Produzione di virus della malattia di Newcastle ricombinante ad alto titolo dal liquido allantoico

Newcastle Disease Virus, noto anche come Avian Orthoavulavirus-1, è un paramixovirus aviario avvolto con il potenziale per essere utilizzato sia come virus oncolitico che come vaccino virale^vettore 1,2,3,4,5,6,7. Più recentemente, NDV progettato per esprimere la proteina spike di SARS-CoV-2 è stato caratterizzato come un vaccino intranasale efficace nei modelli^di sfida di topo e criceto ^7,8,9. Se usato come immunoterapia del cancro, si traduce nel reclutamento di cellule immunitarie innate, in particolare cellule natural killer, produzione di interferone di tipo I e generazione di cellule T antitumorali specifiche 10,11,12,13. Oltre a queste potenti proprietà immunostimolanti, NDV ha un forte profilo di sicurezza e un sistema di genetica inversa ben consolidato ^14,15. Queste caratteristiche desiderabili hanno spinto la valutazione di NDV in numerosi studi clinici preclinici e umani (NCT04871737, NCT01926028, NCT04764422)^16,17. Per far progredire ulteriormente questo vettore virale immunostimolante molto promettente, sono necessari metodi dettagliati per produrre e purificare NDV ultra-puro ad alto titolo che può essere somministrato in modo sicuro in vivo.

Poiché NDV è un paramyxovirus aviario, è più frequentemente amplificato nelle uova di gallina embrionate. Mentre ci sono sistemi basati su cellule disponibili per la propagazione di NDV, la maggior parte non è stata in grado di produrre titoli simili a quelli ottenuti nelle uova di gallina embrionate¹⁸. Tuttavia, ci sono alcuni inconvenienti nella produzione di NDV nelle uova, incluso il fatto che la produzione a base di uova è lunga e non facilmente scalabile, l'approvvigionamento di grandi quantità di uova di gallina SPF può essere problematico ed esiste il potenziale di contaminazione con allergeni dell'uovo 13,18,19,20 . Recentemente, un gruppo ha dimostrato che le cellule Vero cresciute in sospensione in mezzo privo di siero possono supportare la replicazione di NDV in titoli paragonabili a quelli ottenuti nelle uova, prima della purificazione²¹. Tuttavia, ciò ha richiesto il passaggio seriale del virus per adattare il virus alle cellule Vero e l'ottimizzazione di un metodo per purificare NDV dalle cellule Vero in sospensione è ancora richiesta²¹.

Come evidenziato in precedenza, i metodi utilizzati per purificare il virus di alto titolo e di grado in vivo variano a seconda del virus in questione²². Esiste un sistema di genetica inversa ben consolidato disponibile per la generazione di NDV ricombinante. Questo processo, che prevede l'uso di un clone di cDNA, plasmidi helper e un virus helper che esprime T7 RNA polimerasi, è stato precedentemente descritto in dettaglio ^15,23. Questo protocollo può essere applicato a NDV lentogeno o mesogenico. Il virus descritto in questo protocollo è un NDV mesogenico ricombinante che codifica per la proteina fluorescente verde (GFP) dalla medusa Aequorea victoria inserita tra i geni virali P e M come unità di trascrizione individuale, poiché questo è stato precedentemente descritto come il sito ottimale per l'inserimento di transgeni estranei²⁴.

I metodi allegati delineano la purificazione di NDV in base alle sue dimensioni, che vanno da 100 a 500 nm, e alla sua densità¹⁵. Ciò ha permesso la generazione di stock NDV in vivo e ad alto titolo in circa 3 settimane, a partire da quando le uova vengono ricevute fino ad avere un titolo finale. Vengono descritte le tecniche frequentemente utilizzate nella produzione su larga scala di virus a base di uova come la filtrazione a flusso tangenziale, la filtrazione di profondità e l'ultracentrifugazione del gradiente di densità, consentendo la traduzione di questi metodi in una produzione su larga scala. Le tecniche precedentemente descritte per la purificazione dell'NDV sono state migliorate mediante l'incorporazione di un tampone stabilizzante del virus, l'uso di iodixanolo durante l'ultracentrifugazione del gradiente di densità e la descrizione di varie misure di controllo della qualità per garantire la qualità in vivo ¹⁵. Ciò ha permesso la purificazione di NDV di grado in vivo raggiungendo titoli fino a 3 × 10¹⁰ PFU/mL da 0,8 a 1,0 L di liquido allantoico.

Tutto il lavoro che coinvolge l'uso di animali è stato approvato dal Comitato per la cura degli animali dell'Università di Guelph in conformità con il Canadian Council on Animal Care. Tutto il lavoro viene eseguito in un laboratorio di livello di biosicurezza 2 (BSL2) in Canada, dove l'NDV mesogenico è un agente patogeno del gruppo di rischio 2. Tutte le fasi coinvolte nell'amplificazione e purificazione di NDV devono essere eseguite in un armadio di sicurezza biologica di tipo IIA per scopi di sicurezza e sterilità.

