Sistema di coltura tridimensionale privo di siero per cellule staminali della ghiandola lacrimale

Le cellule staminali della ghiandola lacrimale (LGSC) mantengono il rinnovamento cellulare della ghiandola lacrimale (LG) e sono la fonte delle cellule acinari e duttali. Pertanto, il trapianto di LGSC è considerato un approccio alternativo per il trattamento di gravi danni infiammatori e malattia dell'occhio secco carente di acqua (ADDED)^1,2,3. Diversi metodi di coltura sono stati applicati per arricchire le LGSC. Tiwari et al. hanno separato e coltivato cellule LG primarie utilizzando collagene I e gel di matrice integrato con diversi fattori di crescita; tuttavia, le cellule LG non potevano essere coltivate continuamente⁴. Utilizzando la coltura bidimensionale (2D), le cellule staminali derivate da LG di topo sono state isolate da You et ^al.5 e Ackermann et al. ⁶, trovato per esprimere i geni marcatori delle cellule staminali / progenitrici, Oct4, Sox2, Nanog e nestin, e potrebbe essere sottocoltato. Tuttavia, non vi è alcuna chiara indicazione che queste cellule possano differenziarsi in cellule acinari o duttali e non esiste un esperimento di trapianto per verificare il potenziale di differenziazione in vivo.

Recentemente, le cellule c-kit⁺ dim/EpCAM⁺/Sca1^-/CD34^-/CD45^- sono state isolate dagli LG di topo mediante citometria a flusso, hanno trovato per esprimere marcatori di cellule progenitrici LG, come Pax6 e Runx1, e differenziate in condotti e acini in vitro. Nei topi con ADDED, l'iniezione ortotopica con queste cellule potrebbe riparare gli LG danneggiati e ripristinare la funzione secretoria degli LG². Tuttavia, il numero di cellule staminali isolate con questo metodo era piccolo e non ci sono condizioni di coltura adeguate per espandere le LGSC isolate. In sintesi, è necessario stabilire un sistema di coltura appropriato per isolare e coltivare efficacemente le LGSC adulte con un'espansione stabile e continua per lo studio delle LGSC nel trattamento dell'ADDED.

Gli organoidi derivati da cellule staminali o cellule staminali pluripotenti sono un gruppo di cellule che sono istologicamente simili agli organi correlati e possono mantenere il proprio rinnovamento. Dopo che l'organoide intestinale di topo è stato coltivato con successo da Sato et al. nel 2009⁷, gli organoidi di altri organi sono stati coltivati in successione, sulla base del sistema di coltura di Sato, come la cistifellea⁸, il fegato⁹, il pancreas¹⁰, lo stomaco¹¹, il seno¹², il polmone¹³, la prostata¹⁴ e la ghiandola salivare¹⁵ . A causa dell'elevata percentuale di cellule staminali adulte prima della differenziazione cellulare in coltura di organoidi, il metodo di coltura organoide tridimensionale (3D) è considerato ottimale per l'isolamento e la coltura di cellule staminali adulte di LG.

Nel presente studio è stato istituito un sistema di coltura LGSC per topi adulti ottimizzando il metodo di coltura 3D senza siero. È dimostrato che le LGSC coltivate da topi sia normali che AGGIUNTI hanno mostrato una capacità stabile di auto-rinnovamento e proliferazione. Dopo il trapianto nei LG di topo AGGIUNTI, le LGSC hanno colonizzato i LG compromessi e migliorato la produzione di lacrime. Inoltre, le LGSC fluorescenti rosse sono state isolate da topi ROSA26^mT/mG e coltivate. Questo lavoro fornisce un riferimento affidabile per l'arricchimento LGSC in vitro e l'autoinnesto LGSC in applicazione clinica per la terapia ADDED.

Tutti gli esperimenti in questo protocollo hanno seguito le linee guida per la cura degli animali del Comitato etico sulla sperimentazione animale della Sun Yat-sen University. Tutte le operazioni relative alle celle devono essere eseguite sul banco di lavoro ultrapulito nella sala operatoria della cella. Tutte le operazioni con xilene devono essere effettuate in cappe aspiranti.

