Utilizzo di un'iniezione cell-tracer per studiare l'origine delle cellule che formano neointima in un modello di parete laterale sacculare di ratto

L'emorragia subaracnoidea causata dalla rottura di un aneurisma intracranico (IA) è una condizione neurochirurgica devastante associata ad alta morbilità e mortalità 1,2,3,4. Oltre al clipping microchirurgico, che fornisce un contatto diretto tra endotelio ed endotelio, i dispositivi endovascolari hanno acquisito un'importanza crescente negli ultimi decenni per il trattamento delle IA rotte e scoperte incidentalmente. La risposta di guarigione nelle IA trattate endovascolarmente dipende principalmente dalla formazione di neointima e dall'organizzazione del trombo. Entrambi sono processi sinergici, a seconda della migrazione cellulare dal vaso adiacente e dalla parete dell'aneurisma. ⁵ Ad oggi, l'origine delle cellule endoteliali nella formazione neointima degli aneurismi trattati endovascolari rimane poco chiara. C'è un dibattito in corso in letteratura sulla fonte da cui vengono reclutate le cellule che formano neointima.

Utilizzando un'iniezione cell-tracer di colorante CM-Dil (vedi tabella dei materiali) nell'aorta addominale dei ratti, abbiamo mirato ad analizzare il ruolo delle cellule endoteliali, originarie dell'arteria madre, nella formazione di neointima in due diversi punti temporali FU (giorno 7 e giorno 21) (Figura 1). Un vantaggio del modello è l'incubazione diretta del tracciante cellulare locale in vivo in un'arteria genitore prima della sutura dell'aneurisma, consentendo la FU in punti temporali successivi. Le tecniche di iniezione in vivo , come l'incubazione cell-tracer, non sono state descritte in letteratura. Un vantaggio di questa tecnica è l'iniezione diretta, a un punto, intraoperatoria, in vivo , che rende il modello robusto e riproducibile.

Il supporto veterinario è stato eseguito secondo le linee guida istituzionali. Gli esperimenti sono stati approvati dal Comitato etico locale, Svizzera (BE 60/19). Le linee guida ARRIVE e i principi 3R sono stati rigorosamente seguiti ^6,7. Trentuno ratti Lewis maschi, di 12 settimane di età e del peso di 492 ± 8 g, sono stati inclusi. Ospitare tutti i ratti a una temperatura ambiente di 23 °C e un ciclo luce/buio di 12 ore. Fornire l'accesso gratuito ad acqua e pellet. Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando il test non parametrico Wilcoxon-Mann-Whitney U. I valori di probabilità (p) di ≤ 0,05 e/o ≤ 0,01 sono stati considerati significativi.

