Instaurazione di arresto circolatorio ipotermico profondo nei ratti

L'arresto circolatorio ipotermico profondo (DHCA) è stato utilizzato in cardiochirurgia dal 1953¹_. Il DHCA comporta la riduzione della temperatura interna del paziente a livelli profondamente ipotermici (15-22 ° C) prima di interrompere globalmente il flusso sanguigno al corpo². L'arresto circolatorio può fornire un campo operativo relativamente incruento. L'ipotermia profonda diminuisce il metabolismo, specialmente nel cervello e nel miocardio, che è un metodo efficace di protezione contro l'ischemia³. Il DHCA è comunemente applicato durante gli interventi chirurgici per cardiopatia congenita complessa, malattia dell'arco aortico e persino tumori renali o surrenali con un trombo della vena cava ^4,5. Pertanto, la definizione di modelli animali DHCA fornisce un riferimento importante per il perfezionamento della procedura e la prevenzione delle complicanze in ambito clinico.

Sebbene i modelli possano essere stabiliti con cani⁶, conigli⁷ e altri animali, è preferibile utilizzare ratti a causa della loro operabilità e basso costo. Il modello di ratto DHCA è stato descritto per la prima volta nel 2006 da Jungwirth et ^al.8. È stato riscontrato che la durata dell'arresto circolatorio ha avuto un impatto sugli esiti neurologici. Da allora, i modelli di ratto DHCA sono stati ampiamente studiati. È stato chiarito che il DHCA potrebbe provocare la sindrome da risposta infiammatoria sistemica (SIRS)⁹. In studi successivi, i farmacologi hanno scoperto che la neuroinfiammazione correlata al DHCA indotta da SIRS potrebbe essere attenuata dal resveratrolo¹⁰ e dal triptolide¹¹. Il nostro team ha anche scoperto che la neuroinfiammazione correlata al DHCA potrebbe essere attenuata inibendo la proteina legante l'RNA inducibile dal freddo¹². Nel sistema cardiovascolare, la superossido dismutasi ha un effetto cardioprotettivo sulle lesioni da ischemia/riperfusione (I/R) durante il DHCA¹³. Questi risultati hanno ampliato la comprensione dei processi fisiopatologici correlati al DHCA e hanno offerto nuove direzioni per migliorare i risultati del DHCA. Tuttavia, i risultati riguardanti l'endotossiemia, lo stress ossidativo e l'autofagia dopo DHCA sono inconcludenti. DHCA utilizza la stessa tecnologia operativa del bypass cardiopolmonare (CPB)¹⁴, ma la sua strategia di gestione è diversa e le fasi per generare DHCA differiscono tra i vari team 8,9,10,11. Il presente studio mira a fornire un metodo per stabilire la procedura DHCA nei ratti.

I protocolli sono stati sottoposti a una revisione istituzionale e hanno ricevuto l'approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali, dell'ospedale Fuwai, dell'Accademia cinese delle scienze mediche (FW-2021-0005). Tutte le procedure sperimentali sono state eseguite in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio pubblicata dal National Institutes of Health.

NOTA: I ratti maschi di Sprague-Dawley (peso: 500-600 g, età: 12-14 settimane) sono stati tenuti in condizioni di laboratorio standard con libero accesso al cibo e all'acqua. I ratti sono stati assegnati in modo casuale in due gruppi (n = 6, ciascun gruppo): il gruppo DHCA e il gruppo CPB a temperatura normale (gruppo NtCPB).

1. Lavori preparatori

1. Sterilizzare gli strumenti chirurgici (pinze, forbici, micropinze, un elettrocoagulatore, un rasoio, ecc.) prima dell'esperimento (Figura 1).
2. Garantire la disponibilità dei materiali di consumo, che includono seta 2-0, una cannula da 16 G (catetere endotracheale), una cannula da 22 G, una cannula da 16 G fatta in casa (catetere endovenoso multi-orifizio), siringhe per iniezione, garze e nastro adesivo.
   NOTA: Per la cannula da 16 G fatta in casa, utilizzare un bisturi per tagliare due o tre orifizi di 2 mm di diametro sulla punta della cannula, che contribuiranno a rendere più fluido il drenaggio venoso.
3. Garantire la disponibilità di sevoflurano, lidocaina al 2%, soluzione salina, eparina (5 UI/ml, 250 UI/ml), epinefrina (40 μg/ml), noradrenalina (20 μg/ml), amido idrossietilico e bicarbonato.
4. Assicurarsi che i circuiti DHCA contengano un serbatoio (modificato dal contagocce di Murphy), una pompa a rulli, uno scambiatore di calore, un ossigenatore a membrana, tubi di collegamento e un serbatoio dell'acqua (Figura 2). Collegare il circuito e mescolare 12 ml di amido idrossietilico con 1 ml di eparina sodica (250 UI) e 1 ml di soluzione salina. Innescare il circuito con 14 mL della soluzione di adescamento con la pompa a rulli che ruota delicatamente (10-40 mL/min).
   NOTA: Il serbatoio viene rimodellato da un dispositivo trasfusionale con il contagocce di Murphy. La parte di afflusso venoso del contagocce rimane a 10-15 cm e la parte di uscita venosa rimane a 10 cm.