1. Amplificazione di NDV mediante uova di gallina embrionate esenti da agenti patogeni specifici

1. Inoculazione di uova di gallina embrionate SPF
   NOTA: In genere, otto dozzine di uova di gallina embrionate SPF vengono utilizzate per generare un lotto di NDV di grado vivo. Ordina una o due dozzine di uova extra per tenere conto dei danni durante la spedizione e della variabilità della redditività. Le uova di gallina embrionate sono materiale biologico e dovrebbero essere maneggiate secondo le linee guida istituzionali. Tuttavia, poiché gli embrioni non sono nati, non è richiesta l'approvazione del comitato istituzionale per la cura degli animali.
   1. Dopo aver ricevuto uova di gallina embrionate SPF, incubare in un'incubatrice di uova a 37 ° C, 60% di umidità per 9 giorni. Assicurarsi che l'incubatrice sia impostata per oscillare / ruotare automaticamente le uova ogni ora.
      NOTA: le uova possono essere conservate a temperatura ambiente fino a 24 ore o 4 °C fino a 72 ore; tuttavia, ciò può ridurre la vitalità dell'embrione.
   2. Dopo 8-11 giorni di incubazione (idealmente il giorno 9), candela le uova per determinare la vitalità dell'embrione. Cerca la vascolarizzazione simile al web (Figura 1A) e il movimento degli embrioni come indicatori di embrioni vitali. Smaltire le uova prive di queste caratteristiche (Figura 1B).
   3. Sulle uova vitali, contrassegnare l'interfaccia tra la sacca d'aria e l'embrione a matita con una "X" (Figura 1A). Assicurarsi che questo sito di iniezione non causi perforazione della vascolarizzazione. Restituire le uova contrassegnate all'incubatrice mentre l'inoculo è preparato.
   4. Calcola la quantità di virus necessaria per iniettare tutte le uova di gallina embrionate SPF. Assicurarsi che ogni uovo riceva 100 PFU di virus in un volume di 100 μL; diluire il virus in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) ad una concentrazione di 1 × 10³ PFU/mL. Preparare un ulteriore 20% dell'inoculo per tenere conto delle imprecisioni nella somministrazione del virus.
   5. Utilizzando una salvietta antistatica, pulire le parti superiori delle uova contrassegnate con una soluzione di iodio al 10%, diluita in etanolo al 70%. Attendere circa 1-2 minuti affinché la soluzione si asciughi.
   6. Forare con cura il guscio usando un paio di pinzette affilate sterili. Disinfettare le pinzette in etanolo al 70% tra le uova.
   7. Utilizzando una siringa da 1 mL e un ago da 25 G, iniettare 100 μL dell'inoculo preparato al punto 1.1.4 nella cavità corioallantoica (Figura 1C). Avvicinarsi con l'ago con un angolo di quasi 90° rispetto all'uovo. Inserire l'ago appena nella parte superiore della membrana corioallantoica.
   8. Dopo l'inoculazione, utilizzare lo smalto per unghie per coprire il sito di puntura e restituire le uova all'incubatrice. Assicurarsi che l'impostazione a dondolo sia ON fino a 24 ore dopo l'inoculazione.
   9. Controllare la vitalità delle uova 24 ore dopo l'inoculazione. Scartare le uova morte che mancano di vascolarizzazione nella membrana corioallantoica e nel movimento dell'embrione (Figura 1B).
      NOTA: Queste uova sono morte a causa del processo di inoculazione e non da NDV.
   10. Restituire le uova all'incubatrice, con il bilanciere che si avvia OFF per prevenire la contaminazione del liquido allantoico con le proteine dell'uovo.
   11. Controllare le uova ogni 12-24 ore come descritto al punto 1.1.9 per identificare le uova morte. Spostare le uova che muoiono dopo 24 ore dopo l'inoculazione a 4 ° C per ridurre al minimo l'autolisi. Raccogliere il liquido allantoico entro 2-12 ore dalla refrigerazione.
   12. Incubare le uova per almeno 72 ore.
       NOTA: Se si propaga un ceppo mesogenico di NDV, il tempo di incubazione ottimale è di 60-72 ore, poiché tempi di incubazione prolungati possono compromettere il processo di purificazione a causa della ridotta chiarezza del fluido allantoico. Questo problema non è così importante quando si propagano ceppi NDV lentogeni in quanto impiegano molto più tempo per uccidere l'embrione.
   13. Dopo il periodo di incubazione appropriato, spostare le uova rimanenti a 4 °C per 2-12 ore prima di raccogliere il liquido allantoico.
2. Raccolta di fluido allantoico contenente NDV
   1. Spostare le uova refrigerate nell'armadio di biosicurezza. Pulire le parti superiori delle uova con il 70% di etanolo.
   2. Utilizzare pinzette sterili e forbici chirurgiche per aprire il lato apicale dell'uovo dove si trova la sacca d'aria.
   3. Rimuovere il guscio per rivelare la membrana corioallantoica (Figura 1D).
   4. Forare con attenzione la membrana e staccarla per esporre la cavità allantoica (Figura 1E). Assicurarsi che il sacco vitellino non venga forato accidentalmente e che questo rovini l'uovo.
   5. Usa una pinza smussata per afferrare l'embrione e aprire il sacco embrionale.
      NOTA: Il fluido all'interno del sacco embrionale contiene anche NDV.
   6. Deprimere l'embrione con la pinza e raccogliere il liquido allantoico usando una pipetta sierologica da 10 ml.
   7. Conservare il fluido allantoico su ghiaccio in tubi conici da 15 ml fino alla chiarificazione.
      NOTA: Se il liquido allantoico è giallo, il sacco vitellino è stato compromesso e il liquido allantoico deve essere scartato.
   8. Centrifugare i tubi conici contenenti il fluido allantoico a 1.500 × g per 10 min a 4 °C.
   9. Punto di pausa: aliquotare il liquido allantoico chiarificato in tubi conici da 50 ml e conservarli a -80 °C per la conservazione a lungo termine (ad esempio, settimane o mesi), integrando il fluido con saccarosio fino a una concentrazione finale del 5% per proteggere il virus dai duri effetti del congelamento-disgelo. In alternativa, per la conservazione a breve termine (ad esempio, 1-3 giorni), integrare il liquido allantoico con saccarosio (ultimo 5%) o con 3x tampone mannitolo-lisina (ML) (15% mannitolo, 3% lisina; vedere Tabella supplementare S1 per le ricette tampone) per ottenere una concentrazione finale di 1x (5% mannitolo, 1% lisina) prima della conservazione a 4 °C.