1. Preparazione generale di fase preoperatoria e aspetti anestesiologici

1. Randomizzare i ratti in gruppi di trattamento a bobina o stent (Figura 2) tramite un sistema di randomizzazione basato sul web. Ora, esegui un esame clinico preoperatorio di tutti gli animali previsti per l'intervento chirurgico accanto a una sala operatoria silenziosa e asettica mantenendo una temperatura ambiente di 23 ± 3 ° C. Analizzare il comportamento degli animali e ispezionare le mucose e il turgore come parte dell'esame clinico preoperatorio.
2. Registra il peso di ogni animale.
3. Prima dell'intervento chirurgico, incubare le sacche arteriose da ratti donatori in 0,1% di sodio dodecil solfato per 10 ore a 37 °C per ottenere aneurismi decellularizzati⁸. Raccogli queste buste dagli animali donatori pochi giorni prima dell'intervento.
   1. Preparare l'intera lunghezza dell'aorta addominale con microscissori e pinze e applicare 6-0 legature non assorbibili ad un intervallo di 3-4 mm.
   2. Generare direttamente aneurismi vitali per via intraoperatoria da una sacca del vaso arterioso precedentemente legata dalla parte toracica di un animale donatore⁹. Eseguire la toracotomia con forbici e pinze chirurgiche nel punto temporale FU indicato e legare la sacca del vaso alla lunghezza desiderata.
4. Impiantare direttamente la sacca nel ricevente e raccogliere l'aneurisma dall'animale donatore per ulteriori analisi macroscopiche ed elaborazione istologica.
5. Per l'induzione dell'anestesia, mettere tutti i ratti in una scatola pulita fornita di ossigeno (O₂) fino alla perdita di coscienza dopo 5-10 minuti. Anestetizzare i ratti con un'iniezione sottocutanea (SC) di una miscela di fentanil 0,005 mg/kg, medetomidina 0,15 mg/kg e midazolam 2 mg/kg.
   NOTA: Questo garantisce un piano chirurgico di almeno 45 min.
6. Controllare la profondità dell'anestesia dall'assenza del riflesso di prelievo del pedale.
7. Posizionare i ratti in posizione supina e radere la parte toraco-addominale con un rasoio elettrico.
8. Fissare le 4 zampe dei ratti con del nastro adesivo su una tavola, coperta da una piastra riscaldante collegata a una sonda rettale autoregolante. Inserire la sonda rettale nell'ano del ratto per mantenere la temperatura desiderata di 37 °C con l'aiuto della piastra riscaldante.
9. Ora, installare un sensore sulla zampa posteriore destra collegato a un sistema computerizzato per il controllo intraoperatorio dei segni vitali.
10. Coprire il naso e la bocca del ratto con una maschera per il viso. Se si richiede un'anestesia prolungata, iniziare l'isoflurano (1,0-2,0% titolato per effetto in 100% O₂).
11. Disinfettare il campo chirurgico con povidone-iodio o disinfettanti alternati e drappeggiare il campo chirurgico in modo sterile.
12. Per la cura perianestetica, applicare un lubrificante oftalmico sterile sugli occhi e coprirli con una maschera di alluminio opaco per evitare l'essiccazione e il danneggiamento della lampada chirurgica.
13. Durante l'intervento chirurgico, fornire ossigeno continuamente attraverso la maschera facciale, monitorare la temperatura corporea e fornire calore utilizzando una piastra riscaldante, mantenendo la normotermia.
14. Monitorare continuamente altri segni vitali (distensione del polso e del respiro, frequenza cardiaca e respiratoria e saturazione di ossigeno).

2. Fase operativa - iniezione di cell-tracer

NOTA: L'approccio chirurgico dettagliato nell'aneurisma microchirurgico della parete laterale del ratto di Helsinki modello⁹ e le tecniche per l'impianto di bobine e stent sono descritti altrove ^8,10,11.

1. Conservare il tracciante cellulare lipofilo fluorescente a ≤ -20 °C per tutto il tempo, al riparo dalla luce.
2. Eseguire l'intervento chirurgico preparando l'aorta del ratto e la vena cavale, seguita dalla separazione di entrambi, nonché dal bloccaggio temporaneo prossimale e distale dell'aorta.
   NOTA: Questa tecnica è stata descritta in precedenza⁹.
   1. Blocca le parti prossimali e distali dell'aorta con due clip titan temporanee.
3. Metti una microswab con imbottitura viola ciascuna sotto le parti prossimale e distale dell'aorta per una migliore visualizzazione dell'arteria.
4. Ora, proteggi l'addome con una garza bagnata.
5. Il giorno dell'operazione, sciogliere 2 μL del tracciante cellulare mediante pipettaggio in 1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
6. Trasferire la miscela in una siringa da 1 mL dotata di una cannula sterile da 27-1/2 G (0,4 x 13 mm).
   NOTA: prestare attenzione a evitare l'esposizione alla luce durante l'esecuzione dei passaggi 2.5 e 2.6.
7. Spegnere la luce in sala operatoria. Mentre si guarda al microscopio, eseguire l'iniezione di un punto nella parte ventrale centrale dell'aorta utilizzando micro pinze e iniettare con attenzione 1 mL di soluzione salina eparinizzata allo 0,9%.
8. Iniettare accuratamente il cell-tracer (Video 1) e spegnere immediatamente anche il microscopio operatorio. Ancora una volta, proteggere l'addome con una garza bagnata.
9. Lasciare incubare il colorante per almeno 15 minuti. Dopo il periodo di incubazione, accendere il microscopio e le luci della sala operatoria.
10. Eseguire l'arteriotomia longitudinale e la sutura dell'aneurisma, come descritto altrove¹¹.
    1. Utilizzare microforze e microscissori per eseguire l'arteriotomia in modo che la sua lunghezza sia la media del diametro dell'aneurisma raccolto (fase 1.3). Per garantire la lunghezza corretta, posizionare l'aneurisma accanto all'aorta prima di eseguire l'arteriotomia. Suturare l'aneurisma con 8-10 punti singoli utilizzando una sutura 10-0 non assorbibile e rimuovere con cura i morsetti temporanei - a partire distalmente - sotto irrigazione continua con soluzione salina eparinizzata. Chiudi la ferita in modo stratificato. Da notare, utilizzare una densità di imballaggio della bobina di 1 cm.
       NOTA: La tecnica di impianto di bobina o stent è stata descritta altrove ^8,10.