2. Anestesia e incannulamento

1. Anestetizzare i ratti con sevoflurano al 2% -3% e quindi testare la mancanza del riflesso congiuntivale e del rilassamento muscolare dopo che il ratto perde conoscenza.
   NOTA: Il riflesso congiuntivale si riferisce alla chiusura istantanea della palpebra ogni volta che la cornea viene toccata. Utilizzare un batuffolo di cotone per toccare leggermente la cornea. Quando la profondità dell'anestesia è sufficiente, le palpebre non si chiudono.
2. Eseguire l'intubazione endotracheale con una cannula da 16 G dopo che il riflesso congiuntivale scompare e non si osserva alcuna resistenza muscolare. Collegare il tubo a un ventilatore e impostare i parametri facendo clic sui pulsanti sul ventilatore (volume corrente: 1,0-1,2 ml / 100 g, frequenza cardiaca: 80 battiti al minuto [bpm], I: E = 1: 1, frazione di ossigeno inspirato: 60%).
3. Metti una coperta elettrica sotto il topo e fissa il topo con del nastro adesivo. Applicare unguento oftalmico agli occhi per prevenire la secchezza. Rasare i capelli sulla regione inguinale sinistra, sulla regione cervicale destra e sulla coda con un rasoio. Quindi, disinfettare la pelle tre volte con iodio e alcool.
4. Controlla la profondità dell'anestesia prima di passare ai passaggi successivi. Se la frequenza respiratoria è superiore a quella impostata dal ventilatore (80 bpm), o se c'è rigidità muscolare, quindi aumentare la concentrazione di sevoflurano in uscita.
   NOTA: Quando la profondità dell'anestesia è adeguata, il ritmo respiratorio deve essere sincronizzato con il ventilatore e i muscoli devono essere completamente rilassati senza tensione. Controllare la profondità dell'anestesia ogni 30 minuti per assicurarsi che il ratto non stia sperimentando alcun ritorno di coscienza durante la procedura.
5. Utilizzare un bisturi per tagliare la pelle nella regione inguinale sinistra (circa 1 cm) e sezionare delicatamente il muscolo e il tessuto per esporre la vena femorale sinistra e l'arteria. Separare attentamente l'arteria.
6. Cannulare un catetere endovenoso da 22 G nell'arteria femorale sinistra. Ligare l'arteria e il catetere con una seta 2-0 (nella regione di incannulamento). Utilizzare eparina contenente soluzione salina (5 UI / ml) per lavare la cannula per evitare la coagulazione. Collegare il catetere con il sensore di pressione per monitorare la pressione sanguigna.
7. Tagliare la pelle della coda (circa 1,5 cm), quindi utilizzare un bisturi per tagliare la fascia superficiale dell'arteria caudale per esporre l'arteria della coda, che si trova nel mezzo del campo chirurgico.
8. Cannulare l'arteria caudale con un catetere endovenoso da 22 G. Ligare l'arteria e il catetere con una seta 2-0 (nella regione di incannulamento). Utilizzare eparina contenente soluzione salina (5 UI / ml) per lavare il catetere per evitare la coagulazione.
   NOTA: Quando si incannula il catetere endovenoso, la mano sinistra tiene l'arteria / vena con una pinza e la mano destra perfora l'arteria / vena con l'ago all'interno del catetere e quindi inserisce la cannula nell'arteria.
9. Tagliare la pelle sulla vena giugulare destra (circa 2 cm), quindi separare il muscolo e il tessuto per esporre la vena. Inserire un catetere endovenoso multi-orifizio fatto in casa da 16 G nella vena giugulare esterna destra e inserirlo con attenzione nella vena cava inferiore destra o nell'atrio destro.
   NOTA: La vena femorale sinistra e l'arteria sono sotto la superficie della regione inguinale sinistra. La vena è più spessa dell'arteria e il colore del sangue delle arterie è rosso vivo. La vena giugulare destra si trova nel mezzo della regione cervicale destra; Quando la pelle viene tagliata e i muscoli sono separati, la vena può essere vista (larga circa 0,3-0,4 cm). Quando la punta del catetere tocca l'atrio destro, l'onda della pressione sanguigna fluttuerà. Quindi, dopo aver tirato indietro un po 'il catetere, la punta del catetere sarà nella vena cava superiore.
10. Somministrare eparina sodica (500 UI/kg) attraverso la vena esterna destra. Coprire ogni regione cannulata con una garza umida per evitare la contaminazione.
    NOTA: Mettere una scatola sotto il tavolo operatorio per sollevarlo di circa 40 cm.

