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Bioengineering

Captura óptica de nanopartículas plasmônicas para caracterizações de espectroscopia raman aprimoradas na superfície de Situ

Published: June 23, 2022 doi: 10.3791/63862
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1HKUST-Shenzhen Research Institute, 2Department of Chemistry, The Hong Kong University of Science and Technology

Summary

O presente protocolo descreve uma abordagem conveniente para integrar a captura óptica e a espectroscopia raman (SERS) melhorada pela superfície para manipular nanopartículas plasmônicas para detecção molecular sensível. Sem agentes agregadores, o laser de trapping monta nanopartículas plasmônicas para melhorar os sinais sers de analitos de alvo para medições espectroscópicas in situ .

Abstract

A espectroscopia raman aprimorada na superfície (SERS) permite a detecção ultrasensível de moléculas de analito em várias aplicações devido ao campo elétrico aprimorado de nanoestruturas metálicas. A agregação de nanopartículas de prata induzida por sal é o método mais popular para a geração de substratos ativos do SERS; no entanto, é limitado pela baixa reprodutibilidade, estabilidade e biocompatibilidade. O presente protocolo integra a manipulação óptica e a detecção de SERS para desenvolver uma plataforma analítica eficiente para lidar com isso. Um laser de captura de 1064 nm e um laser de sonda Raman de 532 nm são combinados em um microscópio para montar nanopartículas de prata, que geram hotspots plasmônicos para medições in situ SERS em ambientes aquosos. Sem agentes agregadores, este conjunto dinâmico de nanopartículas de prata plasmônica permite um aprimoramento de aproximadamente 50 vezes do sinal da molécula de analito. Além disso, fornece controle espacial e temporal para formar o conjunto ativo sers em uma solução de nanopartículas de prata revestida de analitos de 0,05 nM, o que minimiza a potencial perturbação para análise in vivo . Assim, esta plataforma sers integrada de trapping óptico tem grande potencial para análises moleculares eficientes, reprodutíveis e estáveis em líquidos, especialmente em ambientes fisiológicos aquosos.

Introduction

A espectroscopia raman (SERS) é uma técnica analítica sensível para detectar diretamente a estrutura química de moléculas-alvo em concentrações ultrabaixos ou mesmo no nível de molécula única 1,2,3,4. A irradiação a laser induz a ressonância de plasmon de superfície localizada em nanoestruturas metálicas, usadas como substratos sers para amplificar os sinais de Raman de moléculas-alvo. Os agregados de nanopartículas induzidas por sal são os substratos SERS amplamente utilizados, que se submetem espontaneamente ao movimento browniano em líquidos de suspensão coloidais 5,6. A secagem adicional permite medições estáveis de SERS; no entanto, pode ocorrer concentração de impureza, o que introduz ruídos de fundo e causa danos irreversíveis às amostras biológicas7. Por isso, é pertinente desenvolver agregações de nanopartículas livres de sal, controlar seu movimento em solução e melhorar a biocompatibilidade, mantendo a eficiência da medição.

A captura óptica foi adotada para controlar vários substratos metálicos e facilitar as detecções do SERS 8,9,10,11,12,13,14. Uma armadilha óptica é gerada focando firmemente um raio laser para gerar um campo de força óptica, que atrai pequenos objetos para a região de maior intensidade em torno do foco15,16. Recentemente, armadilhas ópticas têm sido usadas para desenvolver plataformas de sensoriamento plasmônico reprodutíveis e sensíveis para diversas aplicações, exibindo suas vantagens únicas na localização e controle da posição de nanoestruturas metálicas ativas da SERS em soluções 17,18,19,20,21,22,23,24 . O presente protocolo introduz uma abordagem para combinar pinças ópticas e espectro-microscopia Raman para montar dinamicamente nanopartículas de prata (AgNPs) e estabilizá-las contra o movimento browniano em solução para medições sers eficientes. Na região de montagem agNP, o sinal do éster de 3,3'-dithiobis [6-ácido nitrobenómico] bis (succinimida) (DSNB), moléculas de analito revestidas na superfície dos AgNPs, pode ser aumentado em aproximadamente 50 dobras. Esta abordagem é adequada para analisar biomoléculas sensíveis incompatíveis com agentes químicos 25,26,27. Além disso, fornece controle espacial e temporal para gerar o conjunto AgNP ativo do SERS. Isso permite a detecção in situ em ambientes aquosos, o que poderia diminuir o uso de AgNPs e minimizar a perturbação para análise in vivo 28,29,30. Além disso, o conjunto AgNP induzido por trapping óptico é estável, reprodutível e reversível31,32. Por isso, é uma plataforma promissora para detectar moléculas de analito em soluções e em condições fisiológicas onde a agregação induzida por sal não é aplicável.

