हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा के ऑर्थोटोपिक माउस मॉडल में गैर-इनवेसिव पीईटी / एमआर इमेजिंग
Summary
यहां, हम हेपेटिक धमनी बंधाव के साथ और बिना ऑर्थोटोपिक हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा जेनोग्राफ्ट्स बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और [18 एफ] फ्लोरोमिसोनिडाज़ोल ([18 एफ] एफएमआईएसओ) और [18एफ] फ्लोरोडीऑक्सीग्लूकोज ([18एफ] एफडीजी) का उपयोग करके ट्यूमर हाइपोक्सिया की गैर-इनवेसिव पॉज़िट्रॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी (पीईटी) इमेजिंग करते हैं।
Abstract
हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा (एचसीसी) के प्रीक्लिनिकल प्रयोगात्मक मॉडल जो मानव रोग को पुन: उत्पन्न करते हैं, ट्यूमरजेनिसिस का अध्ययन करने और नए चिकित्सीय दृष्टिकोणों का मूल्यांकन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं। पॉज़िट्रॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी (पीईटी) का उपयोग करके गैर-इनवेसिव पूरे शरीर की इमेजिंग वास्तविक समय में आणविक स्तर पर ऊतकों की विवो विशेषताओं में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करती है। हम यहां ट्यूमर हाइपोक्सिया को प्रेरित करने के लिए हेपेटिक धमनी बंधाव (एचएएल) के साथ और उसके बिना ऑर्थोटोपिक एचसीसी जेनोग्राफ्ट निर्माण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और [18एफ] फ्लोरोमिसोनिडाज़ोल ([18एफ] एफएमआईएसओ) और [18एफ] फ्लोरोडीऑक्सीग्लूकोज ([18एफ] एफडीजी) पीईटी / चुंबकीय अनुनाद (एमआर) इमेजिंग का उपयोग करके विवो में उनके ट्यूमर चयापचय का आकलन करते हैं। हाइपोक्सिया मार्कर [18एफ] एफएमआईएसओ का उपयोग करके ट्यूमर हाइपोक्सिया को आसानी से देखा जा सकता है, और यह पाया गया कि गैर-एचएएल समूह की तुलना में एचएएल से गुजरने वाले एचसीसी चूहों में [18एफ] एफएमआईएसओ अपटेक अधिक था, जबकि [18एफ] एफडीजी दो समूहों के बीच ट्यूमर हाइपोक्सिया को अलग नहीं कर सका। एचएएल ट्यूमर ने हाइपोक्सिया के जवाब में हाइपोक्सिया-इंड्यूसेबल फैक्टर (एचआईएफ) -1 की अभिव्यक्ति का एक उच्च स्तर भी प्रदर्शित किया। एचएएल ट्यूमर की मात्रा ने मानकीकृत मूल्य अपटेक (एसयूवी) दृष्टिकोण के आधार पर एफएमआईएसओअपटेक में 2.3 गुना वृद्धि दिखाई।
Introduction
हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा (एचसीसी) छठा सबसे अधिक निदान किया गया कैंसर है और दुनिया भर में कैंसर से मृत्यु का तीसरा सबसे आम कारण है, जिसमें 2020 में 900,000 से अधिक नए मामले और 800,000 मौतें हैं। प्रमुख जोखिम कारक सिरोसिस है, जो वायरल संक्रमण (हेपेटाइटिस बी और सी वायरस), शराब के दुरुपयोग, मधुमेह और गैर-मादक स्टीटोहेपेटाइटिस2 के परिणामस्वरूप होता है। एचसीसी का प्रबंधन जटिल है, और कई उपचार विकल्प उपलब्ध हैं, जिनमें सर्जिकल रिसेक्शन, थर्मल या रासायनिक पृथक्करण, प्रत्यारोपण, ट्रांसआर्टेरियल केमोएम्बोलाइजेशन, विकिरण और कीमोथेरेपी शामिल हैं, जो रोग स्टेजिंग 2,3 पर निर्भर करता है। एचसीसी एक कीमोथेरेपी-दुर्दम्य ट्यूमर है जिसमें उपचारात्मक-इरादे थेरेपी के बाद 70% रोगियों में रोग पुनरावृत्ति होतीहै।
ट्यूमर विषमता की उच्च डिग्री के बावजूद, एचसीसी दो सामान्य परिणामों से जुड़ा हुआ है: (i) एचसीसी बहुत हाइपोक्सिक है, और (ii) ट्यूमर हाइपोक्सिया अधिक ट्यूमर आक्रामकता और उपचार विफलता से जुड़ा हुआ है। एचसीसी कोशिकाओं के अनियंत्रित प्रसार के परिणामस्वरूप एक उच्च ऑक्सीजन खपत दर होती है जो वैस्कुलराइजेशन से पहले होती है, इस प्रकार एक हाइपोक्सिक माइक्रोएन्वायरमेंट बनाती है। कम इंट्रा-ट्यूमरल ऑक्सीजन का स्तर तब जैविक प्रतिक्रियाओं की एक श्रृंखला को ट्रिगर करता है जो ट्यूमर आक्रामकता और उपचार प्रतिक्रिया को प्रभावित करता है। हाइपोक्सिया-इंड्यूसेबल कारक (एचआईएफ) को अक्सर हाइपोक्सिया 2,3 की प्रतिक्रिया में आवश्यक ट्रांसक्रिप्शनल नियामकों के रूप में मान्यता दी जाती है। इसलिए, हाइपोक्सिया का पता लगाने की क्षमता नियोप्लास्टिक ऊतकों की कल्पना करने और दुर्गम साइटों की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है, जिन्हें आक्रामक प्रक्रियाओं की आवश्यकता होती है। यह आणविक परिवर्तनों को बेहतर ढंग से समझने में भी मदद करता है जो ट्यूमर आक्रामकता का कारण बनते हैं और रोगी उपचार के परिणामों में सुधार करते हैं।