1. Cultura primaria LGSC

1. Isolamento LG
   1. Procurati un topo maschio BALB/c di 6-8 settimane e taglia la pelle dietro l'orecchio per esporre l'LG e il tessuto connettivo circostante. Staccare il tessuto connettivo mediante dissezione smussata con l'aiuto di una pinzetta e rimuovere l'LG.
   2. Risciacquare gli LG due volte con 4 ml di soluzione sterile di PBS da 10 mM per rimuovere il sangue in un piatto da 6 cm. Immergere gli LG in un piatto da 6 cm con 4 ml di etanolo al 75% per 10 s e risciacquare con 10 mM PBS due volte immediatamente.
2. Ottenere singole celle di LG
   1. Utilizzare la soluzione tampone HEPES (50 mM HEPES/KOH, pH 7,4; 150 mM NaCl in acqua ultrapura) per preparare 25 U/mL dispase. Preparare la soluzione di collagenasi I allo 0,1% con acqua ultrapura.
   2. Tagliare gli LG in piccoli frammenti (circa 1 mm³), trasferirli in un tubo centrifugo sterile da 15 mL e trattare i tessuti con 500 μL di 25 U/mL dispasi e 500 μL di collagenasi I allo 0,1% per 1 ora a 37 °C.
   3. Utilizzare 10 mM PBS per preparare la soluzione di tripsina-EDTA (0,05 g/L di tripsina, 0,04 g/L di EDTA). Trattare i frammenti LG dal passaggio 1.2.2 con 1 mL di tripsina-EDTA allo 0,05% per 10 minuti a 37 °C e dissociare i frammenti in singole cellule mediante pipettaggio ripetuto.
   4. Filtrare la sospensione attraverso un filtro da 70 μm, raccogliere il filtrato in un tubo centrifugo sterile da 15 mL e centrifugare a 150 × g per 5 minuti.
   5. Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante, aggiungere 10 mL di PBS da 10 mM per lavare il pellet cellulare e centrifugare la sospensione.
   6. Ripetere il passaggio 1.2.5, rimuovere il surnatante e aggiungere 1 mL di DMEM/F12 (miscela 1:1 del mezzo Eagle modificato di Dulbecco e dell'F-12 di Ham) per risospescere i pellet cellulari.
3. Cultura primaria LGSC
   1. Preparare il mezzo per cellule staminali della ghiandola lacrimale (LGSCM) contenente DMEM / F12, 1 integratore N2, 1 integratore B27, 2 mM sostituto della glutammina, 0,1 mM NEAA (aminoacidi non essenziali), 50 ng / mL fattore di crescita epidermico murino (EGF), 100 ng / mL fattore di crescita dei fibroblasti 10 (FGF10), 10 ng / mL Wnt3A e 10 μM Y-27632 (inibitore ROCK).
   2. Aggiungere 20 μL di matrice gel-LGSCM a matrice (matrix gel: LGSCM = 1:1) al centro del pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Utilizzare una punta della pipetta per espanderla a un cerchio (diametro 6-8 mm) e incubare la miscela per 20 minuti a 37 °C per prerivestire il pozzo.
   3. Utilizzare un contatore di cellule per determinare il numero di cellule e aggiungere 40 μL di LGSCM con un totale di 1 × 10⁴ cellule in 40 μL del gel della matrice. Mescolarli delicatamente con una pipetta per ottenere una miscela matrice gel-LGSCM (matrix gel: LGSCM= 1:1).
   4. Utilizzare una pipetta per far cadere con cura 80 μL della miscela sull'area precoata in ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti nel passaggio 1.3.2.
   5. Incubare la miscela per 20 minuti a 37 °C e aggiungere 600 μL di LGSCM.
   6. Cambia il terreno di coltura in ogni pozzo una volta ogni due giorni. Dopo 7 giorni di coltura, cerca le sfere LGSC con un diametro di 100-300 μm al microscopio invertito (oculare: 10x, obiettivo: 4x).
      NOTA: le LGSC possono essere coltivate per più di 14 giorni in totale.
4. Isolare e coltivare LGSC primarie di topi ROSA26^mT/mG e topi DED (NOD/ShiLtJ) seguendo i passaggi sopra descritti.

2. Manutenzione e passaggio LGSC

1. Rimuovere bene il mezzo di coltura dalla cultura della sfera.
2. Disaggregare le sfere LGSC coltivate per 7 giorni mediante incubazione in 20 μL di 10 U/mL dispasi e 100 μL di 10 mM PBS per 30 min a 37 °C.
3. Trasferire la sospensione in un tubo centrifuga da 15 mL e centrifuga a 150 × g per 4 min. Rimuovere il surnatante.
4. Trattare le sfere con 1 mL di tripsina-EDTA allo 0,05% per 5 minuti a 37 °C. Aggiungere 1 mL di inibitore della tripsina allo 0,05% (TI) e pipettare ripetutamente per neutralizzare la tripsina e dissociare le sfere in singole cellule.
5. Centrifugare a 150 × g per 5 minuti e rimuovere il surnatante per ottenere LGSC nel pellet. Aggiungere 1 mL di LGSCM per risospescere il pellet LGSC.
6. Placcare le singole celle come descritto nei passaggi da 1.3.1 a 1.3.6.

3. Differenziazione LGSC

1. Procedura 1: Estendere il tempo di coltura delle LGSC da 7 a 14 giorni con il sistema di coltura LGSC per la differenziazione casuale.
2. Procedura 2: Modificare il rapporto della miscela matrice gel-LGSCM da 1:1 a 1:2 all'inizio della coltura LGSC per la differenziazione delle cellule duttali. Seminare le LGSC nella matrice per l'induzione per 14 giorni (fare riferimento al passaggio 1.3).
3. Procedura 3: Dopo il passaggio, sostituire LGSCM con la miscela di siero bovino fetale LGSCM-10% (FBS) per la differenziazione delle cellule acinari. Indurre la differenziazione per 14 giorni.

4. Disidratazione dei tessuti LG

1. Ottenere i tessuti LG (fase 1.1.1) e risciacquare gli LG con 4 ml di soluzione sterile pbS da 10 mM in una parabola da 6 cm per 2 minuti. Spostare i tessuti alla soluzione di formalina al 10% per la fissazione per 24 ore.
2. Risciacquare i tessuti fissi con 10 mM PBS per 2 minuti per rimuovere la formalina e trasferire il tessuto in una scatola di incorporamento del tessuto. Inserire la scatola di incorporamento nel disidratatore automatico.
3. Utilizzare il disidratatore automatico per disidratare i tessuti come segue: 70% di etanolo, 2 h; 80% etanolo, 2 h; 90% etanolo, 30 min; 95% etanolo, 30 min; etanolo assoluto, 30min; etanolo assoluto, 2 h; etanolo assoluto: miscela 100% xilene (1: 1), 30 min; 100% xilene, 30 min; 100% xilene, 2 h; 100% xilene: miscela di paraffina (1: 1), 30 min; paraffina, 2 h; paraffina,3 h.

