Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Massefølsom partikelsporing til karakterisering af membranassocieret makromolekyledynamik

Published: February 18, 2022 doi: 10.3791/63583
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 1
1Department of Cellular and Molecular Biophysics, Max Planck Institute of Biochemistry, 2Department of Physics, Technical University Munich, 3Department of Cellular Physiology, Biomedical Center (BMC), Ludwig-Maximilians-Universität München

Summary

Denne protokol beskriver en iSCAT-baseret billedbehandlings- og enkeltpartikelsporingsmetode, der muliggør samtidig undersøgelse af molekylmassen og den diffusive opførsel af makromolekyler, der interagerer med lipidmembraner. Trinvise instruktioner til prøveforberedelse, masse-til-kontrast-konvertering, filmopkøb og efterbehandling gives sammen med anvisninger for at forhindre potentielle faldgruber.

Abstract

Kortvarige eller forbigående interaktioner mellem makromolekyler ved og med lipidmembraner, en grænseflade, hvor en lang række væsentlige biologiske reaktioner finder sted, er i sagens natur vanskelige at vurdere med standard biofysiske metoder. Indførelsen af massefølsom partikelsporing (MSPT) udgør et vigtigt skridt i retning af en grundig kvantitativ karakterisering af sådanne processer. Teknisk set blev dette gjort muligt gennem fremkomsten af interferometrisk spredningsmikroskopi (iSCAT)-baseret massefotometri (MP). Når baggrundsfjernelsesstrategien er optimeret til at afsløre den todimensionelle bevægelse af membranassocierede partikler, tillader denne teknik realtidsanalyse af både diffusion og molekylmasse af umærkede makromolekyler på biologiske membraner. Her beskrives en detaljeret protokol til udførelse og analyse af massefølsom partikelsporing af membranassocierede systemer. Målinger udført på et kommercielt massefotometer opnår tidsopløsning i millisekundregimet og, afhængigt af MP-systemet, en massedetektionsgrænse ned til 50 kDa. For at vise MSPT's potentiale til den dybtgående analyse af membrankatalyseret makromolekyledynamik generelt præsenteres resultater opnået for eksemplariske proteinsystemer såsom den oprindelige membrankonaktator annexin V.

Introduction

Engang blot opfattet som en barriere mod den brede vifte af omgivende fysiske forhold, betragtes biologiske membraner i dag som funktionelle enheder og katalytiske platforme 1,2. Baseret på deres evne til at lokalisere, forstærke og dirigere signaler som reaktion på membranassocierede makromolekylereaktioner udgør lipidgrænseflader et afgørende element for en lang række cellulære processer såsom membranhandel og signalkaskader 3,4,5. Membranfastgørelse, der tjener som et nukleationssted til samling af stabile komplekser, er ofte afhængig af en dynamisk ligevægt mellem membranassocierede og cytosoliske former for makromolekyler og er derfor af forbigående karakter 6,7.

På trods af deres store betydning i biologi har det hidtil været udfordrende at udvikle metoder, der kan give adgang til de kompositoriske, rumlige og tidsmæssige heterogeniteter af membranassocierede makromolekylereaktioner i realtid 7,8. For at løse de underliggende molekylære processer er to eksperimentelle aspekter afgørende: tilstrækkelig tidsopløsning og enkeltpartikelfølsomhed. Derfor har ensemble gennemsnitlige teknikker såsom fluorescensgendannelse efter fotoblegning (FRAP), men også den meget mere følsomme fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS) begrænsninger, da de stort set afkobler rumlig information fra tidsmæssig information9. Et vigtigt skridt i retning af karakteriseringen af individuel molekyledynamik har således været fremkomsten af enkeltpartikelsporing (SPT) i kombination med meget følsom mikroskopi. Navnlig har to SPT-tilgange vist sig at være effektive i denne henseende. For det første banede brugen af fluoroforer som etiketter og de tilsvarende fluorescensdetekteringssystemer vejen for nanometerpræcision og millisekundtidsopløsning 10,11,12. For det andet forbedrede spredningsbaseret detektion ved hjælp af guldnanopartikler både lokaliseringspræcision og tidsopløsning til henholdsvis sub-nanometer- og mikrosekundområdet, henholdsvis 13,14,15,16. På trods af de mange fordele ved begge tilgange og deres betydelige bidrag vedrørende den mekanistiske forståelse af membranassocierede systemer 17,18 har begge teknikker hidtil været begrænsede: de kræver mærkning af de molekyler af interesse, som potentielt forstyrrer deres oprindelige adfærd og er ufølsomme over for den molekylære sammensætning af membranassocierede partikler 19,20.

Begge disse begrænsninger er for nylig blevet overvundet ved indførelsen af en ny interferometrisk spredning (iSCAT)-baseret tilgang nævnt massefotometri (MP)21,22,23. Denne teknik gør det muligt at bestemme massefordelinger i opløsningen af biomolekyler i henhold til deres iSCAT-kontrast, når de lander på en glasgrænseflade. Til påvisning og karakterisering af mobile molekyler, der diffunderer på lipidmembraner, måtte der imidlertid udvikles en mere sofistikeret billedanalysemetode. Dette er i mellemtiden blevet implementeret med succes og gør det muligt at detektere, spore og bestemme molekylmassen af enkelte umærkede biomolekyler, der diffunderer på en lipidgrænseflade24,25. Denne teknik, der kaldes dynamisk massefotometri eller massefølsom partikelsporing (MSPT), muliggør nu vurdering af komplekse makromolekyleinteraktioner ved direkte at registrere ændringer i molekylmassen af de sporede enheder og åbner dermed nye muligheder for mekanistisk analyse af membranassocieret molekylær dynamik.

Her præsenteres en detaljeret protokol til prøveforberedelse, billeddannelse og den dataanalysepipeline, der kræves til MSPT. Navnlig diskuteres prøvekrav og potentielle problemer, der kan opstå under måling og analyse. Desuden fremvises det uovertrufne potentiale til at analysere membran-interagerende makromolekylesystemer gennem forskellige repræsentative resultater.

Protocol

1. Prøveforberedelse

  1. Generation af multilamellære vesikler (MLM'er)
    1. Beregn mængden af chloroformopløst lipid (er) i henhold til den ønskede lipidblanding og det krævede suspensionsvolumen.
      BEMÆRK: En endelig vesikelkoncentration på 4 mg/ml lipider anbefales til resuspensionbufferen (reaktionsbufferen).
    2. Pipette det beregnede volumen lipider i et 1,5 ml glashætteglas ved hjælp af positive forskydningspipetter udstyret med glasspidser.
    3. Fordamp lipidopløsningsmidlet under en svag strøm af nitrogen og drej konstant hætteglasset for at sikre en lige fordeling af lipiderne på glasvæggene.
    4. Sørg for fuld opløsningsmiddelfordampning ved at placere hætteglasset under en jævn strøm af nitrogen i 15 minutter.
    5. Fjern resterende spor af chloroform ved vakuumtørring i en vakuumtørrer i yderligere en time.
    6. Rehydrer lipidblandingen i den ønskede resuspensionbuffer (reaktion) og hvirvel suspensionen grundigt, indtil lipidfilmen er opløst fra hætteglassets vægge.
      BEMÆRK: Reaktionsbufferen skal sikre proteinaktivitet og stabilitet. Reaktionsbufferen, der anvendes i denne undersøgelse, indeholder 50 mM Tris-HCl (pH = 7,5), 150 mM KCl og 5 mMMgCl2. Bemærk, at enhver buffer, der bruges til at fortynde lipider eller proteiner, skal filtreres for at fjerne forstyrrende partikler urenheder (se trin 5).
  2. Generation af små ulamellare vesikler (SUV'er)
    1. For på hinanden følgende fryse-optøningscyklusser af lipidresuspensionen (trin 1.1.6) koges 500 ml vand i et bægerglas på en kogeplade (mellem 70 °C og 99 °C), og der fremstilles en beholder med flydende nitrogen.
    2. Chok-frys lipid resuspension i det flydende nitrogen. Overfør hætteglasset til bægerglasset med varmt vand, indtil opløsningen er helt optøet. Gentag denne fryse-optøningscyklus 8-10 gange, eller indtil den tidligere uklare blanding ser klar ud.
      FORSIGTIG: Brug korrekt sikkerhedsbeklædning og udstyr såsom beskyttelsesbriller, handsker og pincet for at forhindre direkte kontakt med det flydende nitrogen, det frosne lipidhætteglas eller det kogende vand.
    3. Til generering af en monodisperse vesikelfordeling skal du samle en lipidekstruder og teste dens integritet med reaktionsbuffer for at sikre, at den ikke lækker.
      BEMÆRK: Hvis der observeres lækage, skal du forsigtigt samle lipidekstruderen igen, indtil der ikke er nogen bufferudslip.
    4. Ekstrudere lipidsuspensionen i 37 passerer gennem en nukleopormembran med en porestørrelse på 50 nm26. Antallet af passager bør være ujævnt for at sikre, at den endelige SUV-blanding krydsede nukleopormembranen og derfor er fri for lipidaggregater eller multilamellære vesikler. De ekstruderede vesikler vil senere blive brugt til at danne understøttede lipiddobbeltlag (se trin 6 og 7).
      BEMÆRK: SUV'er kan ligeledes dannes ved sonikering af den rehydrerede lipidblanding. Forberedelse via ekstrudering giver imidlertid en mere monodisperse fordeling af SUV'er, hvilket letter vesikelbrud under understøttet dannelse af lipiddobbeltlag. Ekstruderede vesikler kan opbevares i køleskabet i højst 3 dage.

