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Immunology and Infection

इन विट्रो साइटोटोक्सिक लिम्फोसाइटों द्वारा प्लास्मोडियम-संक्रमित लाल रक्त कोशिका की हत्या की परख

Published: August 17, 2022 doi: 10.3791/63987
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 1
1Instituto René Rachou, Fundação Oswaldo Cruz, 2Departamento de Bioquímica e Imunologia, Universidade Federal de Minas Gerais
* These authors contributed equally

Summary

यहां हम संक्रमण के रक्त चरण के दौरान प्लास्मोडियम के लिए सेलुलर प्रतिरक्षा के तंत्र को स्पष्ट करने में मदद करने के लिए एक नई विधि का वर्णन करते हैं। यह एक इन विट्रो परख है जो साइटोटोक्सिक लिम्फोसाइटों द्वारा संक्रमित लाल रक्त कोशिका की हत्या को मापता है।

Abstract

मलेरिया एक प्रमुख सार्वजनिक स्वास्थ्य चिंता है, जो दुनिया भर में प्रति वर्ष 200 मिलियन से अधिक मामले पेश करता है। वैज्ञानिक प्रयासों के वर्षों के बावजूद, मलेरिया के लिए सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा अभी भी खराब समझी जाती है, मुख्य रूप से दीर्घकालिक प्लास्मोडियम संस्कृति की पद्धतिगत सीमाओं के कारण, विशेष रूप से प्लास्मोडियम विवैक्स के लिए। अधिकांश अध्ययनों ने एंटीबॉडी द्वारा मलेरिया के खिलाफ अनुकूली प्रतिरक्षा संरक्षण पर ध्यान केंद्रित किया है, जो मलेरिया को नियंत्रित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। हालांकि, क्षीण प्लास्मोडियम स्पोरोज़ोइट्स टीकों द्वारा प्रेरित बाँझ सुरक्षा सेलुलर प्रतिक्रिया से संबंधित है, मुख्य रूप से साइटोटोक्सिक टी लिम्फोसाइटों, जैसे सीडी 8 + और गामा डेल्टा टी कोशिकाओं (3 टी)। इसलिए, सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के कार्यों को बेहतर ढंग से समझने के लिए नई पद्धतियों को विकसित किया जाना चाहिए और इस प्रकार भविष्य की चिकित्सा और वैक्सीन विकास का समर्थन करना चाहिए। प्लाज्मोडियम रक्त-चरण संक्रमण के लिए इस सेल-मध्यस्थता प्रतिरक्षा का विश्लेषण करने के लिए एक नई रणनीति खोजने के लिए, हमारे समूह ने एक इन विट्रो परख की स्थापना की जो साइटोटोक्सिक लिम्फोसाइटों द्वारा संक्रमित लाल रक्त कोशिका (आईआरबीसी) की हत्या को मापता है। इस परख का उपयोग रक्त चरण में विभिन्न प्लास्मोडियम एसपीपी के खिलाफ सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया तंत्र का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। जन्मजात और अनुकूलनशील साइटोटोक्सिक प्रतिरक्षा कोशिकाएं सीधे एक प्रभावक: लक्ष्य तंत्र में आईआरबीसी और इंट्रासेल्युलर परजीवी को खत्म कर सकती हैं। लक्ष्य आईआरबीसी को सेल व्यवहार्यता का मूल्यांकन करने के लिए लेबल किया जाता है, और प्रभावक कोशिकाओं (सीडी 8 + टी, 3 टी, एनके कोशिकाओं, आदि) के साथ सह-संवर्धित किया जाता है। प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित परख में सहज लाइसिस नियंत्रण की तुलना में परीक्षण की गई स्थितियों के आधार पर लाइसिस प्रतिशत की गणना की जाती है। अंततः, यह हत्या परख पद्धति रक्त-चरण मलेरिया के लिए सेल-मध्यस्थता प्रतिरक्षा को समझने में एक प्रमुख प्रगति है, जिससे नए संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों को उजागर करने और मलेरिया टीकों के विकास में तेजी लाने में मदद मिलती है।