2. Purificazione di NDV dal fluido allantoico

1. Filtrazione in profondità del fluido allantoico
   1. Conservare il liquido allantoico chiarificato a -80 °C e scongelarlo a 4 °C la sera prima della purificazione.
   2. In un armadio di sicurezza biologica, impostare il tubo e la pompa peristaltica come mostrato nella Figura 2.
   3. Se non è già stato eseguito, combinare il fluido allantoico con 3x ml tampone ad una concentrazione finale di 1x.
   4. Prima di fissare il filtro di profondità, sterilizzare il tubo facendo passare 50 ml di 0,5 M NaOH attraverso il sistema in un contenitore per rifiuti.
   5. Risciacquare il tubo facendo passare 100 ml di acqua sterile di grado molecolare attraverso il sistema e nel contenitore dei rifiuti.
      NOTA: Poiché NaOH inattiverà NDV, è importante che le linee siano adeguatamente lavate prima di introdurre il fluido allantoico contenente virus.
   6. Innescare il sistema facendo passare 50 mL di PBS attraverso di esso, arrestando la pompa quando nel tubo sono rimasti circa 5 mL di PBS.
   7. Collegare il filtro di profondità con un grado di ritenzione di 1-3 μM al tubo e rimuovere il secondo cappuccio sul lato apicale del filtro di profondità per sfiatare il filtro. Iniziare a eseguire altri 50 ml di PBS attraverso il sistema.
   8. Una volta che PBS inizia a fluire attraverso lo sfiato nella parte superiore del filtro, chiudere la porta e continuare a far fluire PBS attraverso le linee.
      NOTA: le bolle d'aria minori sono accettabili, ma la presenza di grandi quantità d'aria richiederà che il filtro venga nuovamente ventilato come descritto nei passaggi 2.1.7 e 2.1.8.
   9. Arrestare la pompa quando nel tubo rimangono circa 5 ml di PBS.
   10. Sostituire il recipiente per i rifiuti con un nuovo recipiente di raccolta sterile e iniziare a far scorrere il fluido allantoico attraverso il filtro di profondità.
       NOTA: la pressione non deve superare i 10 psi in quanto ciò comporta la tosatura del virus. La pressione può essere manipolata diminuendo o aumentando la portata della pompa. Se la pressione inizia a superare i 10 psi e la portata non può essere ulteriormente diminuita, è necessario utilizzare un nuovo filtro di profondità. In questo caso, i passaggi 2.1.6-2.1.8 devono essere eseguiti prima di riprendere il flusso di liquido allantoico.
   11. Una volta che tutto il fluido allantoico è passato attraverso il filtro, eseguire 50 ml di 1x ML buffer attraverso le linee per massimizzare il recupero del virus.
   12. Raccogliere il liquido fino a quando le linee non si asciugano. Conservare il virus durante la notte o fino a 36 ore a 4 °C.
       NOTA: Una volta che il virus è stato filtrato in profondità, continuare il processo di purificazione entro 36 ore dal completamento della filtrazione di profondità.
   13. Scollegare il filtro di profondità e disinfettare il tubo facendo scorrere 100 mL di 0,5 M NaOH, 400 PPM di candeggina preriscaldata a 42 °C attraverso il sistema prima dello stoccaggio in 0,5 M NaOH.
2. Filtrazione a flusso tangenziale per la concentrazione di NDV
   1. Assemblare i componenti della cassetta come illustrato nella Figura 3A (e come mostrato in precedenza²⁵) in un armadio di sicurezza biologica.
      NOTA: Il collettore e la piastra terminale devono essere lavati in detergente e asciugati prima dell'uso. Le guarnizioni in silicio sono riutilizzabili e devono essere conservate in 0,5 M NaOH con la cassetta.
   2. Impostare il sistema di filtrazione a flusso tangenziale (TFF) (noto anche come filtrazione a flusso incrociato) in una conformazione "aperta" (Figura 3B).
      1. Se si utilizza una cassetta per la prima volta, assemblare la cassetta TFF nella conformazione Elution e lavare con 100 ml di acqua sterile di grado molecolare (Figura 3C).
      2. Una volta che ci sono solo 5 ml di acqua rimanenti nel serbatoio del serbatoio, mettere in pausa la pompa e modificare la configurazione del sistema TFF in una conformazione chiusa (Figura 3D).
      3. Aggiungere 100 mL di 0,5 M NaOH, 400 PPM di candeggina preriscaldata a 42 °C al serbatoio e passare attraverso il sistema per 30-60 min.
      4. Sospendere il flusso e riportare il sistema TFF alla configurazione dell'eluizione, riprendendo il flusso per eluire la soluzione detergente.
      5. Quando rimangono circa 5 ml nel serbatoio, mettere in pausa la pompa e aggiungere 100 ml di acqua sterile di grado molecolare per risciacquare il sistema.
      6. Quando nel serbatoio rimangono circa 5 ml, mettere in pausa la pompa e posizionare il sistema TFF nella conformazione aperta (Figura 3B). Continuare con il passaggio 2.2.3.
   3. Sterilizzare la cassetta e il tubo facendo passare 100 mL di 0,5 M NaOH attraverso il sistema utilizzando la pompa peristaltica. Assicurarsi che la pressione non superi i 30 psi per mantenere l'integrità della cassetta.
   4. Mettere in pausa la pompa quando nel serbatoio sono rimasti circa 5 mL di 0,5 M NaOH.
   5. Aggiungere 100 ml di acqua sterile di grado molecolare al serbatoio e riprendere a far passare il fluido attraverso la cassetta. Ruotare il serbatoio per lavare tutto il NaOH dai lati del serbatoio per prevenire l'inattivazione del virus. Ripetere la fase di lavaggio del serbatoio.
   6. Quando nel serbatoio rimangono circa 5 ml di acqua sterile di grado molecolare, mettere in pausa la pompa.
   7. Aggiungere 100 ml di PBS al serbatoio, ruotando per garantire che l'acqua sterile di grado molecolare venga lavata dai lati. Riprendere il flusso di liquido attraverso la cassetta.
   8. Quando rimangono circa 5 ml nel serbatoio, mettere in pausa la pompa, aggiungere fluido allantoico filtrato in profondità al serbatoio e riprendere il flusso della pompa.
