Sistema di coltura tridimensionale privo di siero per cellule staminali della ghiandola lacrimale

Sommario

Il metodo di coltura tridimensionale privo di siero per le cellule staminali adulte della ghiandola lacrimale (LG) è ben consolidato per l'induzione della formazione di organoidi LG e la differenziazione in cellule acinari o duttali.

Abstract

La terapia a base di cellule staminali della ghiandola lacrimale (LG) è una strategia promettente per le malattie della ghiandola lacrimale. Tuttavia, la mancanza di un metodo di coltura affidabile e privo di siero per ottenere un numero sufficiente di cellule staminali LG (LGSC) è un ostacolo per ulteriori ricerche e applicazioni. Il metodo di coltura tridimensionale (3D), privo di siero per le LGSC di topo adulto è ben consolidato e mostrato qui. Le LGSC potrebbero essere continuamente passate e indotte a differenziarsi in cellule acinari o duttali.

Per la coltura primaria LGSC, gli LG di topi di 6-8 settimane sono stati digeriti con dispasi, collagenasi I e tripsina-EDTA. Un totale di 1 × 10⁴ cellule singole sono state seminate in 80 μL di matrice di matrice di cellule staminali della ghiandola gel-lacrimale (LGSCM) in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti, preclusa con 20 μL di matrice gel-LGSCM della matrice. La miscela è stata solidificata dopo l'incubazione per 20 minuti a 37 °C e sono stati aggiunti 600 μL di LGSCM.

Per il mantenimento della LGSC, le LGSC coltivate per 7 giorni sono state disaggregate in singole cellule mediante dispasi e tripsina-EDTA. Le singole cellule sono state impiantate e coltivate secondo il metodo utilizzato nella coltura primaria LGSC. Le LGSC potrebbero essere passate oltre 40 volte ed esprimere continuamente marcatori di cellule staminali/progenitrici Krt14, Krt5, P63 e nestin. Le LGSC coltivate in LGSCM hanno capacità di auto-rinnovamento e possono differenziarsi in cellule acinari o duttali in vitro e in vivo.

Introduzione

Le cellule staminali della ghiandola lacrimale (LGSC) mantengono il rinnovamento cellulare della ghiandola lacrimale (LG) e sono la fonte delle cellule acinari e duttali. Pertanto, il trapianto di LGSC è considerato un approccio alternativo per il trattamento di gravi danni infiammatori e malattia dell'occhio secco carente di acqua (ADDED)^1,2,3. Diversi metodi di coltura sono stati applicati per arricchire le LGSC. Tiwari et al. hanno separato e coltivato cellule LG primarie utilizzando collagene I e gel di matrice integrato con diversi fattori di crescita; tuttavia, le cellule LG non potevano essere coltivate continuamente⁴. Utilizzando la coltura bidimensionale (2D), le cellule staminali derivate da LG di topo sono state isolate da You et ^al.5 e Ackermann et al. ⁶, trovato per esprimere i geni marcatori delle cellule staminali / progenitrici, Oct4, Sox2, Nanog e nestin, e potrebbe essere sottocoltato. Tuttavia, non vi è alcuna chiara indicazione che queste cellule possano differenziarsi in cellule acinari o duttali e non esiste un esperimento di trapianto per verificare il potenziale di differenziazione in vivo.

Recentemente, le cellule c-kit⁺ dim/EpCAM⁺/Sca1^-/CD34^-/CD45^- sono state isolate dagli LG di topo mediante citometria a flusso, hanno trovato per esprimere marcatori di cellule progenitrici LG, come Pax6 e Runx1, e differenziate in condotti e acini in vitro. Nei topi con ADDED, l'iniezione ortotopica con queste cellule potrebbe riparare gli LG danneggiati e ripristinare la funzione secretoria degli LG². Tuttavia, il numero di cellule staminali isolate con questo metodo era piccolo e non ci sono condizioni di coltura adeguate per espandere le LGSC isolate. In sintesi, è necessario stabilire un sistema di coltura appropriato per isolare e coltivare efficacemente le LGSC adulte con un'espansione stabile e continua per lo studio delle LGSC nel trattamento dell'ADDED.

Gli organoidi derivati da cellule staminali o cellule staminali pluripotenti sono un gruppo di cellule che sono istologicamente simili agli organi correlati e possono mantenere il proprio rinnovamento. Dopo che l'organoide intestinale di topo è stato coltivato con successo da Sato et al. nel 2009⁷, gli organoidi di altri organi sono stati coltivati in successione, sulla base del sistema di coltura di Sato, come la cistifellea⁸, il fegato⁹, il pancreas¹⁰, lo stomaco¹¹, il seno¹², il polmone¹³, la prostata¹⁴ e la ghiandola salivare¹⁵ . A causa dell'elevata percentuale di cellule staminali adulte prima della differenziazione cellulare in coltura di organoidi, il metodo di coltura organoide tridimensionale (3D) è considerato ottimale per l'isolamento e la coltura di cellule staminali adulte di LG.

Nel presente studio è stato istituito un sistema di coltura LGSC per topi adulti ottimizzando il metodo di coltura 3D senza siero. È dimostrato che le LGSC coltivate da topi sia normali che AGGIUNTI hanno mostrato una capacità stabile di auto-rinnovamento e proliferazione. Dopo il trapianto nei LG di topo AGGIUNTI, le LGSC hanno colonizzato i LG compromessi e migliorato la produzione di lacrime. Inoltre, le LGSC fluorescenti rosse sono state isolate da topi ROSA26^mT/mG e coltivate. Questo lavoro fornisce un riferimento affidabile per l'arricchimento LGSC in vitro e l'autoinnesto LGSC in applicazione clinica per la terapia ADDED.