Introduction

मलेरिया एक वैश्विक स्वास्थ्य संकट बना हुआ है, जिसमें 2020 में 240 मिलियन से अधिक मामले और 627,000 मलेरिया से संबंधित मौतें दर्ज की गईहैं। वर्तमान में पांच परजीवी प्रजातियां हैं जो मनुष्यों में मलेरिया का कारण बन सकती हैं, जिनमें से प्लास्मोडियम फाल्सीपेरम और प्लास्मोडियम विवैक्स दो सबसे प्रचलित प्रजातियां हैं। प्लास्मोडियम संक्रमण के दौरान, यकृत या पूर्व-एरिथ्रोसाइटिक चरण स्पर्शोन्मुख होता है, और लक्षण केवल एरिथ्रोसाइटिक चरण में परजीवी के अलैंगिक चक्र के दौरान होते हैं। इस संक्रमण चरण में, यकृत चरण से प्राप्त हजारों मेरोज़ोइट्स रक्तप्रवाह में जारी किए जाते हैं और लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी) को संक्रमित करते हैं। आरबीसी में, परजीवी स्किज़ोगोनी द्वारा ट्रोफोज़ोइट्स और स्किज़ोन्ट्स में अंतर करते हैं, जब तक कि स्किज़ोन्ट्स एरिथ्रोसाइट को तोड़ नहीं देते हैं, नवगठित मेरोज़ोइट्स जारी करते हैं, इस रक्त चक्र को दोहराते हैं। आक्रमण, प्रतिकृति और मेरोज़ोइट रिलीज के बार-बार चक्र के परिणामस्वरूप परजीवी आबादी की घातीय वृद्धि होती है और अंततः रोग के लक्षण 2 ट्रिगर होतेहैं।

मलेरिया के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का अध्ययन करने में एक महत्वपूर्ण चुनौती यह है कि प्लास्मोडियम एसपीपी। जो मनुष्यों को संक्रमित करता है वह प्रयोगशाला पशु मॉडल को संक्रमित नहीं करता है। इस प्रकार, प्लास्मोडियम संक्रमित रोगी के नमूने ताजा एकत्र किए जाने चाहिए और तुरंत संसाधित और विश्लेषण किए जाने चाहिए। हालांकि, मलेरिया-स्थानिक क्षेत्रों में, प्रतिरक्षात्मक और आणविक तंत्र तक पहुंचने के लिए संसाधन सीमित हैं। इन सीमाओं के कारण, कृन्तकों को व्यापक रूप से प्लाज्मोडियम संक्रमण के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की जांच के लिए प्रयोगात्मक मॉडल के रूप में उपयोग किया जाता है। जबकि पी. बर्गेई और पी. चाबौदी को अक्सर पी. फाल्सीपेरम संक्रमण के लिए सरोगेट के रूप में उपयोग किया जाता है, पी. योएली 17एक्सएनएल के गैर-घातक स्ट्रेन में भी पी. विवैक्स के साथ कई विशेषताएं हैं, जैसे कि रेटिकुलोसाइट प्रतिबंधित संक्रमण 3,4। प्लाज्मोडियम इन विट्रो परख का विकास, जिसका उपयोग मानव या पशु मॉडल-व्युत्पन्न नमूनों के लिए किया जा सकता है, मलेरिया के रोगजनन की बेहतर समझ प्राप्त करने और परजीवी की विभिन्न प्रजातियों द्वारा प्राप्त प्रतिरक्षात्मक प्रतिक्रिया की तुलना करने में मूल्यवान है।

सुरक्षात्मक एंटीमलेरियल प्रतिरक्षा को पूरी तरह से समझा नहीं जाता है या तो पूर्व-एरिथ्रोसाइटिक चरण और न ही रक्त चरण में। यह ज्ञात है कि बार-बार संक्रमण के संपर्क में आने से आंशिक अधिग्रहित प्रतिरक्षा होती है, लेकिन बाँझ प्रतिरक्षा शायद हीकभी विकसित होती है। दशकों से, एंटी-प्लास्मोडियम सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा मुख्य रूप से एंटीबॉडी को निष्क्रिय करने या ऑप्सिनाइजिंग करने के प्रेरण से जुड़ी थी जो मेजबान कोशिकाओं के परजीवी आक्रमण को रोकती है या एंटीजन-प्रेजेंटिंग कोशिकाओं द्वारा फागोसाइटोसिस का कारण बनती है। नतीजतन, अब तक एंटीमलेरियल टीकों का उत्पादन करने के अधिकांश प्रयास सुरक्षात्मक और लंबे समय तक चलने वाले एंटीबॉडी 7,8 को प्रेरित करने पर निर्भर हैं। हालांकि, एक क्षीण स्पोरोज़ोइट के साथ टीकाकरण से प्रेरित बाँझ सुरक्षा सीधे साइटोटोक्सिक टी लिम्फोसाइटों 8,9 के सक्रियण और विस्तार से संबंधित है।