5. Disidratazione organoide/sfera LG

1. Ottenere organoidi/sfere LG (passaggi 2.1-2.3) in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL e risciacquare gli organoidi/sfere LG con 1 mL di soluzione PBS sterile da 10 mM per 2 min.
2. Centrifugare a 100 × g per 1 minuto e rimuovere il surnatante.
3. Preparare la soluzione di paraformaldeide al 4% (PFA) come segue: aggiungere 20 g di PFA a una miscela di 400 ml di PBS da 10 mM e 40 μL di 1 M NaOH, agitare bene la soluzione e riscaldarla a bagnomaria a 65 °C per 2 ore fino a completa dissoluzione del PFA. Dopo il raffreddamento a temperatura ambiente, utilizzare PBS da 10 mM per portare il volume a 500 ml e conservarlo a 4 °C.
4. Aggiungere 1 mL di PFA al 4% nel tubo microcentrifuga con il pellet organoide/sfera e mettere il tubo in frigorifero a 4 °C per almeno 24 ore per il fissaggio.
5. Dopo la fissazione, centrifugare a 100 × g per 1 minuto e rimuovere il surnatante. Aggiungere 1 mL di PBS da 10 mM nel tubo microcentrifuga con il pellet organoide/sfera e mescolare delicatamente mediante pipettaggio per 2 minuti per risciacquare il PFA. Ripetere questo passaggio due volte.
6. Centrifugare a 100 × g per 1 minuto e rimuovere il surnatante.
7. Riscaldare l'idrogel di incorporamento per sciogliere e aggiungere 50-60 μL di idrogel incorporante al pellet organoide / sfera e mescolare. Pipettare la miscela sul parafilm sotto forma di goccia e attendere 5 minuti affinché si solidifichi a temperatura ambiente.
8. Disidratare il gel con gli organoidi/sfere in un nuovo tubo microcentrifuga da 1,5 mL come segue.
   1. Aggiungere 1 mL di etanolo al 50% al tubo, attendere 30 minuti a temperatura ambiente e rimuovere il liquido dal tubo mediante pipettaggio. Ripeti questo passaggio modificando la concentrazione di etanolo al 70%, 80%, 90%, 95% in successione.
   2. Aggiungere 1 mL di etanolo assoluto al tubo, attendere 30 minuti a temperatura ambiente e rimuovere il liquido dal tubo mediante pipettaggio. Ripetere questo passaggio.
   3. Aggiungere 1 mL di una miscela di 0,5 mL di etanolo assoluto e 0,5 mL di xilene al 100% al tubo, attendere 30 minuti a temperatura ambiente e rimuovere il liquido dal tubo mediante pipettaggio.
   4. Aggiungere 1 mL di xilene al 100% al tubo, attendere 30 minuti a temperatura ambiente e rimuovere il liquido dal tubo mediante pipettaggio. Ripetere questo passaggio.
      NOTA: i passaggi 5.8.5-5.8.6 devono essere eseguiti in un bagno di metallo a 65 °C.
   5. Aggiungere 1 mL di una miscela di 0,5 mL di paraffina e 0,5 mL di xilene al 100% al tubo, attendere 30 minuti a 65 °C e rimuovere il liquido dal tubo mediante pipettaggio.
   6. Aggiungere 1 mL di paraffina al tubo, attendere 30 minuti a 65 °C e rimuovere il liquido dal tubo mediante pipettaggio. Ripetere questo passaggio ed estendere il tempo di elaborazione a 1 ora.

6. Incorporamento e sezionamento di paraffina

1. Incorporamento di paraffina
   1. Prima di incorporare, accendere la macchina incorporatrice e preriscaldarla per sciogliere la cera di paraffina nel serbatoio di paraffina.
   2. Posizionare il tessuto disidratato o il gel organoide/sfera nella scanalatura della scatola di ferro incorporata e inserire la scatola di ferro nella paraffina della macchina incorporatrice.
   3. Rimuovere il coperchio di plastica e posizionare la scatola di plastica sulla scatola di ferro per coprirla. Spostare la scatola di ferro incorporata su una tavola di raffreddamento.
   4. Dopo che la paraffina si è condensata in blocchi nella scatola di incorporamento, rimuoverla dalla scatola di ferro e affettarla direttamente o conservarla temporaneamente in frigorifero a 4 °C.
2. Sezionamento di paraffina
   1. Prima dell'affettatura della paraffina, preassemblare l'affettatrice di paraffina e aggiungere acqua distillata al lavandino dell'affettatrice per il preriscaldamento. Iniziare a affettare quando la temperatura dell'acqua sale a 42 °C.
   2. Fissare il campione sullo slot campione dell'affettatrice di paraffina. Regolare lo spessore della sezione a 5 μm durante l'affettatura.
   3. Suddividere continuamente il campione. Fissare la sezione completamente piastrellata sulla slitta antiscivolo nel serbatoio dell'affettatrice.
   4. Dopo il sezionamento, posizionare i vetrini apposti con il tessuto campione in un incubatore biochimico a 37 °C per l'essiccazione per 24 ore. Conservare temporaneamente i vetrini in frigorifero a 4 °C.