Protocollo

Tutti gli esperimenti in questo protocollo hanno seguito le linee guida per la cura degli animali del Comitato etico sulla sperimentazione animale della Sun Yat-sen University. Tutte le operazioni relative alle celle devono essere eseguite sul banco di lavoro ultrapulito nella sala operatoria della cella. Tutte le operazioni con xilene devono essere effettuate in cappe aspiranti.

1. Cultura primaria LGSC

1. Isolamento LG
   1. Procurati un topo maschio BALB/c di 6-8 settimane e taglia la pelle dietro l'orecchio per esporre l'LG e il tessuto connettivo circostante. Staccare il tessuto connettivo mediante dissezione smussata con l'aiuto di una pinzetta e rimuovere l'LG.
   2. Risciacquare gli LG due volte con 4 ml di soluzione sterile di PBS da 10 mM per rimuovere il sangue in un piatto da 6 cm. Immergere gli LG in un piatto da 6 cm con 4 ml di etanolo al 75% per 10 s e risciacquare con 10 mM PBS due volte immediatamente.
2. Ottenere singole celle di LG
   1. Utilizzare la soluzione tampone HEPES (50 mM HEPES/KOH, pH 7,4; 150 mM NaCl in acqua ultrapura) per preparare 25 U/mL dispase. Preparare la soluzione di collagenasi I allo 0,1% con acqua ultrapura.
   2. Tagliare gli LG in piccoli frammenti (circa 1 mm³), trasferirli in un tubo centrifugo sterile da 15 mL e trattare i tessuti con 500 μL di 25 U/mL dispasi e 500 μL di collagenasi I allo 0,1% per 1 ora a 37 °C.
   3. Utilizzare 10 mM PBS per preparare la soluzione di tripsina-EDTA (0,05 g/L di tripsina, 0,04 g/L di EDTA). Trattare i frammenti LG dal passaggio 1.2.2 con 1 mL di tripsina-EDTA allo 0,05% per 10 minuti a 37 °C e dissociare i frammenti in singole cellule mediante pipettaggio ripetuto.
   4. Filtrare la sospensione attraverso un filtro da 70 μm, raccogliere il filtrato in un tubo centrifugo sterile da 15 mL e centrifugare a 150 × g per 5 minuti.
   5. Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante, aggiungere 10 mL di PBS da 10 mM per lavare il pellet cellulare e centrifugare la sospensione.
   6. Ripetere il passaggio 1.2.5, rimuovere il surnatante e aggiungere 1 mL di DMEM/F12 (miscela 1:1 del mezzo Eagle modificato di Dulbecco e dell'F-12 di Ham) per risospescere i pellet cellulari.
3. Cultura primaria LGSC
   1. Preparare il mezzo per cellule staminali della ghiandola lacrimale (LGSCM) contenente DMEM / F12, 1 integratore N2, 1 integratore B27, 2 mM sostituto della glutammina, 0,1 mM NEAA (aminoacidi non essenziali), 50 ng / mL fattore di crescita epidermico murino (EGF), 100 ng / mL fattore di crescita dei fibroblasti 10 (FGF10), 10 ng / mL Wnt3A e 10 μM Y-27632 (inibitore ROCK).
   2. Aggiungere 20 μL di matrice gel-LGSCM a matrice (matrix gel: LGSCM = 1:1) al centro del pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Utilizzare una punta della pipetta per espanderla a un cerchio (diametro 6-8 mm) e incubare la miscela per 20 minuti a 37 °C per prerivestire il pozzo.
   3. Utilizzare un contatore di cellule per determinare il numero di cellule e aggiungere 40 μL di LGSCM con un totale di 1 × 10⁴ cellule in 40 μL del gel della matrice. Mescolarli delicatamente con una pipetta per ottenere una miscela matrice gel-LGSCM (matrix gel: LGSCM= 1:1).
   4. Utilizzare una pipetta per far cadere con cura 80 μL della miscela sull'area precoata in ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti nel passaggio 1.3.2.
   5. Incubare la miscela per 20 minuti a 37 °C e aggiungere 600 μL di LGSCM.
   6. Cambia il terreno di coltura in ogni pozzo una volta ogni due giorni. Dopo 7 giorni di coltura, cerca le sfere LGSC con un diametro di 100-300 μm al microscopio invertito (oculare: 10x, obiettivo: 4x).
      NOTA: le LGSC possono essere coltivate per più di 14 giorni in totale.
4. Isolare e coltivare LGSC primarie di topi ROSA26^mT/mG e topi DED (NOD/ShiLtJ) seguendo i passaggi sopra descritti.

2. Manutenzione e passaggio LGSC

1. Rimuovere bene il mezzo di coltura dalla cultura della sfera.
2. Disaggregare le sfere LGSC coltivate per 7 giorni mediante incubazione in 20 μL di 10 U/mL dispasi e 100 μL di 10 mM PBS per 30 min a 37 °C.
3. Trasferire la sospensione in un tubo centrifuga da 15 mL e centrifuga a 150 × g per 4 min. Rimuovere il surnatante.
4. Trattare le sfere con 1 mL di tripsina-EDTA allo 0,05% per 5 minuti a 37 °C. Aggiungere 1 mL di inibitore della tripsina allo 0,05% (TI) e pipettare ripetutamente per neutralizzare la tripsina e dissociare le sfere in singole cellule.
5. Centrifugare a 150 × g per 5 minuti e rimuovere il surnatante per ottenere LGSC nel pellet. Aggiungere 1 mL di LGSCM per risospescere il pellet LGSC.
6. Placcare le singole celle come descritto nei passaggi da 1.3.1 a 1.3.6.