3. Avvio del DHCA

1. Collegare prima il circuito DHCA con il catetere nell'arteria caudale e mantenere la portata della pompa a 1-2 ml / min. Quindi, collegare il serbatoio con il catetere nella vena giugulare esterna destra. Assicurati che ci sia sempre un livello ematico di circa 1 cm nel serbatoio.
2. Accendere il serbatoio dell'acqua e impostare prima la temperatura dell'acqua a 37 °C.
3. Dopo che la pressione sanguigna è stabile, aumentare delicatamente il flusso della pompa fino a 80-100 ml / kg / min per pompare il sangue.

4. Raffreddamento

1. Impostare la temperatura ambiente a circa 20 °C. Metti i cubetti di ghiaccio in guanti usa e getta e poi mettili sulla testa e sui lati del topo. Regolare la temperatura del serbatoio in tempo reale in base alla temperatura rettale dei ratti.
2. Raccogliere 0,1 ml di sangue dall'arteria femorale sinistra e posizionarlo sulla macchina del gas del sangue per l'analisi dei gas del sangue. Modificare i parametri rilevanti del ventilatore in modo appropriato in base ai risultati dell'emogasanalisi (ad es. PaCO₂).
   NOTA: la frequenza cardiaca e la pressione sanguigna possono cambiare e la portata della pompa deve essere regolata di conseguenza. Il gradiente di temperatura tra il serbatoio dell'acqua e il ratto deve essere inferiore a 10 °C. Assicurarsi che la temperatura possa essere ridotta a 15-20 °C entro 30 minuti. L'intervallo normale di PaCO₂ è 35-45 mmHg. Se i risultati dei gas ematici mostrano un PaCO₂ inferiore, si può diminuire il volume corrente e viceversa.

5. Arresto circolatorio ipotermico profondo

1. Quando la temperatura rettale scende a 15-20 °C, cambiare i guanti monouso (contenenti ghiaccio) per garantire il mantenimento dell'ipotermia profonda durante l'arresto circolatorio.
2. Arrestare la pompa a rulli, mantenere il serbatoio a contatto con l'ambiente e drenare lentamente il sangue dalla vena giugulare esterna al serbatoio.
3. Prestare attenzione alla forma d'onda della pressione sanguigna. Quando la pressione sanguigna e la frequenza cardiaca sono 0, interrompere il drenaggio e tenere chiuso il serbatoio. Spegnere il ventilatore.
   NOTA: La durata dell'arresto circolatorio varia a seconda dello scopo dell'esperimento.

6. Riscaldamento e riperfusione

1. Rimuovere tutti i guanti monouso e aumentare la temperatura ambiente a 25 °C. Ripristinare la ventilazione dell'ossigenatore a membrana mantenendo il taglio del tubo di drenaggio venoso. Accendere la pompa a rulli per assicurarsi che il sangue nel serbatoio torni lentamente al corpo del ratto.
2. Accendere il ventilatore. Una volta che il livello ematico nel serbatoio rimane a 1 cm, allentare il tubo di drenaggio e drenare lentamente il sangue dall'atrio destro al serbatoio.
3. Accendere la lampada di riscaldamento, la piastra riscaldante e il serbatoio dell'acqua. Impostare la temperatura del serbatoio dell'acqua a 25 °C in primo luogo, quindi regolare la temperatura di uscita in modo tempestivo in base alla temperatura rettale del ratto.
   NOTA: La lampada riscaldante deve essere diretta verso i grandi vasi sanguigni nella cavità toracica del ratto e deve essere mantenuta a una certa distanza per evitare di bruciare i tessuti. Prestare attenzione alla differenza di temperatura tra la temperatura di uscita e la temperatura rettale del ratto (<10 °C). Se necessario, testare il gas del sangue, quindi regolare di conseguenza i parametri del ventilatore e somministrare bicarbonato, elettroliti, ecc.
4. Rimuovere la lampada riscaldante dopo che la temperatura rettale ritorna a 34 °C.
   NOTA: Questo passaggio, come continuazione del rapido processo di riscaldamento, dovrebbe essere lento. In questa fase, i parametri dell'apparecchiatura del vaporizzatore di sevoflurano, del ventilatore meccanico e della pompa a rulli possono essere ripristinati ai livelli all'inizio del CPB.

