Il metodo di coltura tridimensionale privo di siero per le cellule staminali adulte della ghiandola lacrimale (LG) è ben consolidato per l'induzione della formazione di organoidi LG e la differenziazione in cellule acinari o duttali.
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Articolo metodologico
Sistema di coltura tridimensionale privo di siero per cellule staminali della ghiandola lacrimale
In questo articolo
Sommario
Abstract
La terapia a base di cellule staminali della ghiandola lacrimale (LG) è una strategia promettente per le malattie della ghiandola lacrimale. Tuttavia, la mancanza di un metodo di coltura affidabile e privo di siero per ottenere un numero sufficiente di cellule staminali LG (LGSC) è un ostacolo per ulteriori ricerche e applicazioni. Il metodo di coltura tridimensionale (3D), privo di siero per le LGSC di topo adulto è ben consolidato e mostrato qui. Le LGSC potrebbero essere continuamente passate e indotte a differenziarsi in cellule acinari o duttali.
Per la coltura primaria LGSC, gli LG di topi di 6-8 settimane sono stati digeriti con dispasi, collagenasi I e tripsina-EDTA. Un totale di 1 × 104 cellule singole sono state seminate in 80 μL di matrice di matrice di cellule staminali della ghiandola gel-lacrimale (LGSCM) in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti, preclusa con 20 μL di matrice gel-LGSCM della matrice. La miscela è stata solidificata dopo l'incubazione per 20 minuti a 37 °C e sono stati aggiunti 600 μL di LGSCM.
Per il mantenimento della LGSC, le LGSC coltivate per 7 giorni sono state disaggregate in singole cellule mediante dispasi e tripsina-EDTA. Le singole cellule sono state impiantate e coltivate secondo il metodo utilizzato nella coltura primaria LGSC. Le LGSC potrebbero essere passate oltre 40 volte ed esprimere continuamente marcatori di cellule staminali/progenitrici Krt14, Krt5, P63 e nestin. Le LGSC coltivate in LGSCM hanno capacità di auto-rinnovamento e possono differenziarsi in cellule acinari o duttali in vitro e in vivo.
Introduzione
Le cellule staminali della ghiandola lacrimale (LGSC) mantengono il rinnovamento cellulare della ghiandola lacrimale (LG) e sono la fonte delle cellule acinari e duttali. Pertanto, il trapianto di LGSC è considerato un approccio alternativo per il trattamento di gravi danni infiammatori e malattia dell'occhio secco carente di acqua (ADDED)1,2,3. Diversi metodi di coltura sono stati applicati per arricchire le LGSC. Tiwari et al. hanno separato e coltivato cellule LG primarie utilizzando collagene I e gel di matrice integrato con diversi fattori di crescita; tuttavia,....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti in questo protocollo hanno seguito le linee guida per la cura degli animali del Comitato etico sulla sperimentazione animale della Sun Yat-sen University. Tutte le operazioni relative alle celle devono essere eseguite sul banco di lavoro ultrapulito nella sala operatoria della cella. Tutte le operazioni con xilene devono essere effettuate in cappe aspiranti.
1. Cultura primaria LGSC
- Isolamento LG
- Procurati un topo maschio BALB/c di 6-8 settimane e taglia la pelle dietro l'orecchio per esporre l'LG e il tessuto connettivo circostante. Staccare il tessuto connettivo mediante dissezione ....
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Risultati
Stabilire un sistema di coltura 3D privo di siero
In questo studio, È stato sviluppato LGSCM contenente EGF, Wnt3A, FGF10 e Y-27632 per LGSC di topo e le LGSC sono state isolate e coltivate con successo con un metodo di coltura 3D (Figura 1A). Un sistema di coltura 3D 3D privo di siero di successo di LGSC da topi C57BL / 6, topi NOD / ShiLtJ, topi BALB / c e topi ROSA26mT / mG è stato stabilito utilizzando questo metodo16. Per un topo ma.......