No presente estudo, um laser de captura de 1064 nm, módulo de detecção de força e fonte de iluminação de campo brilhante são integrados ao sistema óptico de microscopia de pinça para manipulação óptica e visualização de partículas. Um laser de sonda Raman de 532 nm também foi incorporado ao microscópio e alinhado com o laser de trapping na câmara de amostra. Para aquisição espectral, a luz rescattered foi coletada e redirecionada para um espectrômetro (Figura 1).

Protocol

1. Configuração óptica

  1. Direcione um raio laser de 532 nm (fonte de excitação Raman) para a porta flex do microscópio de pinça óptica (ver Tabela de Materiais).
  2. Alinhe o raio laser de 532 nm nas vias estéreo de dupla camada do microscópio de pinça óptica com um espelhodicrómico de passagem longa de 750 nm para combinar com os feixes de laser de trapping originais para se concentrar na câmara de amostra.
  3. Colete a luz rescavada da câmara de amostra usando um espelhodicrómico de passe longo de 750 nm e redirecione-a para um espectrômetro contendo uma câmera de dispositivo acoplado a carga (CCD) (ver Tabela de Materiais). Coloque um filtro de entalhe de 532 nm na frente da fenda de entrada do espectrômetro antes da aquisição espectral.
    NOTA: A proteção ocular deve ser usada quando o laser estiver ligado, e o raio laser deve ser contido dentro de uma área segura.

2. Fabricação de AgNPs

  1. Aqueça 50 mL de solução aquosa AgNO3 de 1 mM em um frasco de fundo redondo enquanto ferve.
  2. Adicione 1,0 mL de 0,1 M de solução de citrato de trisódio dropwise na solução aquosa AgNO3 cozida.
  3. Mantenha a mistura fervendo por 16 minutos sob constante agitação.
  4. Esfrie a mistura à temperatura ambiente. A cor amarelada é observada.
  5. Centrifugar os coloides AgNP a 2000 × g por 5 min a temperatura ambiente e, em seguida, remova o supernatante usando uma pipeta.
  6. Resuspend os coloides AgNP com 1 mL de água desionizada (resistência de 18,2 MΩ cm).
  7. Repita as etapas 2.5 e 2.6 três vezes para remover o agente redutor residual.
  8. Caracterize a distribuição de tamanho dos AgNPs utilizando microscopia eletrônica de varredura (SEM) e dispersão dinâmica de luz (DLS)33 para confirmar a uniformidade dos AgNPs (Figura 2). A concentração de AgNP foi estimada em 0,1 nM por absorvância UV34.
    NOTAs: Devido à baixa concentração, a solução de estoque AgNP pode ser mantida sem agrupamento por 2-3 semanas. Não são necessários agentes estabilizadores. Se um precipitado foi observado na solução de ações AgNP, uma nova solução AgNP foi preparada seguindo o protocolo acima.

3. Interação da molécula de analito DSNB e AgNP

  1. Adicione 200 μL de 2 mM DSNB (ver Tabela de Materiais) a 1 mL de coloide AgNP e incubar à temperatura ambiente por 3h para revestir uma camada de DSNB na superfície do AgNP pela formação da ligação Ag-S entre AgNP e DSNB35. Uma representação esquemática dessa interação é mostrada na Figura 3.
  2. Centrifugar o AgNP a 2.000 × g por 5 min a temperatura ambiente e remover o sobrenante.
  3. Resuspene o AgNP-DSNB com 1 mL de água desionizada.
  4. Repita as etapas 3.2 e 3.3 três vezes para remover o excesso de DSNB.
  5. Regissão do espectro visível UV da solução coloide AgNP e AgNP-DSNB.
    NOTA: Este espectro mostra uma mudança de pico de absorção de aproximadamente 420 nm para 450 nm, indicando o revestimento bem sucedido de DSNB na superfície de AgNP (Figura 3).

