Summary
鉄(Fe)バイオアベイラビリティに関するCaco-2細胞バイオアッセイは、食品、食品、サプリメント、食事、さらには食事療法からのFeバイオアベイラビリティを評価するための費用効果が高く汎用性の高いアプローチです。ヒトの研究に対して徹底的に検証されており、Feバイオアベイラビリティの研究のための最先端を表しています。
Abstract
Feバイオアベイラビリティに関する知識は、食品中のFeの栄養価を評価するために重要です。Feバイオアベイラビリティの in vivo 測定は、コスト、スループット、および食品Feの同位体標識に固有の警告によって制限されます。したがって、高スループットで費用対効果の高いアプローチに対する重要なニーズが存在します。Caco-2細胞バイオアッセイは、このニーズを満たすために開発されました。FeバイオアベイラビリティのためのCaco-2細胞バイオアッセイは、Caco-2として知られるヒト腸管上皮細胞株の培養と組み合わせたシミュレートされた胃および腸の消化を利用します。Caco-2細胞では、Feの取り込みは、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって容易に測定されるFe貯蔵タンパク質であるフェリチンの細胞内形成を刺激します。フェリチンはFeの取り込みに比例して形成されます。したがって、Caco-2細胞フェリチン産生を測定することにより、模擬食品消化物から腸細胞への腸内Fe取り込みを評価することができます。
このアプローチにより、モデルは食品Feのバイオアベイラビリティを決定する重要な初期ステップを再現します。1998年の開始以来、このモデルアプローチは、ヒトFeバイオアベイラビリティに影響を与えることが知られている要因と厳密に比較されてきました。さらに、それは並行研究に適用されており、Fe生物強化作物を評価する3つの人間有効性研究があります。すべての場合において、バイオアッセイは、因子、作物、および全体的な食事からFeバイオアベイラビリティの相対量を正しく予測しました。この論文は、FeバイオアベイラビリティのためのCaco-2細胞バイオアッセイを実施するために必要な in vitro 消化プロセスおよび細胞フェリチンELISAと組み合わせたCaco-2細胞培養の詳細な方法を提供します。
Introduction
FeバイオアベイラビリティのためのCaco-2細胞バイオアッセイの研究の必要性と利点を完全に理解するには、まず、このモデルの出現前に実施されていたアプローチを理解する必要があります。in vivoでの食品または食事からのFeバイオアベイラビリティの測定は、特に食事または食事で食品の組み合わせを評価する必要がある場合、困難な作業です。同位体標識は、過去50年間にわたってFeバイオアベイラビリティを測定するための最も一般的なアプローチでした1。同位体標識は、単食および複数食の研究に使用され、長期の研究には実用的ではありません。57Feや58FeなどのFeの安定同位体が最も一般的に使用されています。しかし、59Feなどの放射性同位元素では、全身計数2を利用した研究が行われています。植物性食品の場合、同位体標識は外因性または内因性標識によって行われています。外因性標識のために、既知量の同位体が食品または食事に添加される。次に、食品を混合し、消費前に15〜30分の平衡期間をプロトコルに組み込みます。水耕栽培培養(同位体を養液に添加して、成長および発達する間に植物に取り込む)は、植物性食品の固有の表示に必要です。各アプローチの長所と短所については、以下で説明します。
外因性同位体標識
1970年代初頭から中期にかけて、食品中のFeの外因性標識によってヒトのFe吸収が研究され、食品または食事中の既知の量のFeに既知量の同位体が添加され、混合され、測定前に15〜30分間平衡化されました。様々な量の外因性同位体が使用されており、真性Feの1%から100%の範囲であるが、最も一般的には7%〜30%3の範囲である。外因性標識は、外因性Fe同位体が食品または食事の内因性Feと完全に平衡化されるという仮定に基づいています。次に、外因性同位体吸収が測定され、外因性同位体の各原子が計算されて、所定の数の固有Fe原子を表します。この計算は、相対モル量に基づいています。1983年に、この手法の複数の検証研究がレビュー論文4にまとめられました。この手法の検証は、外因性同位体標識の吸収率と内因性同位体標識の吸収率を同時に比較することによって行われました。したがって、外因性吸収と内因性吸収の比が1に近いことは、Feの各プールが等しく吸収されたことを示唆している。当時、1に近い比率は、外因性同位体と食品または食事の固有Feとの平衡を表すとも考えられていました。外因性Fe吸収と内因性Fe吸収の比は平均値0.40から1.62の範囲であり、63の比較で平均(±SD)比は1.08±0.14であった。本レビューで要約したすべての研究において、外因性標識と内因性Feとの平衡を直接テストしたものはなかったことに注意することが重要です。要約すると、レビューの著者は次のように結論付けました。
「外因性タグ技術は、特定の実験条件下でいくつかの食品に有効であることが証明されています。しかし、この方法は、すべての種類の食品に関してまだ証明されているとは言えません。外因性タグ法は、不溶性の鉄を含む食事からの鉄吸収を監視するのには適していません。この技術の有効性は、外因性タグがすべての内因性の非ヘム食品鉄と完全に交換するという基本的な仮定に依存しています。現在のところ、異なる形態の非ヘム鉄が外因性タグによってどの程度完全に標識されているかは知られていない。これは、鉄阻害剤が食品中のある種の非ヘム鉄とは異なる方法で外因性タグに影響を与える可能性があることを示唆している研究に照らして重要です。完全な同位体交換を損なう可能性のある食物因子に関する研究は乏しい。したがって、外因性タグ研究からのバイオアベイラビリティデータの解釈には、食品または食事に存在する可能性のある交換阻害剤を考慮する必要があります。」
1983年以来、Fe 3,5の外因性標識の精度を評価した2つの研究のみが発表されています。これらの両方の研究において、外因性同位体標識の平衡化は、これらの研究では主食作物であった食品の固有のFeと直接比較されました。白、赤、黒豆の品種が、レンズ豆とトウモロコシとともにテストされました。確立されたin vitro消化技術とFeの溶解度と沈殿の測定を使用して、両方の研究は、外因性同位体標識が一貫して完全な平衡化をもたらさないことを示し、一部の豆品種では、外因性同位体の量と種皮の色に応じて不均衡が非常に高くなる可能性があるという証拠があります3。1983年のレビュー論文の結論にもかかわらず、豆の外因性標識研究は継続された6,7,8,9,10,11,12。これらの研究のいずれも、外因性標識と内因性Feとの平衡化のテストは含まれていなかった。