हाल ही में, ताजा पृथक रोगी के नमूनों और इन विट्रो संस्कृतियों के कुछ अध्ययनों से पता चला है कि सीडी 8 + टी 10, 3 टी11, और एनके सेल12 जैसे जन्मजात या अनुकूलनशील साइटोटॉक्सिक प्रतिरक्षा कोशिकाएं प्लाज्मोडियम-संक्रमित आरबीसी और इसके इंट्रासेल्युलर परजीवी को सीधे प्रभावक: लक्ष्य अनुपात तरीके से खत्म कर सकती हैं। इन मौलिक निष्कर्षों ने मलेरिया के संदर्भ में एक पूरी तरह से नए प्रतिरक्षा प्रभावकारक तंत्र को परिभाषित किया। इस नई एंटीमलेरियल प्रतिरक्षा को विच्छेदित करने के लिए, प्राकृतिक संक्रमण या टीकाकरण में संक्रमित-आरबीसी (आईआरबीसी) के खिलाफ हत्यारे कोशिकाओं के साइटोटोक्सिक प्रभावकारक तंत्र का पता लगाना आवश्यक है।

यहां हम एक इन विट्रो परख प्रस्तुत करते हैं जो रक्त चरण में मलेरिया के खिलाफ लिम्फोसाइटों की साइटोटोक्सिक गतिविधि को मापता है। यह परख तब प्लास्मोडियम एरिथ्रोसाइट चरण के खिलाफ सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के तंत्र को स्पष्ट करने में मदद कर सकती है। लक्ष्य कोशिकाओं, आईआरबीसी को सेल व्यवहार्यता का मूल्यांकन करने के लिए कार्बोक्सीफ्लोरेसिन सक्सिनिमिडिल एस्टर (सीएफएसई) के साथ लेबल किया जाता है, और फिर साइटोटोक्सिक लिम्फोसाइटों (सीटीएल) जैसे प्रभावक कोशिकाओं के साथ सह-संवर्धित किया जाता है। इस कोकल्चर का मूल्यांकन फ्लो साइटोमेट्री द्वारा किया जाता है, जिसमें विशिष्ट सेल प्रकारों के लिए फ्लोरोसेंट मार्करों का उपयोग किया जाता है। अंत में, सीटीएल द्वारा आईआरबीसी लाइसिस के प्रतिशत की गणना आरबीसी के सहज टूटने और सहज लाइसिस नियंत्रण द्वारा प्रयोगात्मक स्थिति को विभाजित करके की जाती है, जो प्रभावक सेल के दौरान इनक्यूबेशन बिना होता है। कुल मिलाकर, यह हत्या परख पद्धति सेल-मध्यस्थता मलेरिया प्रतिरक्षा की बेहतर समझ में योगदान कर सकती है।

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Protocol

सभी प्रक्रियाओं को ओसवाल्डो क्रूज़ फाउंडेशन और नेशनल एथिकल काउंसिल (सीएएई: 59902816.7.0000.5091) की नीतियों का पालन करते हुए आयोजित किया गया था। मानव प्रोटोकॉल को रिसर्च सेंटर फॉर ट्रॉपिकल मेडिसिन ऑफ रोंडोनिया (सीईपीईएम) के नैदानिक अनुसंधान समूह के सहयोग से विकसित किया गया था, जो अध्ययन में रोगियों को नामांकित करने का प्रभारी था। सभी रोगियों से सूचित सहमति प्राप्त की गई थी।

पशु अध्ययन के लिए, जानवरों के प्रयोग के नियंत्रण के लिए राष्ट्रीय परिषद (CONCEA) के वैज्ञानिक और उपदेशात्मक उद्देश्यों के लिए जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए ब्राजील अभ्यास गाइड के आचरण के सिद्धांतों का पालन करते हुए प्रक्रियाएं की गईं। प्रोटोकॉल को फियोक्रूज पशु प्रयोग परिषद (सीईयूए प्रोटोकॉल एलडब्ल्यू 15/20-2) द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. मानव रक्त के नमूनों और पीबीएमसी अलगाव का संग्रह