4. Preparação da câmara amostral e geração de conjunto AgNP para medição do SERS

  1. Limpe o escorregador de vidro e cubra com água e etanol.
  2. Conecte a fita da moldura (0,25 mm de espessura, consulte Tabela de Materiais) ao slide de vidro para criar uma câmara (1,0 cm de comprimento × largura de 1,0 cm × altura de 0,25 mm).
  3. Adicione algumas gotas da solução AgNP-DSNB (cerca de 25 μL) no quadro.
  4. Coloque a mancha na fita da moldura e seque-a (Figura 4).
  5. Adicione nitrogênio líquido ao recipiente da câmera CCD resfriada de nitrogênio líquido até que a temperatura atinja -120 °C.
  6. Bloqueie o caminho do feixe da sonda Raman usando uma tela de segurança laser magnética (ver Tabela de Materiais), em seguida, ligue o laser de 532 nm Raman fonte de excitação.
  7. Fixar a câmara de amostra com a solução AgNP-DSNB no titular da câmara. Adicione água ao objetivo imerso em água (ampliação de 60x com abertura numérica de 1,2 de 1,2) como mostrado na Figura 1. Em seguida, coloque o titular da câmara imediatamente no microestácio acima do objetivo.
  8. Jogue óleo de imersão em cima da tampa e posicione o condensador imerso em óleo para visualizar partículas na câmera do microscópio.
  9. Ajuste a posição Z do objetivo girando o botão do microscópio até que o feixe da sonda Raman de 532 nm esteja focado na superfície inferior do vidro da câmara, mostrando uma mancha branca na câmera do microscópio (Figura 5).
    1. Ajuste as posições X e Y do microestálado para mover a câmara para colocar a região central da câmara na mancha branca. Abra o software óptico de controle de pinça (ver Tabela de Materiais) e use o controle de joystick equipado para mover o laser de trapping de 1064 nm (indicado por um círculo vermelho no sistema de pinça óptica) para se sobrepor à mancha branca (Figura 5).
    2. Em seguida, sintonize o botão do microscópio para mover a posição Z do objetivo para cima.
      NOTA: O desaparecimento da mancha branca na imagem da câmera do microscópio indica que o feixe da sonda Raman de 532 nm está focado dentro da câmara.
  10. Ligue o laser de trapping de 1064 nm para atrair AgNPs na câmara de amostra e crie um conjunto AgNP plasmônico.
    NOTA: A coleta de AgNPs resulta em uma mancha escura na câmara amostral (Figura 6B).
    1. Abaixe o raio laser de trapping para evitar superaquecimento ou formação de bolhas quando necessário.
      NOTA: Aumente o tempo de potência e irradiação do laser de captura se não houver formação aparente do conjunto AgNP.
  11. Ajuste a posição do microestágio da amostra para colocar o ponto escuro do conjunto AgNP plasmônico sob o foco do feixe de sonda Raman de 532 nm para medições espectroscópicas.
  12. Coloque os filtros de densidade neutra (ND) na frente da tomada laser Raman de 532 nm para ajustar a potência a 10 mW. Insira o tempo de aquisição (10 s para o presente estudo, Figura 6) no painel de configuração do software de espectro (ver Tabela de Materiais) e clique no botão Adquirir para iniciar a aquisição espectral.
    NOTA: Isso gera o espectro SERS das moléculas de analito (DSNB no resultado representativo e Figura 6).

