Неинвазивная ПЭТ/МРТ визуализация на ортотопической мышиной модели гепатоцеллюлярной карциномы
Summary
Здесь мы представляем протокол для создания ксенотрансплантатов ортотопической гепатоцеллюлярной карциномы с перевязкой печеночной артерии и без нее и выполняем неинвазивную позитронно-эмиссионную томографию (ПЭТ) гипоксии опухоли с использованием [18 F] фторизонидазола ([18 F]FMISO) и [18 F] фтордезоксиглюкозы ([18F]FDG).
Abstract
Доклинические экспериментальные модели гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК), которые повторяют заболевание человека, представляют собой важный инструмент для изучения онкогенеза и оценки новых терапевтических подходов. Неинвазивная визуализация всего тела с использованием позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) дает критическое представление о характеристиках тканей in vivo на молекулярном уровне в режиме реального времени. Мы представляем здесь протокол создания ортотопического ксенотрансплантата ГЦК с перевязкой печеночной артерии (HAL) и без нее, чтобы вызвать гипоксию опухоли и оценить их опухолевый метаболизм in vivo с использованием [18 F] фторизонидазола ([18 F]FMISO) и [18 F] фтордезоксиглюкозы ([18F] FDG) ПЭТ/магнитно-резонансной (МРТ) томографии. Гипоксию опухоли можно было легко визуализировать с помощью маркера гипоксии [18 F]FMISO, и было обнаружено, что поглощение [18 F] FMISO было выше у мышей с ГЦК, перенесших HAL, чем в группе без HAL, тогда как [18F]FDG не мог различить гипоксию опухоли между двумя группами. Опухоли HAL также показали более высокий уровень экспрессии индуцируемого гипоксией фактора (HIF)-1α в ответ на гипоксию. Количественная оценка опухолей HAL показала 2,3-кратное увеличение поглощения [18F] FMISO на основе стандартизированного подхода поглощения стоимости (SUV).
Introduction
Гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) является шестым наиболее диагностируемым раком и третьей по распространенности причиной смерти от рака во всем мире: в 2020 году было зарегистрировано более 900 000 новых случаев и 800 000 смертей1. Основным фактором риска является цирроз печени, который возникает в результате вирусных инфекций (вирусов гепатита В и С), злоупотребления алкоголем, диабета и неалкогольного стеатогепатита2. Лечение ГЦК довольно сложное, и существует несколько вариантов лечения, включая хирургическую резекцию, термическую или химическую абляцию, трансплантацию, трансартериальную химиоэмболизацию, лучевую терапию и химиотерапию, в зависимости от стадии заболевания 2,3. ГЦК представляет собой рефрактерную к химиотерапии опухоль с рецидивом заболевания у 70% пациентов после лечебной терапии2.
Несмотря на высокую степень гетерогенности опухоли, ГЦК связан с двумя общими исходами: (i) ГЦК очень гипоксичен и (ii) гипоксия опухоли связана с большей агрессивностью опухоли и неэффективностью лечения. Неконтролируемая пролиферация клеток ГЦК приводит к высокой скорости потребления кислорода, которая предшествует васкуляризации, создавая тем самым гипоксическое микроокружение. Низкий внутриопухолевый уровень кислорода вызывает ряд биологических реакций, которые влияют на агрессивность опухоли и реакцию на лечение. Индуцируемые гипоксией факторы (HIF) часто признаются важными транскрипционными регуляторами в ответ на гипоксию 2,3. Следовательно, способность обнаруживать гипоксию имеет решающее значение для визуализации опухолевых тканей и выявления труднодоступных участков, которые требуют инвазивных процедур. Это также помогает лучше понять молекулярные изменения, которые приводят к агрессивности опухоли, и улучшить результаты лечения пациентов.
Молекулярная визуализация с использованием позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) обычно используется для диагностики и определения стадии многих видов рака, включая ГЦК. В частности, комбинированное использование ПЭТ-визуализации с двумя индикаторами с участием [18 F] фтордезоксиглюкозы ([18F] ФДГ) и [11C] ацетата может значительно повысить общую чувствительность при диагностике ГЦК 4,5. С другой стороны, визуализация гипоксии может быть достигнута с помощью широко используемого гипоксического маркера [18 F] фторизонидазола ([18F]FMISO). В клинической практике неинвазивная оценка гипоксии важна для дифференциации различных типов опухолей и областей для планирования лучевой терапии6.