3. Differenziazione LGSC

1. Procedura 1: Estendere il tempo di coltura delle LGSC da 7 a 14 giorni con il sistema di coltura LGSC per la differenziazione casuale.
2. Procedura 2: Modificare il rapporto della miscela matrice gel-LGSCM da 1:1 a 1:2 all'inizio della coltura LGSC per la differenziazione delle cellule duttali. Seminare le LGSC nella matrice per l'induzione per 14 giorni (fare riferimento al passaggio 1.3).
3. Procedura 3: Dopo il passaggio, sostituire LGSCM con la miscela di siero bovino fetale LGSCM-10% (FBS) per la differenziazione delle cellule acinari. Indurre la differenziazione per 14 giorni.

4. Disidratazione dei tessuti LG

1. Ottenere i tessuti LG (fase 1.1.1) e risciacquare gli LG con 4 ml di soluzione sterile pbS da 10 mM in una parabola da 6 cm per 2 minuti. Spostare i tessuti alla soluzione di formalina al 10% per la fissazione per 24 ore.
2. Risciacquare i tessuti fissi con 10 mM PBS per 2 minuti per rimuovere la formalina e trasferire il tessuto in una scatola di incorporamento del tessuto. Inserire la scatola di incorporamento nel disidratatore automatico.
3. Utilizzare il disidratatore automatico per disidratare i tessuti come segue: 70% di etanolo, 2 h; 80% etanolo, 2 h; 90% etanolo, 30 min; 95% etanolo, 30 min; etanolo assoluto, 30min; etanolo assoluto, 2 h; etanolo assoluto: miscela 100% xilene (1: 1), 30 min; 100% xilene, 30 min; 100% xilene, 2 h; 100% xilene: miscela di paraffina (1: 1), 30 min; paraffina, 2 h; paraffina,3 h.

5. Disidratazione organoide/sfera LG

1. Ottenere organoidi/sfere LG (passaggi 2.1-2.3) in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL e risciacquare gli organoidi/sfere LG con 1 mL di soluzione PBS sterile da 10 mM per 2 min.
2. Centrifugare a 100 × g per 1 minuto e rimuovere il surnatante.
3. Preparare la soluzione di paraformaldeide al 4% (PFA) come segue: aggiungere 20 g di PFA a una miscela di 400 ml di PBS da 10 mM e 40 μL di 1 M NaOH, agitare bene la soluzione e riscaldarla a bagnomaria a 65 °C per 2 ore fino a completa dissoluzione del PFA. Dopo il raffreddamento a temperatura ambiente, utilizzare PBS da 10 mM per portare il volume a 500 ml e conservarlo a 4 °C.
4. Aggiungere 1 mL di PFA al 4% nel tubo microcentrifuga con il pellet organoide/sfera e mettere il tubo in frigorifero a 4 °C per almeno 24 ore per il fissaggio.
5. Dopo la fissazione, centrifugare a 100 × g per 1 minuto e rimuovere il surnatante. Aggiungere 1 mL di PBS da 10 mM nel tubo microcentrifuga con il pellet organoide/sfera e mescolare delicatamente mediante pipettaggio per 2 minuti per risciacquare il PFA. Ripetere questo passaggio due volte.
6. Centrifugare a 100 × g per 1 minuto e rimuovere il surnatante.
7. Riscaldare l'idrogel di incorporamento per sciogliere e aggiungere 50-60 μL di idrogel incorporante al pellet organoide / sfera e mescolare. Pipettare la miscela sul parafilm sotto forma di goccia e attendere 5 minuti affinché si solidifichi a temperatura ambiente.
8. Disidratare il gel con gli organoidi/sfere in un nuovo tubo microcentrifuga da 1,5 mL come segue.
   1. Aggiungere 1 mL di etanolo al 50% al tubo, attendere 30 minuti a temperatura ambiente e rimuovere il liquido dal tubo mediante pipettaggio. Ripeti questo passaggio modificando la concentrazione di etanolo al 70%, 80%, 90%, 95% in successione.
   2. Aggiungere 1 mL di etanolo assoluto al tubo, attendere 30 minuti a temperatura ambiente e rimuovere il liquido dal tubo mediante pipettaggio. Ripetere questo passaggio.
   3. Aggiungere 1 mL di una miscela di 0,5 mL di etanolo assoluto e 0,5 mL di xilene al 100% al tubo, attendere 30 minuti a temperatura ambiente e rimuovere il liquido dal tubo mediante pipettaggio.
   4. Aggiungere 1 mL di xilene al 100% al tubo, attendere 30 minuti a temperatura ambiente e rimuovere il liquido dal tubo mediante pipettaggio. Ripetere questo passaggio.
      NOTA: i passaggi 5.8.5-5.8.6 devono essere eseguiti in un bagno di metallo a 65 °C.
   5. Aggiungere 1 mL di una miscela di 0,5 mL di paraffina e 0,5 mL di xilene al 100% al tubo, attendere 30 minuti a 65 °C e rimuovere il liquido dal tubo mediante pipettaggio.
   6. Aggiungere 1 mL di paraffina al tubo, attendere 30 minuti a 65 °C e rimuovere il liquido dal tubo mediante pipettaggio. Ripetere questo passaggio ed estendere il tempo di elaborazione a 1 ora.

6. Incorporamento e sezionamento di paraffina

1. Incorporamento di paraffina
   1. Prima di incorporare, accendere la macchina incorporatrice e preriscaldarla per sciogliere la cera di paraffina nel serbatoio di paraffina.
   2. Posizionare il tessuto disidratato o il gel organoide/sfera nella scanalatura della scatola di ferro incorporata e inserire la scatola di ferro nella paraffina della macchina incorporatrice.
   3. Rimuovere il coperchio di plastica e posizionare la scatola di plastica sulla scatola di ferro per coprirla. Spostare la scatola di ferro incorporata su una tavola di raffreddamento.
   4. Dopo che la paraffina si è condensata in blocchi nella scatola di incorporamento, rimuoverla dalla scatola di ferro e affettarla direttamente o conservarla temporaneamente in frigorifero a 4 °C.
2. Sezionamento di paraffina
   1. Prima dell'affettatura della paraffina, preassemblare l'affettatrice di paraffina e aggiungere acqua distillata al lavandino dell'affettatrice per il preriscaldamento. Iniziare a affettare quando la temperatura dell'acqua sale a 42 °C.
   2. Fissare il campione sullo slot campione dell'affettatrice di paraffina. Regolare lo spessore della sezione a 5 μm durante l'affettatura.
   3. Suddividere continuamente il campione. Fissare la sezione completamente piastrellata sulla slitta antiscivolo nel serbatoio dell'affettatrice.
   4. Dopo il sezionamento, posizionare i vetrini apposti con il tessuto campione in un incubatore biochimico a 37 °C per l'essiccazione per 24 ore. Conservare temporaneamente i vetrini in frigorifero a 4 °C.