2. Rengøring af mikroskop dias

  1. Fordel et lige antal mikroskopdias (nr. # 1,5; 0,17 mm tykkelse) med dimensioner på 24 mm x 60 mm og 24 mm x 24 mm i polytetrafluorethylen (PTFE) mikroskopholdere.
  2. Overfør PTFE-holdere til bægerglas, der indeholder ultrarent vand, og soniker dem i 15 minutter ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: Afhængigt af bægerglasset skal vandmængden justeres, så den helt dækker PTFE-holderen.
  3. Brug pincet til at fjerne holderne fra bægerglasset og udskift vandet med ultrarent isopropanol. Indsæt holderen i bægerglasset, der indeholder isopropanol og sonikat igen i 15 minutter.
    BEMÆRK: Afhængigt af bægerglasset skal isopropanolens volumen justeres, så den helt dækker PTFE-holderen.
  4. Udskift isopropanol med ultrarent vand og sonikere bægerglasset indeholdende holderne i 15 minutter.
  5. Fjern PTFE-holderne fra bægerglassene, og føntør mikroskopet glider i holderen under en jævn strøm af nitrogengas eller trykluft.
    BEMÆRK: Sørg for korrekt rengøring af dækselglider ved hjælp af handsker, rene bægerglas og paraffinfilm til at dække hvert bægerglas. Ellers kan resterende støv forårsage betydelige baggrundsudsving under MSPT-målinger.

3. Hydrofilisering af mikroskop dias

BEMÆRK: For at opnå et homogent og væskeunderstøttet lipiddobbeltlag er hydrofilisering af dias afgørende og skal udføres lige før flowkammersamling.

  1. Anbring PTFE-holdere, der kun indeholder 24 mm x 60 mm mikroskopdias, i en plasmarenser med ilt som procesgas, og rengør mikroskopets dias med plasma (parametre, der anvendes i dette arbejde: 30% effekt, 0,3 mbar ilttryk i 30 s; se Materialetabel for detaljer om den anvendte plasmarenser).
    BEMÆRK: For at opnå væskemembraner skal plasmarensningsparametre som effekt, ilttryk og rengøringstid justeres for hvert instrument. Til dette formål anbefales anvendelsen af fluorescerende mærkede lipider for at sikre membranfluiditet, som kan kvantificeres med fluorescensgenvinding efter fotoblegning (FRAP) eksperimenter27. Hvis parametrene ikke er optimeret til den respektive opsætning, kan membrandiffusionen blive forringet på grund af reduceret membranfluiditet.

4. Samling af flowkamre

  1. Før samling af flowkammeret skal du holde følgende komponenter klar: rengjorte mikroskopdias (24 mm x 24 mm), hydrofiliserede mikroskopdias (24 mm x 60 mm), aluminiumsfolie, fladt pap, skalpel og dobbeltsidet tape.
  2. Pak det flade pap ind med aluminiumsfolie.
  3. Spred de rensede 24 mm x 24 mm mikroskopdias på aluminiumsfolien med tilstrækkelig afstand mellem hinanden.
  4. Fastgør dobbeltsidede båndstrimler til de øverste og nederste kanter af diasene.
  5. Punktafgiftspligten hvert mikroskop glider med skalpellen, så den kan fjernes fra aluminiumsfolien. Som følge heraf skal hvert dias have striber af dobbeltsidet tape fastgjort til diasets øvre og nedre kanter (se figur 1).
  6. Fastgør 24 mm x 24 mm diaset med de to dobbeltsidede båndstrimler til det hydrofiliserede 24 mm x 60 mm dias for at danne en strømningsbane mellem de mindre og større mikroskopdias.
    BEMÆRK: For at sikre rene flowkamre skal du konstant bære handsker og sikre, at arbejdsbordet er støvfrit.

5. Filtrering af reaktionsbuffere

  1. Sterilt filtrerer alle reaktionsbuffere gennem 0,45 μm celluloseacetatmembraner for at sikre minimalt baggrundssignal under MSPT-målinger.
    BEMÆRK: Hvis tilstedeværelsen af nukleotider, såsom ATP, er afgørende for et vellykket eksperiment, skal du være opmærksom på en potentiel stigning i baggrundssignalet. Det anbefales kun at bruge minimale mængder, der stadig sikrer proteinaktivitet.

6. Understøttet dannelse af lipiddobbeltlag (SLB)

BEMÆRK: Det anbefales at udføre dannelsen af understøttede lipiddobbeltlag på massefotometeret for visuelt at sikre en vellykket vesikelspredning og fuldstændig fjernelse af usmeltede vesikel.

  1. Fortynd friske ekstruderede SUV'er (se trin 1 for yderligere oplysninger) til en endelig koncentration på 0,4 mg/ml i den krævede reaktionsbuffer. For at fremme vesikelbrud tilsættes eventuelt 2 mM CaCl2 til vesikkelophænget.
    BEMÆRK: Divalente kationer kan forårsage aggregering af nogle lipider, såsom PiP2. For blandinger, der indeholder sådanne lipider, skal du afstå fra at anvendeCaCl2 til fremme af vesikelbrud eller andre divalente kationer i resuspensionbufferen. Hvis det er nødvendigt for eksperimentet, kan divalente kationer tilsættes efter den vellykkede dannelse af det understøttede lipiddobbeltlag.
  2. Skyl 50 μL af vesikelsuspensionen ind i flowkammeret (trin 4) og inkuber kammeret i 2 minutter.
    BEMÆRK: Buffere, vesikler eller proteinopløsninger kan skylles gennem flowkammeret med et lille stykke blødgøringsvæv. Det er dog også muligt at bruge et mekanisk pumpesystem.
  3. Fjern usmeltede vesikler ved gentagen (mindst tre gange) vask af flowkammeret med 200 μL af reaktionsbufferen hver gang.
    BEMÆRK: Vesikler skal vaskes grundigt ud af flowkammeret for at sikre et stabilt baggrundssignal under MSPT-målinger.

7. Generering af kalibreringskurve

BEMÆRK: For at omdanne kontrasten mellem detekterede partikler til molekylmasse skal deres signal kalibreres ved hjælp af proteiner af kendte størrelser. Det anbefales at justere standardproteinstørrelsesregimet for at dække det interval af molekylære masser, der forventes for det system, der er af interesse.