   9. Monitorare il manometro 1 (Figura 3B) per assicurarsi che non superi i 10 psi per prevenire la tosatura del virus. Utilizzare una combinazione della velocità della pompa peristaltica e l'uso di morsetti a C per aumentare l'eluizione in rifiuti.
      NOTA: la combinazione della velocità della pompa peristaltica e dei morsetti a C comporterà un aumento della pressione.
   10. Quando nel serbatoio sono rimasti 50-100 mL di liquido allantoico, mettere in pausa la pompa per eseguire uno scambio tampone aggiungendo 150-200 mL di 1x buffer ML.
   11. Riprendere il flusso della pompa, monitorando nuovamente il manometro 1 (Figura 3B) per assicurarsi che non superi i 10 psi.
   12. Quando rimangono 5-10 ml nel serbatoio, mettere in pausa la pompa.
   13. Utilizzando due morsetti a C, chiudere le due linee di scarico come mostrato nella Figura 3C.
   14. Disaccoppiare la linea di retentate che alimenta il serbatoio e inserirla in un tubo conico da 50 ml (Figura 3C).
   15. Riprendere il flusso della pompa, fermandosi quando rimangono alcune gocce di liquido nel serbatoio del serbatoio.
   16. Rimuovere i morsetti a C dalle linee di scarico e ricollegare la linea di alimentazione del retentato al serbatoio del serbatoio (Figura 3B).
   17. Aggiungere 20-25 mL di 1x ML buffer e riprendere il flusso della pompa fino a quando non rimangono circa 5 mL nel serbatoio del serbatoio.
   18. Ripetere i passaggi da 2.2.13 a 2.2.16.
       NOTA: una^terza eluizione può essere eseguita ripetendo i passaggi 2.2.17 e da 2.2.13 a 2.2.16 per aumentare la resa del virus. Tuttavia, la maggior parte del virus è presente nelle prime due eluizioni.
   19. Dopo aver terminato le eluizioni, posizionare il virus sul ghiaccio o a 4 °C.
   20. Per pulire le linee, impostare il sistema in modo che sia un formato a circuito chiuso (Figura 3D) con le linee di scarico che alimentano il serbatoio come illustrato nella Figura 3D.
   21. Procedere alla pulizia del sistema aggiungendo 250 mL di 0,5 M NaOH, 400 PPM di candeggina preriscaldata a 42 °C.
   22. Far scorrere la soluzione detergente attraverso il sistema durante la notte.
       NOTA: durante il ricircolo della soluzione detergente, se la pompa viene azionata ad una velocità di 50 ml/min, deve essere osservata una pressione di circa 5 psi. Se la pressione supera questa, la cassetta è sporca e la soluzione detergente deve essere sostituita e il processo ripetuto.
   23. Eluire la soluzione detergente dirigendo sia le linee di scarico che la linea di ripetizione in un contenitore per rifiuti.
   24. Aggiungere 400-500 ml di acqua sterile al serbatoio e farla scorrere attraverso il sistema e nei contenitori dei rifiuti.
   25. Quando nel serbatoio rimangono circa 5 mL, mettere in pausa la pompa e aggiungere 100-200 mL di 0,5 M NaOH al serbatoio del serbatoio, facendo roteare la soluzione per lavare il contenitore del serbatoio.
   26. Una volta che il serbatoio è quasi vuoto, ripetere il passaggio 2.2.23 altre due volte.
   27. Smontare la configurazione TFF, conservando la cassetta TFF e le guarnizioni in un piccolo volume di 0,5 M NaOH in un sacchetto di plastica richiudibile a 4 °C.
       NOTA: i tubi possono essere conservati a temperatura ambiente immersi in 0,5 M NaOH.
3. Ultracentrifugazione del gradiente di densità dello iodixanolo
   1. Accendere l'ultracentrifuga e impostarlo su preraffreddamento a 4 °C. Preraffreddare anche il rotore desiderato a 4 °C (vedere la Tabella dei materiali).
      NOTA: i rotori devono essere conservati a 4 °C.
   2. Utilizzare la soluzione di iodixanolo al 60% (concentrazione al momento dell'acquisto) per generare soluzioni di iodixanolo al 40%, 20% e 10% diluendo con PBS e 3x ML Buffer a una concentrazione finale di 1x di ML buffer.
   3. In un tubo ultracentrifuga a parete sottile da 13,2 mL, sovrapporre 0,5 mL, 2,5 mL e 2,5 mL delle soluzioni di iodixanolo al 40%, 20% e 10% rispettivamente (Figura 4A).
      NOTA: inclinare il tubo ultracentrifuga su un lato ed espellere lentamente la soluzione ridurrà significativamente il rischio di mescolare i due strati sfumati. La separazione di ogni strato dovrebbe essere evidente, con un "alone" visibile tra ogni strato del gradiente.
   4. Utilizzate un pennarello per contrassegnare le interfacce dei vari livelli sfumatura.
   5. Strato 6-6,5 mL del virus eluito dalla procedura TFF sul gradiente di densità. Aggiungere il virus con attenzione come descritto al punto 2.3.3 per evitare di disturbare il gradiente di densità.
   6. Caricare i tubi ultracentrifuga negli inserti per il rotore della benna oscillante (vedere la tabella dei materiali) utilizzando una scala aperta per bilanciare gli inserti entro 0,01 g l'uno dall'altro. Utilizzare PBS o eluente antivirus extra per tenere conto delle differenze di peso.
   7. Una volta bilanciati i tubi, tappare i tubi e caricarli nel rotore.
   8. Centrifuga per 1,5 ore a 125.000 × g a 4 °C.
      NOTA: questa operazione può essere eseguita durante la notte se è disponibile un'ultracentrifuga con funzionalità di avvio ritardato.
   9. Dopo l'ultracentrifugazione, rimuovere i tubi utilizzando un paio di pinze sterili. Cercare la banda target, una banda di grandi dimensioni, compresa tra i gradienti del 10% e del 20% (Figura 4B).
   10. Sospendere il tubo sopra la parte superiore di un becher usando un supporto per storta.
   11. Collegare un ago da 18 G x 1,5 pollici a una siringa da 5 ml e perforare il lato del tubo ultracentrifuga.
       NOTA: il tubo deve essere forato leggermente al di sotto della banda target, con l'ago su un angolo verso l'alto e smussato in modo tale da viaggiare nella banda target.
   12. Estendere lentamente lo stantuffo per rimuovere la banda di destinazione.