7. Colorazione di ematossilina ed eosina

1. Sciogliere le sezioni di paraffina a 60 °C per 30 minuti, immergere le sezioni in xilene al 100% per 15 minuti e ripetere.
2. Trattare le sezioni con etanolo assoluto su uno shaker per 5 minuti.
3. Trattare le sezioni con etanolo al 90%, etanolo all'80% etanolo al 70% su uno shaker, ciascuna per 3 minuti.
4. Trattare le sezioni con acqua deionizzata su uno shaker per 5 minuti e 2 minuti in successione.
5. Macchiare le sezioni su una scatola bagnata per 5 minuti con 4 mg/mL di soluzione di ematossilina. Risciacquare le sezioni in acqua corrente per 10 minuti.
6. Agitare le sezioni su uno shaker prima con acqua deionizzata per 2 minuti e poi con eosina allo 0,5%-1% per 1 minuto.
7. Agitare le sezioni con il 70% di etanolo, l'80% di etanolo e il 90% di etanolo su uno shaker per 3 minuti (ciascuna) successivamente. Agitare le sezioni con etanolo assoluto su uno shaker per 5 minuti.
8. Immergere le sezioni in 100% xilene per 15 minuti e ripetere l'ammollo.
9. Utilizzare una pipetta o un contagocce per aggiungere 3-4 gocce di balsamo neutro alla diapositiva e coprirla lentamente con una diapositiva di copertura. Asciugare all'aria le diapositive a temperatura ambiente.

8. Colorazione immunoistochimica (IHC)

1. Sciogliere le sezioni di paraffina a 60 °C per 30 minuti, immergere le sezioni in xilene al 100% per 10 minuti e ripetere questo passaggio due volte.
2. Agitare le sezioni su uno shaker prima con etanolo assoluto, etanolo al 90% e etanolo all'80% per 2 minuti (ciascuna), successivamente, e poi con acqua deionizzata per 3 minuti. Ripetere l'agitazione con acqua deionizzata due volte.
3. Agitare le sezioni su uno shaker prima con una miscela di 20 ml di 30% H₂O₂ e 180 ml di metanolo per 10 minuti e quindi acqua deionizzata per 5 minuti. Ripetere questo passaggio tre volte.
4. Trasferire le sezioni in tampone di acido citrico preboiled (1 L di acqua deionizzata con 3 g di Na₃C₆H₅O_{7,2H 2}O e 0,4 g C₆H₈O₇, pH 6,0), microonde per 10 minuti per mantenerle al punto di ebollizione subcritico e raffreddare a temperatura ambiente per 30 minuti. Agitare le sezioni con acqua deionizzata su uno shaker per 5 min. Ripetere questo passaggio tre volte.
5. Agitare le sezioni con PBS da 10 mM su uno shaker per 5 minuti e ripetere questo passaggio tre volte. Racchiudere l'area del tessuto sulla scatola bagnata con un pennarello idrorepellente, aggiungere una goccia di siero di capra non immune pronto all'uso per coprire i campioni e metterli a temperatura ambiente per 1 ora.
6. Rimuovere il siero, aggiungere anticorpi primari ai campioni (vedere la tabella dei materiali) e incubarli durante la notte a 4 °C. Rimuovere l'anticorpo primario, agitare le sezioni con 10 mM PBS su uno shaker per 5 minuti e ripetere questa fase di agitazione con 10 mM PBS tre volte.
7. Aggiungere anticorpi secondari (vedere la Tabella dei materiali) per coprire i campioni e incubarli su una scatola bagnata per 30 minuti a temperatura ambiente. Agitare le sezioni con PBS da 10 mM su uno shaker per 5 minuti e ripetere la fase di agitazione tre volte.
8. Aggiungere la soluzione di 0,03-0,05% 3,3'-diaminobenzidina (DAB) appena preparata per coprire i campioni sulla scatola bagnata e macchiare per 30-90 s. Risciacquare le sezioni con acqua corrente per 10 min.
   NOTA: Controllare il tempo di colorazione osservando al microscopio ottico fino a quando non appare il colore giallo.
9. Aggiungere 4 mg/mL di soluzione di ematossilina per coprire i campioni, macchiare per 5 minuti su una scatola bagnata e risciacquare le sezioni con acqua corrente per 10 minuti.
10. Agitare le sezioni su uno shaker con etanolo all'80%, etanolo al 90% ed etanolo assoluto per 2 minuti ciascuna, successivamente, e immergere le sezioni in xilene al 100% per 30 minuti.
11. Utilizzare una pipetta o un contagocce per aggiungere 3-4 gocce di balsamo neutro alla diapositiva e coprirla lentamente con una diapositiva di copertura. Asciugare all'aria le diapositive a temperatura ambiente.

9. Colorazione immunofluorescenza globale di organoidi/sfere

NOTA: Raccogliere gli organoidi/sfere fissati con una soluzione di PFA al 4% in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL (vedere i passaggi da 5.1 a 5.4). Eseguire l'etichettatura di fluorescenza come segue.