Representative Results

Como prova de conceito, o DSNB foi escolhido como a molécula de analito e revestido na superfície dos AgNPs. Os espectros típicos de SERS do DSNB aprimorados pelo conjunto AgNP plasmônico e agNP dispersos são mostrados na Figura 6. Sem o laser de captura, os AgNPs dispersos na câmara de amostrageraram um espectro negro (Figura 6A) após a excitação pelo laser da sonda Raman. Um sinal de SERS fraco e amplo foi observado em aproximadamente 1380-1450 cm-1, o pico característico de DSNB de seu trecho simétrico nº2, o que é consistente com os relatórios de literatura35,36. Uma vez que os AgNPs dispersos estavam sob movimento browniano, as junções interpartículas eram grandes e instáveis, como ilustrado na Figura 6C. Assim, a amplificação do sinal SERS do DSNB foi baixa para os AgNPs dispersos.

AgNPs são reunidos para formar um conjunto agNP plasmônico quando o laser de trapping está ligado. Aumentar a potência e estender o tempo de irradiação do laser de trapping poderia atrair mais AgNPs e gerar uma mancha escura, como mostrado na Figura 6B. Aqui, aplicamos um poder laser de captura de 700 mM e um tempo de irradiação de 20 s para criar um conjunto AgNP plasmônico em uma solução AgNP revestida de 0,05 nM DSNB em um local e momento designados. O espectro SERS de DSNB foi obtido na região do conjunto Plasmônico AgNP (Figura 6A, vermelho). A forte banda Raman em 930 cm-1 é atribuída à vibração de tesoura nitro, e as grandes bandas em 1078 cm-1, 1152 cm-1 e 1191 cm-1 provavelmente correspondem ao trecho succinimidyl N-C-O sobreposto com os modos de anel aromático de DSNB35,37. As bandas de características a 1385 cm-1 e 1444 cm-1 surgem do trecho nitro simétrico do DSNB e são significativamente aprimoradas e ligeiramente deslocadas devido à reação com a superfície de AgNP 35,37. Com base nas impressões digitais sers relatadas anteriormente de DSNB 35,36,37, a banda em 1579 cm-1 foi atribuída ao modo anel aromático do DSNB. As intensidades globais de DSNB no conjunto AgNP plasmônico foram maiores do que as do AgNP disperso. Considerando a intensidade do pico característico em 1444 cm-1, o conjunto AgNP plasmônico pode fornecer aproximadamente um aprimoramento de 50 vezes do sinal SERS do DSNB em comparação com o do AgNP disperso. Como mostrado na Figura 7, os espectros sers de DSNB foram registrados repetidamente (20 vezes) para o conjunto AgNP no experimento, demonstrando características vibracionais idênticas. As intensidades dos picos característicos de DSNB a 1152 cm−1, 1444 cm−1 e 1579 cm-1 através desses 20 espectros sers foram traçadas como histogramas com desvios padrão relativos (RSD) de 6,88%, 6,59% e 5,48%, respectivamente. Isso verificou ainda a reprodutibilidade e estabilidade. Portanto, essa abordagem é confiável para manipular nanopartículas plasmônicas e detecção de sers de moléculas de analito em solução.

Figure 1
Figura 1: Representação esquemática da plataforma espectroscópica Raman acoplada à pinça óptica. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Preparação de AgNP para medição sers. (A) SEM imagem de AgNP. (B) Distribuição de tamanho de AgNP por DLS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Interação de AgNP e DSNB. (A) Esquema do revestimento de DSNB na superfície do AgNP. (B) Espectros visíveis UV de AgNP e AgNP-DSNB. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Esquema de preparação da câmara amostral. (A) Processo de preparação da câmara de amostra. (B) Câmara de amostra preparada. Barra de escala = 1 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Posição sobreposta de laser Raman de 532 nm e laser de trapping de 1064 nm. (A) Posição de laser Raman de 532 nm indicada por mancha branca. (B) Posição de laser de trapping de 1064 nm indicado pelo círculo vermelho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Espectros típicos de SERS das moléculas de analito aprimoradas pelo conjunto AgNP plasmônico. (A) Espectros SERS de DSNB no conjunto AgNP plasmônico (vermelho) e o AgNP disperso (preto). (B) O conjunto AgNP plasmônico quando o laser de trapping está ligado mostra um ponto escuro sob visualização microscópica. (C) O AgNP disperso quando o laser de trapping está desligado. (D) Ilustração do mecanismo de formação de montagem AgNP. (E) Intensidade de SERS dependente da concentração na ausência do laser de trapping. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: Reprodutibilidade do sinal SERS de DSNB. (A) 20 espectros SERS de DSNB no conjunto AgNP plasmônico registrado repetidamente no experimento. (B) Histogramas das intensidades dos picos característicos de DSNB a 1152 cm-1 (RSD = 6,88%), 1444 cm-1 (RSD = 6,59%) e 1579 cm-1 (RSD = 5,48%). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8: Conjunto AgNP gerado sob diferentes parâmetros experimentais. (A) Potência laser de captura diferente; tempo de irradiação 20 s e concentração agnp 0,05 nM. (B) Tempo de irradiação diferente; potência laser de 700 mW e concentração AgNP 0,05 nM. (C) Diferente concentração agnp; tempo de irradiação 20 s e potência laser de 700 mW. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: As imagens da câmera do microscópio do conjunto AgNP em séries temporâneas quando o laser de captura foi desligado. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Discussion