  1. Biotinylering af standardproteiner med en cysteinrest
    1. Beregn den passende mængde maleimid-biotin for standardproteinet i henhold til producentens anvisninger.
    2. Inkuber standardproteinet med det bestemte volumen maleimid-biotin i 1 time ved stuetemperatur.
    3. For at fjerne ukonjugeret maleimid-biotin fra det konjugerede biotinproteinkompleks skal du udføre størrelseseksklusionskromatografi på en kolonne, der er egnet til proteinet af interesse.
    4. Bestem proteinkoncentrationen ved hjælp af et Bradford-assay.
      BEMÆRK: For at opbevare standardproteinet til yderligere målinger skal proteinet fryses i engangsalikvoter i flydende nitrogen og opbevares ved -80 °C.
  2. Måling af standardproteiner til kalibreringskurven
    1. I et flowkammer fremstilles et understøttet lipiddobbeltlag med 0,4 mg/ml ekstruderede SUV'er (se trin 1 og 6 for flere detaljer), der indeholder 0,01 mol% (v/v) Biotinyl Cap PE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-cap biotinyl).
    2. Tilsæt 50 μL 2,5 nM divalent streptavidin til dobbeltlaget i flowkammeret og inkuber i 10 minutter.
      BEMÆRK: Divalent streptavidin er blevet udtrykt og renset som beskrevet i Howarth et al.28. Tetravalent streptavidin kan ligeledes anvendes. Imidlertid kan brugen af divalent streptavidin reducere de mulige reaktionsstøkiometrier mellem biotinylerede lipider og standardproteiner, der er konjugeret til en biotin-moiety for at lette tildelingen af arter.
    3. Fjern ubundet divalent streptavidin med 100 μL reaktionsbuffer.
    4. Tilsæt 50 μL 100 nM biotinkonjugeret standardprotein til dobbeltlag i flowkammeret og inkuber i 2 minutter.
      BEMÆRK: Afhængigt af biotinyleringseffektiviteten, og om der anvendes di- eller tetravalent streptavidin, kan de optimale koncentrationer af biotinkonjugeret standardprotein og streptavidin variere.
    5. Udfør MSPT-måling i henhold til de detaljer, der er beskrevet i trin 8.
      FORSIGTIG: Billeddannelsesbetingelserne skal være identiske for både prøve- og kalibreringsstandarder.

8. Billeddannelse

  1. SLB-dannelse og prøveforberedelse
    1. Som nærmere beskrevet i trin 6 skal du indføre SUV'er med den ønskede lipidblanding (25 μL) i prøveflowkammeret og danne et understøttet lipiddobbeltlag. Vask kammeret grundigt (tre gange) med 100 μL reaktionsbuffer for at fjerne alle usmeltede vesikler.
    2. Der tilsættes 50 μL af det protein, der er af interesse, til prøvekammeret.
      BEMÆRK: Da MSPT er en enkeltpartikelmetode, skal proteinkoncentrationen holdes i pM til nM-området for at muliggøre uforstyrret partikeldetektion og sporing.
  2. Video erhvervelse
    1. Indstil de ønskede billedbehandlingsbetingelser, f.eks. størrelsen på synsfeltet (FOV), billedhastighed, eksponeringstid og anskaffelsestid i anskaffelsessoftwaren.
      BEMÆRK: Følgende indstillinger har vist sig at fungere for MSPT på et kommercielt massefotometer (se Materialetabel): Synsfelt på 128 pixels x 35 pixels, en billedhastighed på 1 kHz, hvilket resulterer i ca. 200 billeder i sekundet efter efterfølgende 5 gange billedgennemsnit og en eksponeringstid på 0,95 ms.
    2. Juster fokus automatisk eller manuelt. Flyt om nødvendigt synsfeltet til en position med en homogen membran ved hjælp af den laterale kontrol.
    3. Opret en projektmappe, og begynd at optage filmen. Når optagelsen er afsluttet, skal du angive et filnavn i dialogboksen, der bliver bedt om af anskaffelsessoftwaren. Filmen gemmes derefter automatisk i projektmappen som en MP-fil til efterfølgende analyse.
      BEMÆRK: Optag mindst tre replikater i forskellige flowkamre for at sikre integriteten af de enkelte membraner og reproducerbarheden af resultaterne. Filmens varighed kan indstilles på forhånd og afhænger af typen af eksperiment. I de fleste tilfælde anbefales en anskaffelsestid mellem 5 min og 7 min.
      FORSIGTIG: Som standard komprimeres filmoptagelser på den kommercielle massefotometeropsamlingssoftware, før de gemmes for at reducere lagerpladsen. Filkomprimering skal dog deaktiveres for at aktivere brugerdefineret dataanalyse som beskrevet i denne protokol. Detaljer om, hvordan du deaktiverer filkomprimering, findes i producentens brugervejledning.

9. Analyse af data

BEMÆRK: Dataanalysepipelinen ledsages af to interaktive Jupyter-notesbøger (MSPT analysis.ipynb, Movie visualization.ipynb). Jupyter-notesbøgerne og tilhørende specialskrevne Python-moduler, der er nødvendige for at udføre MSPT-analysen, der er beskrevet nedenfor, er tilgængelige i et offentligt lager: https://github.com/MSPT-toolkit/MSPT-toolkit. For detaljerede instruktioner om analysen nedenfor henvises læsere til MSPT analysis.ipynb , der er adgang til ved hjælp af ovenstående link.

  1. Videobehandling
    1. Fjern dominerende statisk spredning af lys med den pixelvise baggrundsestimeringsalgoritme ved hjælp af funktionen image_processing.mp_reader .
      1. Hvis du vil anvende fjernelsen af baggrunden, skal du vælge indstillingen continuous_median for parametertilstanden og indstille en passende længde for det glidende medianvindue (window_length) i afsnittet B.1 i notesbogen. Gem eventuelt filmene efter fjernelse af baggrunden, der skal bruges til partikeldetektion og sammenkædning af baner (ved at indstille parameteren save_processed_movies til Sand).
        BEMÆRK: Juster vinduesstørrelsen (window_length) til værdier mellem 101 og 2001 afhængigt af partikeltætheden på membranen, den forventede diffusionskoefficient, anskaffelsesbilledhastighed og den krævede behandlingshastighed.
        FORSIGTIG: Baggrundsfjernelsesstrategien fungerer godt, hvis membranen ikke er for tæt pakket, og hvis diffusionen af partiklerne er tilstrækkelig hurtig (dvs. hver pixel er det meste af tiden ikke optaget af en partikel). Ellers vil partiklernes kontrast systematisk blive undervurderet, da de ikke kan skelnes korrekt fra baggrundssignalet. Dette kan kompenseres for ved at øge medianvinduesstørrelsen på bekostning af beregningshastigheden. Vær dog opmærksom på, at indstilling af vinduesstørrelsen for stor kan påvirke outputtet negativt på grund af prøveafdrift. En visuel inspektion af de behandlede videoer er afgørende.
    2. Registrer partikler og deres respektive position i hele filmen ved hjælp af funktionen particle_fitting.particle_fitter (se afsnit B.2 i notesbogen).
      1. Indstil følsomheden af partikeldetektion med tærskelparameteren (tærsk; se notebook afsnit B.1), som bruges til at fremhæve kandidatpletter ved billedbinarisering. Effekten af varierende tærskelparametre på spotdetekteringsfølsomheden kan undersøges i en separat notesbog (Movie visualization.ipynb). Resultaterne af partikelregistrering gemmes automatisk i CSV-filer i en undermappe til filmfilen.
        BEMÆRK: Det anbefales ikke at indstille tærskelparameteren vilkårligt lavt (f.eks. for film taget med det anvendte massefotometer, en tærskelparameter under 0,0005), da kandidatpletter vil blive domineret af falsk støj og dermed forlænge behandlingstiden.
  2. Link partikler i på hinanden følgende rammer til baner ved hjælp af Python-pakken trackpy (v.0.5.0)29.
    BEMÆRK: Banesammenkædningen udføres i farten efter spotdetektion. Som følge heraf gemmes en ekstra CSV-fil, der indeholder baneoplysningerne, i en undermappe til CSV-filen til partikeldetektion.
    1. Fjern baner med for få punkter ved hjælp af parameteren minimum_trajectory_length (se afsnit B.1 i notesbogen) for at muliggøre en robust bestemmelse af diffusionskoefficienter. For detaljerede forklaringer vedrørende de andre parametre for trackpy-funktioner henvises til trackpys dokumentation.
  3. Bane analyse
    1. I afsnittet Notesbog C.1 skal du angive billedhastigheden (frame_rate) og pixelstørrelsen i nm (pixel_size), som blev brugt til filmanskaffelse. Opret en liste over CSV-filer, der indeholder de baneoplysninger, der returneres af trackpy (se trin 9.2) med funktionen trajectory_analysis.get_csv_files (afsnittet notesbog C.2).
    2. Angiv desuden et outputfilnavn til HDF5-containeren, som bruges til at gemme tilpasningsresultaterne på disken (afsnit C.3 i notesbogen). Analysér alle baner med funktionen trajectory_analysis.fit_trajectories i notesbogsafsnit C.4, som gentages gennem listen over CSV-filer. Denne funktion bruger springafstandsfordeling (JDD)30 og gennemsnitlig kvadratisk forskydning (MSD)31-analyse til at estimere diffusionskoefficienten for hver bane.
    3. Konverter mediankontrasten for hver bane til dens tilsvarende masse ved hjælp af kontrastmasseforholdet opnået ved MSPT-kalibreringen (se pkt. 7). Angiv kalibreringslinjens hældning (hældning) og y-aflytning (forskydning), som relaterer iSCAT-kontrast til molekylmasse (funktion trajectory_analysis.apply_calibration; se afsnit C.5 i notesbogen. Denne funktion føjer en kolonne med banens medianmasse til hver dataramme.
    4. Evaluer den tilsyneladende partikeltæthed på membranen med funktionen trajectory_analysis.membrane_density, som returnerer mediandensitetsværdien i form af detekterede partikler og nuværende baner under hver ramme (se notebook afsnit C.6) som yderligere kolonner i datarammen.
      BEMÆRK: Da en del af partiklerne vil gå tabt under både detektions- og baneforbindelsesprocessen, kan de faktiske partikeltætheder være højere. For pålidelige resultater vedrørende partikeltætheder samt massehistogrammer skal repræsentative filmsnapshots visuelt inspiceres for at kontrollere, at målebetingelserne er plausible for enkeltpartikelsporing (se trin 9.1.1).