  1. सोडियम हेपरिन के साथ 10 एमएल खाली रक्त संग्रह ट्यूब में प्लास्मोडियम संक्रमित रोगियों के रक्त को इकट्ठा करें। चूंकि मलेरिया रोगी लिम्फोपेनिया प्रदर्शित करते हैं, इसलिए 10 एमएल रक्त के नमूने में 5-9 x 106 परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीसी) की सीमा होती है। चूंकि सीडी 8 + टी कोशिकाएं या 3 टी कोशिकाएं पीबीएमसी का ~ 10% बनाती हैं, अधिमानतः 50-100 एमएल रक्त / रोगी एकत्र करती हैं।
    नोट: न्यूनतम 1 x 105 प्रभावक कोशिकाओं / स्थिति पर विचार किया जाना चाहिए।
  2. नीचे वर्णित के रूप में रक्त स्मीयर द्वारा आईआरबीसी के प्रतिशत की गणना करें।
    1. एक स्पष्ट स्लाइड में कुल रक्त का 5 μL जोड़ें और एक रक्त स्मीयर तैयार करें। रोमानोव्स्की-प्रकार के पैनोप्टिक फास्ट स्टेन या मई-गुनवाल्ड-गिम्सा दाग का प्रदर्शन करें। यहां, पैनोप्टिक फास्ट स्टेन किट का उपयोग किया जाता है, जो तीन अभिकर्मकों से बना होता है: अभिकर्मक ए (निर्धारण), अभिकर्मक बी (साइटोप्लाज्मिक दाग), और अभिकर्मक सी (परमाणु और साइटोप्लाज्मिक अंतर दाग)।
    2. धीरे-धीरे स्लाइड को घोल A 10x में, फिर 4x को विलयन B में और अंत में 10x को विलयन C में डुबोएँ। विलयन के बीच स्लाइड से किसी भी अतिरिक्त अभिकर्मक को निकाल दें। घोल सी में डुबोने के बाद, स्लाइड को बहते नल के पानी में धो लें और इसे सूखने दें।
    3. 100x तेल विसर्जन उद्देश्य के साथ एक ईमानदार प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत, अनुक्रमिक वर्गों में 1000 आरबीसी की गणना करें और निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करके परजीवीता के प्रतिशत की गणना करें:
      Equation 1
  3. बाँझ फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) में 1: 1 अनुपात में 15 मिलीलीटर रक्त पतला करें।
  4. 50 एमएल ट्यूब में लिम्फोसाइट पृथक्करण माध्यम (1.077 ग्राम / एमएल का घनत्व) के 15 एमएल जोड़ें। सेंट्रीफ्यूजेशन माध्यम समाधान पर पतला रक्त के नमूने के 30 एमएल को सावधानीपूर्वक परत करें। नमूने को परत करते समय, रक्त के नमूने और लिम्फोसाइट पृथक्करण माध्यम को मिश्रण न करें।
  5. 22 डिग्री सेल्सियस पर 40 मिनट के लिए 400 x g पर ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें, कम त्वरण और बिना ब्रेक सेटिंग के।
  6. एक बाँझ पिपेट का उपयोग करके प्लाज्मा युक्त ऊपरी परत को खींचें, जिससे मोनोन्यूक्लियर सेल परत अबाधित हो जाए। एक बाँझ पिपेट का उपयोग करके मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीसी) की परत को बाँझ ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  7. रक्त गोली युक्त ट्यूब को न छोड़ें क्योंकि इसका उपयोग बाद में संक्रमित आरबीसी अलगाव के लिए किया जाएगा। इस चरण से, आरबीसी को कमरे के तापमान (आरटी) पर रखना सुनिश्चित करें। उन्हें कभी ठंडा न होने दें।
  8. ब्रेक सेटिंग के साथ 10 मिनट के लिए 350 x g पर पीबीएस और सेंट्रीफ्यूज जोड़कर कोशिकाओं को दो बार धोएं। स्ट्रेप्टोमाइसिन और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस; पूर्ण माध्यम) के साथ पूरक आरपीएमआई माध्यम के 5 एमएल में सेल गोली को फिर से निलंबित करें।
  9. हेमसाइटोमीटर (न्यूबॉयर चैंबर) या स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके सेल व्यवहार्यता की जांच करने के लिए ट्राइपैन ब्लू समाधान की उपस्थिति में पीबीएमसी की गणना करें। नीले दाग वाली कोशिकाओं की गिनती न करें क्योंकि ये मरने वाली कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं, जो ट्राइपैन नीले रंग को अवशोषित करते हैं।
  10. पूर्ण माध्यम का उपयोग करके सेल एकाग्रता को 107 कोशिकाओं / एमएल में समायोजित करें। अभिकर्मक निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार चुंबकीय मोती अलगाव का उपयोग करके वांछित साइटोटोक्सिक लिम्फोसाइट आबादी (सीडी 8 + टी कोशिकाओं, एनके कोशिकाओं, 3 टी कोशिकाओं) को शुद्ध करें।