       NOTA: Spostare l'ago all'interno della banda target per massimizzare il virus estratto. Fare attenzione che altre bande o detriti non si mescolino con la banda target ed evitare di assumere una soluzione in eccesso in quanto ciò porterà all'uso di più cassette per dialisi.
   13. Una volta estratta la fascia target, rimuovere l'ago e lasciare che la soluzione rimanente scarichi nel becher di scarto. Erogare la fascia target in un tubo conico da 50 ml fino a quando tutte le bande di tutti gli altri tubi ultracentrifuga sono state estratte.
   14. Ripetere i passaggi 2.3.10-2.3.13 fino a quando tutte le bande target sono state estratte da tutti i tubi ultracentrifuga.
   15. Approccio alternativo all'estrazione delle bande target come descritto nei passaggi da 2.3.10 a 2.3.13
       1. Rimuovere lentamente il liquido che si sovrappone alla fascia target usando una pipetta. Una volta nella banda bersaglio, estrarre utilizzando una pipetta e conservare il virus in un tubo conico da 50 ml.
          NOTA: ciò consente di riutilizzare i tubi ultracentrifuga.
4. Rimozione di iodixanol dalla soluzione di virus
   NOTA: la banda contenente NDV appare ad una densità di iodixanolo compresa tra il 15% e il 16%. La concentrazione di iodixanolo nella soluzione può essere determinata misurando l'assorbanza a 340 nm in riferimento ad una curva standard (Figura supplementare S1). Questa fase può essere omessa in quanto non sono stati osservati effetti avversi o tossicità acuta quando le soluzioni di iodixanolo di questa concentrazione sono state somministrate a topi C57BL/6.
   1. Prewet una cassetta di dialisi cut-off a peso molecolare da 0,5-3 mL 10 kDa immergendola in PBS per 1 min.
      NOTA: La membrana per dialisi dovrebbe cambiare da liscia ad avere un aspetto arruffato o irregolare. Se il volume del virus estratto supera i 10 ml, devono essere utilizzate due cassette per dialisi da 0,5-3 ml o una cassetta per dialisi da 5-12 mL.
   2. A seconda dei casi, utilizzare una siringa da 5 o 10 mL e un ago smussato da 18 G x 1,5 pollici per raccogliere il virus dal tubo conico da 50 ml.
   3. Utilizzare la siringa per entrare nella cassetta di dialisi, facendo attenzione a non perforare la membrana e iniettare il virus.
      NOTA: la cassetta per dialisi può essere ruotata per manipolare il posizionamento della sacca d'aria nella cassetta. La sacca d'aria deve essere rimossa prima di rimuovere l'ago dalla cassetta.
   4. Riempire un becher da 1 L con 1 PBS sterile, posizionare una barra di agitazione e la cassetta di dialisi all'interno e coprire. Incubare a 4 °C mescolando delicatamente.
      NOTA: utilizzare polistirene espanso estruso e una fascia elastica per fissare la cassetta di dialisi in modo che galleggi nel PBS. La cassetta potrebbe gonfiarsi leggermente a causa del buffer ML.
   5. Dopo 1-2 ore, sostituire con 1 pbS fresco e continuare a incubare a 4 °C per altre 8-10 ore con un leggero rimescolamento.
      NOTA: Questo può essere fatto anche durante la notte.
   6. Sostituire con 1x PBS fresco ancora una volta, incubando a temperatura ambiente per 1-2 ore.
5. Concentrazione della soluzione virale
   1. Rimuovere la cassetta per dialisi dal tampone di dialisi (Figura 4C) e inserirla in un piccolo sacchetto di plastica sigillabile. Aggiungere 15-25 ml di polietilenglicole al 40% da 20.000 MW in modo che la cassetta di dialisi sia completamente sommersa.
   2. Incubare a temperatura ambiente con dondolo. Controllare periodicamente il volume del virus nella cassetta utilizzando una siringa da 5 o 10 ml e un ago smussato da 18 G x 1,5 pollici.
      NOTA: la quantità di tempo necessaria per concentrare il virus varia in base al volume iniziale e al volume finale desiderato. In genere, il volume finale desiderato è compreso tra 1 e 1,5 ml indipendentemente dal volume iniziale del fluido allantoico. Quando si controlla il volume, fare attenzione a non utilizzare la stessa porta in quanto ciò comprometterebbe l'integrità della porta e potrebbe comportare la miscelazione della soluzione di polietilenglicole e del virus.
   3. Prima di rimuovere il virus concentrato dalla cassetta di dialisi, sciacquare brevemente la cassetta in 1x PBS e riempire d'aria un ago smussato da 18 G x 1,5 pollici.
   4. Inserire la siringa riempita d'aria nella cassetta di dialisi e premere lo stantuffo. Ruotare l'apparecchio in modo che il virus concentrato possa essere rimosso senza rimuovere l'aria introdotta.
   5. Erogare il virus concentrato in un tubo conico da 50 ml, annotando il volume erogato.
   6. Utilizzando la stessa siringa e ago, iniettare una quantità appropriata di saccarosio al 60% nella cassetta di dialisi in modo che, se combinato con il virus precedentemente rimosso, sia ad una concentrazione finale del 5% di saccarosio.
   7. Utilizzare le dita guantate per massaggiare la membrana per rimuovere il virus residuo che potrebbe aver aderito alla membrana, facendo attenzione a non danneggiarlo. Rimuovere parte dell'aria in eccesso nella cassetta di dialisi per facilitare il processo di spostamento.
   8. Combinare questo lavaggio con il virus già nel tubo conico da 50 ml.
      NOTA: il virus è ora in saccarosio al 5% e pronto per essere dispensato in aliquote da 20 μL, 50 μL, 100 μL o 200 μL e conservato a -80 °C. In alternativa, per la conservazione a lungo termine, l'NDV può essere liofilizzato e conservato a 4 °C come descritto al paragrafo 2.6.
6. Liofilizzazione di NDV
   1. Liofilizzare il virus aliquotato in tubi centrifughi da 1,5 mL o tubi conici da 15 mL a 44 × ^10-3 MBAR e -52 °C per 16 ore.
   2. Conservare i campioni liofilizzati a 4 °C senza riduzione significativa del titolo virale.