1. Disidratare gli organoidi/sfere aggiungendo 1 mL di soluzione di saccarosio al 30% al tubo e incubarlo per una notte in frigorifero a 4 °C.
2. Aggiungere 100 μL di soluzione PBST (soluzione PBS da 10 mM con 0,1% tritone X-100) al tubo per risciacquare gli organoidi/sfere per 5 minuti, centrifugare il tubo a 100 × g per 1 minuto e raccogliere il pellet. Ripetere questo passaggio tre volte.
3. Aggiungere 0,5-1 ml di siero di capra non immune pronto all'uso al tubo e sigillarlo a temperatura ambiente per 1 ora. Centrifugare il tubo a 100 × g per 1 minuto e raccogliere il pellet.
4. Aggiungere diverse gocce di anticorpo primario diluito per coprire il pellet e incubare in frigorifero a 4 °C per 48 ore. Centrifugare il tubo a 100 × g per 1 minuto e raccogliere il pellet.
5. Ripetere il passaggio 9.2.
6. Aggiungere diverse gocce di un anticorpo secondario fluorescente e una soluzione di 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) al tubo per coprire semplicemente il pellet e incubare in frigorifero a 4 °C per 24 ore, evitando la luce.
7. Ripetere il passaggio 9.2, evitando la luce.
8. Aggiungere 100 μL di soluzione PBST al tubo e conservarlo temporaneamente in frigorifero a 4 °C, al riparo dalla luce. Osservare e fotografare gli organoidi/sfere utilizzando il microscopio a scansione a foglio luminoso.

10. Trasfezione LGSC pLX-mCherry

NOTA: La produzione di particelle lentivirali deve essere eseguita in un armadio di biosicurezza e in un banco pulito a livello di biosicurezza BSL2.

1. Coltivare la cella di confezionamento del lentivirus 293T in una piastra a 6 pozzetti con DMEM + 10% FBS a 37 °C, 5% CO₂ per 3-5 giorni per raggiungere l'80% di confluenza cellulare.
2. Trasfettate il vettore lentivirus pLX-mCherry in LGSC.
   NOTA: la preparazione del reagente è indicata per un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti.
   1. Preparare due tubi centrifughi sterili da 1,5 mL e aggiungere 250 μL di DMEM/F12 a ciascun tubo.
   2. Aggiungere 7,5 μL di reagente di trasfezione in un tubo e mescolare accuratamente il reagente mediante pipettaggio.
   3. Aggiungere 2 μg di plasmide pLX-mCherry senza endotossina e plasmide di imballaggio di lentivirus corrispondente in un altro tubo e aggiungere il reagente di trasfezione (2 μL / μg di plasmide).
   4. Mescolare il liquido in entrambi i tubi della centrifuga e lasciare riposare le miscele per 5 minuti a temperatura ambiente.
   5. Rimuovere il terreno di coltura delle cellule 293T e aggiungere la miscela dal punto 10.2.4 alle celle 293T. Cambiare il terreno di coltura in DMEM fresco + 10% FBS dopo 8 ore.
   6. Dopo 48 ore, raccogliere il surnatante virale per la prima volta e filtrarlo attraverso un filtro da 0,45 μm. Dopo 72 ore, raccogliere il surnatante virale per la seconda volta e filtrarlo nuovamente attraverso un filtro da 0,45 μm.
      NOTA: Conservare entrambi i supernatanti filtrati sul ghiaccio fino alla trasduzione del lentivirus.
3. Ottenere le LGSC da topi DED (NOD/ShiLtJ) (vedere il passaggio 1).
4. Aggiungere 1 mL del surnatante preriscelto pLX-mCherry lentivirus per risospese le cellule.
5. Posizionare il tubo della centrifuga su uno shaker nell'incubatore a CO₂ a 37 °C. Agitalo a 100 giri / min per massimizzare il contatto tra il lentivirus e le cellule. Dopo 8 ore, centrifugare la miscela a 250 × g per 4 minuti e rimuovere il surnatante.
6. Aggiungere 1 mL di DMEM/F12 per risospese il pellet cellulare. Utilizzare un contatore di cellule per determinare il numero di cellule e seminare un totale di 1 × 10⁴ cellule in 100 μL di matrice gel-LGSCM della matrice (gel della matrice: LGSCM = 1: 1) in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti precoata con 20 μL di matrice gel-LGSCM della matrice (vedere il passaggio 1.3.2).
7. Dopo 7 giorni di coltura (vedi passaggio 1), selezionare le sfere che mostrano fluorescenza rossa sotto un microscopio a fluorescenza per espandere la coltura.

11. Trapianto ortotopico LGSC

NOTA: Tutte le operazioni chirurgiche vengono eseguite in una sala operatoria SPF e tutti gli strumenti chirurgici sono sterilizzati.