本質的ラベリング
Feバイオアベイラビリティの評価のための植物性食品の固有の標識は、外因性標識における平衡化の精度の問題を排除します。しかしながら、このアプローチは、水耕栽培のための温室スペースを必要とするため、大量の材料を生み出すことができない。水耕栽培は労働集約的であり、大量の高価な安定同位体を必要とし、そしてしばしば収量および種子Fe濃度の点で異なる植物の成長をもたらす。コストがかかるため、内因性標識は、Feの取り込みの根底にあるメカニズムや食品からのFeの取り込みに影響を与える要因を理解することを目的とした小規模な研究にのみ適しています。主食作物の1〜2 kgの生産には、同位体と水耕栽培のアプローチにもよりますが、材料だけで約20,000ドルから30,000ドルの費用がかかります13,14。
同位体標識に関連する課題を考慮して、研究者はin vitroアプローチの開発を目指しました。初期の方法は、生物学的利用能の推定値としてFe溶解度またはFe透析可能性の測定と相まって、シミュレートされた胃および腸の食物を利用しました15。このような研究では、Feは可溶性であり、化合物に強固に結合しているため、交換不可能であり、バイオアベイラビリティの過大評価につながる可能性があるため、Fe透析可能性はバイオアベイラビリティの一貫した尺度ではないことがすぐにわかりました。これらの課題に対処するために、ヒト腸管細胞株を利用する方法論が進化し、それによって生体成分が追加され、Fe取り込み16の測定が可能になりました。ヒト腸細胞であるCaco-2細胞は、ヒト結腸癌に由来し、栄養摂取研究に広く使用されています。この細胞株は、培養において、細胞が小腸のブラシ境界細胞と同様に機能する腸細胞に分化するので有用である。研究によると、Caco-2細胞は、Feの取り込みに影響を与える因子に対して適切なトランスポーターと応答を示します17,18。
Caco-2細胞におけるFe取り込みを測定するために放射性同位元素を利用した最初の研究は、Caco-2細胞のフェリチン形成に基づいてFe取り込みを測定するように改良された。Caco-2細胞フェリチン測定は、サンプルスループットを向上させ、放射性同位元素の取り扱いと外因性Feと内因性Fe19,20の平衡化の問題を打ち消しました。フェリチン形成によるFe取り込みの測定により、研究者は複雑な食事を含む幅広い食品を研究することができました21。したがって、Caco-2細胞のFe取り込みと組み合わせたシミュレートされた(in vitro)消化は、食品からのFe取り込みのより良い生理学的評価を提供しました。このモデルは主にFeバイオアベイラビリティの相対的な違いを決定することに注意することが重要です。多くの有用な細胞株と同様に、Caco-2細胞も応答性にばらつきを示していますが、食品間のFe取り込みに一貫した相対的な違いを維持しています。適切な技術と細部への注意深い注意は、Caco-2細胞における一貫した細胞フェリチン形成応答を改善することができる。
インビトロ消化/Caco-2細胞モデルは、Caco-2細胞バイオアッセイとしても知られています。このアッセイは、ヒトおよび動物の研究との直接比較によって徹底的に検証されています22。バイオアッセイとヒト有効性試験との直接並行比較に加えて、このモデルは、Fe取り込みにおいてヒトのそれと質的に類似した応答を示すことが示されている18,19,23。したがって、in vitroアプローチとして、Caco-2細胞バイオアッセイは、食品からのFe栄養を評価するためのスクリーニングツールとして高い信頼性を保証します。それは多くの食品および食品に広く適用されている21、24、25、26、27、28。
1998年の開始以来、Caco-2細胞バイオアッセイは、腸のFe摂取に影響を与える要因の特定に役立ったため、Fe栄養の分野を進歩させてきました。そうすることで、このモデルは、より決定的で費用のかからない人間の研究のための研究目標を開発し、洗練させました。また、モデルの使用は、いくつかの人間の試験の必要性を否定すると主張することもできます。
要約すると、食品または食事からのFeの相対送達は、Caco−2細胞バイオアッセイを用いて測定することができる。試験食中のFeの量に関係なく、バイオアッセイは、腸細胞に取り込まれるFeの相対量、つまり吸収プロセスの最初のステップを定義します。これは、Feバイオアベイラビリティを定義する上で最も重要なステップであり、ほとんどの場合、目標は食品中のFeの栄養価を改善するか、少なくとも監視する目的で測定することです。鉄の状態は吸収によって調節され、したがってFeの取り込みは栄養ニーズを満たすためにFe欠乏個体でアップレギュレーションされることを考えると、モデルの標準条件は、細胞によるFeの取り込みが最大になるように設計されている。このようにして、バイオアッセイは、Feを送達する食品の可能性の真の尺度を提供します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
注:読者にとって便利な参照ポイントとして、以下の方法論では、バイオアッセイの実行において、20の実験サンプルからのFeバイオアベイラビリティの測定に必要な特定の培養条件と材料、および必要な品質管理について説明します。この容量を超えてサンプル数を増やすことは、バイオアッセイ内のさまざまな細胞培養および in vitro 消化ステップに必要な時間のため、推奨されません。
1.サンプル量の選択
- 固体または液体の食品の場合、テストするサンプルを代表すると見なすことができる食品の量を決定します。
- 豆品種からのFeバイオアベイラビリティの試験では、100〜150 gの豆種子を使用し、この量を均質なサンプルに加工します。
- 強化ジュース、乳製品、スポーツ飲料などの液体サンプルの場合は、サンプリングする前に食品がよく混合されていることを確認してください。
注:上記の豆種子材料の量は、この主食作物の種子間の固有の違いを説明するために不可欠です。
2. サンプルの調製
- 処理する前に、食品サンプルの汚れやほこりを蒸留脱イオン水で洗い流してください。
- 実験目的に応じて、調理方法や粉砕など、適量の試料を加工してください。
注意: 調理および加工には、汚染物質Feの潜在的な発生源ではない調理器具および機器を使用することが重要です。ステンレス鋼の機器は汚染しません。ただし、石臼グラインダー、鋳鉄製調理器具、およびFeを含む非ステンレス鋼機器などの機器は、かなりの量の汚染物質Feを追加する可能性があります。多くの場合、標準のステンレス鋼コーヒーグラインダーが粉砕に適しています。 - 凍結乾燥し、均質な粉末に粉砕する。