3. Monitoraggio della fase postoperatoria e cura analgetica

1. Alla fine dell'intervento chirurgico, invertire l'anestesia con una miscela di iniezione SC di buprenorfina 0,05 mg / kg, atipamezolo 0,75 mg / kg e flumazenil 0,2 mg / kg. Lasciare che ogni animale operato si riprenda in una gabbia pulita fino a quando non è completamente sveglio e riscaldato, se necessario, con una lampada riscaldante.
2. Per 3 giorni, somministrare 1 mg/kg di meloxicam (un'iniezione o un'applicazione orale al giorno) e buprenorfina (0,05 mg/kg quattro volte al giorno) SC. Durante la notte, fornire buprenorfina continuamente nell'acqua potabile con lo stesso dosaggio: 6 mL di buprenorfina 0,3 mg/mL, 360 ml di acqua potabile, 10 ml di glucosio al 5%.
3. Nell'immediata fase postoperatoria, ospitare ogni animale in una singola gabbia per la protezione. Raggruppare gli animali dopo 24 ore.
4. Se un ratto mostra un comportamento angosciato o aggressivo dopo l'iniezione di SC, somministrare buprenorfina nell'acqua potabile durante il giorno.
5. Fornire mangime morbido sul pavimento della gabbia per supportare l'alimentazione e il recupero postoperatorio.
6. Osserva e prenditi cura di tutti gli animali secondo il foglio di valutazione del benessere e del dolore.
7. Somministrare l'analgesia sc di salvataggio (meloxicam 1 mg/kg e 0,05 mg/kg di buprenorfina) quando necessario.

Un totale di 31 animali sono stati inclusi nel contesto di laboratorio: 27 ratti sono stati inclusi nell'analisi statistica finale; 4 ratti sono morti prematuramente (tasso di mortalità del 12,9%). Per via intraoperatoria, la distensione del respiro è risultata significativamente ridotta (p = 0,03) nei ratti trattati con stent ( 12,9 μm ± 0,7) rispetto ai ratti trattati con bobina (13,5 μm ± 0,6). L'angiografia a fluorescenza è stata eseguita per ogni ratto alla fine del FU finale. La riperfusione è stata indicata in tutti e 6 gli animali trattati con bobine, mentre la riperfusione è stata osservata solo nel 12,5% degli 8 animali trattati con stent.

I volumi di aneurisma al basale aggregati per il giorno 7 e il giorno 21 non differivano in modo significativo (né per gli aneurismi decellularizzati (p = 0,9) né vitali (p = 0,1)) tra i gruppi di trattamento con bobina o stent (Figura 3). I volumi di FU aggregati per gli aneurismi decellularizzati hanno mostrato una crescita non significativa dell'aneurisma in spirale rispetto agli aneurismi stentati (p = 0,28), significativamente maggiore nel gruppo vitale arrotolato rispetto al gruppo stented (60,1 mm3 ± 31,1 mm3 vs 20,5 mm3 ± 20,6 mm3; p = 0,002).

Le quantità di cellule tracer-positive nella neointima degli aneurismi decellularizzati non differivano significativamente tra i gruppi trattati con stent o bobina al giorno 7 FU (p = 0,8), ma erano significativamente più alte nei ratti stentati al giorno 21 FU (Figura 4; p = 0,04). Nei ratti vitali suturati con aneurisma, non sono state osservate differenze significative a 7 giorni (p = 1,0) o 21 giorni (Figura 5) FU (p = 0,66). Negli aneurismi decellularizzati a 7 giorni FU, significativamente più cellule cell-tracer-positive sono rimaste nel trombo dello stent trattato rispetto al gruppo trattato con bobina (p = 0,01). Questa differenza non è stata osservata negli aneurismi vitali a 7 giorni fu. Vedere la Tabella 1 per la proporzione di cellule tracer-positive per aneurismi decellularizzati, così come aneurismi vitali a spirale e stentati per il giorno 7 e il giorno 21 FU. La controcolorazione per il fattore di von Willebrand (F8) è stata eseguita nelle cellule endoteliali del neointima di ciascun ratto (Figura 6).