10. Datavisualisering

  1. Illustrer korrelationen mellem masse- og diffusionskoefficient med todimensionel kernetæthedsestimering (KDE), som er baseret på Python-pakken fastkde (v.1.0.19; https://pypi.org/project/fastkde/).
  2. Hvis du vil generere plottet, skal du angive HDF5-filen, der indeholder MSPT-resultaterne (se trin 9.3.2 og notesbogssektion D.1) og vælge en enkelt (notesbogssektion D.2) eller en sammenkædet dataramme (notesbogssektion D.3) som inputdata for funktionen plotting.generate_2D_KDE (notesbogsafsnit D.4).
    BEMÆRK: Hvert afbildet datasæt skal ideelt set indeholde mere end 1.000 baner for en pålidelig 2D-KDE.

Representative Results

Efter den detaljerede protokol heri til fremstilling af understøttede lipiddobbeltlag (SLP'er) i flowkamre (figur 1) kan man tydeligt genkende et speckle-lignende mønster i den oprindelige visning af alle viste forhold (figur 2). Denne effekt skyldes glassets overfladeruhed, som generelt dominerer spredningssignalet og fører til visuelt uadskillelige forhold (glas, glas med SLB eller glas med SLB og vedhæftede proteiner). Tilstedeværelsen af vesikler er imidlertid tydeligt tydelig på grund af vesiklernes store spredningstværsnit og muliggør observation af vesikelbrud og fusion til homogene membraner (figur 2B og supplerende film 1). Når man fjerner glasoverfladens statiske spredningssignal med en ratiometrisk tilgang, der understreger de dynamiske elementer inden for synsfeltet24,25, kan man afdække umærkede proteiner, der diffunderer på membranen (figur 2D), mens en tom SLB (figur 2C) eller selve glasset (figur 2A) fremstår som et støjende billede.

Den iboende baggrund for MSPT-målinger kan estimeres lokalt ved at dividere hver pixelværdi gennem medianen af n forudgående og efterfølgende pixels i filmen på samme billedposition (figur 3). Som et resultat fremstår makromolekyler som isotrope punktspredningsfunktioner (PSF'er), hvis bevægelse på membranen kan observeres, spores og kvantificeres. Faktisk muliggør tilgængeligheden af både kontrast og dynamisk adfærd den direkte relation mellem en partikels molekylære størrelse og dens respektive diffusive adfærd, alt sammen uden behov for mærkning af partiklen. Ikke desto mindre er det vigtigt at udføre en kalibrering, der oversætter signalamplituden til molekylmasse, for at fortolke iSCAT-kontrasten bestemt under MSPT-eksperimenter. Dette kan opnås ved at binde biomolekyler af kendt masse til en SLB via et biotin-streptavidin-biotinkompleks (figur 4A). Som en eksemplarisk strategi kan man bruge biotinylerede varianter af bovin serumalbumin (BSA), protein A (prA), alkalisk phosphatase (AP) og fibronectin (FN), som binder til streptavidin (STP), der selv er bundet til biotinholdige lipider (Biotinyl Cap PE) i membranen. Som vist i figur 4A afspejler den stadig mere udtalte kontrast mellem disse eksemplariske makromolekyler den stigende molekylvægt af de respektive biotinylerede standarder. Ved at tildele hver top af kontrasthistogrammerne (figur 4B) til den tilsvarende masse af standardproteinets oligomertilstand afsløres et lineært forhold mellem kontrast og masse21,22 og kan efterfølgende anvendes til analyse af ukendte makromolekylesystemer (figur 4C).

Et godt eksempel, der demonstrerer ANVENDELIGHEDEN og kapaciteten af MSPT til at analysere molekylvægte og dermed studere oligomertilstande og oligomeriseringshændelser, er overvejelsen af biotinyleret aldolase og biotinyleret IgG (figur 5). Aldolase er almindeligt rapporteret at være en homotetramer32. Massefordelingen løst af MSPT har imidlertid fire forskellige toppe, hvilket fremhæver tilstedeværelsen af flere populationer (figur 5A). Mens den første mindre top svarer til ubesat streptavidin og kan forventes på grund af konfigurationen i denne type eksperiment, kan aldolasekomplekser med kun to underenheder (2SU) eller seks underenheder (6SU) ligeledes detekteres (figur 5B). Interessant nok viser tetra- og hexameriske aldolase-streptavidinkomplekser en reduceret diffusionskoefficient sammenlignet med dimerisk aldolase og streptavidin alene, hvilket indikerer en øget viskøs træk, f.eks. via fastgørelsen af et andet biotinyleret lipid til streptavidin. Tilsvarende udviser biotinyleret IgG tre toppe i massefordelingen, hvor den første top igen matcher massen af en enkelt streptavidin. Massen af den mest rigelige top svarer til massen af en let og en tung kæde (1SU), dvs. halvdelen af et IgG-antistof. Det fulde antistof med to identiske halvdele (2SU) påvises i ca. 11% af tilfældene. Faldet i diffusionskoefficienten med stigende komplekse størrelser indikerer interaktioner mellem streptavidin med mere end et biotinyleret lipid eller yderligere træk forårsaget af den vedhæftede IgG eller begge dele.

Udover den eneste analyse af membranafhængige oligomertilstande giver MSPT også den særlige fordel at korrelere den diffusive opførsel af et makromolekyle af interesse med dets oligomertilstand. Repræsentative resultater for denne type analyse er vist for henholdsvis annexin V (AnV) og koleratoksinunderenhed B (CTxB), som binder til henholdsvis dioleoylphosphatidylserin (DOPS) eller glycosphingolipider (GM1), inkorporeret i membranen (figur 6A). Begge kernetæthedsestimater (KDE'er) har unimodale fordelinger af masse og diffusion, hvilket indikerer en enkelt rigelig art med lignende diffusiv adfærd. Toppositionen for molekylmasse og diffusionskoefficient viste sig at være henholdsvis 49,8 ± 2,2 kDa og 1,4 ± 0,1 μm2/s for Henholdsvis AnV samt 62,7 ± 3,1 kDa og 0,4 ± 0,1 μm2/s for CTxB. De målte diffusionskoefficienter er sammenlignelige med tidligere rapporterede værdier opnået fra højhastigheds-AFM og FRAP33,34. Den let reducerede masse sammenlignet med massen af det forventede makromolekyle (52 kDa for en AnV-trimmer, 65 kDa for en CTxB-pentamer) kan indikere tilstedeværelsen af mindre komplekser med færre underenheder i ensemblet. Mens masseforskellen mellem proteinerne er lille og tæt på mikroskopets specificerede detektionsgrænse (≈50 kDa), varierer deres diffusionskoefficienter betydeligt. I en ækvimolær blanding kan man for eksempel ved at sammenligne blandingens diffusion med fordelingen af AnV og CTxB alene konkludere, at AnV er mere rigelig på membranen end CTxB (figur 6B). Men hvis koncentrationen af CTxB fordobles i forhold til koncentrationen af AnV, forskydes ligevægten mod CTxB som det fremherskende protein på membranen. Som illustreret for blandinger af AnV og CTxB tillader MSPT ikke kun at diskriminere membranassocierede makromolekyler i henhold til deres molekylvægt, men muliggør også diskrimination af forskellige makromolekylepopulationer i henhold til deres diffusive adfærd.

