS system |
Thermo Scientific, Waltham, MA, USA |
IQLAAGGAAQFAQKMBIT | |
| Image and Data Analysis software | Perceptive Instrument, Bury St Edmunds, England, UK |
125525 | Free image analysis softwared is available e.g., ImageJ |
| Internal Standard Mix | SPEX Certiprep, Metuchen, NJ, USA |
CL-ISM1-500 | Bismuch (isotope monitored 209 Bi)-concnetration of 10 µg/mL in 5% HNO3 |
| Low melting point Agarose | Invitrogen Waltham, MA, USA |
P4864 | |
| Na2EDTA (disodium ethylenediaminetetraacetic acid) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA |
E5134 | |
| NaCl (Sodium chloride) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA |
S7653 | |
| NanoDrop One | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA |
701-058108 | Nanodrop for measuring DNA concentration |
| Nanopure Infinity Ultrapure Water System (Barnstead Nanopure) | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA |
D11901 | Ultrapure water (16 MΩ cm-1) |
| NaOH (sodium Hydroxide) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA |
E5134 | |
| Normal melting point Agarose | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA |
16520100 | For pre-coating slides |
| OCI-P5X | University of Miami, Miami, FL, USA |
N/A | Live Tumor Culture Core facility provided the cells |
| Platinum (Pt) reference standard | SPEX Certiprep, Metuchen, NJ, USA |
PLPT3-2Y | (1000 µg/mL in 10% HCl) containing Bismuch |
| Propidium Iodide (1.0 mg/mL in water) |
Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA |
12-541BP486410ML | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen Valencia, CA, USA |
51304 | DNA extraction Kit |
| Single-frosted glass microscope slides | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA |
12-541B | |
| SKOV3 | ECACC, Louis, MO, USA |
91091004 | |
| Slide box | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA |
03-448-2 | Light proof, to protect cells from the formation adventitious damage (according to the widely held view) and prevent fading of the fluorescent dye |
| Slide Chilling plate | Cleaver Scientific, Rugby, England, UK |
CSL-CHILLPLATE | |
| Treatment dish | Cleaver Scientific, Rugby, England, UK |
STAINDISH4X | |
| Tris-base | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA |
93362 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA |
BP151-500 | |
| Trypsin EDTA (0.5%) | Invitrogen Gibco, Waltham, MA, USA |
15400054 | |
| Vertical Slide Carrier | Cleaver Scientific, Rugby, England, UK |
COMPAC-25 |
References
- Cooke, M. S., Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Lunec, J. Oxidative DNA damage: mechanisms, mutation, and disease. The FASEB Journal. 17 (10), 1195-1214 (2003).
- Barnes, J. L., Zubair, M., John, K., Poirier, M. C., Martin, F. L.
- Evans, M. D., Cooke, M. S. Factors contributing to the outcome of oxidative damage to nucleic acids. Bioessays. 26 (5), 533-542 (2004).
- Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Cooke, M. S. Oxidative DNA damage and disease: induction, repair and significance. Mutatation Research. 567 (1), 1-61 (2004).
- Miyamae, Y., et al. Detection of DNA lesions induced by chemical mutagens using the single-cell gel electrophoresis (comet) assay. 2. Relationship between DNA migration and alkaline condition. Mutatation Research. 393 (1-2), 107-113 (1997).
- Angelis, K. J., Dusinská, M., Collins, A. R. Single cell gel electrophoresis: detection of DNA damage at different levels of sensitivity. Electrophoresis. 20 (10), 2133-2138 (1999).
- Duarte, T. L., Cooke, M. S., Jones, G. D. Gene expression profiling reveals new protective roles for vitamin C in human skin cells. Free Radical Biology & Medicine. 46 (1), 78-87 (2009).
- Karbaschi, M., et al. Rescue of cells from apoptosis increases DNA repair in UVB exposed cells: implications for the DNA damage response. Toxicology Research. 4 (3), 725-738 (2015).
- Wu, J. H., Jones, N. J. Assessment of DNA interstrand crosslinks using the modified alkaline comet assay. Methods in Molecular Biology. 817, 165-181 (2012).