3. Saggi di controllo qualità

1. Isolamento dell'RNA virale e PCR a trascrizione inversa per la conferma del genoma
   1. Scongelare un'aliquota virale di 20 μL. Seguire il protocollo di isolamento dell'RNA virale fornito con il kit.
   2. Utilizzare immediatamente l'RNA isolato come modello per la PCR a trascrizione inversa (RT-PCR) o memorizzarlo a -80 °C.
   3. Preparare le reazioni di trascrizione inversa come descritto nel protocollo fornito dal produttore.
   4. Utilizzare il cDNA risultante come modello per varie reazioni PCR di controllo qualità per confermare il patotipo NDV (Tabella 1, set di primer proteico F) e la presenza di elementi di controllo genico richiesti (Tabella 1, Set di primer Transgene).
      NOTA: i primer devono essere progettati in base al ceppo di NDV che viene propagato.
      1. Per sequenziare il sito di scissione della proteina F, il principale determinante del patotipo, utilizzare il set di primer della proteina F (Tabella 1). Cerca un prodotto PCR di 435 paia di basi di lunghezza.
         NOTA: Qui, i primer sono stati progettati sulla base del ceppo LaSota di NDV (adesione Genbank AF077761.1). È ben noto che l'espressione ottimale del transgene si verifica quando un transgene estraneo viene inserito tra i geni P e M²⁴.
      2. Utilizzare il set di primer transgenico per confermare l'integrità degli elementi di inizio del gene e degli elementi finali del gene del transgene. Sequenziare il prodotto PCR per confermare l'inizio del gene e l'integrità della sequenza di fine genica.
   5. Invia i prodotti PCR per il sequenziamento del DNA e confrontali con il modello per l'omologia.
2. Colorazione SDS PAGE e Coomassie per rilevare proteine contaminanti
   1. Fondere un gel SDS PAGE con gradiente di densità preparando prima soluzioni di poliacrilammide al 6% e al 15% (Tabella supplementare S1). Utilizzare una pipetta da 10 mL per prelevare 5 mL della soluzione al 15%, seguiti da 5 mL della soluzione al 6%.
   2. Rimuovere la pipetta dalla soluzione e generare una bolla d'aria aspirando brevemente l'aria.
      NOTA: quando la bolla d'aria viaggia verso l'alto, la soluzione viene miscelata per creare la sfumatura SDS PAGE.
   3. Erogare la soluzione nell'apparato di fusione e lasciarla solidificare per 30 minuti.
   4. In un volume finale di 20 μL, combinare un'aliquota del virus con un tampone riducente 4x (Tabella supplementare S1) in modo che la concentrazione finale sia 1x e far bollire per 10 minuti a 95 °C in un termociclatore. Caricare almeno 1 × 10⁷ PFU del virus.
   5. Immergere la pagina SDS nel buffer in esecuzione (tabella supplementare S1) e caricare i campioni.
   6. Eseguire il gel a 120 V per 1-1,5 ore.
   7. Rimuovere il gel dal buffer in esecuzione e trasferirlo in un contenitore più piccolo.
   8. Aggiungere la soluzione colorante Coomassie (Tabella supplementare S1) per coprire il gel. Incubare a temperatura ambiente per 4-5 ore.
   9. Rimuovere la soluzione colorante e aggiungere la soluzione di destain (Tabella supplementare S1), incubando per 4-8 ore a temperatura ambiente con agitazione. Modificare la soluzione destain da tre a quattro volte.
      NOTA: Il gel deve essere chiaro e il suo colore deve essere come era prima della colorazione.
   10. Immagine del gel su un'impostazione colorimetrica. Vedere la Figura 5 per un'immagine rappresentativa di un gel SDS PAGE macchiato con Coomassie contenente campioni di liquido allantoico e virus purificato.
3. Quantificazione del titolo virale infettivo mediante dose infettiva di coltura tissutale mediana (TCID₅₀) e saggio di immunofluorescenza
   NOTA: le celle Vero possono essere utilizzate come alternativa alle celle DF1; tuttavia, l'effetto citopatico (CPE) è meno pronunciato nelle cellule Vero. NDV che ospita la mutazione L289A, che migliora la fusogenicità, ed esprime GFP tra i geni P e M viene utilizzato in questo test.
   1. Seminare una piastra a 96 pozzetti di cellule DF1 a 20.000 cellule/pozzetto in un volume di 80 μL il giorno prima di utilizzare DMEM integrato con il 2% di siero bovino fetale (FBS) e 125 μg/mL di tripsina. Incubare le cellule a 37 °C e 5% CO₂.
   2. Il giorno dopo, scongelare un'aliquota di virus di 20 μL sul ghiaccio.
   3. Utilizzare tubi da 1,5 ml per preparare diluizioni seriali. Iniziare diluendo 10 μL del virus con 990 μL di PBS per preparare una diluizione ^10-2 . Preparare tutte le altre diluizioni, fino a ^10-10 al minimo, realizzate con 900 μL di PBS e l'aggiunta di 100 μL della diluizione precedente.
      NOTA: utilizzare una nuova punta della pipetta quando ci si sposta tra le diluizioni.
   4. Utilizzare 20 μL di ogni diluizione per infettare ogni pozzetto della piastra a 96 pozzetti come mostrato nella Figura 6.
      NOTA: Il volume finale in ogni pozzo sarà di 100 μL.
   5. Incubare la piastra per almeno 48 ore a 37 °C e 5% di CO₂, prima di esaminare la presenza di CPE/GFP o eseguire un test di immunofluorescenza indiretta (IFA).
      NOTA: In queste condizioni di coltura, la CPE è evidente dopo 10 ore (Figura 7A-D), aumentando nelle successive 24 ore (Figura 7E-H). La piastra può essere incubata più a lungo per migliorare l'intensità del CPE se segnata da GFP o CPE.
      1. Se si assegna un punteggio per CPE o GFP e NON si esegue IFA, andare al passaggio 3.3.18.1.
   6. Se si esegue IFA, sciacquare le cellule due volte con 100 μL di 1x PBS.
   7. Aggiungere 100 μL di paraformaldeide al 4% diluita in PBS a ciascun pozzetto e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
   8. Lavare le celle 3x 5 min ciascuna con 100 μL di 1x PBS, 0,1% Tween 20 (0,1% PBS-T).
   9. Permeabilizzare le cellule con l'aggiunta di 100 μL di NP-40 allo 0,1% in PBS e incubarle a temperatura ambiente per 10 min.
   10. Lavare le celle 3x 5 min con 100 μL di PBS-T allo 0,1%.
   11. Aggiungere 100 μL di tampone bloccante composto da siero di capra normale al 5% (V/V) diluito in PBS-T allo 0,1% per 1 ora a temperatura ambiente o durante la notte a 4 °C.
   12. Aggiungere 100 μL per pozzetto di anticorpo ribonucleoproteico anti-NDV primario di topo diluito in PBS-T allo 0,1% a 1 μg/mL, incubando per 1 ora a temperatura ambiente o durante la notte a 4 °C.
   13. Lavare le celle 3x per 5 min in 100 μL di PBS-T allo 0,1%.
   14. Aggiungere 100 μL di un anticorpo secondario anti-topo AlexaFluor 488 Goat diluito in PBS-T allo 0,1% a 2 μg/mL. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
   15. Lavare le celle 3x per 5 min in 100 μL di PBS-T allo 0,1%.
   16. Dopo il lavaggio finale, lasciare le cellule in 100 μL di PBS-T allo 0,1%.
   17. Immagina i pozzetti usando un microscopio fluorescente invertito.
   18. Quando si esegue IFA, cercare una fluorescenza maggiore di quella osservata nei pozzetti di controllo negativi, indicando che il pozzo è positivo per NDV come mostrato nella Figura 8.
       1. Cerca la presenza di sincizia e grandi cellule arrotondate che caratterizzano NDV CPE. Se si segnano pozzi infettati da un virus che esprime GFP, cercare la presenza di GFP.
   19. Inserire le informazioni appropriate nel calcolatore del titolo Spearman-Karber²⁶ per determinare la PFU/mL del virus (Tabella 2). Vedere la Figura 6 per un esempio di piastra di_titolazione TCID 50.
4. Quantificazione del titolo virale mediante PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR)
   NOTA: si consiglia un kit qRT-PCR in un solo passaggio per risparmiare tempo e ridurre la manipolazione dei campioni. Un test basato su sonda viene utilizzato per aumentare la specificità di rilevamento per le sequenze di virus.
   1. Creare una curva standard di una quantità nota delle sequenze virali (Figura supplementare S2A,B).
      NOTA: Questo può essere fatto acquistando un frammento sintetico di DNA a doppio filamento da 500 bp del gene NDV L. La sequenza per un frammento di 500 bp del gene NDV L può essere vista nella Figura supplementare S2C.
   2. Convertire la quantità del frammento di DNA del virus (di solito fornito come nanogrammi o femtomoli dai produttori) nel numero di molecole o copie del frammento di DNA utilizzando il numero di Avogadro e la formula delle moli in molecole (Eq (1)).
      (1)
   3. Preparare i campioni della curva standard preparando una serie di diluizione decuplicata di copie di frammenti di DNA di virus noti, a partire da 1,00 ×^{10 10} copie fino a 1,00 × 10⁰ copie.
   4. Per determinare la quantità di NDV RNA in campioni sconosciuti, estrarre l'RNA NDV utilizzando un kit di estrazione dell'RNA. Seguire il protocollo fornito con il kit. Una volta estratto l'RNA, procedere con il protocollo raccomandato fornito nel kit qRT-PCR one-step.
   5. Eseguire le reazioni in uno strumento PCR in tempo reale con le seguenti condizioni di temperatura e ciclo: 1) un ciclo di trascrizione inversa a 55 °C per 10 min; 2) un ciclo di denaturazione iniziale a 95 °C per 1 min; e 3) 40 cicli di denaturazione (95 °C per 10 s), estensione (60 °C per 30 s) e acquisizione del segnale fluorescente.
   6. Una volta completato il test qRT-PCR, generare la curva standard basata sui campioni di curva standard utilizzando il software dello strumento PCR in tempo reale (Figura supplementare S2A,B).
      NOTA: Il software calcolerà anche la quantità di NDV RNA in campioni sconosciuti in base alla curva standard.
5. Test di sicurezza per la tossicità acuta nei topi
   1. Iniettare 1 × 10⁸ PFU del virus per via endovenosa attraverso la vena della coda in tre topi BALB/C di 8 settimane per valutare la tossicità acuta.
   2. Monitorare i topi per eventi avversi come perdita di peso (>20%), postura curva, cappotti arruffati, letargia e cambiamenti nella respirazione. Valutare da tre a quattro volte al giorno nelle prime 48 ore. Poiché i topi dovrebbero iniziare a riprendersi dopo 48 ore, monitorarli una o due volte al giorno fino a quando non si sono completamente ripresi.
      1. Somministrare cure saline per via sottocutanea e di supporto secondo necessità. Ad esempio, integrare con gel dietetico di recupero, burro di arachidi o utilizzare puck di calore. Eutanasia topi che hanno raggiunto criteri endpoint, come delineato dalle linee guida istituzionali per la cura degli animali, per sovradosaggio di isoflurano seguito da lussazione cervicale.