Som med alle mikroskopiteknikker er nogle eksperimentelle krav afgørende for at opnå den ønskede datakvalitet. Et vigtigt eksempel i denne sammenhæng er grundigt rengjorte dæksedler. Generelt betragtes dette som en forudsætning for mikroskopirelaterede enkeltmolekyleforsøg, men MSPT er særligt følsom over for prøveurenheder. Den øgede spredning, der stammer fra glasoverfladen på urensede dæksedler, forhindrer enhver kvantitativ iSCAT-måling. Især kan selv resterende snavs eller støvpartikler på utilstrækkeligt rengjort glas forårsage bemærkelsesværdige billedforvrængninger, der kan genkendes som lyse pletter i den oprindelige billeddannelsestilstand (figur 7A). Selv om disse defekter fjernes af baggrundsestimatet på grund af deres statiske natur, kan nøjagtig bestemmelse af en partikels kontrast blive forringet og dermed påvirke dens kvantitative analyse negativt. Et andet almindeligt problem, der opstår i MSPT-eksperimenter, er de resterende vesikler, der enten flyder (omkranset i orange) gennem synsfeltet eller usmeltede vesikler, der sidder fast (omgivet af blåt) i en bestemt position på membranen og fremstår som store pulserende spredere (figur 7B). For at minimere deres forekomst og interferens med filmoptagelse anbefales det at vaske SLB grundigt, inden proteinet tilsættes, og at anvende frisklavede blandinger af små unilamellare vesikler (SUV'er) og divalente kationer.

En faktor, der skal tages i betragtning ved udformningen af massefølsomme partikelsporingseksperimenter, er tætheden af makromolekyler forbundet med membrangrænsefladen. Høje partikeltætheder på membranen kan faktisk forårsage problemer af to grunde: i) Sammenkædningen af partikeldetektioner fra på hinanden følgende rammer til baner bliver tvetydig og øger dermed sandsynligheden for fejl og fejlbedømte diffusionskoefficienter. ii) Massen af partikler, der ekstraheres fra amplituden af deres tilsvarende PSF-tilpasning, bliver systematisk undervurderet, og massetoppene udvides, fordi adskillelsen af det statiske baggrundssignal fra det dynamiske partikelsignal bliver stadig vanskeligere (figur 7C). I øjeblikket er visuel vurdering af datakvalitet i processen med at erhverve MSPT-videoer vanskelig på de tilgængelige kommercielle mikroskoper, fordi den implementerede ratiometriske visning i erhvervelsessoftwaren bruger den baggrundsfjernelse, der er etableret for massefotometri21 i stedet for den medianbaserede algoritme, der er beskrevet her og i referencer24,25 (figur 7D ). Den middelbaserede kontinuerlige baggrundsfjernelse, der bruges til at visualisere landingsmolekyler i massefotometri, får diffuserende partikler til at fremstå som mørke fronter med lyse haler, hvilket får pletterne til at virke meget anisotrope og forstyrrer PSF-tilpasning under detektionsproceduren. Anvendelsen af den implementerede middelbaserede billedbehandling i anskaffelsessoftwaren er således uegnet til analyse af diffuserende biomolekyler på membraner.