注:均質化されると、研究によると、測定される各食品に対して3つの独立した分析の複製が適切であることが示されています。- サンプルの均一性を達成するのが難しい場合は、製品の配合または処理を修正してください。これが不可能な場合は、非均質性が重大でない場合は複製を追加します。
- ほとんどの均質な固形食品では、反復ごとに0.5 gの凍結乾燥サンプルを使用します。必要に応じて、反復ごとに最大1.0 gのサンプルを使用しますが、0.5 gを超えると応答の程度に利点があるかどうかを確認します。
注意: 固形食品が0.5 gを超えると、透析膜が詰まる可能性があります(以下を参照)。 - 1〜2 mLの液体サンプルを使用してください。
注:液体サンプルでは凍結乾燥は必要ないことがよくあります。
3. Caco-2細胞培養
- ストックカルチャー
- 認定サプライヤーからCaco-2細胞を入手します。
- 25 mM HEPES(pH 7.2)、10%(v/v)ウシ胎児血清(FBS)、および1%抗生物質抗真菌溶液を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を使用して、5%CO2 空気雰囲気(一定の湿度)のインキュベーター内でストックバイアルから細胞を培養します。
- 十分な細胞が利用可能になったら、通常7〜10日間の培養後、細胞をコラーゲンコーティングされていないフラスコに30,000細胞/cm2の密度で播種します。
- フラスコのサイズは、マルチウェルプレートの播種に必要な細胞数に応じて選択してください。
注:一般に、T225(225 cm 2)フラスコは、バイオアッセイごとに11枚のマルチウェル(6ウェル、9.66 cm2 /ウェル)プレート(サンプル比較用に10プレート、品質管理用に1プレート)を使用する実験に最適です。 - フラスコ内で細胞を7日間増殖させ、1日おきに培地を交換し、7日目 にマルチウェルプレートの播種に使用します。
注:細胞がストック培養から開始され、その後一連の実験で使用されるときから10〜15継代以下の継代範囲を使用することをお勧めします。広範囲の継代が細胞株に適応的な変化をもたらし、したがってモデルの応答にばらつきをもたらす可能性があるため、細胞培養継代は制限する必要があります。
- マルチウェルプレートでの細胞培養
- Caco-2細胞を50,000細胞/cm2 の密度で6ウェルコラーゲンコーティングプレートに播種します。
注: この手順は通常、水曜日に実行すると最適に機能します。次の手順により、この曜日が最適である理由が明らかになります。 - 25 mM HEPES(pH 7.2)、10%(v/v)FBS、および1%抗生物質抗真菌溶液を添加したDMEMを使用して、5%CO2空気雰囲気(一定の湿度)のインキュベーターで37°Cで12 日間細胞を増殖させます。
注:細胞単層を12日以上培養すると、細胞の異常増殖を引き起こす可能性があります。以前の研究では、これらの条件下で、播種後12日で、細胞単層が成熟し、プレートによく付着し、応答の一貫性において最適であることが明確に示されています29、30、31。細胞を19〜21日までなど、より長く増殖させると、細胞の異常増殖が起こり、培地は栄養素を急速に枯渇させ、不健康な単層をもたらします。 - 12日間は、一貫した毎日のスケジュールで少なくとも2日ごとに培地を交換してください。
- 播種後12日目に 、培養液を10 mMパイプ(ピペラジン-N,N'-ビス-[2-エタンスルホン酸])、1%抗生物質抗真菌溶液、ヒドロコルチゾン(4 mg/L)、インスリン(5 mg/L)、セレン(5 μg/L)、トリヨードチロニン(34 μg/L)、および上皮成長因子(20 μg/L)を添加した2 mLの最小必須培地(MEM [pH 7])と交換します。
注:シードが水曜日に開始された場合、12日目 は月曜日になります。 - 翌日(すなわち、13日目)に、MEMを取り外し、1mLのMEM(pH 7)と交換します。
注: この手順は火曜日に実行されます。これはバイオアッセイが始まる日です。したがって、13日間のスケジュールは、一貫した毎週のスケジュールの利点をもたらし、バイオアッセイを同じ平日に一貫して実施することができます。
- Caco-2細胞を50,000細胞/cm2 の密度で6ウェルコラーゲンコーティングプレートに播種します。
4. 体外 消化
- インサートリングの作製
- 酸洗浄透析膜を取り付けたシリコンOリングを使用して、滅菌済みインサートリングを作成します(図1A)。
注:バイオアッセイ当日の1日前(つまり、月曜日、12日目)にインサートを準備し、使用できるようになるまで4°Cの18MΩ水に保管します。 - バイオアッセイ当日(13日目火曜日)に、冷蔵庫からインサートを取り外し、水を切り、水を0.5 M HClと交換します。 使用前に、層流フードに室温で少なくとも1時間放置してください。
注:この手順は、培養プレートからMEMを取り除く前に実行する必要があります。メンブレンの酸洗浄は、汚染可能性のあるFeを除去し、インサートリングおよびメンブレンを滅菌する役割を果たす。 - インサートから0.5 M HClを排出し、滅菌した18 MΩ水ですすいでください。使用する準備ができるまで、層流フード内の室温で滅菌18MΩ水に保管してください。
- Caco-2細胞を含む6ウェルプレートの各ウェルにリングを挿入し、2チャンバーシステムを作成します。インサート付きのプレートをインキュベーターに戻します。
注:この手順は、新しい1.0 mLのMEMを各ウェルに追加した直後に実行する必要があります(手順3.2.5を参照)。
- 酸洗浄透析膜を取り付けたシリコンOリングを使用して、滅菌済みインサートリングを作成します(図1A)。
- ペプシン溶液の調製
- 実験当日、0.145 gのペプシンを50 mLの0.1 M HClに溶解してペプシン溶液を調製します。 室温で30分間、プラットフォームシェーカーで溶液を穏やかに振とうします。
- パンクレアチン胆汁溶液の調製
- 実験と同じ日に、2.1gのNaHCO3を250mLの18MΩ水に溶解して0.1M NaHCO3を調製した。
- 0.35gのパンクレアチンおよび2.1gの胆汁抽出物を175mLの0.1M NaHCO3に混合する。
- パンクレアチンと胆汁抽出物が可溶になったら、弱陽イオン交換樹脂( 材料表を参照)を87.5 g加え、室温で30分間振とうして混合します。