La durata media della procedura chirurgica è stata di 119,1 ± 21,3 minuti per il gruppo di avvolgimento rispetto a 154,1 ± 30,2 minuti per il gruppo stent (p = 0,001). Anche il numero di punti per le suture di aneurisma differiva in modo significativo (p = 0,000002) per la bobina (15,6 ± 2,9 punti) e i gruppi di stent (11,3 ± 1,1).

Figura 1: Diagramma di flusso dell'impostazione sperimentale. Un totale di 35 animali sono stati operati e randomizzati a gruppi di avvolgimento o stenting. Due animali del gruppo stent sono morti nell'immediato decorso postoperatorio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Fotografie intraoperatorie di aneurismi durante l'embolizzazione di bobine e stent. (A) raffigura un aneurisma della parete laterale (#), suturato sull'aorta addominale del ratto (*). Si noti il dispositivo a bobina introdotto nell'aneurisma prima di eseguire l'ultimo singolo punto per completare la sutura dell'aneurisma. Si noti la colorazione rosata (freccia) sul lato sinistro dell'arteriotomia, che indica la corretta distribuzione del tracciante cellulare. (B) La stessa impostazione di cui al punto A, che mostra il dispositivo dello stent già in situ. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Misurazioni macroscopiche post mortem in 31 animali. I volumi di aneurisma (mm3) sono stati documentati prima dell'impianto e al follow-up, rappresentati lungo l'asse y. (A) Basale (decellularizzato), (B) follow-up (decellularizzato), (C) basale (vitale), (D) follow-up (vitale). I dati per il giorno 7 e il giorno 21 vengono raggruppati. ** p < 0,01. I valori sono espressi come mediane con intervalli interquartili. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Immagine esemplare di un aneurisma decellularizzato trattato con stent al giorno 21. A destra, viene mostrata la panoramica dell'immagine di un antiα-SMA monoclonale, aneurisma cellulare impoverito (ingrandimento 2 volte); barra della scala = 150 μm. A sinistra, controcolorato con DAPI; i globuli rossi sono cellule-traccianti-positivi (A) nella parete dell'aneurisma, (B) nel trombo, (C) cellule residue colorate ma sbiadite cell-tracer-positive nel neointima e (D) nel complesso vaso adiacente. Barre di scala = 100 μm (A-D). Una singola freccia segna la parete dell'aneurisma, la doppia freccia l'arteria madre. Abbreviazioni: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo; α-SMA = actina della muscolatura α liscia. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Immagine esemplare di un aneurisma vitale trattato con bobina al giorno 21. Lato destro, viene mostrata la panoramica dell'immagine di un antiα-SMA monoclonale, aneurisma ricco di cellule (ingrandimento 2 volte); barra della scala = 150 μm. Lato sinistro, controinfangato con DAPI; i globuli rossi sono cell-tracer-positivi (A) nella parete dell'aneurisma, (B) nel trombo, (C) più cellule positive nel neointima e (D) nel complesso vaso adiacente. Barre di scala = 100 μm (A-D). Una singola freccia segna la parete dell'aneurisma, la doppia freccia l'arteria madre. Abbreviazioni: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo; α-SMA = actina della muscolatura α liscia. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: ingrandimento di 40 volte dalla colorazione F8. # raffigura la formazione del trombo, * il neointima e § il lato endoluminale sotto l'orifizio dell'aneurisma. Si noti la stratificazione endoteliale mostrata come colorazione viola nello strato endoluminale del neointima. Barra della scala = 175 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Percentuale di cellule positive al tracciante cellulare nella parete neointima, arteria genitore, trombo e aneurisma. I valori sono rappresentati come percentuali per sacchetti decellularizzati e vitali per il trattamento di bobine e stent per il giorno 7 e il giorno 21. Abbreviazione: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo.

Video 1: Iniezione di cell-tracer nella parte addominale dell'aorta di ratto. Questa tecnica viene eseguita utilizzando un'iniezione di un punto nell'aorta di ratto bloccata. Clicca qui per scaricare questo video.

Gli autori sono gli unici responsabili della progettazione e della conduzione dello studio presentato e non dichiarano interessi concorrenti.