Figure 1
Figur 1: Procesflowdiagram over de enkelte trin, der kræves for at analysere protein-membraninteraktioner med massefølsom partikelsporing (MSPT). For at forberede prøver til MSPT-målinger skal glasdækseldias rengøres grundigt og aktiveres med et iltplasma. Efter deres samling i prøveflowkamre forberedes små unilamellare vesikler (SUV'er) til dannelse af understøttet lipiddobbeltlag (SLB), og alle reaktionsbuffere filtreres for at reducere baggrundsspredning. SUV'er tilsættes for at danne lipiddobbeltlag i strømningskamrene. Eventuelt kan divalente kationer såsom Ca2+ ioner føjes til SUV'erne for at fremme vesikkelbrud. Til sidst skylles lave koncentrationer af proteinet af interesse ind i reaktionskammeret. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Indfødt og ratiometrisk visning af eksemplariske overflader, der er relevante for MSPT-målinger. Repræsentative billeder af overfladens ruhed af et glasdæksel dias (A), under dannelsen af et understøttet lipid dobbeltlag (B), med et intakt understøttet lipid dobbeltlag (C) og af eksemplariske proteiner rekonstitueret på en SLB (D). Alle fire eksempler vises i den oprindelige tilstand, som kan tilgås under selve målingen, og som behandlede ratiometriske billeder efter medianbaseret fjernelse af baggrund. Skalastænger repræsenterer 1 μm. Til dataanalyse (se ledsaget Jupyter-notesbog; trin 9) blev følgende parametre anvendt: median vinduesstørrelse (window_length) = 1001. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Trin-for-trin diagram over de faser, der kræves til MSPT-dataindsamling og -analyse. Efter dataindsamling for prøven af interesse på massefotometeret behandles film for at fjerne den statiske baggrund gennem en pixelvis glidende mediantilgang. Derefter identificeres og monteres kandidatpartikler ved hjælp af en punktspredningsfunktion (PSF), inden de forbindes til partikelbaner. For at gøre det muligt at bestemme diffusionskoefficienten for hver partikel anvendes analyse af gennemsnitlig kvadratisk forskydning (MSD) eller springafstandsfordeling (JDD). På dette stadium kan kontrastværdier omdannes til molekylære masser i henhold til kontrastmasse-relationen bestemt gennem kalibreringsstrategien. Som et sidste trin kan baner filtreres baseret på deres længde eller membranpartikeltæthed og visualiseres ved todimensionel kernetæthedsestimering (2D-KDE). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Kalibrering af masse-til-kontrast-relationen for MSPT-målinger. (A) Repræsentative ratiometriske rammer opnået for eksemplariske streptavidin-standardproteinkomplekser, der diffunderer på et understøttet lipiddobbeltlag indeholdende en lille procentdel af biotinylerede lipider (DOPC: DOPG: Biotinyl Cap PE-forhold på 70: 29.99: 0.01 mol%). Som modelmolekylære standarder vises monovalent streptavidin28 (kun STP) eller divalent streptavidin28 i kompleks med enten biotinyleret bovin serumalbumin (BSA), biotinyleret protein A (prA), biotinyleret alkalisk phosphatase (AP) eller biotinyleret fibronectin (FN). Kandidatpletter fremhæves i orange (stiplede cirkler), og vellykkede partikeldetektioner fremhæves i rødt (faste cirkler). Skalabjælkerne repræsenterer 1 μm. (B) Sandsynlighedstæthedsfordelinger af kontrastværdier opnået for de fem modelstandardproteiner. Alle viste data repræsenterer samlede fordelinger af tre uafhængige eksperimenter pr. Betingelse: STP kun n = 82.719; BSA n = 9.034; prA n = 22.204; AP n = 69.065 og FN n = 71.759 baner. Sammenlignet med partikeltal bestemt for membraner med proteiner er antallet af partikler, der detekteres på et tomt dobbeltlag, ubetydeligt ved moderate membrantætheder (supplerende figur 1). Kontrasttoppe, der overvejes til massekalibrering, markeres gennem kontinuerlige linjer, mens stiplede repræsenterer oligomertilstande, der ikke tages i betragtning. C) Kalibreringskurve mellem kontrast og masse afledt af spidskontraster i panel D og kompleksernes respektive sekvensmasser. Fejllinjer viser standardfejlen for de spidsbelastningssteder, der estimeres af bootstrapping (100 resamples med 1.000 baner hver). Til dataanalyse (se Jupyter notebook; trin 9) blev følgende parametre brugt: median vinduesstørrelse (window_length) = 1.001 billeder, detektionstærskel (tærsk) = 0,00055, søgeområde (dmax) = 4 pixels, hukommelse (max_frames_to_vanish) = 0 billeder, mindste banelængde (minimum_trajectory_length) = 7 billeder (kun STP), 9 billeder (BSA/FN), 15 billeder (prA), 10 billeder (AP). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Dechifrering af oligomertilstande af membranassocierede proteiner. (A) 2D kernetæthedsestimater af både masse- og diffusionskoefficient for tetravalent streptavidin i kompleks med biotinyleret aldolase (venstre panel) eller med et biotinmodificeret gede-anti-kanin-IgG-antistof (højre panel). Rekonstitution af begge komplekser er blevet udført på et understøttet lipiddobbeltlag indeholdende DOPC, DOPG og Biotinyl Cap PE i et forhold på henholdsvis 70:29,99:0,01 mol%. I alt er der medtaget 116.787 baner af tre uafhængige replikater for streptavidin-aldolasekomplekset (partikeltæthed på 0,1 μm-2) og 348.405 for streptavidin-IgG-kompositten (partikeltæthed på 0,1 μm-2). Kun partikler med en sporlængde på mindst fem rammer blev inkluderet. Marginale sandsynlighedsfordelinger af både molekylmasse (øverst) og diffusionskoefficient (højre) præsenteres. Det sorte x i begge paneler markerer den respektive lokale maks. B) Sammenligning af bestemte oligomermasser for komplekset af tetravalent streptavidin med biotinmodificeret aldolase (venstre panel) eller biotinyleret IgG (højre panel) med forventede molekylvægte i henhold til sekvensmasserne. Forkortelsen SU indføres på vegne af underenheden protein af interesser. Fejllinjer viser standardfejlen for de spidsbelastningssteder, der estimeres af bootstrapping (100 resamples med 1.000 baner hver). Til dataanalyse (se ledsaget Jupyter-notesbog; trin 9) blev følgende parametre anvendt: median vinduesstørrelse (window_length) = 1.001 billeder, detektionstærskel (tærsk) = 0,00055, søgeområde (dmax) = 4 pixels, hukommelse (max_frames_to_vanish) = 0 billeder, mindste banelængde (minimum_trajectory_length) = 5. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Opløsning af den diffusive opførsel af de indfødte membran-interagerende proteiner annexin V (AnV) og koleratoksin underenhed B (CTxB). (A) 2D kernedensitet estimater af både masse og diffusionskoefficient for annexin V (venstre panel) og koleratoksin underenhed B (højre panel). Til AnV- og CTxB-membranrekonstitution er lipidsammensætninger på henholdsvis 80:20 mol% DOPC til DOPS og 99,99:0,01 mol% DOPC til GM1 blevet anvendt. I alt er der medtaget 206.819 baner af tre uafhængige replikater for AnV (partikeltæthed på 0,1 μm-2) og 142.895 baner for CTxB (partikeltæthed på 0,2 μm-2). B) 2D-kernetæthedsestimater af CTxB- og AnV-blandinger i forholdet 1:1 (venstre panel) eller 2:1 (højre panel). Rekonstitution af proteinblandinger blev udført på et understøttet lipiddobbeltlag indeholdende DOPC-, DOPS- og GM1-lipider i et forhold på 80:19,99:0,01 mol%. I alt er der medtaget 42.696 baner af tre uafhængige replikater for 1:1-blandingen (partikeltæthed på 0,1 μm-2) og 264.561 baner for 2:1-forholdet (partikeltæthed på 0,3 μm-2). For både (A) og (B) blev kun partikler med en sporlængde på mindst fem rammer inkluderet. Marginale sandsynlighedsfordelinger af både molekylmasse (øverst) og diffusionskoefficient (højre) præsenteres. Det hvide x i hvert panel markerer det respektive globale maksimum for KDE. Til dataanalyse (se ledsaget Jupyter-notesbog; trin 9) blev følgende parametre anvendt: median vinduesstørrelse (window_length) = 1.001 billeder, detektionstærskel (tærsk) = 0,00055, søgeområde (dmax) = 4 pixels, hukommelse (max_frames_to_vanish) = 0 billeder, mindste banelængde (minimum_trajectory_length) = 5. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Potentielle komplikationer i løbet af MSPT-målinger eller under dataanalyse. (A) Repræsentative billeder af overfladens ruhed, der vises i både den oprindelige og den behandlede (medianbaseret fjernelse af baggrunden) ratiometrisk visning af et urenset dækglasdias. I begge tilfælde udgør lyse pletter resterende overfladeurenheder, der hindrer artefaktfrie målinger. (B) Eksemplariske billeder af resterende vesikler i synsfeltet efter utilstrækkelig membranvask. Både statiske (fremhævet med blåt) og diffuserende (fremhævet i orange) vesikler vil forringe målekvaliteten enten på grund af henholdsvis pulserende og vrikkende eller på grund af deres retningsbevægelse. (C) Som en enkeltpartikelteknik kræver MSPT lave partikeltætheder (repræsentativt billede, øverste panel) for at muliggøre korrekt sammenkædning og massebestemmelse af hver partikel. I tilfælde af høje membran-partikeltætheder (midterpanel) er partikeltilpasningen svækket, hvilket påvirker massebestemmelsen (se nederste panel). D) Repræsentative ratiometriske billeder af partikler, der diffunderer på en membrangrænseflade efter enten middelbaseret (øvre panel) eller medianbaseret baggrundsfjernelse. For diffuserende partikler producerer den middelbaserede baggrundsfjernelsesstrategi forvrængede billeder af partiklens PSF, som det kan ses i de små indsætninger mellem det øverste og midterste panel. I modsætning hertil kan ikke-fordrejede partikel-PSF'er opnås gennem den medianbaserede tilgang. Nederste panel: Sammenligning af linjeprofiler gennem midten af PSF opnået efter fjernelse af middel- eller medianbaseret baggrund. For alle oprindelige og ratiometriske billeder, der vises i denne figur, repræsenterer skalabjælkerne 1 μm. Til dataanalyse (se ledsaget Jupyter-notesbog; trin 9) blev følgende parametre anvendt: median vinduesstørrelse (window_length) = 1.001 billeder, detektionstærskel (tærsk) = 0,00055, søgeområde (dmax) = 4 pixels, hukommelse (max_frames_to_vanish) = 0 billeder, mindste banelængde (minimum_trajectory_length) = 5. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende figur 1: Sammenligning af proteinfrie og besatte membraner. Repræsentative billeder af et intakt understøttet lipiddobbeltlag før (A) og efter (B) tilsætning af renset streptavidin (STP). Kandidatpladser, der med succes passede til modellen PSF, er omgivet af rødt. (C) Kontrastsandsynlighedsfordelinger af partikler detekteret på en tom membran (membranbaggrund, grå) og på et dobbeltlag med diffuserende streptavidinpartikler (blå). Begge sandsynlighedsfordelinger repræsenterer de samlede data fra tre uafhængige eksperimenter med identiske filmoptagelses- og analyseparametre. Til dataanalyse (se ledsaget Jupyter-notesbog; trin 9) blev følgende parametre anvendt: median vinduesstørrelse (window_length) = 1.001 billeder, detektionstærskel (tærsk) = 0,00055, søgeområde (dmax) = 4 pixels, hukommelse (max_frames_to_vanish) = 0 billeder, mindste banelængde (minimum_trajectory_length) = 7 billeder. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende film 1: Eksemplarisk film, der viser brud og fusion af vesikler til en homogen membran optaget med massefotometeret. Medianvinduesstørrelse for billedbehandling (window_length) = 1.001 billeder. Vægtstang: 1 μm. Kamera tæller rækkevidde: sort = 16.892; hvid = 65.408. Klik her for at downloade denne film.

Supplerende film 2: Eksemplariske film, der viser diffusionen af annexin V (øverst) og biotinylerede aldolase (nederste) komplekser på et dobbeltlag som opnået ved MSPT-målinger. Medianvinduesstørrelse for billedbehandling (window_length) = 1.001 billeder. Vægtstang: 1 μm. Interferometrisk spredningskontrastområde: sort = -0,0075; hvid = 0,0075. Klik her for at downloade denne film.