7. Colorazione di ematossilina ed eosina

1. Sciogliere le sezioni di paraffina a 60 °C per 30 minuti, immergere le sezioni in xilene al 100% per 15 minuti e ripetere.
2. Trattare le sezioni con etanolo assoluto su uno shaker per 5 minuti.
3. Trattare le sezioni con etanolo al 90%, etanolo all'80% etanolo al 70% su uno shaker, ciascuna per 3 minuti.
4. Trattare le sezioni con acqua deionizzata su uno shaker per 5 minuti e 2 minuti in successione.
5. Macchiare le sezioni su una scatola bagnata per 5 minuti con 4 mg/mL di soluzione di ematossilina. Risciacquare le sezioni in acqua corrente per 10 minuti.
6. Agitare le sezioni su uno shaker prima con acqua deionizzata per 2 minuti e poi con eosina allo 0,5%-1% per 1 minuto.
7. Agitare le sezioni con il 70% di etanolo, l'80% di etanolo e il 90% di etanolo su uno shaker per 3 minuti (ciascuna) successivamente. Agitare le sezioni con etanolo assoluto su uno shaker per 5 minuti.
8. Immergere le sezioni in 100% xilene per 15 minuti e ripetere l'ammollo.
9. Utilizzare una pipetta o un contagocce per aggiungere 3-4 gocce di balsamo neutro alla diapositiva e coprirla lentamente con una diapositiva di copertura. Asciugare all'aria le diapositive a temperatura ambiente.

8. Colorazione immunoistochimica (IHC)

1. Sciogliere le sezioni di paraffina a 60 °C per 30 minuti, immergere le sezioni in xilene al 100% per 10 minuti e ripetere questo passaggio due volte.
2. Agitare le sezioni su uno shaker prima con etanolo assoluto, etanolo al 90% e etanolo all'80% per 2 minuti (ciascuna), successivamente, e poi con acqua deionizzata per 3 minuti. Ripetere l'agitazione con acqua deionizzata due volte.
3. Agitare le sezioni su uno shaker prima con una miscela di 20 ml di 30% H₂O₂ e 180 ml di metanolo per 10 minuti e quindi acqua deionizzata per 5 minuti. Ripetere questo passaggio tre volte.
4. Trasferire le sezioni in tampone di acido citrico preboiled (1 L di acqua deionizzata con 3 g di Na₃C₆H₅O_{7,2H 2}O e 0,4 g C₆H₈O₇, pH 6,0), microonde per 10 minuti per mantenerle al punto di ebollizione subcritico e raffreddare a temperatura ambiente per 30 minuti. Agitare le sezioni con acqua deionizzata su uno shaker per 5 min. Ripetere questo passaggio tre volte.
5. Agitare le sezioni con PBS da 10 mM su uno shaker per 5 minuti e ripetere questo passaggio tre volte. Racchiudere l'area del tessuto sulla scatola bagnata con un pennarello idrorepellente, aggiungere una goccia di siero di capra non immune pronto all'uso per coprire i campioni e metterli a temperatura ambiente per 1 ora.
6. Rimuovere il siero, aggiungere anticorpi primari ai campioni (vedere la tabella dei materiali) e incubarli durante la notte a 4 °C. Rimuovere l'anticorpo primario, agitare le sezioni con 10 mM PBS su uno shaker per 5 minuti e ripetere questa fase di agitazione con 10 mM PBS tre volte.
7. Aggiungere anticorpi secondari (vedere la Tabella dei materiali) per coprire i campioni e incubarli su una scatola bagnata per 30 minuti a temperatura ambiente. Agitare le sezioni con PBS da 10 mM su uno shaker per 5 minuti e ripetere la fase di agitazione tre volte.
8. Aggiungere la soluzione di 0,03-0,05% 3,3'-diaminobenzidina (DAB) appena preparata per coprire i campioni sulla scatola bagnata e macchiare per 30-90 s. Risciacquare le sezioni con acqua corrente per 10 min.
   NOTA: Controllare il tempo di colorazione osservando al microscopio ottico fino a quando non appare il colore giallo.
9. Aggiungere 4 mg/mL di soluzione di ematossilina per coprire i campioni, macchiare per 5 minuti su una scatola bagnata e risciacquare le sezioni con acqua corrente per 10 minuti.
10. Agitare le sezioni su uno shaker con etanolo all'80%, etanolo al 90% ed etanolo assoluto per 2 minuti ciascuna, successivamente, e immergere le sezioni in xilene al 100% per 30 minuti.
11. Utilizzare una pipetta o un contagocce per aggiungere 3-4 gocce di balsamo neutro alla diapositiva e coprirla lentamente con una diapositiva di copertura. Asciugare all'aria le diapositive a temperatura ambiente.

9. Colorazione immunofluorescenza globale di organoidi/sfere

NOTA: Raccogliere gli organoidi/sfere fissati con una soluzione di PFA al 4% in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL (vedere i passaggi da 5.1 a 5.4). Eseguire l'etichettatura di fluorescenza come segue.