7. Svezzamento del CPB

1. Ridurre lentamente e gradualmente la portata della pompa a rulli e regolare la velocità di drenaggio venoso fino a quando la portata si riduce a 1 ml / min.
   NOTA: Ogni regolazione della portata deve essere osservata per 3-5 minuti.
2. Mantenere il serbatoio a contatto con l'ambiente (togliendo il tappo del serbatoio). Infondere il sangue rimanente nel circuito con una portata di 1 ml/min.
3. Arrestare l'ossigenazione a membrana e la pompa a rulli.
4. Eutanasia il ratto dopo un periodo di ventilazione meccanica in anestesia profonda.
   NOTA: questa è una procedura terminale. La durata tra lo svezzamento del CPB e l'eutanasia varia a seconda dei diversi protocolli di studio. Ricordarsi di disinfettare le ferite con iodio e alcool e quindi coprire ogni regione cannulata con garza umida per evitare la contaminazione prima dell'eutanasia. Aumentare la concentrazione di sevoflurano per aumentare la profondità dell'anestesia.

Come gruppo di controllo, i ratti CPB a temperatura normale (NtCPB) senza arresto circolatorio hanno mostrato una pressione arteriosa media stabile (MAP) e una temperatura corporea durante l'intera procedura, mentre la MAP dei ratti DHCA è diminuita durante l'arresto cardiaco (p < 0,01, Figura 3A). La temperatura dei ratti DHCA è scesa rapidamente durante la fase di raffreddamento e si è ripresa gradualmente durante la fase di riscaldamento. Durante lo svezzamento dei ratti dai circuiti DHCA, la temperatura dei ratti DHCA è tornata alla normalità (Figura 3B).

L'effetto del processo DHCA sui ratti è stato studiato mediante analisi dei gas del sangue. Dopo il contatto dell'intero sangue con la soluzione di priming, la concentrazione di emoglobina (Hb) era superiore a 6 g / dL in entrambi i gruppi (Figura 4A). Durante lo svezzamento dei ratti dal circuito DHCA, la concentrazione è aumentata a 9 g / dL a causa dell'infusione del sangue rimanente nel circuito CPB nel ratto. L'ematocrito (HCT) ha mostrato una tendenza simile all'Hb (Figura 4B). All'inizio della procedura CPB, le differenze tra Hb e HCT potrebbero essere dovute al diverso peso dei ratti. Il peso medio dei ratti DHCA era di 571,1 g ± 7,254 g, mentre il peso medio dei ratti nel gruppo NtCPB era di 535,0 g ± 8,317 g (p = 0,075). Sebbene le differenze nella concentrazione di Hb portino a differenze nella capacità del sangue di trasportare ossigeno, le tendenze di cambiamento dei due gruppi erano le stesse, indicando che il DHCA non influenzava ulteriormente la concentrazione di Hb. Dopo DHCA e riperfusione, il livello di acido lattico è aumentato rapidamente, e questo è stato più pronunciato nel gruppo DHCA (Figura 4C). Il pH è diminuito dopo la procedura DHCA, che era molto probabilmente il risultato dell'accumulo di acido lattico (Figura 4D). Durante l'intero esperimento, le concentrazioni di Na+, Cl−, K+ e glucosio non hanno mostrato differenze significative in nessun momento (Figura 5). Questi risultati suggeriscono che il DHCA ha causato solo un aumento dell'acido lattico, ma non ha influenzato il pH del sangue e la concentrazione di emoglobina, ematocrito, Na+, Cl−, K+ e glucosio.