O presente estudo relata uma plataforma analítica que combina trapping óptico e detecção de SERS para caracterizações moleculares in situ . Um feixe de sonda Raman de 532 nm foi combinado com um raio laser de 1064 nm através de vias de camada dupla estéreo para combinar foco e coletar para medições espectroscópicas adicionais na geometria de backscattering. O raio laser de captura montou AgNPs para formar hotspots plasmônicos, seguido pela excitação do raio laser da sonda Raman para gerar o sinal SERS das moléculas de analito na solução. Como prova de conceito, foi demonstrada a detecção de DSNB, que foi revestida na superfície dos AgNPs. Na região de montagem agNP controlada pelo feixe laser de trapping, foi alcançado um aprimoramento de aproximadamente 50 vezes no sinal de DSNB em comparação com os AgNPs dispersos ao redor. Uma amplificação de alto sinal semelhante de moléculas de analito nas medições sers fase de solução na plataforma apresentada foi obtida de forma reprodutivelmente.

A etapa crítica que afeta a amplificação do sinal SERS está formando um conjunto AgNP induzido por armadilhas ópticas. O sinal SERS das moléculas de analito pode ser otimizado por parâmetros experimentais de ajuste fino, como o poder de captura do laser, o tempo de irradiação e a concentração de AgNP. Como mostrado na Figura 8, o uso de uma potência laser de captura mais alta pode aumentar a eficiência da formação de montagem AgNP. Conjuntos AgNP reprodutíveis foram obtidos aumentando a potência do laser de captura de 450 mW para 700 mW. No entanto, uma potência laser de captura superior a 950 mW pode induzir superaquecimento e geração debolhas 38. Assim, recomenda-se uma potência laser de trapping moderada para criar um conjunto AgNP dinâmico. Analogamente, um tempo de irradiação mais longo é útil para promover a formação de conjuntos AgNP. A Figura 8B mostra que uma clara montagem esférica de AgNP foi formada quando o tempo de irradiação aumentou de 5-20 s. No entanto, a montagem agnp foi distorcida após a irradiação de 60 s. Além disso, a formação do conjunto AgNP foi acelerada em uma maior concentração agnp, de 0,01 nM para 0,05 nM, enquanto foi rapidamente superaquecida em 0,25 nM, como mostrado na Figura 8C. Se não houver formação de montagem AgNP aparente, é recomendado o aumento da potência do laser de captura e o tempo de irradiação. Após a geração de um conjunto AgNP estável, o laser de captura deve ser desligado para evitar possíveis danos térmicos.

A atividade sers do conjunto AgNP induzido por armadilha óptica foi atribuída a um aumento na concentração local de AgNP na região de irradiação a laser de trapping, que é o ponto escuro na Figura 6B. Na solução AgNP fluidica, a armadilha óptica pode atrair continuamente AgNPs para acumular e formar hotspots plasmônicos em um espaço confinado nas junções interpartículas. Isso produz um campo elétrico aprimorado que melhora o efeito SERS. Verificou-se ainda pelo sinal sers mais forte obtido em maior concentração de AgNP (1,00 nM) em comparação com o sinal sers mais fraco adquirido em uma menor concentração de AgNP (0,05 nM) sem o laser de trapping, como mostrado na Figura 6E.