- スラリーを大きなカラムに注ぎ、溶出液を集めます。
- 追加の70 mLの0.1 M NaHCO3でカラムを溶出し、この容量をパンクレアチン胆汁溶液に収集します。
注:樹脂の目的は、パンクレアチン胆汁抽出物に一般的に見られる汚染物質Feを除去することです。
- インビトロ消化を開始します。
- 滅菌済みの50 mL遠沈管(ポリプロピレン)でサンプルを計量し、続いて140 mM NaClおよび5 mM KClを含むpH 2の生理食塩水10 mLを添加します。
- 調製したブタペプシン溶液0.5 mLをサンプルに加えて胃消化プロセスを開始し、ロッキングシェーカーで低く穏やかな設定で37°Cで1時間インキュベートします。
- この期間に続いて、1.0 M NaHCO3でpHを5.5〜6.0に調整することにより、各サンプルの腸管消化プロセスを開始します。
- 2.5 mLのパンクレアチン胆汁溶液を各サンプルチューブに加え、1.0 M NaHCO3でpHを6.9〜7.0に調整します。
- pHを調整したら、140 mM NaCl、5 mM KCl(pH 6.7)溶液を使用して各チューブ内の体積を均等化し、目標値15 gでチューブの重量を測定します。
注意: 一部の食品では、食品の緩衝能力に応じて、総量を16gまたは17gにする必要があるかもしれません。 - 各腸管消化物1.5 mLを、Caco-2細胞を含む6ウェル培養プレートの対応するウェルの上部チャンバー(すなわち、透析膜を備えたインサートリングを含む)に移します(図1B)。
- プレートカバーを元に戻し、ロッキングシェーカーで37°C(5%CO2 空気雰囲気)で6振動/分で2時間インキュベートします。
- ダイジェストでインサートリングを取り外し、各ウェルにさらに1 mLのMEM(pH 7)を追加します。
- 細胞培養プレートをインキュベーター(37°C、5%CO2空気雰囲気下)に戻し、さらに22 時間反応します。
- 22時間後、細胞培養培地を取り出し、2.0 mLの18 MΩ水を細胞単層に加えます。
注:水は細胞を浸透圧溶解します。 - 細胞ライセート全体を標準的なポリプロピレン製マイクロ遠心チューブなどに回収し、その後の細胞タンパク質および細胞フェリチン分析を行います。
5. Caco-2細胞フェリチンおよび細胞タンパク質の測定
- ステップ4.4.10の細胞ライセートを使用します。細胞フェリチンおよびタンパク質の測定用。
- Caco-2細胞のフェリチン含有量を測定するには、マウス抗フェリチン抗体-西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲートのインキュベーション時間を30分から2時間に増やすことを除いて、キットの指示に従ってください( 材料表を参照)。
- 細胞タンパク質を測定するには、細胞タンパク質キットに記載されている指示に従ってください(材料の表を参照)。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
主食作物におけるFeバイオアベイラビリティの同定と測定
このモデルを開発した主な理由の1つは、主食作物のFeバイオアベイラビリティに影響を与える要因を特定し、植物育種家がFeバイオアベイラビリティを高めた品種を特定および開発できるようにするツールを提供することでした。一般的な豆(Phaseolus vulgaris)は、Fe生物強化のための作物として世界的に標的にされています。したがって、このモデルは、幅広い豆市場クラスおよび豆育種プログラムにおけるFeの栄養価を評価するために広く適用されています。たとえば、黄豆は米国の新興市場クラスです。東アフリカなどの地域では、それらは非常に人気があり、ファーストクッキングであることが広く知られており、多くの人に「消化しやすい」と考えられています。Caco-2細胞バイオアッセイを用いた最近の研究では、特定の種類の黄豆が他の色クラスと比較して高いFeバイオアベイラビリティを有することが実証されています(図2)。この研究では、マンテカ品種は、白と赤のまだらの色クラスの参照対照と比較して、Feバイオアベイラビリティが高いことが特定されました。さらに、結果は2年連続の収穫年にわたって一貫していました。このような比較は、動物およびヒトの試験のコストが高く、スループットがはるかに低いため、他のモデル、特に in vivo モデルでは単純に実行できません。
Feバイオアベイラビリティに及ぼす食品加工効果の評価
Caco-2細胞バイオアッセイは、Feバイオアベイラビリティに対する食品加工効果を評価するためにも適用できます。たとえば、 図3 の結果は、複数の色クラスの豆と豆ベースのパスタの分析からのものです。結果は、豆を小麦粉に加工すると、白(スノードン、アルピーナ、サムライ)および黄色(カナリオ)の豆品種からのFeバイオアベイラビリティがどのように増加したかを示しています。クランベリー(エトナ)、レッドキドニー(レッドホーク)、ブラック(ゼニス)の品種では、パスタ粉の調製物でFeバイオアベイラビリティが低下しました。関連する分析により、豆を小麦粉に加工すると、豆の子葉細胞壁が破壊され、細胞内のFeが取り込まれやすくなることが示されました。白豆と黄色のパスタでは、これらの品種の種皮にFeのバイオアベイラビリティを阻害するポリフェノール化合物が含まれていないため、鉄の摂取量が増加しました。対照的に、クランベリー、赤腎臓、黒豆の種皮には高レベルの阻害性ポリフェノールが含まれているため、Feの取り込みが減少します。これらの結果は、他の方法では検出されないFeの栄養価に影響を与える可能性のある要因を明らかにする上でのモデルの有用性を明確に示しています。