Raccolta del fluido allantoico
Poiché il liquido allantoico viene raccolto da uova di gallina embrionate, dovrebbe apparire chiaro e trasparente. Se il fluido appare opaco e giallo, questo indica la presenza di contaminanti. L'inclusione di questo fluido allantoico durante la purificazione impedirà il processo di purificazione, poiché la pressione aumenterà rapidamente e supererà i 10 psi, con conseguente taglio del virus e perdita del virus infettivo. Il liquido allantoico che appare sanguinante suggerisce che le uova sono state inoculate con troppi PFU di virus. La resa di questo lotto di uova sarà significativamente inferiore al previsto ed è improbabile che questo virus possa essere utilizzato in vivo. Gli ovuli inoculati con NDV lentogeno dovrebbero avere ancora una vascolarizzazione evidente dopo 72 ore e gli embrioni non dovrebbero essere morti, come visualizzato nella Figura 1. Se lo hanno fatto, questo suggerisce che l'embrione è stato danneggiato o contaminato in qualche modo.

Ultracentrifugazione del gradiente di densità dello iodixanolo
Dopo l'ultracentrifugazione, una banda bianca contenente NDV ad alto titolo deve essere posizionata tra i gradienti del 10% e del 20% (Figura 4B).

Colorazione Coomassie di gel SDS-PAGE
La Figura 5 mostra la differenza tra uno stock di virus non purificato (Lane 2) e uno stock di virus purificato (Lane 3). Un confronto tra i due mostra una significativa diminuzione dell'intensità delle bande proteiche contaminanti e l'emergere di bande NDV dominanti nello stock di virus purificato.

Quantificazione del titolo virale mediante TCID50
Se si utilizzano le condizioni raccomandate quando si tiziona uno stock concentrato di NDV, il CPE dovrebbe essere evidente dopo 24 ore (Figura 6). Rispetto a un ceppo lentogeno NDV di titolo simile, il CPE è più pronunciato nel ceppo mesogenico nello stesso punto temporale.

Analisi di tossicità acuta in topi BALB/C di 8 settimane
Quando 1 × 108 PFU sono stati somministrati per via endovenosa, i topi devono essere monitorati per effetti avversi come perdita di peso >20%, pelo arruffato, postura curva e respirazione anormale. Entro le prime 24-36 ore, i topi inizieranno a perdere peso e probabilmente svilupperanno cappotti arruffati e una postura curva. Tuttavia, se il virus è sufficientemente puro, i topi iniziano a riprendersi, come osservato dall'aumento di peso e dal miglioramento della postura e delle condizioni del mantello dopo 36 ore. I topi che non mostrano questi segni di recupero entro 36 ore devono continuare a essere attentamente monitorati per i criteri endpoint. In genere, ciò è accaduto a causa di un tittering impreciso, potenzialmente dovuto all'aggregazione di particelle virali.