Доклиническая визуализация стала незаменимым инструментом для неинвазивной и продольной оценки моделей мышей для различных заболеваний. Надежная и воспроизводимая модель ГЦК представляет собой важную платформу для доклинических и трансляционных исследований патофизиологии ГЦК человека и оценки новых методов лечения. Вместе с ПЭТ-визуализацией поведение in vivo может быть выяснено, чтобы обеспечить важную информацию на молекулярном уровне для любого заданного момента времени. Здесь мы описываем протокол генерации ортотопических ксенотрансплантатов ГЦК для перевязки печеночной артерии (HAL) и анализа их опухолевого метаболизма in vivo с использованием [18 F]FMISO и [18F]FDG PET/MR. Включение HAL делает подходящую модель трансгенных или химически индуцированных ксенотрансплантатов мышей ГЦК для изучения гипоксии опухоли in vivo, поскольку HAL может эффективно блокировать артериальное кровоснабжение, вызывая внутриопухолевую гипоксию 7,8. Кроме того, в отличие от иммуногистохимического окрашивания ex vivo с использованием пимонидазола, изменения метаболизма опухоли в результате гипоксии могут быть легко визуализированы и точно количественно количественно неинвазивно с помощью ПЭТ-визуализации, что позволяет проводить продольную оценку ответа на лечение или измерять возникновение резистентности 3,7,8 . Наш метод, показанный здесь, позволяет создать надежную гипоксическую модель ГЦК вместе с неинвазивным мониторингом гипоксии опухоли с использованием ПЭТ/МРТ для изучения биологии ГЦК in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом исследовании мы описали процедуры выполнения HAL на ортотопических ксенотрансплантатах печени ГЦК с использованием подкожных опухолей, а также методы неинвазивного мониторинга гипоксии опухоли в ортотопических ксенотрансплантатах с использованием [18 F]FMISO и [18F]FDG PET/MR.</su…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы выражаем признательность Гонконгскому трастовому фонду по борьбе с раком, Фонду совместных исследований Совета по исследовательским грантам Гонконга (CRF C7018-14E) в проведении экспериментов по визуализации мелких животных. Мы также благодарим Центр молекулярной визуализации и медицинских циклотронов (MIMCC) при Университете Гонконга за предоставление [18 F]FMISO и [18F]FDG.
Materials
| 0.9% sterile saline | BBraun | N/A | 0.9% sodium chloride intravenous infusion, 500 mL |
| 10# Scalpel blade | RWD Life Science Co.,ltd | S31010-01 | Animal surgery tool |
| 10% povidone-iodine solution | Banitore | 6.425.678 | For disinfection |
| 25G needle with a 1 mL syringe | BD PrecisionGlide | N/A | 1 mL syringe with 25G needle for cell suspensions injections |
| 5 mL syringe | Terumo | SS05L | 5 mL syringe Luer Lock |
| 70% Ethanol | Merck | 1.07017 | For disinfection |
| Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF2000 | For automated cell counting |
| Buprenorphine | HealthDirect | N/A | Subcutaneous injection (0.05-0.2 mg/kg/12 hours) for analgesic after surgery |
| Cell Culture Dish (60 mm diameter) | Thermo Scientific | 150462 | For tumor tissue processing |
| Centrifuge | Sigma | 3-16KL, fixed-angle rotor 12311 | For cell suspensions collection |
| Centrifuge Conical Tube | Eppendorf | EP0030122151 | For cell suspensions collection |
| Culture media (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) | Gibco | 10566024 | high glucose, GlutaMAX™ Supplement |
| Digital Caliper | RS PRO | 841-2518 | For subcutaneous tumor size measurement |
| Direct heat CO2 incubator | Techcomp Limited | NU5841 | For cell culture |
| Dose calibrator | Biodex | N/A | Atomlab 500 |
| DPBS (Dulbecco’s phosphate-buffered saline) | Gibco | 14287072 | For cell wash and injection |
| Eye lubricant | Alcon Duratears | N/A | Sterile ocular lubricant ointment, 3.5 g |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | A4766801 | Used for a broad range of cell types, especially sensitive cell lines |
| Forceps (curved fine and straight blunt) | RWD Life Science Co.,ltd | F12012-10 & F12011-13 | Animal surgery tool |
| Heating pad | ALA Scientific Instruments | N/A | Heat pad for mice during surgery |
| Insulin syringe | Terumo | 10ME2913 | 1 mL insulin syringe with needle for radiotracer injections |
| InterView fusion software | Mediso | Version 3.03 | Post-processing and image analysis software |