1. Ottenere le sfere LGSC da topi ROSA26^mT/mG con fluorescenza rossa (td-Tomato) o trasfezione mCherry coltivati per 7 giorni (vedere passaggio 1).
2. Raffreddare un tubo di microcentrifuga da 1,5 mL contenente una miscela 1:1 di gel a matrice e DMEM/F12 sul ghiaccio prima dell'uso. Digerire le sfere LGSC in singole celle e risospescere le cellule ad una densità di 2 × 10⁶ celle / mL nel tubo.
3. Anestetizzare i topi NOD/ShiLtJ mediante iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodico (50 mg/kg).
   NOTA: il topo NOD / ShiLtJ è un modello ideale con sintomi aggiunti idiopatici, tra cui ridotta secrezione lacrimale, infiltrazione infiammatoria e ulcerazione orbitale.
4. Dopo l'anestesia, utilizzare un unguento salino o veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza, quindi utilizzare forbici oftalmiche per effettuare un taglio di 5-8 mm nella pelle dietro l'orecchio (vicino all'occhio) dei topi anestetici per esporre i LG.
   NOTA: Iodophor deve essere rigorosamente utilizzato per la disinfezione intorno all'incisione.
5. Iniettare 2 × 10⁴ celle nell'LG sinistro e iniettare la miscela senza cellule (vedere il punto 11.2) nell'LG sul lato destro come controllo.
6. Dopo l'iniezione, riportare gli LG alle loro posizioni originali con pinze oftalmiche e suturare la ferita. Nutrire i topi per 2 mesi e osservare l'effetto del trattamento.
   NOTA: anche il materiale del cuscino della gabbia deve essere rigorosamente sterilizzato dopo l'operazione e il materiale del cuscino deve essere sostituito una volta al giorno. Dopo aver suturato la ferita, il tramadolo può essere iniettato selettivamente nella vena della coda dei topi alla dose standard di 2,5 mg / kg per ottenere l'analgesia.
7. Anestetizzare questi topi 2 mesi dopo l'esperimento (vedere il passo 11.3). Filmare i sintomi della regione oculare.
   1. Durante l'anestesia, cercare i seguenti sintomi: rilassamento muscolare del collo e degli arti; respirazione profonda, lenta e costante; restringimento della pupilla; scomparsa del riflesso corneale.
   2. Durante l'anestesia e il funzionamento, mantenere la temperatura corporea dei topi a 37 °C. Dopo l'intervento chirurgico, aggiungere antibiotici appropriati all'acqua potabile per i topi per ridurre il rischio di infezione della ferita. Non lasciare i topi incustoditi fino a quando non hanno riacquistato una coscienza sufficiente per mantenere la reclinazione sternale. Non restituire i topi che hanno subito un intervento chirurgico alla compagnia di altri topi fino a quando non sono completamente guariti.
   3. Dopo aver filmato i sintomi della regione oculare, aprire il software ImageJ, fare clic su File | Apri | Selezioni a mano libera, tenere premuto il pulsante sinistro del mouse e selezionare l'area di ulcerazione orbitale nell'immagine. Clicca su Analizza | Misurare per ottenere l'area relativa di ulcerazione.
8. Metti il filo di cotone rosso fenolo sul canto laterale dei topi anestetici per 10 s; misurare e registrare la lunghezza della parte scolorita del filo di cotone. Eutanasia dei topi mediante lussazione della vertebra cervicale dopo la misurazione delle lacrime.
9. Sezionare i topi e ottenere gli LG per l'analisi IHC.

12. Isolamento dell'RNA

NOTA: Prima dell'esperimento, preraffreddare la centrifuga a 4 °C e garantire che tutti i reagenti e i materiali di consumo siano esenti da contaminazione da RNAsi.

1. Raccogli frammenti LGSC o LG in un tubo microcentrifuga. Aggiungere 1 mL di tampone di lisi cellulare e lisare completamente le cellule o i tessuti mediante oscillazione del vortice.
2. Aggiungere 0,2 ml di cloroformio e lasciarlo riposare a temperatura ambiente per 10 minuti dopo l'oscillazione del vortice per 1 minuto. Centrifuga per 15 min a 4 °C, 12.000 × g.
   NOTA: Dopo la centrifugazione, il liquido viene diviso in tre strati e l'RNA si trova nella fase acquosa trasparente superiore.
3. Pipettare con cura la fase acquosa trasparente superiore e trasferirla in un nuovo tubo centrifugo da 1,5 mL privo di RNA.
4. Aggiungere un volume uguale di alcol isopropilico e mescolare delicatamente. Lasciare riposare la miscela a temperatura ambiente per 10 minuti e poi centrifugare per 15 minuti a 4 °C, 12.000 × g.
5. Rimuovere il surnatante e aggiungere 1 ml di etanolo al 75%. Capovolgere il tubo per lavare il pellet e centrifugare per 5 minuti a 4 °C, 7.500 × g. Ripetere questo passaggio.
6. Rimuovere con cura il surnatante e mettere il tubo della centrifuga nel banco da lavoro ultrapulito per asciugarlo per circa 20 minuti.
   NOTA: Procedere al passaggio successivo quando il pellet bianco diventa traslucido. Eseguire tutte le operazioni sul ghiaccio.
7. Aggiungere 20 μL di acqua priva di RNAsi per sciogliere completamente il pellet. Misurare la concentrazione di RNA utilizzando uno spettrofotometro (vedere la Tabella dei materiali) e conservare la soluzione di RNA a -80 °C.