2. मानव आरबीसी अलगाव।

नोट: मानव संक्रमित आरबीसी अलगाव के लिए, रक्त के नमूनों से शुरू करने की सिफारिश की जाती है जिनमें कम से कम 2% परजीवीमिया होता है, अधिमानतः ट्रोफोज़ोइट / प्रारंभिक स्किज़ोंट परजीवी चरण में अधिक होता है।

  1. नीचे वर्णित अनुशंसित एकाग्रता पर PERCOL (इसके बाद घनत्व ढाल पृथक्करण माध्यम के रूप में संदर्भित) तैयार करें।
    1. 90% आइसोटोनिक घनत्व ढाल पृथक्करण माध्यम प्राप्त करने के लिए 100% घनत्व ढाल पृथक्करण माध्यम के 90 एमएल और 10 x पीबीएस के 10 एमएल जोड़ें।
    2. विवाक्स-संक्रमित रेटिकुलोसाइट पृथक्करण के लिए,45% घनत्व ढाल पृथक्करण मीडिया तैयार करें। 45% घनत्व ढाल पृथक्करण माध्यम प्राप्त करने के लिए 90% आइसोटोनिक घनत्व ढाल पृथक्करण माध्यम के 50 मिलीलीटर और 1x पीबीएस के 50 मिलीलीटर जोड़ें।
    3. फाल्सीपेरम-संक्रमित एरिथ्रोसाइट पृथक्करण के लिए, 65% घनत्व ढाल पृथक्करण मीडिया तैयार करें। 65% घनत्व ढाल पृथक्करण माध्यम प्राप्त करने के लिए 90% आइसोटोनिक घनत्व ढाल पृथक्करण माध्यम का 72 एमएल और 1x पीबीएस का 28 एमएल जोड़ें।
    4. असंक्रमित रेटिकुलोसाइट पृथक्करण के लिए, 70% घनत्व ढाल पृथक्करण मीडिया तैयार करें। 70% घनत्व ढाल पृथक्करण माध्यम प्राप्त करने के लिए 90% आइसोटोनिक घनत्व ढाल पृथक्करण माध्यम के 78 एमएल और 1x पीबीएस के 22 एमएल जोड़ें।
  2. पानी के स्नान में घनत्व ढाल पृथक्करण माध्यम को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
  3. पीबीएमसी परत को हटाने के बाद, कोशिकाओं को छूने के बिना सेंट्रीफ्यूजेशन माध्यम की शीर्ष परत को सावधानीपूर्वक हटा दें। ग्लास पाश्चर पिपेट के साथ, आरबीसी गोली को परेशान किए बिना ऊपरी न्यूट्रोफिल परत को सावधानीपूर्वक हटा दें और गोली की मात्रा का अनुमान लगाएं। आरटी पूर्ण माध्यम के आरबीसी गोली की मात्रा को 4 गुना जोड़ें और फिर से निलंबित करें।
  4. एक दूसरे 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में, सेल प्रकार को अलग करने के आधार पर 45%, 65%, या 70% घनत्व ढाल पृथक्करण माध्यम की गोली मात्रा 5x जोड़ें। घनत्व ढाल पृथक्करण मध्यम परत के शीर्ष पर आरबीसी निलंबन को सावधानीपूर्वक परत करें।
  5. कम त्वरण और बिना ब्रेक सेटिंग के 850 x g पर 15 मिनट के लिए स्पिन करें। 5 एमएल पिपेट के साथ सुपरनैटेंट और घनत्व ढाल पृथक्करण माध्यम के बीच में पड़ी बादल लाल/ भूरे रंग की परत को इकट्ठा करें। एक बाँझ 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  6. 15 एमएल तक आरटी पूर्ण माध्यम जोड़कर कोशिकाओं को धोएं और 860 x g पर 10 मिनट के लिए स्पिन करें। 10 मिलीलीटर आरटी पूर्ण माध्यम जोड़कर धोने को दोहराएं और नीचे घुमाएं। सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें और चरण 1.2 का पालन करते हुए आईआरबीसी संवर्धन की जांच के लिए गोली से रक्त स्मीयर तैयार करें।
  7. आरटी पूर्ण माध्यम के 1 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें और कोशिकाओं की गिनती करते समय कमरे के तापमान पर बैठने दें। एक हेमोसाइटोमीटर (न्यूबॉयर कक्ष) में सेल निलंबन के 10 μL जोड़ें और 25 मध्यम वर्गों में विभाजित केंद्रीय क्षेत्र में आरबीसी की गिनती करें। आरटी पूर्ण मीडिया में सेल एकाग्रता को 1 x 107 आईआरबीसी / एमएल में समायोजित करें।