Discussion

Den præsenterede protokol udvider massefotometri21, en teknik, der analyserer massen af enkelte biomolekyler, der adsorberer på glas, til et endnu mere alsidigt værktøj, der er i stand til samtidig at måle massen og diffusionen af umærkede membran-interagerende biomolekyler. Denne analyseudvidelse opnås gennem implementering af en modificeret baggrundsfjernelsesstrategi tilpasset den laterale bevægelse af molekyler24,25. Generelt er fjernelsen af baggrunden af største betydning for iSCAT-baserede tilgange, da den stærke spredning af glasoverfladens ruhed udgør den vigtigste analysehindring, og den nøjagtige bestemmelse af hver pixels lokale baggrund er afgørende for kvantificering af partikelmasse og placering. Udover billedanalysen, der er tilpasset partikelbevægelse, fuldender efterfølgende partikeldetektion, baneforbindelse og dataanalyse den nye udvidelse af MP til massefølsom partikelsporing (MSPT).

Generelt er grundigt rengjorte glasafdækningsrutsjebaner og et rent arbejdsmiljø kritiske krav til en vellykket udførelse af MSPT-eksperimenter. På grund af fraværet af makromolekylemærkning er det erhvervede signal i sagens natur ikke-selektivt. Rene prøver samt korrekt prøvehåndtering er derfor afgørende for at sikre, at observationer ikke kan misfortolkes. Især når molekyler med lav molekylvægt undersøges, godkendes kontrolmålinger af proteinfrie membraner for at vurdere baggrundsbidrag (supplerende figur 1). Ud over medtagelsen af kontrolmålinger anbefales det derfor at følge forberedelsestrinnene i figur 2 for hvert flowkammer. Når de kombineres, vil disse sikkerhedsforanstaltninger sikre, at det detekterede signal stammer fra det biomolekyle, der er af interesse, og ikke for eksempel et forurenet flowkammer, buffer eller membran.

Udover forholdsreglerne vedrørende det eksperimentelle design skal der også tages omhu under MSPT-billedbehandling. Under videobehandlingen bør værdien for tre parametre vælges omhyggeligt for at sikre korrekte resultater: i) længden af medianvinduet til fjernelse af baggrunden, ii) tærsklen for partikeldetektion og iii) den maksimale søgeradius under sammenkædningsopgaven. Et større medianvindue (i) letter generelt adskillelsen af diffuserende partikler fra den overlejrede kvasikonstante baggrund. For store vinduesstørrelser vil prøveafdrift dog i sidste ende blive mærkbar og mindske nøjagtigheden af baggrundsestimeringen. Optimale indstillinger afhænger i høj grad af prøveegenskaber og måleforhold. Ikke desto mindre kan en værdi på 1.001 bruges som et robust udgangspunkt. Tærskelparameteren (ii) skal indstilles afhængigt af den laveste molekylmasse, der forventes i prøven. En værdi under 0,0005 anbefales ikke til målinger taget med det massefotometer, der anvendes i denne undersøgelse. For at fremskynde analysetiderne kan der vælges højere værdier, hvis der forventes en prøve med høj molekylvægt. Søgeradius i banesammenkædning (iii) angiver den maksimale radiale afstand i pixels, hvor partiklens forskudte placering vil blive søgt efter i på hinanden følgende rammer. Det skal tilpasses den hurtigste partikel i prøven, og hvis det foretrækkes, kan et adaptivt søgeområde (se dokumentation af trackpy) i stedet bruges til at reducere beregningstiden. Især i den indledende fase af et projekt anbefales det at genanalysere filmene med forskellige parametre for at validere de opnåede resultater.

I lyset af MSPT's enkeltmolekylekarakter bør det undgås at måle ved høje membranpartikeltætheder, da disse kan forstyrre nøjagtig kontrast og massebestemmelse. Det har vist sig, at tætheder under en partikel pr. Kvadratisk mikrometer er gunstige for MSPT-målinger24. En yderligere overvejelse er de forventede diffusionskoefficienter i prøven. Selv om MSPT finder anvendelse på en bred vifte af diffusionskoefficienter, har MSPT en nedre grænse for tilgængelige diffusionskoefficienter. Lokal indespærring i et område på få pixels i en betydelig del af medianvinduesperioden fusionerer partiklen med den statiske baggrund. For de billeddannelsesbetingelser, der anvendes i denne protokol, anbefales det ikke at måle diffusionskoefficienter under 0,01 μm2/s. Ved denne diffusionshastighed er for eksempel den gennemsnitlige kvadrerede forskydning af en partikel under medianvinduets halvstørrelse ca. 4 pixels og dermed af samme størrelse som PSF's udstrækning. Som følge heraf vil det statiske baggrundsestimat sandsynligvis indeholde signalbidrag fra selve partiklen, hvilket resulterer i en tilsyneladende reduceret kontrast af partiklen, indtil den til sidst nærmer sig støjniveauet. Makromolekylediffusionskoefficienter på mellem 0,05 og 10 μm2/s kan dog klart løses.