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Discussione
Esistono metodi consolidati per l'isolamento e la coltura in vitro di cellule staminali lacrimali per la coltura di cellule staminali lacrimali e la riparazione delle lesioni LG. Shatos et al.17 e Ackermannet al. 6 cellule staminali lacrimali coltivate e sottocoltate con successo di ratti e topi con metodi di coltura 2D, rispettivamente, rendendo possibile il trapianto di cellule staminali lacrimali per il trattamento di ADDED. Studi su cellule staminali
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione della National Natural Science Foundation of China (n. 31871413) e da due programmi di scienza e tecnologia del Guangdong (2017B020230002 e 2016B030231001). Siamo davvero grati ai ricercatori che ci hanno aiutato durante lo studio e ai membri dello staff che lavorano nel centro animali per il loro supporto nella cura degli animali.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Animal (Mouse) | |||
| Bal B/C | Model Animal Research Center dell'Università | ||
| C57 BL/6J | Laboratory Animal Center dell'Università | ||
| NOD/ShiLtJ | Model Animal Research Center dell'Università | ||
| ROSA26mT/mG | Modello Animal Research Center dell'Università | ||
| Equipment | |||
| Bilancia analitica | Sartorius | ||
| Essiccatore automatico | Thermo | ||
| Camera di conteggio del sangue | BLAU | ||
| Cell Counter | CountStar | ||
| Incubatore CO2 a temperatura costante | Thermo | ||
| ECL Gel sistema di imaging | GE healthcare | ||
| Bagno elettrico per bagnomaria | Tecnologia Yiheng Apparecchio | ||
| per elettroforesi | BioRad | ||
| Strumento di PCR quantitativa a fluorescenza | Roche | ||
| Affettatrice per tessuti congelati | Lecia | ||
| Centrifuga orizzontale | CENCE | ||
| Microscopio a fluorescenza invertita | Nikon | ||
| Microscopio invertito | Olympus | ||
| Laser micrografo a scansione lamellare | Carl Zeiss | ||
| Contenitore di azoto liquido | Thermo Bassa | ||
| temperatura alta centrifuga di velocità | Eppendorf | ||
| Micropipettor | Gilson | ||
| Forno a microonde | Panasonic | ||
| Nanodrop spettrofotometro ultravioletto | Thermo | misura della concentrazione | |
| Affettatrice per paraffina | Amplificatore Thermo | ||
| PCR | Eppendorf | ||
| Tester di pH | Sartorius | ||
| 4 ° C Frigorifero | Haier | ||
| Oscillatore termostatico di coltura | ZHICHENG | ||
| Strumento di inclusione in paraffina tissutale | Thermo | ||
| -80° C Frigorifero a bassissima temperatura | Thermo | ||
| -20° C Frigorifero a bassissima temperatura | Thermo | ||
| Sistema di purificazione dell'acqua ultra pura | ELGA | ||
| u>Reagent | |||
| Animal Experiment | |||
| HCG | Sigma | 9002-61-3 | |
| PMSG | Sigma | 14158-65-7 | |
| Pentobarbital Sodio | Sigma | 57-33-0 | |
| Coltura cellulare | |||
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| Collagenasi I | Gibco | 17018029 | |
| Dispase | BD | 354235 | |
| DMEM | Sigma | D6429 | |
| DMEM/F12 | Sigma | D0697 | |
| DMSO | Sigma | 67-68-5 | |
| EDTA | Sangon Biotech | A500895 | |
| Siero Bovino Fetale | Gibco | 04-001-1ACS | |
| GlutaMax | Gibco | 35050087 | |
| Umano FGF10 | PeproTech | 100-26 | |
| Matrigel (Matrix gel) | BD | 356231 | |
| Noggin murino | PeproTech | 250-38 | |
| Murine Wnt3A | PeproTech | 315-20 | |
| EGF murino | PeproTech | 315-09 | |
| NEAA | Gibco | 11140050 | |
| N2 | Gibco | 17502048 | |
| R-spondina 1 | PeproTech | 120-38 | |
| Inibitore della tripsina (TI) | Sigma | T6522 | Derivato da Glycine max; può inibire la tripsina, la chimotripsina e la plasminasi in misura minore. Un mg inibisce 1,0-3,0 mg di tripsina. |
| Tripsina | Sigma | T4799 | |
| Y-27632 | Selleck | S1049< | |
| strong>HE colorazione & Immunocolorazione | |||
| Alexa Fluor 488 asino anti-Topo IgG | Thermo | A-21202 | Diluizione usata: IHC) 2 μ g/mL, (IF) 0,2 μ g/mL |
| Alexa Fluor 488 asino anti-coniglio IgG | Thermo | A-21206 | Diluizione usata: (IHC) 2 μ g/mL, (IF) 2 μ g/mL |
| Alexa Fluor 568 asino anti-Topo IgG | Thermo | A-10037 | Diluizione usata: (IHC) 2 μ g/mL, (IF) 2 μ g/mL |
| Alexa Fluor 568 asino anti-Coniglio IgG | Thermo | A-10042 | Diluizione usata: (IHC) 2 μ g/mL, (IF) 4 μ g/mL |