3. माउस में प्रायोगिक मलेरिया संक्रमण

  1. क्रायोप्रिजर्व्ड पी. योएली 17एक्सएनएल: पाइजीएफपी (एमआरए-817), एमआर4/एटीसीसी से प्राप्त जीएफपी-अभिव्यक्ति तनाव को पिघलाएं, और 8 सप्ताह की महिला सी 57बीएल/6 माउस में 100 μL इंट्रापरिटोनियल (यानी) इंजेक्ट करें।
  2. पूंछ की नस के रक्त संग्रह द्वारा हर 3 दिनों में परजीवीबोझ का पालन करें।
    1. सुई के साथ बर्तन को पंचर करें, पूंछ के बाहर के छोर से शुरू होने वाले उथले कोण पर नस में प्रवेश करें।
    2. 5 या 10 एमएल तक पिपेट या केशिका ट्यूब के साथ रक्त का नमूना एकत्र करें, फिर रक्तस्राव को रोकने के लिए मैन्युअल दबाव लागू करें।
    3. एक रक्त स्मीयर तैयार करें (जैसा कि चरण 1.2 में वर्णित है) जब तक कि परजीवी 10% -15% संक्रमित आरबीसी तक नहीं पहुंच जाता।
  3. पूंछ की नस लैंसिंग द्वारा 10 μL रक्त एकत्र करें और दूसरे दाता माउस में इंजेक्ट करने के लिए पीबीएस के 100 μL को पतला करें।
    नोट: प्रयोगात्मक संक्रमण के लिए उपयोग किए जाने से पहले क्रायोसंरक्षित परजीवी को चूहों में दो बार पिघलाया और पारित किया जाना चाहिए।
  4. जब दूसरा मार्ग 15% परजीवीता तक पहुंच जाता है, तो पूंछ की कतरन विधि द्वारा रक्त की पांच बूंदों को इकट्ठा करें और पीबीएस के 1 एमएल में पतला करें। बाँझ पीबीएस में एकाग्रता को 1 x 106 आईआरबीसी / एमएल में समायोजित करके एक संक्रमण समाधान तैयार करें और प्रयोग के लिए आवश्यक प्रत्येक माउस में घोल के 100 μL (1 x 105 iRBCs) इंजेक्ट करें।
  5. हर 2-3 दिनों में पैरासाइटिमिया की निगरानी करें जब तक कि यह ~ 30% आईआरबीसी तक न पहुंच जाए, जो संक्रमण के लगभग 12 दिन बाद होता है। जब चूहे वांछित परजीवीतक पहुंच जाते हैं, तो नीचे वर्णित कार्डियक पंचर द्वारा रक्त एकत्र करें।
    1. हेपरिन घोल (30 यू / एमएल) के 100 μL को 26 ग्राम सुई के साथ 1 एमएल सिरिंज में डालें।
    2. 5% आइसोफ्लुरेन के साथ साँस द्वारा माउस को एनेस्थेटाइज करें और सजगता की अनुपस्थिति की पुष्टि करें। माउस को इसके किनारे पर रखें और लंबवत रूप से सुई को कोहनी के ठीक नीचे, पसलियों के माध्यम से और दिल में डालें। सिरिंज प्लंजर को धीरे-धीरे बाहर निकालें और सुई को तब तक घुमाएं जब तक कि 0.5-1 एमएल रक्त प्राप्त न हो जाए।
    3. एनेस्थीसिया के तहत सर्वाइकल डिस्लोकेशन द्वारा मानवीय इच्छामृत्यु करें। 70% इथेनॉल के साथ माउस के बाईं ओर सड़न रोकनेवाला रूप से साफ करें। सर्जिकल कैंची से त्वचा और पेरिटोनियम से गुजरने वाले माउस के बाईं ओर कट लगाएं। प्लीहा का पता लगाएं और इसे हटा दें।
    4. वांछित प्रभावक कोशिका आबादी (जैसे, सीडी 8 + टी कोशिकाओं) को शुद्ध करने के लिए माउस प्लीहा को 5 एमएल पूर्ण माध्यम के साथ पेट्री डिश में रखें।