1. Disidratare gli organoidi/sfere aggiungendo 1 mL di soluzione di saccarosio al 30% al tubo e incubarlo per una notte in frigorifero a 4 °C.
2. Aggiungere 100 μL di soluzione PBST (soluzione PBS da 10 mM con 0,1% tritone X-100) al tubo per risciacquare gli organoidi/sfere per 5 minuti, centrifugare il tubo a 100 × g per 1 minuto e raccogliere il pellet. Ripetere questo passaggio tre volte.
3. Aggiungere 0,5-1 ml di siero di capra non immune pronto all'uso al tubo e sigillarlo a temperatura ambiente per 1 ora. Centrifugare il tubo a 100 × g per 1 minuto e raccogliere il pellet.
4. Aggiungere diverse gocce di anticorpo primario diluito per coprire il pellet e incubare in frigorifero a 4 °C per 48 ore. Centrifugare il tubo a 100 × g per 1 minuto e raccogliere il pellet.
5. Ripetere il passaggio 9.2.
6. Aggiungere diverse gocce di un anticorpo secondario fluorescente e una soluzione di 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) al tubo per coprire semplicemente il pellet e incubare in frigorifero a 4 °C per 24 ore, evitando la luce.
7. Ripetere il passaggio 9.2, evitando la luce.
8. Aggiungere 100 μL di soluzione PBST al tubo e conservarlo temporaneamente in frigorifero a 4 °C, al riparo dalla luce. Osservare e fotografare gli organoidi/sfere utilizzando il microscopio a scansione a foglio luminoso.

10. Trasfezione LGSC pLX-mCherry

NOTA: La produzione di particelle lentivirali deve essere eseguita in un armadio di biosicurezza e in un banco pulito a livello di biosicurezza BSL2.

1. Coltivare la cella di confezionamento del lentivirus 293T in una piastra a 6 pozzetti con DMEM + 10% FBS a 37 °C, 5% CO₂ per 3-5 giorni per raggiungere l'80% di confluenza cellulare.
2. Trasfettate il vettore lentivirus pLX-mCherry in LGSC.
   NOTA: la preparazione del reagente è indicata per un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti.
   1. Preparare due tubi centrifughi sterili da 1,5 mL e aggiungere 250 μL di DMEM/F12 a ciascun tubo.
   2. Aggiungere 7,5 μL di reagente di trasfezione in un tubo e mescolare accuratamente il reagente mediante pipettaggio.
   3. Aggiungere 2 μg di plasmide pLX-mCherry senza endotossina e plasmide di imballaggio di lentivirus corrispondente in un altro tubo e aggiungere il reagente di trasfezione (2 μL / μg di plasmide).
   4. Mescolare il liquido in entrambi i tubi della centrifuga e lasciare riposare le miscele per 5 minuti a temperatura ambiente.
   5. Rimuovere il terreno di coltura delle cellule 293T e aggiungere la miscela dal punto 10.2.4 alle celle 293T. Cambiare il terreno di coltura in DMEM fresco + 10% FBS dopo 8 ore.
   6. Dopo 48 ore, raccogliere il surnatante virale per la prima volta e filtrarlo attraverso un filtro da 0,45 μm. Dopo 72 ore, raccogliere il surnatante virale per la seconda volta e filtrarlo nuovamente attraverso un filtro da 0,45 μm.
      NOTA: Conservare entrambi i supernatanti filtrati sul ghiaccio fino alla trasduzione del lentivirus.
3. Ottenere le LGSC da topi DED (NOD/ShiLtJ) (vedere il passaggio 1).
4. Aggiungere 1 mL del surnatante preriscelto pLX-mCherry lentivirus per risospese le cellule.
5. Posizionare il tubo della centrifuga su uno shaker nell'incubatore a CO₂ a 37 °C. Agitalo a 100 giri / min per massimizzare il contatto tra il lentivirus e le cellule. Dopo 8 ore, centrifugare la miscela a 250 × g per 4 minuti e rimuovere il surnatante.
6. Aggiungere 1 mL di DMEM/F12 per risospese il pellet cellulare. Utilizzare un contatore di cellule per determinare il numero di cellule e seminare un totale di 1 × 10⁴ cellule in 100 μL di matrice gel-LGSCM della matrice (gel della matrice: LGSCM = 1: 1) in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti precoata con 20 μL di matrice gel-LGSCM della matrice (vedere il passaggio 1.3.2).
7. Dopo 7 giorni di coltura (vedi passaggio 1), selezionare le sfere che mostrano fluorescenza rossa sotto un microscopio a fluorescenza per espandere la coltura.

11. Trapianto ortotopico LGSC

NOTA: Tutte le operazioni chirurgiche vengono eseguite in una sala operatoria SPF e tutti gli strumenti chirurgici sono sterilizzati.