पॉज़िट्रॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी (पीईटी) का उपयोग करके आणविक इमेजिंग आमतौर पर एचसीसी सहित कई कैंसर के निदान और मंचन में उपयोग की जाती है। विशेष रूप से, दोहरे-ट्रेसर पीईटी इमेजिंग का संयुक्त उपयोग जिसमें [18एफ] फ्लोरोडीऑक्सीग्लूकोज ([18एफ] एफडीजी) और [11सी] एसीटेट शामिल हैं, एचसीसी निदान 4,5 में समग्र संवेदनशीलता में काफी वृद्धि कर सकते हैं। दूसरी ओर, हाइपोक्सिया की इमेजिंग, आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले हाइपोक्सिक मार्कर [18एफ] फ्लोरोमिसोनिडाज़ोल ([18एफ] एफएमआईएसओ) का उपयोग करके प्राप्त की जा सकती है। नैदानिक अभ्यास में, हाइपोक्सिया का गैर-इनवेसिव मूल्यांकन विकिरण चिकित्सा योजनाके लिए विभिन्न प्रकार के ट्यूमर और क्षेत्रों के बीच अंतर करने के लिए महत्वपूर्ण है।
प्रीक्लिनिकल इमेजिंग विभिन्न बीमारियों के लिए माउस मॉडल के गैर-इनवेसिव और अनुदैर्ध्य मूल्यांकन के लिए एक अनिवार्य उपकरण बन गया है। एक मजबूत और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य एचसीसी मॉडल मानव एचसीसी के पैथोफिज़ियोलॉजी और नए उपचारों के मूल्यांकन में प्रीक्लिनिकल और ट्रांसलेशनल अनुसंधान के लिए एक महत्वपूर्ण मंच का प्रतिनिधित्व करता है। पीईटी इमेजिंग के साथ, विवो व्यवहार में किसी भी समय बिंदु के लिए आणविक स्तर पर महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए स्पष्ट किया जा सकता है। यहां, हम हेपेटिक धमनी बंधाव (एचएएल) ऑर्थोटोपिक एचसीसी जेनोग्राफ्ट्स की पीढ़ी के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं और [18एफ] एफएमआईएसओ और [18एफ] एफडीजी पीईटी / एमआर का उपयोग करके विवो ट्यूमर चयापचय में उनके विश्लेषण का वर्णन करते हैं। एचएएल का समावेश विवो में ट्यूमर हाइपोक्सिया का अध्ययन करने के लिए ट्रांसजेनिक या रासायनिक रूप से प्रेरित एचसीसी चूहों का एक उपयुक्त मॉडल बनाता है, क्योंकि एचएएल इंट्रा-ट्यूमरल हाइपोक्सिया 7,8 को प्रेरित करने के लिए धमनी रक्त की आपूर्ति को प्रभावी ढंग से अवरुद्ध कर सकता है। इसके अलावा, पिमोनिडाज़ोल का उपयोग करके एक्स विवो इम्यूनोहिस्टोकेमिकल स्टेनिंग के विपरीत, हाइपोक्सिया के परिणामस्वरूप ट्यूमर चयापचय में परिवर्तन को पीईटी इमेजिंग का उपयोग करके गैर-आक्रामक रूप से आसानी से देखा और सटीक रूप से परिमाणित किया जा सकता है, जिससे उपचार प्रतिक्रिया के अनुदैर्ध्य मूल्यांकन या प्रतिरोध 3,7,8 के उद्भव का अनुमान लगाया जा सकता है। . यहां दिखाई गई हमारी विधि विवो में एचसीसी जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए पीईटी / एमआर इमेजिंग का उपयोग करके ट्यूमर हाइपोक्सिया की गैर-इनवेसिव निगरानी के साथ एक मजबूत हाइपोक्सिक एचसीसी मॉडल के निर्माण की अनुमति देती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अध्ययन में, हमने चमड़े के नीचे के ट्यूमर का उपयोग करके यकृत ऑर्थोटोपिक एचसीसी जेनोग्राफ्ट्स पर एचएएल करने की प्रक्रियाओं का वर्णन किया, साथ ही [18 एफ] एफएमआईएसओ और [18एफ] एफडीजी पीईटी / एमआर का उपयोग ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम छोटे पशु इमेजिंग प्रयोगों के लिए हांगकांग एंटीकैंसर ट्रस्ट फंड, हांगकांग रिसर्च ग्रांट्स काउंसिल सहयोगी अनुसंधान कोष (सीआरएफ सी 7018-14 ई) के समर्थन को स्वीकार करते हैं। हम [18एफ] एफएमआईएसओ और [18एफ] एफडीजी के प्रावधान के लिए हांगकांग विश्वविद्यालय में आणविक इमेजिंग और मेडिकल साइक्लोट्रॉन सेंटर (एमआईएमसीसी) के समर्थन का भी धन्यवाद करते हैं।
Materials
| 0.9% sterile saline | BBraun | N/A | 0.9% sodium chloride intravenous infusion, 500 mL |