Além disso, o controle de posição do conjunto Plasmônico AgNP em solução, contra o movimento browniano, por trapping óptico melhorou significativamente a eficiência e estabilidade das medições sers. A detecção de alto rendimento pode ser conduzida quando conectada ao sistema microfluido. Em comparação com a tradicional agregação induzida por sal de nanopartículas para gerar substratos ativos do SERS, nossa plataforma permite a formação dinâmica de conjuntos AgNP plasmônicos, no local e momento projetados, com alta flexibilidade26,28. Além disso, ele funciona eficientemente em concentrações agnp nanomolares e permite a manipulação espaço-temporal de hotspots ativos do SERS para medições espectroscópicas in situ em soluções. Este conjunto agNP dinâmico gradualmente desmontado em poucos minutos quando o laser de trapping foi desligado. Sem o laser de trapping, o conjunto AgNP quase desapareceu em 20 minutos, como mostrado na Figura Suplementar 1. Isso pode minimizar a influência no sistema de detecção e apresenta grande potencial para várias biossulicações, especialmente a detecção de biomoléculas (DNA, RNA e proteína) em condições fisiológicas e in vivo. No entanto, este conjunto agNP dinâmico fornece um fator de aprimoramento menor do que os agregados agNP induzidos por sal2 e, portanto, novas modificações e desenvolvimento são necessárias.

Em conclusão, a integração da captura óptica e da detecção de SERS fornece um método conveniente para controlar nanopartículas plasmônicas e alcançar o aprimoramento de sinal SERS reprodutível para detectar moléculas de analito em soluções com alta eficiência, estabilidade e biocompatibilidade.

Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Reconhecemos o apoio de financiamento da Comissão de Ciência, Tecnologia e Inovação do Município de Shenzhen (Nº. JCYJ20180306174930894), Secretaria Municipal de Ciência e Tecnologia de Zhongshan (2020AG003) e Conselho de Bolsas de Pesquisa de Hong Kong (Projeto 26303018). Também reconhecemos o Prof. Chi-Ming Che e seu apoio de financiamento do "Laboratório de Química Sintética e Biologia Química" no âmbito do Programa Health@InnoHK lançado pela Comissão de Inovação e Tecnologia, Região Administrativa Especial do Governo de Hong Kong da República Popular da China.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1064 nm trapping laser IPG Photonics, United States 1064 nm CW Yb fiber laser, 10W
3,3'-Dithiobis[6-nitrobenzoic acid] bis(succinimide) ester  Biosynth Carbosynth FD15467
532 nm Raman excitation source CNI, China MLL-III-532
Bluelake software LUMICKS, Netherlands version 1.6.12 optical tweezer control software
Frame tape Thermo Fisher Scientific, Inc AB-0576
Immersion oil Cargille Laboratories, Inc 16482
Liquid nitrogen-cooled charge-coupled device (CCD) camera Teledyn Princeton Instrument, United States 400B eXcelon
Long-pass dichroic mirror AHF, Germany F48-801
Magnetic laser safety screen ThorLabs TPSM2
Optical tweezer microscope LUMICKS, Netherlands m-trap
Silver nitrate Sigma-Aldrich China, Inc. S8157
Spectrometer Teledyn Princeton Instrument, United States IsoPlane SCT-320
Trisodium citrate Sigma-Aldrich China, Inc. S4641
WinSpec software Teledyn Princeton Instrument, United States version 2.6.24.0 spectrum software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Bioengenharia Edição 184
Captura óptica de nanopartículas plasmônicas para caracterizações de espectroscopia raman aprimoradas na superfície de <em>Situ</em>
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Dai, X., Qiu, W., Huang, J. Optical… More

Dai, X., Qiu, W., Huang, J. Optical Trapping of Plasmonic Nanoparticles for In Situ Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Characterizations. J. Vis. Exp. (184), e63862, doi:10.3791/63862 (2022).

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