13. PCR

1. Reazione di trascrizione inversa
   1. Aggiungere 1 μg di RNA totale (calcolare il volume della soluzione di RNA aggiunta in base alla concentrazione della soluzione di RNA) nella sonda di reazione PCR e incubare a 65 °C per 5 minuti per la denaturazione.
   2. Metterlo sul ghiaccio per 1 minuto e poi aggiungere acqua priva di enzimi fino a quando il volume totale raggiunge i 12 μL. Aggiungere 4 μL di 4x DNA Master Mix e incubarlo a 37 °C per 5 min.
   3. Mettere il tubo sul ghiaccio, aggiungere 4 μL di 5x RT Master Mix e mescolare delicatamente. Impostare le seguenti impostazioni PCR: 37 °C per 15 min, 50 °C per 5 min, 98 °C per 5 min, 4 °C per 1 min.
   4. Conservare a -20 °C o procedere al passaggio successivo dopo che la reazione di trascrizione inversa è stata completata.
2. Reazione PCR
   1. Preparare la reazione PCR nel tubo PCR come segue: 14,1 μL di acqua priva di enzimi, 2 μL di dNTP, 2 μL di tampone 10x, 0,8 μL di primer (10 μM, 0,4 μL di primer in avanti e 0,4 μL di primer inverso, fare riferimento alla tabella dei materiali), 1 μL di cDNA a trascrizione inversa (fare riferimento al passo 13.1) e 0,1 μL dell'enzima Taq.
   2. Posizionare la reazione PCR preparata nell'apparato PCR per pcr. Fare riferimento alle istruzioni del kit enzimatico Taq per la procedura PCR (vedere la Tabella dei materiali).
3. Elettroforesi su gel di agarosio
   1. Utilizzare una bilancia analitica per pesare 242 g di Tris e 37,2 g di Na₂EDTA·2H₂O e aggiungerli a un becher da 1 L. Aggiungere ~ 800 ml di acqua deionizzata e 57,1 mL di acido acetico glaciale al becher, mescolare bene, aggiungere acqua deionizzata a 1 L per ottenere 50x tampone TAE e conservarlo a temperatura ambiente.
      NOTA: Tampone TAE diluito 50x con acqua deionizzata prima dell'uso.
   2. Utilizzare una bilancia analitica per pesare 1,2 g di agarosio e aggiungerla a un matraccio conico contenente 80 ml di 1 tampone TAE. Riscaldarlo ripetutamente nel forno a microonde fino a completa dissoluzione.
   3. Raffreddare il matraccio sotto l'acqua corrente del rubinetto fino a quando la temperatura della soluzione scende a 60 °C. Aggiungere 8 μL di macchia di acido nucleico, versare la soluzione nel serbatoio di gelatinizzazione dopo aver mescolato bene, posizionare il pettine e lasciarlo riposare a temperatura ambiente per 30 minuti.
   4. Estrarre il pettine e caricare i prodotti PCR nel gel di agarosio preparato. Eseguire elettroforesi a 120 V per 30 min.
   5. Posizionare il gel nel sistema di imaging ECL Gel e fotografare.

Risultati

Stabilire un sistema di coltura 3D privo di siero
In questo studio, È stato sviluppato LGSCM contenente EGF, Wnt3A, FGF10 e Y-27632 per LGSC di topo e le LGSC sono state isolate e coltivate con successo con un metodo di coltura 3D (Figura 1A). Un sistema di coltura 3D 3D privo di siero di successo di LGSC da topi C57BL / 6, topi NOD / ShiLtJ, topi BALB / c e topi ROSA26^{mT / mG} è stato stabilito utilizzando questo metodo¹⁶. Per un topo ma...

Discussione

Esistono metodi consolidati per l'isolamento e la coltura in vitro di cellule staminali lacrimali per la coltura di cellule staminali lacrimali e la riparazione delle lesioni LG. Shatos et ^al.17 e Ackermannet al. ⁶ cellule staminali lacrimali coltivate e sottocoltate con successo di ratti e topi con metodi di coltura 2D, rispettivamente, rendendo possibile il trapianto di cellule staminali lacrimali per il trattamento di ADDED. Studi su cellule staminali