4. ताजा पूरे माउस स्प्लेनोसाइट्स प्राप्त करना

  1. पेट्री डिश में, कैंची या रेजर का उपयोग करके प्लीहा को छोटे टुकड़ों में सावधानी पूर्वक काटें।
  2. 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब पर 100 μM सेल छन्नी रखें और एक पिपेट के साथ सेल छन्नी में उत्पादित प्लीहा को स्थानांतरित करें। सिरिंज प्लंजर के साथ छन्नी के माध्यम से प्लीहा को मैश करें।
  3. 10 एमएल पूर्ण मीडिया के साथ छन्नी के माध्यम से कोशिकाओं को धोएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 x g पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें, फिर सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें।
  4. सेल गोली को 2 मिलीलीटर ठंडे 1 x आरबीसी लाइसिस बफर में पुन: निलंबित करें। बर्फ पर 5 मिनट के लिए निलंबन को इनक्यूबेट करें।
  5. सेल सस्पेंशन को 10 एमएल 4 डिग्री सेल्सियस पूर्ण मीडिया के साथ धोएं। धोने के चरण को तीन बार दोहराएं और प्लास्मोडियम संक्रमित चूहों से प्लीहा के लिए धोने के बीच किसी भी कोशिका के थक्कों को हटा दें।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 x g पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें, फिर सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें।
    नोट: प्लास्मोडियम संक्रमित प्लीहा बढ़े हुए होते हैं और फागोसाइटिक कोशिकाओं से भरे होते हैं जिनमें अवक्रमित हीमोग्लोबिन और हेमोज़ोइन होते हैं।
  7. प्रभावक कोशिकाओं के चुंबकीय मोती अलगाव के दौरान किसी भी मुद्दे से बचने के लिए, हेमोज़ोइन-समृद्ध फागोसाइटिक कोशिकाओं और हेमोज़ोइन को हटाने के लिए निम्नलिखित चरणों का उपयोग करें। एमएसीएस बफर के साथ स्प्लेनिक कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें और एकाग्रता को 1 x 108 कोशिकाओं / एमएल में समायोजित करें। चुंबकीय क्षेत्र में एक एलएस या एलडी कॉलम रखें। एमएसीएस बफर के 3 एमएल के साथ कुल्ला करके कॉलम तैयार करें।
  8. स्तंभ पर कक्ष निलंबन लागू करें. 3 एमएल एमएसीएस बफर के साथ कॉलम को तीन बार धोएं। स्प्लेनिक कोशिकाओं से युक्त प्रवाह एकत्र करें।
  9. एक ट्राइपैन ब्लू समाधान में स्प्लेनोसाइट्स की गणना करें और हेमसाइटोमीटर (न्यूबॉयर चैंबर) या स्वचालित सेल काउंटर में सेल व्यवहार्यता की जांच करें। आरटी पूर्ण मीडिया में सेल एकाग्रता को 1 x 107 कोशिकाओं / एमएल में समायोजित करें।

5. साइटोटोक्सिक प्रभावक कोशिका शुद्धिकरण (सीडी 8 ए + टी सेल नकारात्मक चयन)

नोट: कई सकारात्मक और नकारात्मक चयन अभिकर्मक हैं जो साइटोटोक्सिक प्रभावक कोशिकाओं (सीडी 8 + टी, 3 टी, एनके, आईएनकेटी, एमएआईटी कोशिकाओं) को शुद्ध कर सकते हैं। इस प्रोटोकॉल में, हम स्प्लेनिक सीडी 8 ए + टी कोशिकाओं के नकारात्मक चयन का उपयोग करते हैं और निर्माता निर्देशों का पालन करते हैं।