図1:Caco-2細胞Fe取り込み用のインサートリングセットアップ 。 (A)Caco-2細胞と透析膜を取り付けたインサートリングの画像。(B)マルチウェルプレートの単一ウェル内でのCaco-2細胞Fe取り込みと結合した インビトロ 消化のための全体的な手順の図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:黄豆の多様なパネルにおける、浸されていない全種子遺伝子型の鉄バイオアベイラビリティスコア。 (A)フィールドシーズン2015;(B)フィールドシーズン2016。値は、遺伝子型ごとの2つのフィールド反復からの三重測定値の平均(標準偏差)です(n = 6)。遺伝子型は、調理クラスによってx軸に分類され、最も速く調理する遺伝子型から最も遅い調理エントリにランク付けされます。*他のYBPエントリよりも鉄バイオアベイラビリティスコアが有意に低い(p < 0.05)。**他のYBP遺伝子型よりも有意に高い(p < 0.05)鉄バイオアベイラビリティスコア。この数字は32から修正されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:豆品種とそれに対応する豆ベースのスパゲッティのCaco-2細胞フェリチン形成(細胞タンパク質1ミリグラムあたりフェリチンナノグラム)として表される鉄バイオアベイラビリティ 。 (A)3つの白豆品種とそれに対応する豆ベースのスパゲッティ。(B)4種類の着色豆とそれに対応する豆ベースのスパゲッティ。値は、各品種からの6つの測定値の平均(±標準偏差)です。青いハイフン付きの線は、豆ベースのスパゲッティと同じ方法で押し出され、調理され、処理された強化されていないデュラム小麦パスタコントロールの鉄のバイオアベイラビリティを示しています。*調理後の全豆よりも有意に高いCaco-2細胞フェリチン形成(p ≤ 0.05)。**調理後のCaco-2細胞フェリチン形成は、全豆よりも有意に低い(p ≤ 0.05)。この数字は33から修正されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
その開始以来、Caco-2細胞バイオアッセイのためのこの方法を説明する多数の研究が発表されてきた。基本的な条件は、1998年の最初の発行以来比較的変わっていません18。しかし、過去20年間にわたり、バイオアッセイの応答に前例のない一貫性をもたらすために、多くの技術的詳細が洗練され、標準化されてきました。細胞培養と in vitro 消化条件への慎重かつ正確な遵守は、バイオアッセイの一貫した高感度応答の鍵です。
この方法の使用について多くの個人を訓練した経験から、最も一般的な闘争はCaco-2細胞の適切な培養です。健康な単層の一貫した培養は、健康で応答性の高いCaco-2細胞単層の鍵です。細胞タンパク質レベルがウェルごとに非常に一貫しておらず、プロトコルに記載されている細胞タンパク質の範囲内にない場合、研究者は細胞培養条件を再検討する必要があります プロトコルからの逸脱。あるいは、低レベルの微生物汚染が存在するか、細胞培養インキュベーターが適切に動作していないか、または細胞培養培地が適切に処方されていない可能性があります。
インビトロ消化プロセスは、潜在的な問題の別の原因です。消化酵素からの汚染物質Feの除去は重要です。メーカーの主張にもかかわらず、酵素のFe濃度を定期的にチェックし、Fe除去プロセス(プロトコルを参照)が効果的であることを確認することが賢明です。消化酵素にFe汚染が存在する場合、ベースライン消化品質管理により、推奨範囲を超える細胞フェリチン値が得られます。
経験豊富で訓練を受けた研究者は、バイオアッセイの1回の実行で、20の実験サンプルと品質管理を分析できる必要があります。したがって、バイオアッセイの各実行に約12個の6ウェルプレートが必要です。バイオアッセイあたりのサンプル数が多いと、消化プロセス中のpH滴定のタイミングが長すぎて、サンプルの消化時間に不一致が生じる可能性があるため、お勧めしません。
このモデルの欠点は比較的少ないです。これには、細胞培養に高度なスキルを持ち、細部とプロトコルに正確な注意を払うことができる研究者が必要です。実験室スペースにはFe汚染源がなく、試薬やその他の材料はFe汚染について定期的に監視する必要があります。したがって、ユーザは、Fe濃度の測定のための機器への能力またはアクセス権を有するべきである。このモデルは、相対的または半定量的な尺度にすぎません。ただし、参照コントロールを適切に使用することで、モデルはFe吸収の定量的推定値を提供できます。実際に、対照対試験材料の吸収比の変換式が19生成されている。
バイオアッセイは、次の原理に従って機能します:Caco-2細胞は、細胞のFe濃度の増加に応答して、より多くのフェリチンタンパク質を産生します。したがって、Feバイオアベイラビリティは、Caco−2細胞フェリチン産生の増加に比例する。この増加は、消化された試料19への曝露後の総Caco−2細胞タンパク質に対する細胞フェリチンの比率(全細胞タンパク質のミリグラム当たりのフェリチンのナノグラム)として表される。フェリチン測定は、このバイオアッセイでの応答についてテストされたELISAキット(材料の表を参照)を使用して行われます。総細胞タンパク質濃度は、タンパク質アッセイキットを用いて定量される。前述のように、この方法に使用される条件下では、6ウェルプレートの典型的なCaco-2細胞タンパク質レベルは、ウェルあたり2.0 mgから2.6 mgの細胞タンパク質の範囲です。この範囲外の値は、不健康な細胞培養、細胞の異常増殖の可能性、または不十分な細胞播種技術を示します。バイオアッセイの所定の実行内で、値はウェルあたり最大0.2 mgまでしか変化しないはずです。さらに、この方法論で使用される播種密度および培養条件下では、播種後13日目に実質的なブラシボーダー酵素活性があり、細胞単層28、29、30のすべてではないにしてもほとんどの成熟を示す。使用前の13日間、液胞形成や単層形成のギャップなどの汚染やストレスがないか、細胞単層を監視します。そのような条件が明らかな場合、細胞はバイオアッセイでの使用に有効であると考えられるべきではありません。
Caco-2バイオアッセイの応答性を監視するには、生理学的にバランスの取れた生理食塩水と胃腸酵素のみを含むブランクダイジェストを含むいくつかの品質管理で各実験を実行する必要があります。これらのコントロールは、バイオアッセイにFe汚染がないことを保証します。ブランク消化物に曝露されたCaco-2細胞のフェリチン値は、通常、1 ngから6 ngのフェリチン/ mg細胞タンパク質の範囲です。この範囲のベースラインフェリチンはまた、細胞が比較的低いFe状態にあり、したがって、利用可能なFeに対して最大の感受性を示すべきであることを示す。
最初の15年間の使用では、追加の品質管理には、1)FeCl 3(66 μM)を含むブランクダイジェストと2)FeCl 3(66 μM)のブランクダイジェストと1.3 mMアスコルビン酸の添加が含まれていました。FeCl 3消化物のフェリチン値は、典型的にはフェリチン/mg細胞タンパク質の30-50 ngの範囲であり、アスコルビン酸を含むFeCl3消化物は、フェリチン/mg細胞タンパク質の250-400 ngの範囲であった。近年では、空白のダイジェストは品質管理のままです。ただし、アスコルビン酸の有無にかかわらず、アスコルビン酸塩:Feの比率で食品サンプルを使用するように切り替えました。使用した食品サンプルは、約65μgのFe / gサンプルを含む白豆粉でした。これらの品質管理により、より狭く一貫した応答範囲が得られ、白豆粉の場合は20〜30 ngのフェリチン/ mgの細胞タンパク質が得られ、白豆粉とアスコルビン酸塩の場合は70〜150 ngのフェリチン/ mgの細胞タンパク質が得られます。新しい値の範囲は、材料表の参照キットからのものであり、現在は廃止されたRamco ELISAキットよりもわずかに低くなる傾向があることに注意してください。この原稿の出版時点で、参照キットで取得されたデータは2〜3か月のみです。