| Anticorpo di coniglio anti-AQP5 | Abcam | ab104751 | Diluizione utilizzata: (IHC) 1 μ g/mL, (IF) 0,1 μ g/mL |
| Anticorpo anti-E-caderina Anticorpo di ratto | Abcam | ab11512 | Diluizione utilizzata: (IF) 5 μ g/mL |
| Anticorpo di coniglio anti-cheratina14 | Abcam | ab181595 | Diluizione utilizzata: (IHC) 1 μ g/mL, (IF) 2 μ g/mL |
| Anticorpo di coniglio Anti-Ki67 | Abcam | ab15580 | Diluizione utilizzata: (IHC) 1 μ g/mL, (IF) 1 μ g/mL |
| Anticorpo di topo Anti-mCherry | Abcam | ab125096 | Diluizione utilizzata: (IHC) 2 μ g/mL, (IF) 2 μ g/mL |
| Anticorpo anti-mCherry rabbit | Abcam | ab167453 | Diluizione utilizzata: (IF) 2 μ g/mL |
| C6H8O7 | Sangon Biotech | A501702-0500 | |
| Acido citrico | Sangon Biotech | 201-069-1 | |
| Kit DAB (20x) | CWBIO | CW0125 | |
| DAPI | Thermo | 62248 | |
| Eosin | BASO | 68115 | |
| Montaggio fluorescente Medio | Dako | S3023 | |
| Formalina | Sangon Biotech | A501912-0500 | |
| Capra anticorpo IgG di topo (HRP) | Abcam | ab6789 | Diluizione usata: 2 μ g/mL |
| Anticorpo IgG di capra anti-coniglio (HRP) | Abcam | ab6721 | Diluizione utilizzata: 2 μ g/mL |
| Ematossilina | BASO | 517-28-2 | |
| Histogel (Idrogel incorporante) | Thermo | HG-400-012 | |
| 30% H2O2 | Guangzhou Chimica | KD10 | |
| Soluzione di perossido di idrogeno al 30% | Chimica Guangzhou | 7722-84-1 | |
| Metanolo | Chimica Guangzhou | 67-56-1 | |
| Na3C6H5O7.2H2O | Sangon Biotech | A501293-0500 | |
| Balsamo neutro | SHANGHAI YYYANG | YY-Balsamo | |
| Siero di capra non immunizzato | BOSTER | AR0009 | |
| Paraffina | Sangon Biotech | A601891-0500 | |
| Paraformaldeide | DAMAO | 200-001-8 | |
| Saccharose | Guangzhou Chimica | 57-50-1 | |
| Citrato di sodio tribasico diidrato | Sangon Biotech | 200-675-3 | |
| Saccarosio | Guangzhou Chimica | IB11-AR-500G | |
| Tissue-Tek O.T.C. Composto | SAKURA | SAKURA.4583 | |
| Tritone X-100 | DINGGUO | 9002-93-1 | |
| Xilene | Guangzhou Chimica | 128686-03-3 | |
| RT-PCR & qRT-PCR | |||
| Agarosio | Sigma | 9012-36-6 | |
| Alcool | Guangzhou Chimica | 64-17-5 | |
| Cloroformio | Guangzhou Chimica | 865-49-6 | |
| Bromuro di etidio | Sangon Biotech | 214-984-6 | |
| Alcool isopropilico | Guangzhou Chimica | 67-63-0 | |
| LightCycler 480 SYBR Verde I Master Mix | Roche | 488735200H | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | TOYOBO-Taq | ||
| DNA polimerasi | TAKARA | R10T1 | |
| Goldview (acido nucleico macchia) | BioSharp | BS357A | |
| TRIzol | Magen | R4801-02 | |
| Vector Costruzione & Trasfezione cellulare | |||
| Agar | |||
| Sigma | 69-52-3 | ||
| Cloramfenicolo | Sigma | 56-75-7 | |
| Kit di estrazione plasmidico senza endotossine | Thermo | A36227 | |
| Kanamicina | Sigma | 25389-94-0 | |
| Lipo3000 Plasmide Kit di Trasfezione | Kit | L3000015 | |
| LR | Kit | ||
| TIANGEN | DP103 | ||
| Trans5α Cellula chimicamente competente | TRANSGEN | CD201-01 | |
| Estratto di lievito | OXID OXID-strong | ||
| OXID | - | ||
| Primers e Sequenza | Company | ||
| Primer: AQP5 Sequence: F: CATGAACCCAGCCCGATCTT R: CTTCTGCTCCCATCCCATCC | Synbio Tech | ||
| Primer: β-actin Sequence: F: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCCTCTCTCTCTCTCT> | Tech | ||
| Primer: Epcam Sequence: F: CATTTGCTCCAAACTGGCGT R: TGTCCTTGTCGGTTCTTCGG | Synbio Tech | ||
| Primer: Krt5 Sequence: F: AGCAATGGCGTTCTGGAGG R: GCTGAAGGTCAGGTAGAGCC | Synbio Tech | ||
| Primer: Krt14 Sequenza: F: CGGACCAAGTTTGAGACGGA R: GCCACCTCCTCGTGGTTC | Synbio Tech | ||
| Primer: Krt19 Sequence: F: TCTTTGAAAAACACTGAACCCTG R: TGGCTCCTCAGGGCAGTAAT | Synbio Tech | ||
| Primer: Ltf Sequence: F: CACATGCTGTCGTATCCCGA R: CGATGCCCTGATGGACGA | Synbio Tech | ||
| Primer: Nestin Sequence: F: GGGGCTACAGGAGTGGAAAC R: GACCTCTAGGGTTCCCGTCT | Synbio Tech | ||
| Primer: P63 Sequence: F: TCCTATCACGGGAAGGCAGA R: GTACCATCGCCGTTCTTTGC | Synbio Tech | ||
| Vector | |||
| pLX302 lentivirus vettore a vuoto | Addgene | ||
| pENRTY-mCherry | Xiaofeng Qin laboratory, Università |
Riferimenti
- Zoukhri, D., Macari, E., Kublin, C. L. A single injection of interleukin-1 induces reversible aqueous tear deficiency, lacrimal gland inflammation, and acinar and ductal cell proliferation. Experimental Eye Research. 84 (5), 894-904 (2007).
- Gromova, A., et al.
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Ristampe e permessi