| 10# Scalpel blade | RWD Life Science Co.,ltd | S31010-01 | Animal surgery tool |
| 10% povidone-iodine solution | Banitore | 6.425.678 | For disinfection |
| 25G needle with a 1 mL syringe | BD PrecisionGlide | N/A | 1 mL syringe with 25G needle for cell suspensions injections |
| 5 mL syringe | Terumo | SS05L | 5 mL syringe Luer Lock |
| 70% Ethanol | Merck | 1.07017 | For disinfection |
| Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF2000 | For automated cell counting |
| Buprenorphine | HealthDirect | N/A | Subcutaneous injection (0.05-0.2 mg/kg/12 hours) for analgesic after surgery |
| Cell Culture Dish (60 mm diameter) | Thermo Scientific | 150462 | For tumor tissue processing |
| Centrifuge | Sigma | 3-16KL, fixed-angle rotor 12311 | For cell suspensions collection |
| Centrifuge Conical Tube | Eppendorf | EP0030122151 | For cell suspensions collection |
| Culture media (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) | Gibco | 10566024 | high glucose, GlutaMAX™ Supplement |
| Digital Caliper | RS PRO | 841-2518 | For subcutaneous tumor size measurement |
| Direct heat CO2 incubator | Techcomp Limited | NU5841 | For cell culture |
| Dose calibrator | Biodex | N/A | Atomlab 500 |
| DPBS (Dulbecco’s phosphate-buffered saline) | Gibco | 14287072 | For cell wash and injection |
| Eye lubricant | Alcon Duratears | N/A | Sterile ocular lubricant ointment, 3.5 g |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | A4766801 | Used for a broad range of cell types, especially sensitive cell lines |
| Forceps (curved fine and straight blunt) | RWD Life Science Co.,ltd | F12012-10 & F12011-13 | Animal surgery tool |
| Heating pad | ALA Scientific Instruments | N/A | Heat pad for mice during surgery |
| Insulin syringe | Terumo | 10ME2913 | 1 mL insulin syringe with needle for radiotracer injections |
| InterView fusion software | Mediso | Version 3.03 | Post-processing and image analysis software |
| Inverted microscope | Yu Lung Scientific Co., Ltd | BM-209G | For cells morphology visualization |
| Isoflurane | Chanelle Pharma | N/A | Iso-Vet, inhalation anesthetic, 250 mL |
| Ketamine | Alfasan International B.V. | HK-37715 | Ketamine 10% injection solution, 10 mL |
| Medical oxygen | Linde HKO | 101-HR | compressed gas, 99.5% purity |
| nanoScan PET/MR Scanner | Mediso | N/A | 3 Tesla MR |
| Needle holder | RWD Life Science Co.,ltd | F31026-12 | Animal surgery tool |
| Nucline nanoScan software | Mediso | Version 3.0 | Scanner operating software |
| Nylon Suture (6/0 and 5/0) | Healthy Medical Company Ltd | 000524 & 000526 | Animal surgery tool |
| Penicillin- Streptomycin | Gibco | 15140122 | Culture media for a final concentration of 50 to 100 I.U./mL penicillin and 50 to 100 µg/mL streptomycin. |
| Pentabarbital | AlfaMedic | 13003 | Intraperitoneal injection (330 mg/kg) to induce cessation of breathing of mice |
| Sharp scissors | RWD Life Science Co.,ltd | S14014-10 | Animal surgery tool |
| Spring Scissors | RWD Life Science Co.,ltd | S11005-09 | Animal surgery tool |
| Trypan Blue Solution, 0,4% | Gibco | 15250061 | For cell counting |
| Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, 0.25%), phenol red. | Gibco | 25200072 | For cell digestion |
| Xylazine | Alfasan International B.V. | HK-56179 | Xylazine 2% injection solution, 30 mL |
Riferimenti
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