バイオアッセイの実行が無効または最適ではないことを示す結果と細胞培養条件を認識することが重要です。まず、方法で述べたように、ブランク消化条件が細胞フェリチン濃度を推奨範囲よりも高くする場合、これは細胞培養培地、消化酵素、または透析膜のFe汚染を示している可能性があります。細胞培養培地および消化酵素の許容Fe濃度は<20μgFe/mLです。他の品質管理の範囲外の値、特に低い側にある場合も、結果の妥当性が疑わしいことを示します。
要約すると、このモデルは、細胞培養条件が低Fe状態の細胞を作成するように設計されているため、生物学的に利用可能なFeに非常に敏感です。したがって、Feの取り込みに対するそれらのメカニズムは高度にアップレギュレーションされています。これは、高スループットが可能な堅牢なモデルです。このモデルでは、人間に与えることができるあらゆる食物や食事を評価できるため、バイオアッセイには幅広い用途があります。植物育種家はこのモデルを使用して、主食中のFeバイオアベイラビリティを測定し、Feバイオアベイラビリティに影響を与える形質と染色体領域を特定できます。食品科学者は、このモデルを適用して最適な製剤を決定し、処理の効果を評価して、適切なFeバイオアベイラビリティを確保できます。栄養士は、このモデルを使用して、個々の食品、食品の組み合わせ、さらには食事計画からの食事中のFeバイオアベイラビリティを評価および監視できます。ヒト試験で徹底的に検証されており、すべてのアプリケーションで効果の方向と大きさを正しく予測しています。したがって、シミュレートされた消化と腸上皮細胞のFe取り込みを組み合わせることにより、このモデルはFe吸収プロセスの重要な最初のステップを表し、したがって、食品からのFeの送達またはバイオアベイラビリティを予測することができます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者には利益相反はありません。
Acknowledgments
著者は、Yongpei ChangとMary Bodisの技術的な努力に深く感謝しています。栄養学の分野でのこのモデルの非常に成功した適用は、彼らの専門知識と細部への注意の直接の結果です。このモデルの開発は、米国農務省農業研究サービスによって完全に資金提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M HCl | Fisher Scientific | A508-4 Hydrochloric Acid TraceMetal Grade | |
| 18 megaohm water | Also known as distilled, deionized water | ||
| 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma Aldrich Co | T6397 | |
| 6-well plates | Costar | 3506 | Use for bioassay experiments |
| ascorbic acid | Sigma Aldrich Co | A0278 | |
| bile extract | Sigma Aldrich Co | B8631 | |
| Caco-2 cells | American Type Culture Collection | HTB-37 | HTB-37 is a common variety. |
| Cell culture flasks T225 | Falcon | 353138 | |
| Cell culture flasks T25 | Corning | 430639 | |
| Cell culture flasks T75 | Corning | 430641U | |
| Chelex-100 | Bio-Rad Laboratories Inc | 142832 | Known as the weak cation exchange resin in the protocol |
| collagen | Corning | 354236 | |
| dialysis membrane | Spectrum Laboratories | Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO | Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Gibco | 12100046 | DMEM |
| epidermal growth factor | Sigma Aldrich Co | E4127-5X.1MG | |
| Ferritin ELISA Assay Kit | Eagle Biosciences | FRR31-K01 | |
| fetal bovine serum | R&D Systems | S12450 | Optima |
| HEPES | Sigma Aldrich Co | H3375 | |
| Hydrocortisone-Water Soluble | Sigma Aldrich Co | H0396 | |
| insert ring | Corning Costar | not sold | Transwell, for 6 well plate, without membrane |
| insulin | Sigma Aldrich Co | I2643 | |
| KCl | Sigma Aldrich Co | P9333 | |
| large column | VWR International | KT420400-1530 | |
| Minimum Essential Medium | Gibco | 41500034 | MEM |
| NaCl | Fisher Scientific | S271 | |
| pancreatin | Sigma Aldrich Co | P1750 | |