| Inverted microscope | Yu Lung Scientific Co., Ltd | BM-209G | For cells morphology visualization |
| Isoflurane | Chanelle Pharma | N/A | Iso-Vet, inhalation anesthetic, 250 mL |
| Ketamine | Alfasan International B.V. | HK-37715 | Ketamine 10% injection solution, 10 mL |
| Medical oxygen | Linde HKO | 101-HR | compressed gas, 99.5% purity |
| nanoScan PET/MR Scanner | Mediso | N/A | 3 Tesla MR |
| Needle holder | RWD Life Science Co.,ltd | F31026-12 | Animal surgery tool |
| Nucline nanoScan software | Mediso | Version 3.0 | Scanner operating software |
| Nylon Suture (6/0 and 5/0) | Healthy Medical Company Ltd | 000524 & 000526 | Animal surgery tool |
| Penicillin- Streptomycin | Gibco | 15140122 | Culture media for a final concentration of 50 to 100 I.U./mL penicillin and 50 to 100 µg/mL streptomycin. |
| Pentabarbital | AlfaMedic | 13003 | Intraperitoneal injection (330 mg/kg) to induce cessation of breathing of mice |
| Sharp scissors | RWD Life Science Co.,ltd | S14014-10 | Animal surgery tool |
| Spring Scissors | RWD Life Science Co.,ltd | S11005-09 | Animal surgery tool |
| Trypan Blue Solution, 0,4% | Gibco | 15250061 | For cell counting |
| Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, 0.25%), phenol red. | Gibco | 25200072 | For cell digestion |
| Xylazine | Alfasan International B.V. | HK-56179 | Xylazine 2% injection solution, 30 mL |
Riferimenti
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Chen, C., Lou, T. Hypoxia inducible factors in hepatocellular carcinoma. Oncotarget. 8 (28), 46691-46703 (2017).
- Lu, R. -. C., et al. Positron-emission tomography for hepatocellular carcinoma: Current status and future prospects. World Journal of Gastroenterology. 25 (32), 4682-4695 (2019).
- Larsson, P., et al. Adding 11C-acetate to 18F-FDG at PET examination has an incremental value in the diagnosis of hepatocellular carcinoma. Molecular Imaging and Radionuclide Therapy. 21 (1), 6-12 (2012).
- Huo, L., et al. Kinetic analysis of dynamic 11C-acetate PET/CT imaging as a potential method for differentiation of hepatocellular carcinoma and benign liver lesions. Theranostics. 5 (4), 371-377 (2015).
- Lopci, E., et al. PET radiopharmaceuticals for imaging of tumor hypoxia: A review of the evidence. American Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 4 (4), 365-384 (2014).
- Mao, X., et al. Mechanisms through which hypoxia-induced caveolin-1 drives tumorigenesis and metastasis in hepatocellular carcinoma. Ricerca sul cancro. 76 (24), 7242-7253 (2016).
- Kung-Chun Chiu, D., et al. Hypoxia regulates the mitochondrial activity of hepatocellular carcinoma cells through HIF/HEY1/PINK1 pathway. Cell Death & Disease. 10 (12), 934 (2019).
- Li, Y., et al. Establishment of cell clones with different metastatic potential from the metastatic hepatocellular carcinoma cell line MHCC97. World Journal of Gastroenterology. 7 (5), 630-636 (2001).
- Faustino-Rocha, A., et al. Estimation of rat mammary tumor volume using caliper and ultrasonography measurements. Lab Animal. 42 (6), 217-224 (2013).
- Liu, Q., Tan, K. V., Chang, H. C., Khong, P. L., Hui, X. Visualization and quantification of brown and beige adipose tissues in mice using [18F] FDG micro-PET/MR imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (173), e62460 (2021).
- Lin, W. -. H., et al. Hypoxia-activated cytotoxic agent tirapazamine enhances hepatic artery ligation-induced killing of liver tumor in HBx transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (42), 11937-11942 (2016).
- Wong, T. L., et al. CRAF methylation by PRMT6 regulates aerobic glycolysis-driven hepatocarcinogenesis via ERK-dependent PKM2 nuclear relocalization and activation. Hepatology. 71 (4), 1279-1296 (2020).
- Yang, X., et al. Development of cisplatin-loaded hydrogels for trans-portal vein chemoembolization in an orthotopic liver cancer mouse model. Drug Delivery. 28 (1), 520-529 (2021).
- Shi, J., et al. Longitudinal evaluation of five nasopharyngeal carcinoma animal models on the microPET/MR platform. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49 (5), 1497-1507 (2021).
- Kilian, K., et al. Imaging of hypoxia in small animals with F fluoromisonidasole. Nukleonika. 61 (2), 219-223 (2016).
- Kawamura, M., et al. Evaluation of optimal post-injection timing of hypoxic imaging with 18F-Fluoromisonidazole-PET/CT. Molecular Imaging and Biology. 23 (4), 597-603 (2021).