L'autofagia è un processo in cui le cellule eucariotiche usano lisosomi per degradare le loro proteine citoplasmatiche e gli organelli danneggiati15. In condizioni fisiologiche e patologiche, un lieve livello di autofagia è essenziale per il mantenimento dell'omeostasi cellulare. Tuttavia, un'eccessiva autofagia può portare a stress metabolico, degradazione dei componenti cellulari e persino alla morte cellulare16. Al fine di valutare l'impatto del DHCA sull'autofagia neurale, abbiamo utilizzato la microscopia elettronica a trasmissione e, sorprendentemente, abbiamo trovato un aumento del numero di autofagosomi nell'ippocampo dei ratti DHCA (Figura 6). Sulla base delle funzioni bidirezionali degli autofagosomi, se l'aumento degli autofagosomi svolga un ruolo neuroprotettivo e compensativo o patologico durante il DHCA necessita ancora di ulteriori ricerche.

Figura 1: Strumenti chirurgici utilizzati nel modello DHCA. (a) Iodio, (b) siringhe per iniezione, (c) nastro adesivo, (d) garza umida, (e) pinze, (f) forbici, (g,h) micropinze, (i) un elettrocoagulatore, (j) un rasoio e (k) seta. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Circuito di bypass cardiopolmonare del modello di ratto DHCA. (A) a: ossigenatore a membrana; b: Scambiatore di calore; c: Serbatoio; d1: Il tubo che collega la pompa a rulli (diametro esterno [OD], 6 mm; diametro interno [ID], 4 mm; lunghezza, 15 cm); d2: Il tubo che collega lo scambiatore di calore e l'ossigenatore a membrana (OD, 6 mm; ID 4 mm; lunghezza, 8 cm); d3: La linea di uscita dell'arteria (OD, 2,5 mm; ID, 1,5 mm; lunghezza, 20 cm). b) a: serbatoio; b: Ossigenatore a membrana; c: scambiatore di calore; d: Pompa a rulli. La freccia gialla mostra la direzione del flusso sanguigno. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Segni vitali dei ratti DHCA e dei ratti CPB a temperatura normale. (A) La pressione arteriosa media e (B) la temperatura rettale sono state continuamente monitorate durante tutta la procedura. I dati sono presentati come media ± errore standard della media (SEM), n = 6 per gruppo. DHCA = 30 min. Le differenze tra i due gruppi in ogni punto temporale sono state confrontate utilizzando un test t di Student spaiato. Abbreviazioni: DHCA = arresto circolatorio ipotermico profondo; NtCPB = bypass cardiopolmonare a temperatura normale; MAP = pressione arteriosa media. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001; p > 0,05 non mostrato. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Il pH e le concentrazioni di emoglobina, ematocrito e acido lattico nei ratti. I campioni di sangue delle arterie per l'analisi di (A) emoglobina, (B) ematocrito, (C) acido lattico, (D) e pH sono stati raccolti attraverso l'arteria femorale in tre punti temporali: l'inizio del CPB, prima del DHCA, e lo svezzamento del CPB. DHCA = 30 min. I dati sono presentati come media ± SEM, n = 6 per gruppo. La differenza tra i due gruppi in ogni punto temporale è stata confrontata utilizzando un test t di Student spaiato. Abbreviazioni: DHCA = arresto circolatorio ipotermico profondo; NtCPB = bypass cardiopolmonare a temperatura normale; Hb = emoglobina; Hct = ematocrito; Lac = acido lattico. * p < 0,05. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 5: La concentrazione di Na+, Cl−, K+ e glucosio nei ratti. I campioni di sangue delle arterie per l'analisi di (A) Na+, (B) Cl−, (C) K+ e (D) glucosio sono stati raccolti attraverso l'arteria femorale in tre punti temporali: l'inizio del CPB, prima del DHCA, e lo svezzamento del CPB. DHCA = 30 min. I dati sono presentati come media ± SEM, n = 6 per gruppo. Le differenze tra i due gruppi in ogni punto temporale sono state confrontate utilizzando un test t di Student spaiato. Abbreviazioni: DHCA = arresto circolatorio ipotermico profondo; NtCPB = bypass cardiopolmonare a temperatura normale; Glu = glucosio. p > 0,05 non mostrato. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 6: Autofagosomi nell'ippocampo dei ratti. I ratti sono stati sottoposti a eutanasia 30 minuti dopo lo svezzamento dal circuito CPB e gli ippocampi sono stati raccolti immediatamente. Quindi, gli ippocampi sono stati fissati nella glutaraldeide per un'ulteriore microscopia elettronica a trasmissione per studiare l'espressione degli autofagosomi nell'ippocampo di (A) ratti NtCPB e (B) ratti DHCA. DHCA = 30 min. Barre scala: 1 μm e 250 nm. Le frecce indicano gli autofagosomi. Abbreviazioni: DHCA = arresto circolatorio ipotermico profondo; NtCPB = bypass cardiopolmonare a temperatura normale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.