| PIPES disodium salt | Sigma Aldrich Co | Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid) disodium salt P3768 | |
| porcine pepsin | Sigma Aldrich Co | P6887 or (P7012-25G Sigma | |
| protein assay kit | Bio-Rad Laboratories Inc | Bio-Rad DC protein assay kit 500-0116 | Measurement of Caco-2 cell protein |
| silicone o rings | Web Seal, Inc Rochester NY | 2-215S500 | |
| sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233 | |
| Sodium selenite | Sigma Aldrich Co | S5261 | |
| ZellShield | Minerva Biolabs | 13-0050 | Use at 1% as antibiotic/antimycotic ordered through Thomas Scientific |
References
- Fairweather-Tait, S. J., Dainty, J. Use of stable isotopes to assess the bioavailability of trace elements: a review. Food Additives Contaminants. 19 (10), 939-947 (2002).
- Hadley, K. B., Johnson, L. K., Hunt, J. R. Iron absorption by healthy women is not associated with either serum or urinary prohepcidin. American Journal of Clinical Nutrition. 84 (1), 150-155 (2006).
- Glahn, R. P., Cheng, Z., Giri, S. Extrinsic labeling of staple food crops with isotopic iron does not consistently result in full equilibration: revisiting the methodology. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (43), 9621-9628 (2015).
- Consaul, J. R., Lee, K. Extrinsic tagging in iron bioavailability research: a critical review. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 31 (4), 684-689 (1983).
- Jin, F., Cheng, Z., Rutzke, M. A., Welch, R. M., Glahn, R. P. Extrinsic labeling method may not accurately measure Fe absorption from cooked pinto beans (Phaseolus vulgaris): comparison of extrinsic and intrinsic labeling of beans. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (16), 6881-6885 (2008).
- Junqueira-Franco, M. V. M., et al. Iron absorption from beans with different contents of iron, evaluated by stable isotopes. Clinical Nutrition ESPEN. 25, 121-125 (2018).
- Petry, N., Egli, I., Zeder, C., Walczyk, T., Hurrell, R. Polyphenols and phytic acid contribute to the low iron bioavailability from common beans in young women. Journal of Nutrition. 140 (11), 1977-1982 (2010).
- Petry, N., et al. Stable iron isotope studies in Rwandese women indicate that the common bean has limited potential as a vehicle for iron biofortification. Journal of Nutrition. 142 (3), 492-497 (2012).
- Petry, N., Egli, I., Campion, B., Nielsen, E., Hurrell, R. Genetic reduction of phytate in common bean (Phaseolus vulgaris L.) seeds increases iron absorption in young women. Journal of Nutrition. 143 (8), 1219-1224 (2013).
- Petry, N., et al. Phytic acid concentration influences iron bioavailability from biofortified beans in Rwandese women with low iron status. Journal of Nutrition. 144 (11), 1681-1687 (2014).
- Petry, N., Boy, E., Wirth, J. P., Hurrell, R. F. Review: The potential of the common bean (Phaseolus vulgaris) as a vehicle for iron biofortification. Nutrients. 7 (2), 1144-1173 (2015).