Figura 1: Infezione e raccolta di NDV da uova di gallina embrionate esenti da agenti patogeni specificati. (A) Vascolarizzazione simile a una rete (frecce) che dovrebbe essere evidente dopo 9 giorni di incubazione oltre al movimento dell'embrione. 'X' indica l'interfaccia tra la membrana corioallantoica e la cavità dell'aria, e dove il foro dovrebbe essere creato per l'inoculazione dell'uovo. (B) Immagine raffigurante un embrione morto. Si noti l'assenza di vascolarizzazione weblike. Si osserverà anche una mancanza di movimento dell'embrione. (C) Diagramma dei componenti di un uovo di gallina embrionato che mostra le posizioni della cavità dell'aria, del sacco vitellino, del sacco amniotico, della membrana corioallantoica e del liquido allantoico. (D) Rimozione del guscio per esporre la membrana coriallantoica. (E) Illustra come dovrebbero apparire il liquido allantoico e l'embrione dopo l'apertura della membrana corioallantoica. Abbreviazione: NDV = virus della malattia di Newcastle. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Schema che delinea l'assemblaggio generale dell'apparecchio utilizzato per la filtrazione in profondità. Assicurarsi che il manometro sia installato a monte del filtro di profondità. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Configurazione della filtrazione a flusso tangenziale nelle sue diverse configurazioni. Le frecce mostrano la direzione del flusso del fluido. (A) Illustrazione di come viene assemblata la cassetta TFF. (B) Schema del sistema TFF nella sua configurazione "aperta" utilizzata durante la purificazione e la concentrazione del fluido. (C) Schema della configurazione del TFF quando il fluido viene eluito dal sistema, come utilizzato durante l'eluizione del virus e della soluzione detergente. (D) Schema del sistema TFF nella sua configurazione "chiusa", che viene utilizzato durante la pulizia del sistema TFF. Abbreviazione: TFF = Filtrazione a flusso tangenziale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Ultracentrifugazione e dialisi del gradiente di densità del virus concentrato da TFF. (A) Schema che mostra la composizione del gradiente di densità dello iodixanolo. (B) Modello di bande virale a seguito di ultracentrifugazione del virus prodotto utilizzando il tampone ML durante il processo di purificazione. La banda principale contenente virus è indicata da un ovale nero. (C) Dimensioni tipiche di una cassetta di dialisi caricata con 10 mL di virus preparata attraverso un gradiente di iodixanolo al termine della procedura di dialisi. Abbreviazione: TFF = Filtrazione a flusso tangenziale; ML = Mannitolo-Lisina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Gel SDS-PAGE tinto con Coomassie. Gel confronta la presenza di proteine contaminanti tra scorte NDV mesogeniche non purificate (corsia 2) e purificate (corsia 3) quando sono stati caricati 1 × 105 PFU. Corsie 1 e 4 = scala a peso molecolare (MW). NDV HN, F0 e le sue subunità successive alla scissione, F1 e F2, insieme ai rispettivi pesi molecolari27 sono mostrati in carattere bianco. Abbreviazioni: SDS-PAGE = elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide; NDV = virus della malattia di Newcastle; PFU = unità formanti placche; HN = emoagglutinina; F0 = Fusione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Esempio di un layout di piastra a 96 pozzetti utilizzato per determinare il titolo del virus da TCID50. La piastra è divisa in 12 colonne, con ogni colonna che rappresenta una diversa diluizione seriale. I pozzetti positivi (determinati da CPE, espressione transgenica o IFA) sono indicati in grigio. Dato il numero di pozzi positivi in questo esempio, il titolo previsto dopo aver utilizzato il calcolatore del titolo Spearman-Karber (Tabella 2) è elencato sia in TCID50/mL che in PFU/mL. Abbreviazioni: TCID50 = dose infettiva mediana di coltura tissutale; CPE = effetto citopatico; IFA = saggio di immunofluorescenza; PFU = unità formanti placche. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Confronto del CPE a seguito di infezione di cellule DF1 con NDV lentogeno o mesogenico. Un MOI di 0,5 è stato utilizzato dopo 10 ore di incubazione (A-D) o 24 ore di incubazione (E-H) in diverse condizioni di coltura di DMEM + 15% FBS, DMEM + 15% FBS + 5% liquido allantoico, o DMEM + 2% FBS + 125 μg / mL di tripsina. Barre di scala = 200 μm. Abbreviazioni: CPE = effetto citopatico; NDV = virus della malattia di Newcastle; MOI = molteplicità di infezione; FBS = siero bovino fetale; DMEM = il mezzo dell'aquila modificata di Dulbecco. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Un esempio di una situazione in cui l'IFA è necessario per titer un NDV lentogeno privo di un transgene GFP. Le cellule Vero sono state coltivate in DMEM contenente il 2% di FBS e 125 μg/mL di tripsina. Le immagini sono state prese dalla diluizione seriale 10-7 . (A) Immagine Brightfield di cellule infette. (B) Illustra l'aspetto tipico delle cellule colorate quando l'IFA viene utilizzato per rilevare il virus. (C) Un'immagine unita di (A) e (B). Barre di scala = 100 μm. Abbreviazioni: IFA = saggio di immunofluorescenza; NDV = virus della malattia di Newcastle; GFP = proteina fluorescente verde; FBS = siero bovino fetale; DMEM = il mezzo dell'aquila modificata di Dulbecco. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Primer PCR e RT-qPCR per il rilevamento di segmenti genici del virus della malattia di Newcastle. Set di primer utilizzati per l'amplificazione specifica di due regioni del genoma NDV. Il set di primer della proteina F provoca l'amplificazione di una regione della proteina F che si estende sul sito di scissione della proteina F. Il set di primer transgenici amplifica la regione intergenica tra i geni della fosfoproteina e della matrice, il sito di inserimento transgenico ottimale. Questa tabella contiene anche le sequenze di primer che prendono di mira il gene virale L21 e la sonda del gene L utilizzata nel test qRT-PCR. Abbreviazioni: PCR = reazione a catena della polimerasi; RT-qPCR = PCR quantitativa a trascrizione inversa; NDV = virus della malattia di Newcastle. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Calcolatrice del titolo Spearmann-Karber. Questo foglio di calcolo interattivo contiene il flusso di lavoro e le equazioni appropriate per determinare la concentrazione del virus utilizzando i risultati TCID50 basati sull'inoculo del pozzo in ml, sullo schema di diluizione e sul numero di repliche per diluizione. La concentrazione è riportata come volume in ml necessari per infettare il 50% della coltura tissutale (TCID50) e unità di formazione della placca per mL di sospensione virale. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Figura supplementare S1: Determinazione delle concentrazioni di iodixanolo. (A) Curva standard generata dall'assorbanza di soluzioni di concentrazione nota di iodixanolo a 340 nm. (B) La curva standard e l'equazione di (A) sono state utilizzate per determinare la concentrazione di iodixanolo in soluzione dopo ultracentrifugazione del gradiente di densità, dialisi e concentrazione di polietilenglicole. Fare clic qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S2: Amplificazione e curva standard generata dal saggio qRT-PCR di frammento sintetico di DNA a doppio filamento da 500 bp del gene NDV L. L'amplificazione (A) e la curva standard (B) sono state create da campioni contenenti una diluizione seriale decuplicata (1,0 × 109 copie a 1,0 × 100 copie) del frammento di DNA. Per l'amplificazione e la curva standard, i campioni contenenti 1,0 × 101 copie e 1,0 × 100 copie erano al di sotto della soglia e non producevano un valore del punto di incrocio inferiore a 35 Cp. La curva standard finale è stata generata sulla base di campioni contenenti 1,0 × 109 copie a 1,0 × 102 copie del frammento di DNA. (C) Sequenza del DNA del frammento del gene 500 nucleotide NDV L utilizzato per generare la curva standard nel protocollo qRT-PCR. Abbreviazioni: PCR = reazione a catena della polimerasi; RT-qPCR = PCR quantitativa a trascrizione inversa; NDV = virus della malattia di Newcastle; Cp = punto di attraversamento. Fare clic qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S3: Caricamento ed estrazione di NDV dalla cassetta di dialisi. (A) La dimensione tipica di una cassetta per dialisi dopo essere stata caricata con circa 10 ml di soluzione contenente virus isolata da un gradiente di densità di saccarosio e ripresa alla fine della fase di dialisi. (B) Un esempio dei risultati ottenuti utilizzando l'ultracentrifugazione del gradiente di densità di iodixanolo senza integrazione del tampone ML. Encircled è la banda del virus di destinazione per la rimozione. Indicato dalle frecce è una banda aggiuntiva che può contenere virioni danneggiati. Si noti che dopo l'incorporazione del buffer ML nel processo di purificazione, questa banda non è più evidente. Abbreviazioni: NDV = virus della malattia di Newcastle; ML = mannitolo-lisina. Fare clic qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare S1: fornisce i passaggi necessari per generare soluzioni western blot e buffer ML utilizzati durante il processo di purificazione. Abbreviazioni: SDS-PAGE = elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide; TEMED = tetrametiletilendiammina; ML = Mannitolo-lisina. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.