1. Ottenere le sfere LGSC da topi ROSA26^mT/mG con fluorescenza rossa (td-Tomato) o trasfezione mCherry coltivati per 7 giorni (vedere passaggio 1).
2. Raffreddare un tubo di microcentrifuga da 1,5 mL contenente una miscela 1:1 di gel a matrice e DMEM/F12 sul ghiaccio prima dell'uso. Digerire le sfere LGSC in singole celle e risospescere le cellule ad una densità di 2 × 10⁶ celle / mL nel tubo.
3. Anestetizzare i topi NOD/ShiLtJ mediante iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodico (50 mg/kg).
   NOTA: il topo NOD / ShiLtJ è un modello ideale con sintomi aggiunti idiopatici, tra cui ridotta secrezione lacrimale, infiltrazione infiammatoria e ulcerazione orbitale.
4. Dopo l'anestesia, utilizzare un unguento salino o veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza, quindi utilizzare forbici oftalmiche per effettuare un taglio di 5-8 mm nella pelle dietro l'orecchio (vicino all'occhio) dei topi anestetici per esporre i LG.
   NOTA: Iodophor deve essere rigorosamente utilizzato per la disinfezione intorno all'incisione.
5. Iniettare 2 × 10⁴ celle nell'LG sinistro e iniettare la miscela senza cellule (vedere il punto 11.2) nell'LG sul lato destro come controllo.
6. Dopo l'iniezione, riportare gli LG alle loro posizioni originali con pinze oftalmiche e suturare la ferita. Nutrire i topi per 2 mesi e osservare l'effetto del trattamento.
   NOTA: anche il materiale del cuscino della gabbia deve essere rigorosamente sterilizzato dopo l'operazione e il materiale del cuscino deve essere sostituito una volta al giorno. Dopo aver suturato la ferita, il tramadolo può essere iniettato selettivamente nella vena della coda dei topi alla dose standard di 2,5 mg / kg per ottenere l'analgesia.
7. Anestetizzare questi topi 2 mesi dopo l'esperimento (vedere il passo 11.3). Filmare i sintomi della regione oculare.
   1. Durante l'anestesia, cercare i seguenti sintomi: rilassamento muscolare del collo e degli arti; respirazione profonda, lenta e costante; restringimento della pupilla; scomparsa del riflesso corneale.
   2. Durante l'anestesia e il funzionamento, mantenere la temperatura corporea dei topi a 37 °C. Dopo l'intervento chirurgico, aggiungere antibiotici appropriati all'acqua potabile per i topi per ridurre il rischio di infezione della ferita. Non lasciare i topi incustoditi fino a quando non hanno riacquistato una coscienza sufficiente per mantenere la reclinazione sternale. Non restituire i topi che hanno subito un intervento chirurgico alla compagnia di altri topi fino a quando non sono completamente guariti.
   3. Dopo aver filmato i sintomi della regione oculare, aprire il software ImageJ, fare clic su File | Apri | Selezioni a mano libera, tenere premuto il pulsante sinistro del mouse e selezionare l'area di ulcerazione orbitale nell'immagine. Clicca su Analizza | Misurare per ottenere l'area relativa di ulcerazione.
8. Metti il filo di cotone rosso fenolo sul canto laterale dei topi anestetici per 10 s; misurare e registrare la lunghezza della parte scolorita del filo di cotone. Eutanasia dei topi mediante lussazione della vertebra cervicale dopo la misurazione delle lacrime.
9. Sezionare i topi e ottenere gli LG per l'analisi IHC.

12. Isolamento dell'RNA

NOTA: Prima dell'esperimento, preraffreddare la centrifuga a 4 °C e garantire che tutti i reagenti e i materiali di consumo siano esenti da contaminazione da RNAsi.

1. Raccogli frammenti LGSC o LG in un tubo microcentrifuga. Aggiungere 1 mL di tampone di lisi cellulare e lisare completamente le cellule o i tessuti mediante oscillazione del vortice.
2. Aggiungere 0,2 ml di cloroformio e lasciarlo riposare a temperatura ambiente per 10 minuti dopo l'oscillazione del vortice per 1 minuto. Centrifuga per 15 min a 4 °C, 12.000 × g.
   NOTA: Dopo la centrifugazione, il liquido viene diviso in tre strati e l'RNA si trova nella fase acquosa trasparente superiore.
3. Pipettare con cura la fase acquosa trasparente superiore e trasferirla in un nuovo tubo centrifugo da 1,5 mL privo di RNA.
4. Aggiungere un volume uguale di alcol isopropilico e mescolare delicatamente. Lasciare riposare la miscela a temperatura ambiente per 10 minuti e poi centrifugare per 15 minuti a 4 °C, 12.000 × g.
5. Rimuovere il surnatante e aggiungere 1 ml di etanolo al 75%. Capovolgere il tubo per lavare il pellet e centrifugare per 5 minuti a 4 °C, 7.500 × g. Ripetere questo passaggio.
6. Rimuovere con cura il surnatante e mettere il tubo della centrifuga nel banco da lavoro ultrapulito per asciugarlo per circa 20 minuti.
   NOTA: Procedere al passaggio successivo quando il pellet bianco diventa traslucido. Eseguire tutte le operazioni sul ghiaccio.
7. Aggiungere 20 μL di acqua priva di RNAsi per sciogliere completamente il pellet. Misurare la concentrazione di RNA utilizzando uno spettrofotometro (vedere la Tabella dei materiali) e conservare la soluzione di RNA a -80 °C.

13. PCR

1. Reazione di trascrizione inversa
   1. Aggiungere 1 μg di RNA totale (calcolare il volume della soluzione di RNA aggiunta in base alla concentrazione della soluzione di RNA) nella sonda di reazione PCR e incubare a 65 °C per 5 minuti per la denaturazione.
   2. Metterlo sul ghiaccio per 1 minuto e poi aggiungere acqua priva di enzimi fino a quando il volume totale raggiunge i 12 μL. Aggiungere 4 μL di 4x DNA Master Mix e incubarlo a 37 °C per 5 min.
   3. Mettere il tubo sul ghiaccio, aggiungere 4 μL di 5x RT Master Mix e mescolare delicatamente. Impostare le seguenti impostazioni PCR: 37 °C per 15 min, 50 °C per 5 min, 98 °C per 5 min, 4 °C per 1 min.
   4. Conservare a -20 °C o procedere al passaggio successivo dopo che la reazione di trascrizione inversa è stata completata.
2. Reazione PCR
   1. Preparare la reazione PCR nel tubo PCR come segue: 14,1 μL di acqua priva di enzimi, 2 μL di dNTP, 2 μL di tampone 10x, 0,8 μL di primer (10 μM, 0,4 μL di primer in avanti e 0,4 μL di primer inverso, fare riferimento alla tabella dei materiali), 1 μL di cDNA a trascrizione inversa (fare riferimento al passo 13.1) e 0,1 μL dell'enzima Taq.
   2. Posizionare la reazione PCR preparata nell'apparato PCR per pcr. Fare riferimento alle istruzioni del kit enzimatico Taq per la procedura PCR (vedere la Tabella dei materiali).
3. Elettroforesi su gel di agarosio
   1. Utilizzare una bilancia analitica per pesare 242 g di Tris e 37,2 g di Na₂EDTA·2H₂O e aggiungerli a un becher da 1 L. Aggiungere ~ 800 ml di acqua deionizzata e 57,1 mL di acido acetico glaciale al becher, mescolare bene, aggiungere acqua deionizzata a 1 L per ottenere 50x tampone TAE e conservarlo a temperatura ambiente.
      NOTA: Tampone TAE diluito 50x con acqua deionizzata prima dell'uso.
   2. Utilizzare una bilancia analitica per pesare 1,2 g di agarosio e aggiungerla a un matraccio conico contenente 80 ml di 1 tampone TAE. Riscaldarlo ripetutamente nel forno a microonde fino a completa dissoluzione.
   3. Raffreddare il matraccio sotto l'acqua corrente del rubinetto fino a quando la temperatura della soluzione scende a 60 °C. Aggiungere 8 μL di macchia di acido nucleico, versare la soluzione nel serbatoio di gelatinizzazione dopo aver mescolato bene, posizionare il pettine e lasciarlo riposare a temperatura ambiente per 30 minuti.
   4. Estrarre il pettine e caricare i prodotti PCR nel gel di agarosio preparato. Eseguire elettroforesi a 120 V per 30 min.
   5. Posizionare il gel nel sistema di imaging ECL Gel e fotografare.

Stabilire un sistema di coltura 3D privo di siero
In questo studio, È stato sviluppato LGSCM contenente EGF, Wnt3A, FGF10 e Y-27632 per LGSC di topo e le LGSC sono state isolate e coltivate con successo con un metodo di coltura 3D (Figura 1A). Un sistema di coltura 3D 3D privo di siero di successo di LGSC da topi C57BL / 6, topi NOD / ShiLtJ, topi BALB / c e topi ROSA26mT / mG è stato stabilito utilizzando questo metodo16. Per un topo maschio, 1,5-2 × 106 cellule sono state ottenute da due LG per dissociazione. Dopo una settimana di coltura, si sono formate 30-60 sfere durante la semina di 1 × 104 cellule LG all'inizio della coltura. Inoltre, le cellule coltivate con questo metodo hanno espresso Epcam, Krt5, Krt14, P63, nestina e altri marcatori di cellule staminali16, indicando che le cellule ottenute avevano le proprietà delle LGSC. Krt14 e Ki67 sono stati espressi in tutte le sfere formate da LGSC coltivate per 7 giorni (Figura 1B), indicando che le LGGC avevano capacità di auto-rinnovamento.

Durante una coltura di 7 giorni, le sfere LGSC hanno raggiunto un diametro di 100 μm. La colorazione di ematossilina ed eosina (H & E) ha mostrato cellularità al giorno 7 (Figura 1C e Figura 1F). I fattori di arricchimento delle LGSC ottenute dopo 7 giorni di coltura primaria e sottocultura hanno indicato che le LGSC arricchite da questo metodo avevano una forte capacità proliferativa (Figura 1D). In questo sistema, le LGSC potevano essere passate oltre 40 volte e mantenevano ancora le caratteristiche delle cellule staminali (Figura 1E e Figura 1G). In conclusione, questo documento descrive un protocollo per stabilire un sistema di coltura 3D privo di siero per LGSC in vitro. Le cellule coltivate con questo protocollo hanno capacità proliferativa continua e stabile.

Indurre il differenziamento in vitro
È stata analizzata la capacità di differenziazione delle LGSC in vitro . Quando coltivate per più di 7 giorni, le LGSC hanno gradualmente perso capacità di crescita e l'espressione di AQP5, Ltf, Krt19 e altri marcatori associati alla differenziazione è aumentata, mentre l'espressione di Krt14 è gradualmente diminuitadi 16. Le LGSC sono state indotte a formare più gemme da FBS e una bassa percentuale di gel della matrice (Figura 2A, B). Inoltre, la colorazione H & E ha indicato che FBS potrebbe indurre le sfere a produrre più strutture cavitanti (Figura 2C).

Il lavoro precedente suggeriva che la diminuzione della durezza della matrice promuoveva la differenziazione delle LGSC in organoidi duttali. Le cellule dello strato basale hanno mantenuto le caratteristiche delle cellule staminali che esprimono Krt14, mentre le cellule dello strato superiore basale si sono differenziate in strutture simili a condotti con cavità ed hanno espresso Krt19. Inoltre, l'aggiunta di FBS potrebbe indurre la differenziazione delle LGSC in organoidi acinosi, che mantengono le caratteristiche delle cellule staminali con un elevato rapporto nucleare/citoplasmatico. Alcune cellule acinari differenziate hanno espresso alti livelli di AQP5 con un basso rapporto nucleare/citoplasmatico16.