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Animal (Mouse)
Bal B/C	Model Animal Research Center dell'Università
C57 BL/6J	Laboratory Animal Center dell'Università
NOD/ShiLtJ	Model Animal Research Center dell'Università
ROSA26mT/mG	Modello Animal Research Center dell'Università
Equipment
Bilancia analitica	Sartorius
Essiccatore automatico	Thermo
Camera di conteggio del sangue	BLAU
Cell Counter	CountStar
Incubatore CO2 a temperatura costante	Thermo
ECL Gel sistema di imaging	GE healthcare
Bagno elettrico per bagnomaria	Tecnologia Yiheng Apparecchio
per elettroforesi	BioRad
Strumento di PCR quantitativa a fluorescenza	Roche
Affettatrice per tessuti congelati	Lecia
Centrifuga orizzontale	CENCE
Microscopio a fluorescenza invertita	Nikon
Microscopio invertito	Olympus
Laser micrografo a scansione lamellare	Carl Zeiss
Contenitore di azoto liquido	Thermo Bassa
temperatura alta centrifuga di velocità	Eppendorf
Micropipettor	Gilson
Forno a microonde	Panasonic
Nanodrop spettrofotometro ultravioletto	Thermo	misura della concentrazione
Affettatrice per paraffina	Amplificatore Thermo
PCR	Eppendorf
Tester di pH	Sartorius
4 ° C Frigorifero	Haier
Oscillatore termostatico di coltura	ZHICHENG
Strumento di inclusione in paraffina tissutale	Thermo
-80° C Frigorifero a bassissima temperatura	Thermo
-20° C Frigorifero a bassissima temperatura	Thermo
Sistema di purificazione dell'acqua ultra pura	ELGA
u>Reagent
Animal Experiment
HCG	Sigma	9002-61-3
PMSG	Sigma	14158-65-7
Pentobarbital Sodio	Sigma	57-33-0
Coltura cellulare
B27	Gibco	17504044
Collagenasi I	Gibco	17018029
Dispase	BD	354235
DMEM	Sigma	D6429
DMEM/F12	Sigma	D0697
DMSO	Sigma	67-68-5
EDTA	Sangon Biotech	A500895
Siero Bovino Fetale	Gibco	04-001-1ACS
GlutaMax	Gibco	35050087
Umano FGF10	PeproTech	100-26
Matrigel (Matrix gel)	BD	356231
Noggin murino	PeproTech	250-38
Murine Wnt3A	PeproTech	315-20
EGF murino	PeproTech	315-09
NEAA	Gibco	11140050
N2	Gibco	17502048
R-spondina 1	PeproTech	120-38
Inibitore della tripsina (TI)	Sigma	T6522	Derivato da Glycine max; può inibire la tripsina, la chimotripsina e la plasminasi in misura minore. Un mg inibisce 1,0-3,0 mg di tripsina.
Tripsina	Sigma	T4799
Y-27632	Selleck	S1049<
strong>HE colorazione & Immunocolorazione
Alexa Fluor 488 asino anti-Topo IgG	Thermo	A-21202	Diluizione usata: IHC) 2 μ g/mL, (IF) 0,2 μ g/mL
Alexa Fluor 488 asino anti-coniglio IgG	Thermo	A-21206	Diluizione usata: (IHC) 2 μ g/mL, (IF) 2 μ g/mL
Alexa Fluor 568 asino anti-Topo IgG	Thermo	A-10037	Diluizione usata: (IHC) 2 μ g/mL, (IF) 2 μ g/mL
Alexa Fluor 568 asino anti-Coniglio IgG	Thermo	A-10042	Diluizione usata: (IHC) 2 μ g/mL, (IF) 4 μ g/mL
Anticorpo di coniglio anti-AQP5	Abcam	ab104751	Diluizione utilizzata: (IHC) 1 μ g/mL, (IF) 0,1 μ g/mL
Anticorpo anti-E-caderina Anticorpo di ratto	Abcam	ab11512	Diluizione utilizzata: (IF)  5 μ g/mL
Anticorpo di coniglio anti-cheratina14	Abcam	ab181595	Diluizione utilizzata: (IHC) 1 μ g/mL, (IF) 2 μ g/mL
Anticorpo di coniglio Anti-Ki67	Abcam	ab15580	Diluizione utilizzata: (IHC) 1 μ g/mL, (IF) 1 μ g/mL
Anticorpo di topo Anti-mCherry	Abcam	ab125096	Diluizione utilizzata: (IHC) 2 μ g/mL, (IF) 2 μ g/mL
Anticorpo anti-mCherry rabbit	Abcam	ab167453	Diluizione utilizzata: (IF)  2 μ g/mL
C6H8O7	Sangon Biotech	A501702-0500
Acido citrico	Sangon Biotech	201-069-1
Kit DAB (20x)	CWBIO	CW0125
DAPI	Thermo	62248
Eosin	BASO	68115
Montaggio fluorescente Medio	Dako	S3023
Formalina	Sangon Biotech	A501912-0500
Capra anticorpo IgG di topo (HRP)	Abcam	ab6789	Diluizione usata: 2 μ g/mL
Anticorpo IgG di capra anti-coniglio (HRP)	Abcam	ab6721	Diluizione utilizzata: 2 μ g/mL
Ematossilina	BASO	517-28-2
Histogel (Idrogel incorporante)	Thermo	HG-400-012
30% H2O2	Guangzhou Chimica	KD10
Soluzione di perossido di idrogeno al 30%	Chimica Guangzhou	7722-84-1
Metanolo	Chimica Guangzhou	67-56-1
Na3C6H5O7.2H2O	Sangon Biotech	A501293-0500
Balsamo neutro	SHANGHAI YYYANG	YY-Balsamo
Siero di capra non immunizzato	BOSTER	AR0009
Paraffina	Sangon Biotech	A601891-0500
Paraformaldeide	DAMAO	200-001-8
Saccharose	Guangzhou Chimica	57-50-1
Citrato di sodio tribasico diidrato	Sangon Biotech	200-675-3
Saccarosio	Guangzhou Chimica	IB11-AR-500G
Tissue-Tek O.T.C. Composto	SAKURA	SAKURA.4583
Tritone X-100	DINGGUO	9002-93-1
Xilene	Guangzhou Chimica	128686-03-3
RT-PCR & qRT-PCR
Agarosio	Sigma	9012-36-6
Alcool	Guangzhou Chimica	64-17-5
Cloroformio	Guangzhou Chimica	865-49-6
Bromuro di etidio	Sangon Biotech	214-984-6
Alcool isopropilico	Guangzhou Chimica	67-63-0
LightCycler 480 SYBR Verde I Master Mix	Roche	488735200H
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix	TOYOBO-Taq
DNA polimerasi	TAKARA	R10T1
Goldview (acido nucleico macchia)	BioSharp	BS357A
TRIzol	Magen	R4801-02
Vector Costruzione & Trasfezione cellulare
Agar
	Sigma	69-52-3
Cloramfenicolo	Sigma	56-75-7
Kit di estrazione plasmidico senza endotossine	Thermo	A36227
Kanamicina	Sigma	25389-94-0
Lipo3000 Plasmide Kit di Trasfezione	Kit	L3000015
LR	Kit
	TIANGEN	DP103
Trans5α Cellula chimicamente competente	TRANSGEN	CD201-01
Estratto di lievito		OXID OXID-strong
	OXID	-
Primers e Sequenza	Company
Primer: AQP5 Sequence: F: CATGAACCCAGCCCGATCTT R: CTTCTGCTCCCATCCCATCC	Synbio Tech
Primer: β-actin Sequence: F: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCCTCTCTCTCTCTCT>	Tech
Primer: Epcam Sequence: F: CATTTGCTCCAAACTGGCGT R: TGTCCTTGTCGGTTCTTCGG	Synbio Tech
Primer: Krt5 Sequence: F: AGCAATGGCGTTCTGGAGG R: GCTGAAGGTCAGGTAGAGCC	Synbio Tech
Primer: Krt14 Sequenza: F: CGGACCAAGTTTGAGACGGA R: GCCACCTCCTCGTGGTTC	Synbio Tech
Primer: Krt19 Sequence: F: TCTTTGAAAAACACTGAACCCTG R: TGGCTCCTCAGGGCAGTAAT	Synbio Tech
Primer: Ltf Sequence: F: CACATGCTGTCGTATCCCGA R: CGATGCCCTGATGGACGA	Synbio Tech
Primer: Nestin Sequence: F: GGGGCTACAGGAGTGGAAAC R: GACCTCTAGGGTTCCCGTCT	Synbio Tech
Primer: P63 Sequence: F: TCCTATCACGGGAAGGCAGA R: GTACCATCGCCGTTCTTTGC	Synbio Tech
Vector
pLX302 lentivirus vettore a vuoto	Addgene
pENRTY-mCherry	Xiaofeng Qin laboratory, Università