- Merk, O., Speit, G. Detection of crosslinks with the comet assay in relationship to genotoxicity and cytotoxicity. Environmental and Molecular Mutagenesis. 33 (2), 167-172 (1999).
- Spanswick, V. J., Hartley, J. M., Hartley, J. A. Measurement of DNA interstrand crosslinking in individual cells using the Single Cell Gel Electrophoresis (Comet) assay. Methods in Molecular Biology. 613, 267-282 (2010).
- Saha, D. T., et al. Quantification of DNA repair capacity in whole blood of patients with head and neck cancer and healthy donors by comet assay. Mutation Research. 650 (1), 55-62 (2008).
- Giovannelli, L., Pitozzi, V., Riolo, S., Dolara, P. Measurement of DNA breaks and oxidative damage in polymorphonuclear and mononuclear white blood cells: a novel approach using the comet assay. Mutatation Research. 538 (1-2), 71-80 (2003).
- Al-Salmani, K., et al. Simplified method for the collection, storage, and comet assay analysis of DNA damage in whole blood. Free Radical Biology & Medicine. 51 (3), 719-725 (2011).
- Akor-Dewu, M. B., et al. Leucocytes isolated from simply frozen whole blood can be used in human biomonitoring for DNA damage measurement with the comet assay. Cell Biochemistry and Function. 32 (3), 299-302 (2014).
- Ge, J., et al. CometChip: a high-throughput 96-well platform for measuring DNA damage in microarrayed human cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e50607 (2014).
- Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochemical and Biophysical Reseach Communications. 123 (1), 291-298 (1984).
- Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Experimental Cell Research. 175 (1), 184-191 (1988).
- Karbaschi, M., et al. Evaluation of the major steps in the conventional protocol for the alkaline comet assay. International Journal of Molecular Sciences. 20 (23), 6072 (2019).
- Karbaschi, M., Cooke, M. S. Novel method for the high-throughput processing of slides for the comet assay. Scientific Reports. 4 (1), 7200 (2014).
- Karbaschi, M., Cooke, M. S. Chilling apparatus. USA patent. , 10690574 (2020).
- Cooke, M. S., Karbaschi, M. Method and apparatus for performing electrophoresis. USA patent. , 20160195494 (2019).
- Ji, Y., Karbaschi, M., Cooke, M. S. Mycoplasma infection of cultured cells induces oxidative stress and attenuates cellular base excision repair activity. Mutatation Research. 845, 403054 (2019).
- Møller, P., et al. Minimum Information for Reporting on the Comet Assay (MIRCA): recommendations for describing comet assay procedures and results. Nature Protocols. 15 (12), 3817-3826 (2020).
- Almeida, G. M., Duarte, T. L., Steward, W. P., Jones, G. D. Detection of oxaliplatin-induced DNA crosslinks in vitro and in cancer patients using the alkaline comet assay. DNA Repair (Amst). 5 (2), 219-225 (2006).
- Moneef, M. A., et al. Measurements using the alkaline comet assay predict bladder cancer cell radiosensitivity. British Journal of Cancer. 89 (12), 2271-2276 (2003).
- Bowman, K. J., et al. Comet assay measures of DNA damage are predictive of bladder cancer cell treatment sensitivity in vitro and outcome in vivo. International Journal of Cancer. 134 (5), 1102-1111 (2014).
- Abdulwahed, A. M. S. Investigation of DNA Damage and Genomic Organization in the Cellular Response to Platinum Chemotherapy. , Florida International University. Doctor of Philosophy thesis (2020).
- Olive, P. L., Banáth, J. P., Durand, R. E. Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the "comet" assay. Radiation Research. 122 (1), 86-94 (1990).
- Kumaravel, T. S., Vilhar, B., Faux, S. P., Jha, A. N. Comet Assay measurements: a perspective. Cell Biology and Toxicology. 25 (1), 53-64 (2009).
- Ji, Y. Formation and Repair of Environmetally-induced damage to Mitochondrial and Nuclear Genomess. , Florida International University. Doctor of Philosophy thesis (2020).