For yderligere at udvide rækkevidden af MSPT-applikationer kan man forestille sig en udvikling af den medianbaserede baggrundsalgoritme gennem eliminering af pixels, der midlertidigt er optaget af en partikel, eller ved prøveafdriftkorrektion, der muliggør større medianvinduesstørrelser. Begge tilgange ville afhjælpe problemerne med målinger ved høje partikeltætheder og langsom diffusion. Forbedringer med hensyn til lavere massefølsomhed er på vej med en ny generation af massefotometre, som kan give adgang til biomolekyler mindre end 50 kDa. Derfor vil fremtidige MSPT-eksperimenter være i stand til at studere enkeltmolekyledynamik og membranrelaterede interaktioner for et endnu bredere udvalg af membranefterligninger såsom polstrede dobbeltlag og makromolekylære systemer.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi sætter stor pris på støtten fra Philipp Kukura, Gavin Young og Refeyn-softwareteamet og anerkender deres hjælp ved at dele dele af billedanalysekoden. Vi takker Cryo-EM MPIB Core Facility for at give adgang til det kommercielle Refeyn massefotometer. F.S. anerkender taknemmeligt den støtte og finansiering, som Jürgen Plitzko og Wolfgang Baumeister har ydet. T.H. og P.S. modtog støtte gennem Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) - Project-ID 201269156 - SFB 1032 (A09). N.H. blev støttet af et DFG-returtilskud HU 2462/3-1. P.S. anerkender støtte gennem forskningsnetværket MaxSynBio via det fælles finansieringsinitiativ fra det tyske forbundsministerium for uddannelse og forskning (BMBF) og Max Planck Society.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
annexin V Sigma Aldrich #SRP8026 examplary membrane-interacting protein
Bio-Rad Protein Assay Bio-Rad Laboratories Inc. #5000006 bradford assay kit to determine protein stock concentrations
biotin labeled bovine albumin Sigma Aldrich #A8549 examplary protein that can be used as standard protein for MSPT
cholera toxin subunit B Sigma Aldrich #SAE0069 examplary membrane-interacting protein
cover glasses, #1.5, 24 x 24 mm Paul Marienfeld GmbH & Co. KG #0102062
cover glasses, #1.5, 24 x 60 mm Paul Marienfeld GmbH & Co. KG #0102242
dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) Avanti Polar Lipids #850375 lipid - in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation
dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-cap biotinyl (18:1 Biotinyl Cap PE Avanti Polar Lipids #870273 lipid - in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation
dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DOPG) Avanti Polar Lipids #840475 lipid - in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation
dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (DOPS) Avanti Polar Lipids #840035 lipid - in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation
double-sided tape tesa #57912-00000-02 needed for the assembly of glass sample chambers
Extruder Avanti Polar Lipids #610023 Lipid extruder to enable monodisperse vesicle distributions
EZ-Link Maleimide-PEG2-Biotin Thermo Fisher Scientific #A39261 maileimide-fused biotin that can be used to biotinylate standard proteins for MSPT
Fibronectin (Biotinylated) Cytoskeleton Inc. #FNR03-A examplary protein that can be used as standard protein for MSPT
Gel Filtration HMW Calibration Kit Cytiva #28403842 standard proteins, e.g. aldolase that can be biotinylated and used as molecular weight standards for MSPT
GM1 Ganglioside (Brain, Ovine-Sodium Salt) Avanti Polar Lipids #860065 lipid - in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Biotin Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) #31820 examplary protein to highlight the existence of different protein states
Isopropanol, 99.5%, for spectroscopy Thermo Fisher Scientific #10003643
Low Autofluorescence Immersion Oil Olympus K.K. #IMMOIL-F30CC
pET21a-Streptavidin-Alive Addgene #20860 required to express and purify divalent streptavidin in combination with each other
pET21a-Streptavidin-Dead Addgene #20859 required to express and purify divalent streptavidin in combination with each other
Pierce Alkaline Phosphatase, biotinylated Thermo Fisher Scientific #29339 examplary protein that can be used as standard protein for MSPT
Pierce Protein A, Biotinylated Thermo Fisher Scientific #29989 examplary protein that can be used as standard protein for MSPT
Refeyn Acquire Refeyn Ltd. control software for Refeyn OneMP
Refeyn One Refeyn Ltd. - mass photometer
sterile syringe filters 0.45 µm cellulose acetate membrane VWR International #514-0063 needed to filter particles from the buffer of interest
tetravalent streptavidin Thermo Fisher Scientific #SNN1001 tetravalent streptavidin to enable the presence of several biotin binding sites
Whatman Nuclepore Hydrophilic Membrane, 0.05 µm Pore Size, 25 mm Circle Cytiva #110603 a pore size of 50 nm is recommended for supported lipid bilayer formation in the context of MSPT
Zepto model 2 plasma cleaner Diener electronic GmbH -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Robertson, J. L. The lipid bilayer membrane and its protein constituents. Journal of General Physiology. 150 (11), 1472-1483 (2018).
  2. Grecco, H. E., Schmick, M., Bastiaens, P. I. H. Signaling from the Living Plasma Membrane. Cell. 144 (6), 897-909 (2011).
  3. Cho, W., Stahelin, R. V. Membrane-protein interactions in cell signaling and membrane trafficking. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 34, 119-151 (2005).
  4. Whited, A. M., Johs, A. The interactions of peripheral membrane proteins with biological membranes. Chemistry and Physics of Lipids. 192, 51-59 (2015).
  5. Gonzalez, L., Scheller, R. H. Regulation of membrane trafficking: Structural insights from a Rab/effector complex. Cell. 96 (6), 755-758 (1999).
  6. Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).
  7. Bagheri, Y., Ali, A. A., You, M. Current methods for detecting cell membrane transient interactions. Frontiers in Chemistry. 8, 603259 (2020).
  8. Miller, H., Zhou, Z., Shepherd, J., Wollman, A. J. M., Leake, M. C. Single-molecule techniques in biophysics: A review of the progress in methods and applications. Reports on Progress in Physics. 81 (2), 024601 (2018).
  9. Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. A review of progress in single particle tracking: From methods to biophysical insights. Reports on Progress in Physics. 78 (12), 124601 (2015).
  10. Gelles, J., Schnapp, B. J., Sheetz, M. P. Tracking kinesin-driven movements with nanometre-scale precision. Nature. 331 (6155), 450-453 (1988).
  11. Funatsu, T., Harada, Y., Tokunaga, M., Saito, K., Yanagida, T. Imaging of single fluorescent molecules and individual ATP turnovers by single myosin molecules in aqueous solution. Nature. 374 (6522), 555-559 (1995).
  12. Schmidt, T., Schütz, G. J., Baumgartner, W., Gruber, H. J., Schindler, H. Imaging of single molecule diffusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (7), 2926-2929 (1996).
  13. Taylor, R. W., et al. Interferometric scattering microscopy reveals microsecond nanoscopic protein motion on a live cell membrane. Nature Photonics. 13 (7), 480-487 (2019).
  14. Kukura, P., et al. High-speed nanoscopic tracking of the position and orientation of a single virus. Nature Methods. 6 (12), 923-927 (2009).
  15. Jacobsen, V., Stoller, P., Brunner, C., Vogel, V., Sandoghdar, V. Interferometric optical detection and tracking of very small gold nanoparticles at a water-glass interface. Optics Express. 14 (1), 405 (2006).
  16. Ueno, H., et al. Simple dark-field microscopy with nanometer spatial precision and microsecond temporal resolution. Biophysical Journal. 98 (9), 2014-2023 (2010).
  17. Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Herold, C., Kruse, K., Schwille, P. Min protein patterns emerge from rapid rebinding and membrane interaction of MinE. Nature Structural and Molecular Biology. 18 (5), 577-583 (2011).
  18. Bezeljak, U., Loya, H., Kaczmarek, B., Saunders, T. E., Loose, M. Stochastic activation and bistability in a Rab GTPase regulatory network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (12), 6504-6549 (2020).
  19. Ha, T., Tinnefeld, P. Photophysics of fluorescent probes for single-molecule biophysics and super-resolution imaging. Annual Review of Physical Chemistry. 63 (1), 595-617 (2012).
  20. Garcia-Parajo, M. F., Segers-Nolten, G. M. J., Veerman, J. A., Greve, J., Van Hulst, N. F. Real-time light-driven dynamics of the fluorescence emission in single green fluorescent protein molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (13), 7237-7242 (2000).
  21. Young, G., et al. Quantitative mass imaging of single biological macromolecules. Science. 360 (6387), 423-427 (2018).
  22. Piliarik, M., Sandoghdar, V. Direct optical sensing of single unlabelled proteins and super-resolution imaging of their binding sites. Nature Communications. 5, 4495 (2014).
  23. Cole, D., Young, G., Weigel, A., Sebesta, A., Kukura, P. Label-free single-molecule imaging with numerical-aperture-shaped interferometric scattering microscopy. ACS Photonics. 4 (2), 211-216 (2017).
  24. Heermann, T., Steiert, F., Ramm, B., Hundt, N., Schwille, P. Mass-sensitive particle tracking to elucidate the membrane-associated MinDE reaction cycle. Nature Methods. 18 (10), 1239-1246 (2021).
  25. Foley, E. D. B., Kushwah, M. S., Young, G., Kukura, P. Mass photometry enables label-free tracking and mass measurement of single proteins on lipid bilayers. Nature Methods. 18 (10), 1247-1252 (2021).
  26. Voss, O. H., Lee, H. N., Tian, L., Krzewski, K., Coligan, J. E. Liposome preparation for the analysis of lipid-receptor interaction and efferocytosis. Current Protocols in Immunology. 120, 1-21 (2018).
  27. Pincet, F., et al. FRAP to characterize molecular diffusion and interaction in various membrane environments. PLoS ONE. 11 (7), 0158457 (2016).
  28. Howarth, M., et al. A monovalent streptavidin with a single femtomolar biotin binding site. Nature Methods. 3 (4), 267-273 (2006).
  29. Allan, D., et al. soft-matter/trackpy: Trackpy v.0.5.0. Zenodo. , (2021).
  30. Weimann, L., et al. A quantitative comparison of single-dye tracking analysis tools using Monte Carlo simulations. PLoS ONE. 8 (5), 64287 (2013).
  31. Michalet, X. Mean square displacement analysis of single-particle trajectories with localization error: Brownian motion in an isotropic medium. Physical Review E - Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 82 (4), 041914 (2010).
  32. Sygusch, J., Beaudry, D., Allaire, M. Molecular architecture of rabbit skeletal muscle aldolase at 2.7-A resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (22), 7846-7850 (1987).
  33. Heath, G. R., Scheuring, S. High-speed AFM height spectroscopy reveals µs-dynamics of unlabeled biomolecules. Nature Communications. 9 (1), 4983 (2018).
  34. Day, C. A., Kenworthy, A. K. Mechanisms underlying the confined diffusion of cholera toxin B-subunit in intact cell membranes. PLOS ONE. 7 (4), 34923 (2012).

Tags

Biokemi udgave 180 enkeltpartikelsporing iSCAT massefotometri lipidmembran proteinmembraninteraktion etiketfri dynamik
Massefølsom partikelsporing til karakterisering af membranassocieret makromolekyledynamik
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Steiert, F., Heermann, T., Hundt,… More

Steiert, F., Heermann, T., Hundt, N., Schwille, P. Mass-Sensitive Particle Tracking to Characterize Membrane-Associated Macromolecule Dynamics. J. Vis. Exp. (180), e63583, doi:10.3791/63583 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter