Summary
Le présent protocole décrit l’étude des interactions neutrophiles-biofilm. Les biofilms de Staphylococcus aureus sont établis in vitro et incubés avec des neutrophiles humains dérivés du sang périphérique. La réponse oxydative des neutrophiles est quantifiée et la localisation des neutrophiles dans le biofilm est déterminée par microscopie.
Abstract
Les neutrophiles sont la première ligne de défense déployée par le système immunitaire lors d’une infection microbienne. In vivo, les neutrophiles sont recrutés sur le site de l’infection où ils utilisent des processus tels que la phagocytose, la production d’espèces réactives d’oxygène et d’azote (ROS, RNS, respectivement), NETosis (piège extracellulaire des neutrophiles) et la dégranulation pour tuer les microbes et résoudre l’infection. Les interactions entre les neutrophiles et les microbes planctoniques ont été largement étudiées. Il y a eu de nouveaux intérêts dans l’étude des infections causées par les biofilms au cours des dernières années. Les biofilms présentent des propriétés, y compris une tolérance à la destruction par les neutrophiles, distinctes de leurs homologues cultivés en plancton. Avec l’établissement réussi de modèles de biofilm in vitro et in vivo , les interactions entre ces communautés microbiennes avec différentes cellules immunitaires peuvent maintenant être étudiées. Ici, les techniques qui utilisent une combinaison de modèles traditionnels de biofilm et de tests d’activité des neutrophiles bien établis sont spécialement conçues pour étudier les interactions entre les neutrophiles et le biofilm. La microscopie à fluorescence à grand champ est utilisée pour surveiller la localisation des neutrophiles dans les biofilms. Ces biofilms sont cultivés dans des conditions statiques, suivis de l’ajout de neutrophiles dérivés du sang périphérique humain. Les échantillons sont colorés avec des colorants appropriés avant d’être visualisés au microscope. De plus, la production de ROS, qui est l’une des nombreuses réponses des neutrophiles contre les agents pathogènes, est quantifiée en présence d’un biofilm. L’ajout de cellules immunitaires à ce système établi permettra d’élargir la compréhension des interactions hôte-pathogène tout en assurant l’utilisation de conditions normalisées et optimisées pour mesurer ces processus avec précision.
Introduction
Un biofilm est une communauté de microbes associés à la surface ou d’agrégats non attachés enfermés dans une substance polymère extracellulaire (EPS)1,2. Ces communautés protègent les micro-organismes enfermés des facteurs de stress environnementaux, y compris la tolérance aux agents antimicrobiens et au système immunitaire3. Plusieurs espèces microbiennes pathogènes forment des biofilms qui ont été associés à des infections chroniques4. Le développement de biofilms est un processus complexe impliquant la fixation aux surfaces, la production d’EPS, la prolifération cellulaire, la structuration du biofilm et le détachement cellulaire5. Une fois que les cellules se dispersent pour former un biofilm, elles restent planctoniques ou se transloquent vers un nouveau substrat et relancent le développement du biofilm6.
Staphylococcus aureus, un pathogène opportuniste, suit un schéma général de développement du biofilm, y compris la fixation, la prolifération, la maturation et la dispersion7. Le processus de fixation dans les biofilms de S. aureus est dicté par les interactions hydrophobes, les acides teichoïques et les composants de surface microbiens reconnaissant les molécules de matrice adhésive (MSCRAMM)8,9. Alors que la prolifération de S. aureus commence, l’EPS, qui se compose principalement de polysaccharides, de protéines, d’ADN extracellulaire et d’acides teichoïques, est produit5. Au fur et à mesure que les composants EPS sont produits, diverses exoenzymes et petites molécules sont également produites, contribuant à la structure 3 dimensions du biofilm et aidant au détachement5. S. aureus profite de ce mode de vie hautement coordonné pour établir diverses infections chroniques, y compris des infections dues à l’habitation de dispositifs médicaux10.
Le S. aureus résistant à la méthicilline (SARM) est l’une des principales causes d’infections liées aux dispositifs médicaux à demeure, tels que les cathéters veineux et urinaires centraux, les prothèses articulaires, les stimulateurs cardiaques, les valves cardiaques mécaniques et les dispositifs intra-utérins11. Au cours de telles infections, les neutrophiles sont les premières cellules immunitaires hôtes recrutées sur le site d’infection pour combattre les agents pathogènes via de multiples stratégies12. Il s’agit notamment de la phagocytose, de la dégranulation, de la production d’espèces réactives de l’oxygène et de l’azote (ROS/RNS) ou de la libération de pièges extracellulaires à neutrophiles (TNE) pour éliminer les agents pathogènes13.
La génération de ROS lors de la phagocytose des microbes est l’une des principales réponses antimicrobiennes présentées par les neutrophiles14. La phagocytose est améliorée si les microbes sont enrobés d’opsonines, en particulier d’immunoglobulines et de composants du complément présents dans le sérum15. Les microbes opsonisés sont ensuite reconnus par les récepteurs de surface cellulaire sur les neutrophiles et engloutis, formant un compartiment appelé phagosome15. Les neutrophiles génèrent et libèrent des ROS dans le phagosome via la NADPH-oxydase16 associée à la membrane. Ce complexe enzymatique multi-composants génère des anions superoxydes en transférant des électrons à l’oxygène moléculaire16. De plus, les neutrophiles génèrent également du RNS par l’expression de l’oxyde nitrique synthase inductible (iNOS)17. Ces radicaux riches en superoxyde et en oxyde nitrique dans le phagosome ont de vastes activités antimicrobiennes. Ils peuvent interagir avec les centres métalliques dans les enzymes et endommager les acides nucléiques, les protéines et les membranes cellulaires de l’agent pathogène 18,19,20,21. De nombreux microbes adoptent un mode de vie de biofilm et emploient différentes stratégies pour échapper à la mise à mort par ROS22,23. Ainsi, les tests standardisés qui couplent les biofilms avec les neutrophiles pour quantifier les ROS sont bénéfiques pour des résultats cohérents.
Alors que les essais, tels que la quantification de la production de ROS de neutrophiles, fournissent des informations sur les réponses des neutrophiles aux biofilms, la capacité de visualiser les interactions des neutrophiles dans un biofilm peut également servir d’outil puissant. L’utilisation de colorants fluorescents pour la microscopie nécessite souvent une optimisation pour obtenir des images de haute qualité pouvant être utilisées pour l’analyse d’imagerie microscopique. La flexibilité pour optimiser certaines conditions est limitée car les neutrophiles peuvent subir la mort cellulaire après l’isolement. De plus, les biofilms sont généralement lavés pour éliminer la population planctonique de la configuration expérimentale avant l’ajout de neutrophiles. Pendant le lavage, une variabilité entre les biofilms répliqués peut survenir en raison de la perte de biomasse partielle si les biofilms adhèrent faiblement à la surface.
De manière générale, les méthodes actuelles dans le domaine pour analyser les interactions entre les neutrophiles et les biofilms comprennent principalement la microscopie, la cytométrie en flux et le dénombrement des unités formant des colonies (UFC)24,25,26,27. La microscopie implique l’utilisation de colorants qui colorent directement les neutrophiles et les biofilms, ou ciblent diverses réponses des neutrophiles contre les microbes telles que la formation de TNE, la dégranulation et la mort cellulaire25,28. Un sous-ensemble de ces réponses, telles que la mort et la dégranulation des cellules neutrophiles, peut également être analysé par cytométrie en flux, mais nécessite que les neutrophiles soient préférentiellement non associés à de grands agrégats de microbes dans un biofilm28,29. La cytométrie de flux permet également de quantifier certains paramètres du biofilm, tels que la viabilité cellulaire27. Ces processus, cependant, nécessitent une perturbation de la biomasse du biofilm et ne seraient pas utiles pour visualiser d’autres interactions importantes telles que la distribution spatiale des neutrophiles et de leurs composants dans un biofilm27,29,30.
Le présent protocole se concentre sur l’adaptation de certaines des méthodes traditionnellement utilisées pour étudier les interactions neutrophiles-biofilm sur des biofilms qui ont été optimisées pour fournir une variabilité minimale pendant la manipulation. Ce protocole fournit donc des méthodes standardisées pour cultiver et quantifier des biofilms, isoler les neutrophiles humains primaires du sang périphérique, quantifier la production de ROS et visualiser les interactions biofilm-neutrophiles par microscopie. Ce protocole peut être adapté à différents systèmes pour comprendre les interactions biofilm-neutrophiles tout en tenant compte de l’hétérogénéité entre les bassins de donneurs.
Protocol
Toutes les procédures ont été approuvées par l’Ohio State University Institutional Review Board (IRB) (2014H0154). Le consentement écrit éclairé a été obtenu de tous les donneurs pour le prélèvement de sang périphérique afin d’isoler les neutrophiles humains primaires. Staphylococcus aureus (USA300 LAC)31 a été utilisé comme organisme modèle pour effectuer les expériences. Les expériences ont été réalisées avec un équipement de protection individuelle (EPI) approprié en raison d’une exposition potentielle à un agent pathogène transmissible par le sang.
1. Préparation du biofilm in vitro
- Obtenir des colonies isolées de S. aureus à partir d’un stock cryoconservé 31 en utilisant une technique de plaque de stries32,33 sur une plaque de gélose riche en nutriments, comme la gélose de soja tryptique (voir le tableau des matériaux).
- Enduire les puits individuels d’une plaque de 96 puits avec 100 μL de poly-L-lysine (PLL) à 0,001 % (v/v) diluée dans duH2Ostérile et incuber à température ambiante pendant 30 min. Aseptiquement, aspirer la solution PLL à l’aide d’un piège d’aspiration assisté par le vide. Laissez les puits sécher pendant la nuit à température ambiante.
REMARQUE: Toutes les étapes d’aspiration du protocole sont effectuées à l’aide d’un piège à aspiration assisté par le vide, sauf indication contraire. - Préparer une culture de nuit en inoculant une colonie de S. aureus dans un milieu alpha essentiel minimal (MEMα) supplémenté en glucose à 2% et incuber à 37 °C, en agitant à 200 rpm pendant 16-18 h.
- Diluer la culture pendant la nuit en transférant 50 μL à 5 mL de MEMα frais additionné de glucose à 2 % et incuber à 37 °C, en agitant à 200 tr/min, jusqu’à la phase logarithmique moyenne, généralement entre une densité optique de 600 (DO600 nm) de 0,5 à 0,8. Utilisez MEMα pour normaliser la culture logarithmique moyenne à une OD de600 nm de 0,1.
- Transférer 150 μL de culture normalisée dans chaque puits de la plaque de 96 puits traitée par la LPL. Incuber statiquement pendant 18-20 h dans une chambre humidifiée à 37 °C.
REMARQUE: Les biofilms peuvent également être cultivés dans d’autres formats tels que les lames à μ canaux (voir le tableau des matériaux). - Aspirer le surnageant pour éliminer les cellules planctoniques. Lavez délicatement la biomasse restante avec 150 μL de solution saline équilibrée (HBSS) de Hanks pour éliminer les cellules non attachées. Ajoutez HBSS goutte à goutte pour éviter de perturber le biofilm.
REMARQUE: Lors de l’aspiration du surnageant et du HBSS pendant les lavages, laissez juste assez de liquide (surnageant ou HBSS) dans les puits contenant le biofilm de sorte que le biofilm soit encore immergé. Cela empêche la perturbation de la structure du biofilm lorsque HBSS est ajouté goutte à goutte pour laver le biofilm. - Répétez l’étape 1.6 au moins deux fois de plus pour retirer toutes les cellules planctoniques. À ce stade, les biofilms sont prêts pour des expériences immédiates en aval.
REMARQUE: Si les biofilms ne sont pas utilisés pour les expériences sur les neutrophiles, HBSS peut être remplacé par une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). L’HBSS est préféré au PBS car l’HBSS contient des composants, y compris le glucose, qui fournissent des conditions optimales pour l’activation des neutrophiles34.
2. Quantification de la biomasse du biofilm
- Préparer un stock de solution de violet cristallin (CV) à 0,1 % (p/v) (voir le tableau des matières) en le dissolvant dans de l’éthanol à 20 % (v/v) et dans du H 2O à 80 % (v/v). Assurez-vous que le CV est complètement dissous dans de l’éthanol avant d’ajouter H2O. Stériliser la solution par filtre.
- Ajouter 150 μL de solution CV à 0,1% au biofilm lavé et incuber pendant 20 min à température ambiante. Utiliser au moins trois puits vides comme contrôles multimédias seulement.
- Aspirer la solution CV à 0,1% des biofilms et laver les biofilms colorés avec 200 μL de 1x PBS. Répétez ce processus pendant un total de trois lavages pour éliminer tout excès de CV des puits.
- Ajouter 150 μL d’acide acétique glacial à 33 % (v/v) dilué avecH2O. Incuber à température ambiante sur une bascule à 50 rpm pendant 30 min pour permettre au CV lié à la biomasse de se dissoudre complètement.
ATTENTION : Effectuez cette étape dans une hotte à flux laminaire avec EPI approprié car l’acide acétique glacial est un produit chimique corrosif. - En attendant, configurez le lecteur de microplaques (voir le tableau des matériaux) pour lire les valeurs de coloration CV. Après le traitement à l’acide acétique glacial, lire la plaque à une longueur d’onde de 595 nm.
REMARQUE: La longueur d’onde utilisée pour mesurer la DO de CV peut aller de 500 à 600 nm35.
3. Isolement des neutrophiles
NOTE: Les neutrophiles ont été isolés selon une méthode publiée précédemment avec des modifications mineures36. Ce protocole d’isolement combine d’abord la centrifugation par gradient de densité, suivie d’une sédimentation de 3% de dextrane. Cette section ne couvre que le protocole global d’isolement des neutrophiles, en se concentrant sur les modifications apportées au protocole publié. De plus, le protocole décrit ci-dessous est l’une des nombreuses méthodes qui peuvent isoler les neutrophiles et peuvent être substituées au besoin. D’autres méthodes d’isolement des neutrophiles comprennent l’utilisation de milieux de séparation cellulaire ou de séparation cellulaire d’anticorps magnétiques37.
- Prélever du sang d’un donneur adulte par ponction veineuse, conformément au protocole décrit dans la CISR de l’établissement. Avant la prise de sang, assurez-vous que la seringue contient suffisamment d’héparine sans agent de conservation, de sorte que la concentration finale d’héparine soit de 20 U/mL.
- Diluer le sang hépariné avec les 3/4 du volume de NaCl à 0,9 % exempt d’endotoxines (voir tableau des matières) dansH2Oà température ambiante.
- Pour chaque tranche de 20 mL de l’échantillon de sang dilué, aliquote de 14 mL d’un milieu de gradient de densité disponible dans le commerce (voir le tableau des matières) dans un tube conique frais de 50 mL. Déposer soigneusement l’échantillon de sang dilué sur le milieu de gradient de densité.
- Centrifuger l’échantillon de sang stratifié à 400 x g pendant 40 min à température ambiante. Assurez-vous que la centrifugeuse a une rupture lente pour éviter de perturber la couche une fois la centrifugation terminée.
REMARQUE: L’échantillon de sang aura cinq couches contenant un mélange de solution saline et de plasma, une couche cellulaire mononucléaire, un milieu de gradient de densité, des neutrophiles et des érythrocytes. - À l’aide d’une pipette sérologique, aspirer toutes les couches au-dessus des neutrophiles et de la pastille érythrocytes, suivie d’une remise en suspension douce de la pastille dans du NaCl froid exempt d’endotoxines à 0,9% dansH2O. Pour chaque pastille produite à partir d’un échantillon de sang de 20 mL, remettre la pastille en suspension à 20 mL de volume total. Ajouter 1:1 volume de 3 % de dextrane (voir le tableau des matières). Incuber le tube à la verticale pendant 18-20 min sur la glace.
NOTE: Assurez-vous que le dextrane à 3% est fabriqué avec 0,9% de NaCl sans endotoxines dans H2O. - Retirer 20 mL de la couche supérieure contenant les neutrophiles et certains érythrocytes sur un nouveau tube conique de 50 mL et centrifuger à 355 x g pendant 10 min à 4 °C. Versez le surnageant en laissant derrière lui une pastille rouge.
- Remettez doucement la pastille en suspension dans 10 mL deH2Ofroid et stérile pendant 30 s pour lyser les érythrocytes restants. Ajouter immédiatement 10 mL de solution saline froide à 0,9 % sans endotoxines au mélange pour rétablir la tonicité. Centrifuger la solution à 233 x g pendant 3 min à 4 °C.
- Verser le surnageant et remettre en suspension la pastille contenant 95 % à 97 % de neutrophiles dans 1 mL de HBSS froid par 20 mL d’échantillon de sang.
- Transférer 10 μL des neutrophiles en suspension dans 90 μL de colorant d’exclusion bleu trypan à 0,4 % et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre (voir le tableau des matériaux).
REMARQUE: Les cellules non viables sont colorées en bleu car le colorant d’exclusion bleu trypan est imperméable dans les cellules viables. Ce protocole assure >99% de viabilité cellulaire37,38. - Ajouter du HBSS supplémentaire de telle sorte que la concentration finale de neutrophiles soit de 4 x 106 cellules/mL.
REMARQUE : Dans les cas où la viabilité cellulaire est de <99 %, la concentration finale de 4 x 106 cellules/mL peut encore être atteinte; cependant, le volume total de solution contenant 4 x 106 cellules/mL obtenu diminuera. La concentration finale des neutrophiles peut être ajustée en fonction des besoins expérimentaux de l’utilisateur. Les neutrophiles ont été remis en suspension à une concentration finale de 4 x 106 cellules/mL pour toutes les expériences décrites ci-dessous. Pour tenir compte de la variabilité d’un donneur à l’autre, il est fortement recommandé que toutes les expériences impliquant des neutrophiles soient effectuées avec au moins trois donneurs différents.
4. Mesure des ROS produites par les neutrophiles
- Ajouter 100 μL de sérum humain normal à 20 % (dilué dans HBSS) goutte à goutte au biofilm lavé (étape 1.6) et incuber à 37 °C en condition statique pendant 30 min pour opsoniser le biofilm.
- Aspirer la solution de sérum à 20% et laver les biofilms goutte à goutte avec 150 μL de HBSS une fois. Aspirer le HBSS, laissant derrière lui des puits avec des biofilms opsonisés.
NOTE: Pour l’interprétation de l’expérience, un minimum de quatre groupes est recommandé: (A) Neutrophiles + Biofilm, (B) Neutrophiles + PMA (témoin positif, voir Tableau des matériaux), (C) Neutrophiles seulement, et (D) Biofilm seulement. - Ajouter du luminol (voir le tableau des matières) aux neutrophiles remis en suspension dans le HBSS à une concentration de 4 x 106 cellules/mL de telle sorte que la concentration finale de luminol soit de 50 μM. Cette solution est prête à l’emploi pour les groupes (A) et (C). Ajouter 4 x 105 neutrophiles mélangés avec du luminol dans les puits avec des biofilms opsonisés.
- Dans un tube séparé, préparer une solution de luminol 50 μM dans HBSS sans aucun neutrophile et l’ajouter au biofilm contenant bien (groupe D).
- Aliquote 350 μL de neutrophiles mélangés avec du luminol et ajouter du phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) à une concentration finale de 500 ng / mL au mélange. Pour le groupe (B), ajouter 4 x 105 neutrophiles de ce mélange dans des puits sans biofilm. Cela sert de contrôle positif.
NOTE: La concentration de PMA indiquée dans cette étape est relativement élevée pour assurer une réponse robuste en rafale car les neutrophiles stimulés par la PMA sont un témoin positif. La PMA peut être utilisée à une concentration plus faible pour activer les neutrophiles, selon l’expérience. - Centrifuger la plaque à 270 x g pendant 30 s à 4 °C.
- Assurez-vous que le lecteur de plaques est réglé à 37 °C avec le réglage de la luminescence et de la lecture cinétique pendant 60 minutes à intervalles de 3 minutes. Placer la plaque dans le lecteur de plaques pour mesurer la production de ROS par les neutrophiles pendant 60 min.
NOTE: Pour ce test, les biofilms ont été cultivés dans des plaques blanches utilisées pour les essais de luminescence. La PMA est un agoniste connu de la réponse oxydative en rafale39. Lorsque vous effectuez des études impliquant de la PMA, assurez-vous que la PMA est ajoutée à l’étape finale pendant que la solution contenant les neutrophiles est froide, car la PMA déclenche immédiatement la réponse en rafale.
5. Imagerie des interactions biofilm-neutrophiles
- Configurez un biofilm en suivant les étapes 1.2 à 1.6. Pour faciliter l’imagerie du biofilm, utilisez une souche fluorescente de S. aureus, telle que USA300 exprimant la protéine fluorescente verte (GFP)40,41, pour faciliter l’imagerie microscopique.
REMARQUE : Une lame à 6 canaux μ canaux (voir le tableau des matériaux) a été utilisée au lieu d’une plaque de 96 puits pour démontrer le modèle de biofilm in vitro (étape 1). - Incuber 4 x 106 cellules/mL de neutrophiles avec 100 μM de colorant CMAC bleu (7-amino-4-chlorométhylcoumarine) (BCD, voir le tableau des matériaux) pendant 30 min dans une bascule à 37 °C et 5% CO2. Assurez-vous que les échantillons sont incubés dans l’obscurité et limitez l’exposition à la lumière pour les étapes restantes.
- Pour laver l’excès de BCD, centrifuger les neutrophiles à 270 x g pendant 5 min et aspirer le surnageant. Remettez les neutrophiles en suspension dans du HBSS frais. À ce stade, ajouter de l’homodimère-1 d’éthidium (voir le tableau des matériaux) aux neutrophiles colorés au BCD à une concentration finale de 4 μM pour surveiller la mort des neutrophiles et des bactéries.
- Ajouter 150 μL de neutrophiles au biofilm de S. aureus qui a été cultivé en lames μ, de sorte que le rapport neutrophiles / bactéries soit de 1:30 (neutrophiles: bactéries). Incuber les lames μ dans une chambre humidifiée pendant 30 min. Le nombre de cellules bactériennes est basé sur le nombre de cellules obtenues en plaquant un biofilm de 18 h.
- Imagez l’interaction neutrophiles-biofilm à l’aide de canaux fluorescents correspondant aux longueurs d’onde d’excitation et d’émission des colorants/protéines fluorescents.
REMARQUE : Pour la présente étude, la BCD est de 353/466 nm, l’homodimère-1 d’éthidium est de 528/617 nm et la GFP est de 395/509 nm. Limiter l’exposition de l’échantillon au laser ou à la lumière pour éviter le photoblanchiment des échantillons. - Analysez les images à l’aide de logiciels ou de programmes d’analyse d’images de microscopie tels que FIJI / ImageJ, COMSTAT2, BiofilmQ et BAIT, parmi beaucoupd’autres 42,43,44,45.
REMARQUE: Lorsque vous travaillez avec des taches, il est important de tenir compte de la spécificité des colorants utilisés. Certaines colorations agissent sur les cellules procaryotes et eucaryotes, tandis que d’autres ne fonctionnent que sur une seule. Si les neutrophiles et les biofilms sont colorés séparément à l’aide de colorants qui peuvent colorer les deux types de cellules, assurez-vous de laver tout colorant restant avant de combiner les neutrophiles et les biofilms pour éviter la coloration croisée.
Representative Results
Les milieux utilisés pour cultiver des biofilms bactériens influencent la survie des neutrophiles. Différents milieux ont été testés pour réduire l’effet des milieux seuls sur la viabilité des neutrophiles pour l’étude des interactions neutrophiles-biofilm (Figure 1). Les milieux de croissance bactériens tels que le bouillon de soja tryptique minimisent la viabilité des neutrophiles, de sorte que ~60% des neutrophiles sont vivants après une période d’incubation de 30 minutes à 37 ° C avec 5% de CO2. Les milieux de culture de cellules de mammifères, tels que MEMα, n’affectent pas la viabilité des neutrophiles et favorisent la croissance des biofilms de S. aureus. En fait, un milieu minimal favorise une croissance robuste des biofilms dans d’autres bactéries46,47.
Pour évaluer l’effet des milieux sur la croissance et la variabilité du biofilm dans la quantification de la biomasse du biofilm après lavage de la biomasse pour éliminer les cellules planctoniques, un biofilm de S. aureus de 18 h a été cultivé dans une plaque de 96 puits, avec des puits traités ou non traités avec de la poly-L-lysine. Un milieu riche en nutriments (bouillon de soja tryptique (BST)) et minimal (MEMα) a été utilisé tel quel ou complété par du glucose à 2%. La biomasse du biofilm colorée avec CV a révélé que le biofilm de S. aureus cultivé dans MEMα complété par 2% de glucose produisait le biofilm le plus robuste parmi tous les milieux testés (Figure 2A). De plus, les biofilms cultivés dans des puits prétraités par PLL contenant MEMα + 2% de glucose ont montré moins de variabilité que les biofilms dans des puits non traités PLL contenant MEMα + 2% de glucose. Ces biofilms ont montré moins de variabilité dans la quantification via le test CV35 et le CFU/mL lorsqu’ils ont été plaqués après avoir manipulé avec précision les biofilms pour la quantification de la biomasse. Ces biofilms contenaient, en moyenne, 1 x 108 UFC/mL, comme démontré par le placage des biofilms en 3 jours distincts (Figure 2B). Ce nombre est utile pour déterminer le nombre de neutrophiles à ajouter aux biofilms pour les tests de fonctionnalité des neutrophiles.
Pour mesurer la production de ROS par les neutrophiles en réponse aux biofilms, les biofilms de S. aureus ont été cultivés statiquement pendant 18 à 20 heures dans une plaque de 96 puits. Des biofilms ont ensuite été opsonisés et des neutrophiles ont été ajoutés. La production de ROS a ensuite été mesurée pendant 60 min (figure 3A). L’aire sous la courbe est calculée à partir de la courbe cinétique pour quantifier la production totale de ROS par les neutrophiles. Les neutrophiles traités avec un agoniste, tel que la PMA, utilisée comme témoin, montrent une production accrue de ROS. En l’absence de biofilms, les neutrophiles traités avec du PMA ont montré une production robuste de ROS. En présence de biofilm de S. aureus , la production globale de ROS par les neutrophiles traités avec PMA a diminué. En l’absence de PMA, les neutrophiles dépendent uniquement de leur interaction avec le biofilm, ce qui réduit encore la quantité de ROS produite (Figure 3B).
Pour visualiser les interactions neutrophiles-biofilm à l’aide de la microscopie à fluorescence, une souche exprimant la GFP de S. aureus, colorant CMAC bleu et homodimère-1 d’éthidium, qui colore respectivement le cytoplasme des cellules vivantes et l’ADN des cellules mortes. Le biofilm de S. aureus a été cultivé pendant 18 heures dans une lame de 6 μ canaux. Des neutrophiles marqués au colorant CMAC bleu ont été ajoutés avec de l’homodimère-1 d’éthidium aux biofilms lavés et incubés pendant 30 minutes à 37 °C avec 5% de CO2 avant l’imagerie. La microscopie fluorescente à grand champ a révélé que de nombreux neutrophiles étaient localisés à la surface des biofilms de S. aureus, tandis que quelques-uns se trouvent dans le biofilm (figure 4A). L’interaction entre les cellules de S. aureus dans les neutrophiles était également apparente (Figure 4C). La plupart des cellules de S. aureus interagissant avec les neutrophiles (cyan) étaient mortes (magenta), tandis que quelques-unes sont restées vivantes (jaune) comme déterminé par la coloration de mort vivante (Figure 4C). À titre de comparaison, les biofilms de S. aureus exprimant la GFP ont été colorés avec de l’homodimère-1 d’éthidium, ce qui a révélé une fraction de la population morte de S. aureus dans le biofilm (figure 4B). Les neutrophiles non viables qui étaient positifs pour l’homodimère-1 d’éthidium ont été quantifiés à l’aide d’un logiciel d’analyse (voir le tableau des matériaux) après incubation avec des biofilms de S. aureus. Environ 48% des neutrophiles étaient déjà morts dans les 30 minutes suivant l’incubation avec le biofilm de S. aureus. Lors de l’optimisation du protocole de microscopie, l’effet du lavage du biofilm et des neutrophiles après 30 min d’incubation pour éliminer les neutrophiles non adhérents a également été évalué, révélant environ 33% des neutrophiles morts encore attachés au biofilm (Figure 4D).
Figure 1 : Le test LIVE-DEAD compare la survie des neutrophiles entre les milieux de croissance bactériens et mammifères. Les neutrophiles ont été isolés et incubés dans HBSS, MEMα, TSB ou SDS à 0,1% pendant 30 min. La coloration LIVE-DEAD a été réalisée en utilisant Calcein AM (vivant) et ethidium homodimer-1 (mort). Le pourcentage de neutrophiles vivants a été déterminé, où les neutrophiles incubés par HBSS ont été traités comme des neutrophiles vivants à 100%. Les résultats représentent en moyenne deux expériences indépendantes réalisées en triplicate, avec des neutrophiles obtenus à partir de deux donneurs différents. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± ET (*p < 0,05, ****p < 0,0001. ANOVA à sens unique). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Quantification de la biomasse du biofilm dans différentes conditions et comptage de viabilité bactérienne des biofilms cultivés dans les conditions optimisées. (A) S. aureus a été ensemencé dans une plaque de 96 puits, enduite ou non de poly-L-lysine (PLL). Les biofilms ont été cultivés dans le BST, le MEMα ou l’un ou l’autre des milieux supplémentés avec du glucose à 2 % dans des conditions statiques pendant 18 heures. La coloration au cristal violet (CV) a été effectuée pour colorer la biomasse du biofilm. La coloration CV éluée a été diluée à 1:10 et lue dans un lecteur de microplaques. Les résultats représentent en moyenne trois expériences indépendantes réalisées en triplicate. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type. L’écart-type de chaque groupe est indiqué en bas pour démontrer la variabilité des différentes conditions de croissance du biofilm. (B) Le nombre d’UFC bactériennes a été obtenu à partir de biofilms cultivés dans un milieu optimisé (MEMα + 2% de glucose). Les biofilms statiques de 18 h ont été soumis au même nombre de lavages suivis d’une sonication de 10 minutes pour desserrer la biomasse du biofilm et ont traversé une aiguille 22G pour perturber les agrégats avant le placage. Les résultats représentent trois répétitions réalisées en trois exemplaires. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± ET (ns = non significatif. ANOVA à sens unique). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Quantification de la production de ROS par les neutrophiles par dosage par chimiluminescence. (A) Les neutrophiles (PMN) ont été incubés avec des biofilms de S. aureus lavés par HBSS, soit en présence (triangle gris fermé) ou en absence (triangle gris inversé ouvert) de PMA pour mesurer la production de ROS par les neutrophiles. Le luminol a été utilisé pour détecter les ROS toutes les 3 minutes pendant 60 minutes dans un lecteur de microplaques. Alors que les neutrophiles traités avec PMA en l’absence d’un biofilm (cercle noir fermé) ont servi de contrôle positif, les groupes neutrophiles seuls (cercle noir ouvert) et biofilm seulement (triangle gris ouvert) ont servi de témoins négatifs. Les données représentent en moyenne deux expériences indépendantes réalisées en triple exemplaire avec des neutrophiles obtenus à partir de deux donneurs différents. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type. (B) L’aire sous la courbe de (A) a été calculée pour quantifier les MDO totaux générés par les neutrophiles. Les données sont représentées sous forme de moyenne ± écart-type. (***p < 0,0001. ANOVA à sens unique). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Visualisation de l’interaction entre le biofilm de S. aureus et les neutrophiles par microscopie à fluorescence à grand champ. Les neutrophiles marqués au colorant CMAC bleu (cyan) ont été complétés par de l’homodimère-1 d’éthidium (magenta; mort) avant d’être incubés avec un biofilm de S. aureus de 18 h (jaune). Les interactions biofilm-neutrophiles ont été imagées à l’aide de microscopie fluorescente à grand champ et les images traitées à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images. Des expériences ont été réalisées avec trois donneurs différents. Des images représentatives sont présentées comme (A) vue 3D du biofilm de S. aureus avec des neutrophiles vivants (cyan) et morts (magenta; quelques-uns indiqués par des flèches blanches), (B) vue 3D d’un biofilm de S. aureus en l’absence de neutrophiles avec S. aureus vivant exprimant GFP (jaune) ou S. aureus mort coloré avec de l’ethidium homodimer-1 (magenta), (C) une vue orthogonale de S. aureus et l’interaction des neutrophiles telle que décrite par les plans xy, yz et xz, et (D) la quantification de la viabilité des neutrophiles en présence de biofilm de S. aureus après 30 minutes, soit immédiatement (non lavé), soit après trois cycles de lavage avec HBSS pour éliminer les neutrophiles non adhérents (lavés). La mort cellulaire des neutrophiles est présentée comme une moyenne ± SD (test t de Student). La barre d’échelle indique 50 μm en (A) et (B) et 10 μm en (C). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Discussion
De nombreux efforts ont été déployés pour cultiver des biofilms de S. aureus robustes et reproductibles pour des expériences in vitro in vitro48,49,50. Un protocole normalisé est décrit qui tire parti de la nature cationique de la LPL, ainsi que de la supplémentation du milieu avec du glucose pour la croissance de biofilms robustes in vitro de S. aureus. L’ajout de PLL permet une meilleure fixation de la cellule bactérienne chargée négativement aux surfaces revêtues de PLL chargées positivement. Il est important de noter que la LPL à une concentration de 10 μg/mL a une activité antimicrobienne contre Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli et S. aureus lorsqu’elle est incubée pendant 24 h51. La même concentration est utilisée pour recouvrir les surfaces; cependant, l’excès de LPL est aspiré, ce qui rend la concentration de PLL inférieure à 10 μg/mL lors de l’ensemencement pour la croissance du biofilm.
Il est important de noter que la LPL n’a fonctionné que dans des milieux de croissance spécifiques tels que MEMα avec 2% de glucose, où il a été observé que S. aureus produisait des biofilms robustes avec une variabilité minimale (Figure 2A). La concentration de PLL à utiliser conjointement avec d’autres types de milieux nécessiterait une optimisation supplémentaire, comme l’utilisation d’une concentration accrue de LPL pour recouvrir les puits. De plus, ces conditions ont été optimisées pour un biofilm monospécifique de S. aureus. Bien que les biofilms de plaies chroniques soient souvent polymicrobiens, la normalisation des essais pour étudier le biofilm monospécifique et ses interactions avec les neutrophiles et d’autres cellules immunitaires est essentielle pour comprendre leur contribution à la pathogenèse52. Ces protocoles standardisés peuvent être optimisés davantage pour soutenir et étudier les biofilms polymicrobiens et leurs interactions avec les neutrophiles.
Il a également été observé que les milieux de culture bactériens riches, tels que le BST, entraînaient une perte de viabilité des neutrophiles (figure 1). Par conséquent, les conditions de croissance des biofilms de S. aureus dans MEMα, utilisés pour les cultures de cellules de mammifères, ont été optimisées. Pour les études impliquant des neutrophiles, ce milieu soutient la viabilité des neutrophiles et favorise la croissance de S. aureus. Bien qu’il ait été observé que les milieux affectent la viabilité des neutrophiles, il est également important de considérer que les neutrophiles isolés du sang humain périphérique subissent une apoptose ex vivo avec environ 70% de neutrophiles apoptotiques à 20 h53. Cela nécessite une manipulation appropriée, comme le stockage des neutrophiles sur la glace lors de la préparation des expériences, l’utilisation de réactifs sans endotoxines et la prévention de l’activation des neutrophiles en évitant le vortex des échantillons avec des neutrophiles.
L’évaluation de l’éclatement oxydatif des neutrophiles est couramment effectuée pour déterminer l’effet destructeur des neutrophiles sur l’agent pathogène14,54,55. Ces études sont fréquemment réalisées avec des bactéries planctoniques où des neutrophiles sont ajoutés, et la réponse oxydative en rafale est quantifiée à l’aide de la chimiluminescence amplifiée par le luminol qui détecte les anions superoxydes produits par les neutrophiles. Le protocole actuel est modifié en remplaçant les bactéries planctoniques par un biofilm de S. aureus cultivé statiquement sur 18 h. En tant que tels, les neutrophiles peuvent être directement ajoutés au biofilm pour évaluer leur activation. D’autre part, les bactéries dans les biofilms produisent des enzymes, telles que la catalase et la superoxyde dismutase pour détoxifier ROS23,56. Les biofilms de Staphylococcus epidermidis produisent une catalase plus élevée que son homologue planctonique sous stress57. La chimiluminescence totale des neutrophiles stimulés par la PMA dans un biofilm de S. aureus est significativement inférieure à celle des neutrophiles stimulés par la PMA où le biofilm est absent (Figure 2). Cela peut être dû à l’activité de ces enzymes détoxifiantes. De plus, les biofilms de S. aureus produisent plusieurs toxines formant des pores appelées leucocidines qui tuent les neutrophiles58. La réponse réduite à l’éclatement est également probablement due à la viabilité réduite des neutrophiles en présence de biofilm de S. aureus. Bien que cette étude utilise du luminol qui détecte les ROS totaux produits à l’intérieur et à l’extérieur des cellules, d’autres réactifs, tels que le DCFDACM-H 2(5-(and-6)-chloromethyl-2'7'-dichlorodichlorodihydrofluorescein diacétate) ou l’isoluminol, doivent être pris en compte si l’objectif du travail est d’étudier spécifiquement la production intracellulaire ou extracellulaire de ROS14,53,54.
La capacité de visualiser les interactions neutrophiles-biofilm par microscopie peut être informative sur le comportement des neutrophiles et des biofilms en présence les uns des autres. Les spectres d’excitation et d’émission des colorants fluorescents et des protéines représentent un instantané de l’interaction entre un biofilm de S. aureus de 18 h et les neutrophiles après une incubation de 30 minutes. Pour capter efficacement les signaux des cellules colorées, il est important de limiter l’exposition des échantillons aux sources lumineuses lors de la configuration des échantillons pour la microscopie. Lors de l’imagerie, le photoblanchiment rapide des échantillons a été évité en abaissant l’intensité de la source lumineuse lors du réglage de tous les paramètres tels que la hauteur de la pile Z et le temps d’exposition pour différents canaux.
Ces pratiques simples ont permis une imagerie microscopique appropriée où il a été observé que peu de neutrophiles sont localisés dans le biofilm (Figure 4A). Cela peut être dû aux espaces présents dans le biofilm, car le biofilm de S. aureus de 18 h cultivé dans MEMα avec 2% de glucose ne couvre pas uniformément la surface (Figure 4B). Cependant, l’utilisation de milieux riches par d’autres études a montré une pelouse uniforme de croissance du biofilm de S. aureus et de leucocytes pénétrant à travers le biofilm30,58. En outre, on observe également qu’il y a eu mort cellulaire des neutrophiles après 30 minutes d’incubation avec des biofilms de S. aureus en raison de leucocidines produites par le biofilm de S. aureus qui lysent les neutrophiles58 (Figure 4A,D). L’ajout d’une étape de lavage pour éliminer les neutrophiles non adhérents après les avoir incubés avec du biofilm pendant 30 min a éliminé ~15% des neutrophiles morts du système par rapport au groupe non lavé, dans lequel la microscopie a été réalisée immédiatement après 30 minutes d’incubation (Figure 4D). Des neutrophiles interagissant avec S. aureus ont également été observés (Figure 4C). D’autres expériences sont nécessaires pour évaluer si S. aureus est englouti par les neutrophiles ou attaché à la surface cellulaire des neutrophiles54. L’imagerie des neutrophiles et des biofilms est la première étape pour évaluer plusieurs fonctionnalités des neutrophiles en aval, telles que la phagocytose et NETosis54,59. L’effet des neutrophiles sur les biofilms peut également être évalué en quantifiant la biomasse du biofilm, les changements structurels du biofilm et la viabilité du biofilm, entre autres, à l’aide des outils d’analyse d’images énumérés à l’étape 5.6. Enfin, la variabilité d’un donneur à l’autre existe dans les neutrophiles; Ainsi, il est recommandé d’utiliser au moins trois donneurs différents pour les études impliquant des neutrophiles.
Dans l’ensemble, des essais in vitro standardisés ont été combinés pour évaluer les interactions entre les neutrophiles et les biofilms. Bien que ces tests utilisent S. aureus, les protocoles décrits peuvent facilement être adaptés pour étudier d’autres agents pathogènes. Bien qu’il existe divers modèles in vivo pour étudier les interactions hôte-pathogène, ils peuvent être coûteux et exigeants en main-d’œuvre, surtout si les conditions ne sont pas optimisées. Travailler avec des tests in vitro standardisés permet d’optimiser les conditions expérimentales et de confirmer les observations avant de passer à un système in vivo. Enfin, divers modèles d’infection animale ont été utilisés pour étudier les interactions biofilm-neutrophiles in vivo. Cependant, il est important de tenir compte des différences immunologiques entre les modèles humains et animaux60,61,62,63. Cela nécessite l’utilisation de neutrophiles dérivés de l’homme pour étudier ces interactions complexes hôte-pathogène.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par le National Institute of Allergy and Infectious Diseases (R01AI077628) à DJW et un prix de développement de carrière de l’American Heart Association (19CDA34630005) à ESG. Nous remercions le Dr Paul Stoodley de nous avoir fourni la souche USA 300 LAC GFP. En outre, nous reconnaissons les ressources du Campus Microscopy and Imaging Facility (CMIF) et de l’OSU Comprehensive Cancer Center (OSUCCC) Microscopy Shared Resource (MSR), The Ohio State University. Nous remercions également Amelia Staats, Peter Burback et Lisa Coleman du laboratoire Stoodley d’avoir effectué des prises de sang.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% sodium chloride irrigation, USP | Baxter | 2F7124 | Endotoxin-free; Used for isolation of neutrophils |
| 150 mL rapid-flow filter unit | Thermo Scientific | 565-0020 | |
| 200 proof ethanol | VWR | 89125-188 | |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | Used for blood draw |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | |
| 60 mL syringe | BD | 309653 | Used for blood draw |
| Agar | Fisher Bioreagents | BP1423-2 | |
| Alcohol swab | BD | Used for blood draw | |
| Band-aids | Used for blood draw | ||
| BD Bacto Tryptic Soy Broth | BD | DF0370-07-5 | Combine with 1.5% agar to make Tryptic Soy Agar |
| Cell counter | Bal Saupply | 202C | |
| CellTracker blue CMCH | Invitrogen | C2111 | Blue CMAC Dye (BCD) |
| Clear bottom 96-well flat bottom polystyrene plates | Costar | 3370 | |
| Cotton gauze | Fisherbrand | 13-761-52 | Used for blood draw |
| Crystal violet | Acros Organic | 40583-0250 | |
| Culture tubes | Fisherbrand | 14-961-27 | Borosilicate Glass 13 x 100 mm |
| D-(+)-glucose | Sigma | G-8270 | |
| Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma | 31392-250G | Used for isolation of neutrophils |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) 1x | Gibco | 14190-144 | |
| Ethidium homodimer-1 | Invitrogen | L3224 B | |
| Ficoll-Paque plus | Cytiva | 17144003 | Used for isolation of neutrophils (density gradient medium) |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) 1x | Corning cellgro | 21-022-CV | without calcium, magnesium, and phenol red |
| Hemacytometer | Bright Line | ||
| Heparin | Novaplus | NDC 63323-540-57 | 1000 USP units/mL, Used for blood draw |
| IMARIS 9.8 | Oxford Instruments | Microscopy image analysis software | |
| Luminol | Sigma | A8511-5G | |
| Minimal essential media (MEM) Alpha 1x | Gibco | 41061-029 | |
| Needle (23 G1) | BD | 305145 | Used for blood draw |
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon | ||
| NIS-Elements | Nikon | Quantification of dead neutrophils | |
| Normal human serum | Complement Technology | NHS | |
| Petri Dish (100 x 15 mm) | VWR | 25384-342 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | |||
| Poly-L-lysine solution | Sigma | P4707-50ML | |
| Sodium chloride | Fisher Bioreagents | BP358-10 | Used for neutrophil isolation |
| SoftMax Pro Software | Molecular Devices | Microplate reader software used for data acquisition | |
| SpectraMax i3x | Molecular Devices | Microplate reader | |
| Sterile water for irrigation, USP | Baxter | 2F7114 | Endotoxin-free; Used for neutrophil isolation |
| Surflo winged infusion set | Terumo | SC*19BLK | 19 G x 3/4", used for blood draw |
| Trypan blue stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Turnicate | Used for blood draw | ||
| UltraPure distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
| White opaque 96-well plates | Falcon | 353296 | Tissue culture treated and flat bottom plate |
| μ-Slide VI 0.4 | Ibidi | 80601 | μ-channel slide |
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