- Petry, N., et al. In Rwandese women with low iron status, iron absorption from low-phytic acid beans and biofortified beans is comparable, but low-phytic acid beans cause adverse gastrointestinal symptoms. Journal of Nutrition. 146 (5), 970-975 (2016).
- Donangelo, C. M., et al. Iron and zinc absorption from two bean (Phaseolus vulgaris L.) genotypes in young women. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51 (17), 5137-5143 (2003).
- Dellavalle, D. M., Glahn, R. P., Shaff, J. E., O'Brien, K. O. Iron absorption from an intrinsically labeled lentil meal is low but upregulated in women with poor iron status. Journal of Nutrition. 145 (10), 2253-2257 (2015).
- Miller, D. D., Schricker, B. R., Rasmussen, R. R., Van Campen, D. An in vitro method for estimation of iron availability from meals. American Journal of Clinical Nutrition. 34 (10), 2248-2256 (1981).
- Glahn, R. P., Wien, E. M., Van Campen, D. R., Miller, D. D. Caco-2 cell iron uptake from meat and casein digests parallels in vivo studies: use of a novel in vitro method for rapid estimation of iron bioavailability. Journal of Nutrition. 126 (1), 332-339 (1996).
- Martini, L. A., Tchack, L., Wood, R. J. Iron treatment downregulates DMT1 and IREG1 mRNA expression in Caco-2 cells. Journal of Nutrition. 132 (4), 693-696 (2002).
- Glahn, R. P., Wortley, G. M., South, P. K., Miller, D. D. Inhibition of iron uptake by phytic acid, tannic acid, and ZnCl2: studies using an in vitro digestion/Caco-2 cell model. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 50 (2), 390-395 (2002).
- Glahn, R. P., Lee, O. A., Yeung, A., Goldman, M. I., Miller, D. D. Caco-2 cell ferritin formation predicts nonradiolabeled food iron availability in an in vitro digestion/Caco-2 cell culture model. Journal of Nutrition. 128 (9), 1555-1561 (1998).
- Yun, S., Habicht, J. P., Miller, D. D., Glahn, R. P. An in vitro digestion/Caco-2 cell culture system accurately predicts the effects of ascorbic acid and polyphenolic compounds on iron bioavailability in humans. Journal of Nutrition. 134 (10), 2717-2721 (2004).
- Pachón, H., Stoltzfus, R. J., Glahn, R. P. Homogenization, lyophilization or acid-extraction of meat products improves iron uptake from cereal-meat product combinations in an in vitro digestion/Caco-2 cell model. British Journal of Nutrition. 101 (6), 816-821 (2009).
- Tako, E., Bar, H., Glahn, R. P. The combined application of the Caco-2 cell bioassay coupled with in vivo (Gallus gallus) feeding trial represents an effective approach to predicting Fe bioavailability in humans. Nutrients. 8 (11), 732-757 (2016).
- Engle-Stone, R., Yeung, A., Welch, R., Glahn, R. Meat and ascorbic acid can promote Fe availability from Fe-phytate but not from Fe-tannic acid complexes. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (26), 10276-10284 (2005).
- Tako, E., Blair, M. W., Glahn, R. P. Biofortified red mottled beans (Phaseolus vulgaris L.) in a maize and bean diet provide more bioavailable iron than standard red mottled beans: studies in poultry (Gallus gallus) and an in vitro digestion/Caco-2 model. Nutrition Journal. 10, 113 (2011).
- Pachón, H., Stoltzfus, R. J., Glahn, R. P. Chicken thigh, chicken liver, and iron-fortified wheat flour increase iron uptake in an in vitro digestion/Caco-2 cell model. Nutrition Research. 28 (12), 851-858 (2008).
- Beasley, J. T., et al. Metabolic engineering of bread wheat improves grain iron concentration and bioavailability. Plant Biotechnology Journal. 17 (8), 1514-1526 (2019).
- Zhu, L., Glahn, R. P., Nelson, D., Miller, D. D. Comparing soluble ferric pyrophosphate to common iron salts and chelates as sources of bioavailable iron in a Caco-2 cell culture model. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (11), 5014-5019 (2009).
- Wortley, G., Leusner, S., Good, C., Gugger, E., Glahn, R. Iron availability of a fortified processed wheat cereal: a comparison of fourteen iron forms using an in vitro digestion/human colonic adenocarcinoma (Caco-2) cell model. British Journal of Nutrition. 93 (1), 65-71 (2005).
- Jumarie, C., Malo, C. Alkaline phosphatase and peptidase activities in Caco-2 cells: differential response to triiodothyronine. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Animal. 30 (11), 753-760 (1994).
- Engle, M. J., Goetz, G. S., Alpers, D. H. Caco-2 cells express a combination of colonocyte and enterocyte phenotypes. Journal of Cellular Physiology. 174 (3), 362-369 (1998).
- Ferruzza, S., Rossi, C., Sambuy, Y., Scarino, M. L. Serum-reduced and serum-free media for differentiation of Caco-2 cells. Alternatives to Animal Experimentation. 30 (2), 159-168 (2013).
- Wiesinger, J. A., Cichy, K. A., Tako, E., Glahn, R. P. The fast cooking and enhanced iron bioavailability properties of the Manteca yellow bean (Phaseolus vulgaris L). Nutrients. 10 (11), 1609 (2018).
- Wiesinger, J. A., Cichy, K. A., Hooper, S. D., Hart, J. J., Glahn, R. P. Processing white or yellow dry beans (Phaseolus vulgaris L.) into a heat treated flour enhances the iron bioavailability of bean-based pastas. Journal of Functional Foods. 71, 104018 (2020).