 Riparazione LGSC  in vivo
Sulla base degli esperimenti di cui sopra, la capacità delle LGSC di riparare IG danneggiati è stata esplorata mediante iniezione ortotopica. Dopo l'iniezione ortotopica di ROSA-LGSC in topi NOD/ShiLtJ, si sono formati nuovi lobuli lacrimali adiacenti agli LG (Figura 3A-C). La maggior parte dei lobuli erano composti da cellule acinari mature con alta espressione di AQP5 e c'era formazione di dotti intralobulari con bassa espressione di AQP5 (Figura 3D-F). Dopo l'iniezione di ROSA-LGSC per 8 settimane, è stato misurato il decadimento intorno all'orbita dei riceventi. Le misurazioni hanno indicato che l'iniezione di LGSC ha ridotto l'area di decadimento di ~ 60% (Figura 3G, H). La dissezione ha mostrato che il volume LG è aumentato dopo l'iniezione per 10 settimane (Figura 3I). La quantità di secrezione lacrimale sul lato di iniezione ROSA-LGSC era superiore a quella sul lato di controllo, ma inferiore rispetto ai topi wild-type (Figura 3J). Questi risultati indicano che le cellule raccolte da questo sistema di coltura hanno le caratteristiche delle LGSC e possono essere utilizzate per la terapia con cellule staminali nei topi con ADDED e xerophthalmia.

Figura 1: Isolamento e caratterizzazione delle LGSC. (A) La strategia della cultura di passaggio primario e continuo LGSC. (B) Colorazione immunofluorescenza delle LGSC al giorno 7. Le LGSC esprimono il marcatore delle cellule epiteliali E-caderina (rosso), il marcatore delle cellule staminali Krt14 (rosso), il marcatore cellulare proliferativo Ki67 (rosso). Controcolore, DAPI (blu). (C) La morfologia delle LGSC in coltura per 1, 3, 5 e 7 giorni. (D) Fattore di arricchimento relativo della cultura LGSC nella cultura primaria e nella sottocultura. Il fattore di arricchimento relativo è il rapporto tra il numero totale di cellule ottenute dopo 7 giorni di coltura e il numero di cellule seminate in coltura. P < 0,01. (E) Trascrizione di marcatori di cellule staminali/progenitrici adulte del topo LG e diversi LGSC di passaggio (P1, P10, P20 e P40). (F) La morfologia (a sinistra) e la colorazione H&E (a destra) delle LGSC in coltura primaria al giorno 7. (G) LGSC coltivate in diversi passaggi (P1, P10, P20 e P40). Barre di scala = 50 μm (B, F, G), 100 μm (C). Abbreviazioni: LG = ghiandola lacrimale; LGSC = cellule staminali LG; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo;; NC = controllo negativo; TE = tripsina-EDTA; H&E = ematossilina ed eosina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Differenziazione delle LGSC in vitro. (A,B) Morfologia delle LGSC coltivate in mezzo normale o in mezzo di differenziazione. (A) LGSC coltivate per 10 giorni in P10 (a sinistra: mezzo normale, a destra: terreno contenente FBS). (B) LGSC coltivate per 14 giorni in P31 (a sinistra: mezzo normale, a destra: medio con 1/3di gel di matrice). (C) Colorazione H&E delle LGSC coltivate per 14 giorni (in alto: medio normale, in basso: mezzo contenente FBS). Barre di scala = 100 μm (A), 200 μm (B), 50 μm (C). Abbreviazioni: LG = ghiandola lacrimale; LGSC = cellule staminali LG; H&E = ematossilina ed eosina; FBS = siero bovino fetale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Attecchimento dell'allotrapianto di LGSC e sollievo dai sintomi AGGIUNTI. (A-F) Colorazione IHC di NOD/ShiLtJ LG trapiantata con colture a 7 giorni di ROSA-LGSC dopo 8 settimane. Utilizzare i lati sinistro e destro dello stesso mouse del gruppo sperimentale e del gruppo di controllo. (A-C) Colorazione IHC con anticorpo anti-td-Tomato; (D-F) Colorazione IHC con anticorpo anti-AQP5; (A, D) LG iniettato con veicolo (miscela 1:1 di gel di matrice e DMEM/F12), (B, E) LG iniettato con ROSA-LGSC, (C, F) le immagini ingrandite dei quadrati neri in B, E (freccia rossa, dotto intralobulare). (G, H) La condizione dell'orbita dell'occhio del topo NOD/ShiLtJ dopo l'iniezione di ROSA-LGSC a 8 settimane. L'iniezione di LGSC allevia significativamente il decadimento intorno all'orbita oculare. (I) LG del mouse NOD/ShiLtJ a 10 settimane (a sinistra: LG dal lato iniettato dalla cella, a destra: LG dal lato di controllo). (J) Volume lacrimale di topi wild-type e NOD/ShiLtJ trapiantati con colture a 7 giorni di ROSA-LGSC dopo 8 settimane. Il volume di strappo degli LG iniettati da ROSA-LGSC è superiore a quello degli LG di controllo ma significativamente inferiore a quello dei LG WT. n = 3; Topi NOD/ShiLtJ, n = 4; P < 0,01; *P < 0,05. Barre di scala = 50 μm (A-F). Abbreviazioni: LG = ghiandola lacrimale; LGSC = cellule staminali LG; IHC = immunoistochimico; WT = wild-type; AGGIUNTO = malattia dell'occhio secco carente di acquosità. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.