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 400 x g पर सभी स्प्लेनोसाइट्स को सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें। एमएसीएस बफर के 40 μL में सेल गोली को पुन: निलंबित करें।
  2. बायोटिन-एंटीबॉडी कॉकटेल के 10 μL जोड़ें। अच्छी तरह मिलाएं और बर्फ पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. MACS बफर के 30 μL जोड़ें। एंटी-बायोटिन माइक्रो-बीड्स के 20 μL जोड़ें। अच्छी तरह से मिलाएं और बर्फ पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. एमएसीएस बफर के 400 μL जोड़ें और चुंबकीय सेल पृथक्करण के लिए आगे बढ़ें। चुंबकीय क्षेत्र समर्थन में MACS LS स्तंभ रखें। एमएसीएस बफर के 3 एमएल के साथ कुल्ला करके कॉलम तैयार करें।
  5. स्तंभ पर कक्ष निलंबन लागू करें. 3 एमएल एमएसीएस बफर के साथ कॉलम को तीन बार धोएं। सभी अनलेबल कोशिकाओं वाले प्रवाह को इकट्ठा करें, जो समृद्ध सीडी 8 ए + टी कोशिकाएं हैं।
  6. एक ट्राइपैन ब्लू समाधान में सीडी 8 ए + टी कोशिकाओं की गणना करें और हेमसाइटोमीटर (न्यूबॉयर कक्ष) या स्वचालित सेल काउंटर में सेल व्यवहार्यता की जांच करें। आरटी पूर्ण मीडिया में सेल एकाग्रता को 1 x 107 कोशिकाओं / एमएल में समायोजित करें।

6. पी योएली संक्रमित आरबीसी अलगाव।

  1. एकत्रित रक्त को 3 मिनट के लिए 850 x g पर 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में सेंट्रीफ्यूज करें। सीरम को त्याग दें और एफबीएस के बिना 1x आरपीएमआई के 1 एमएल में रक्त को फिर से निलंबित करें।
  2. एलएस कॉलम को चुंबकीय क्षेत्र समर्थन में रखें और 1x RPMI के 3 मिलीलीटर के साथ कुल्ला करें। कॉलम के माध्यम से आरबीसी निलंबन पास करें। अधिक आईआरबीसी को अलग करने के लिए, कॉलम में फ्लोथ्रू (आरपीएमआई के 3 एमएल और पतला रक्त के 1 एमएल) को फिर से लागू करें।
  3. 1x RPMI के 5 मिलीलीटर के साथ दो बार धोएं। स्तंभ जलाशय खाली होते ही बफर एलिकोट जोड़कर धोने के चरण ों का पालन करें। किसी भी स्तंभ को सूखने न दें।
  4. आरपीएमआई के 5 एमएल जोड़ें, कॉलम को हटा दें, और आईआरबीसी को एक नई 15 एमएल ट्यूब में शुद्ध करें। आईआरबीसी की गणना करें और एकाग्रता को 1 x 107 आरबीसी / एमएल में समायोजित करें।

7. आरबीसी की सीएफएसई लेबलिंग और फ्लो साइटोमेट्री की तैयारी।

नोट: प्रयोग के लिए उपयोग की जाने वाली कोशिकाओं की दोगुनी संख्या के साथ आरबीसी लेबलिंग प्रोटोकॉल शुरू करें, क्योंकि ~ 50% कोशिकाएं आमतौर पर सीएफएसई लेबलिंग चरण के बाद धोने के चरणों में खो जाती हैं। आरबीसी / आईआरबीसी के ऑटोफ्लोरेसेंस को स्थापित करने के लिए, बिना लेबल वाली कोशिकाओं का एक नियंत्रण नमूना शामिल करें।

  1. एफबीएस के बिना 1x आरपीएमआई में सीएफएसई को 10 एमएम की अंतिम एकाग्रता तक पतला करें। 15 एमएल ट्यूब में एफबीएस के बिना 1x RPMI के साथ कोशिकाओं को एक बार धोएं।
  2. एफबीएस के बिना 1x आरपीएमआई के 500 μL में RBCs को पुन: निलंबित करें और पतला CFSE के 500 μL जोड़ें। आरटी पर 8 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, प्रकाश से सुरक्षित।
  3. 14 एमएल पूर्ण माध्यम (10% एफबीएस आरपीएमआई) जोड़कर तीन बार धोएं, इसके बाद 10 मिनट के लिए 850 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूजेशन करें। कोशिकाओं को पूर्ण माध्यम में 1-5 x 106 / एमएल की एकाग्रता के लिए पुन: निलंबित करें। आरटी पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।

8. साइटोटोक्सिक लिम्फोसाइट / आरबीसी कोकल्चर और फ्लो साइटोमेट्री की तैयारी।

नोट: यदि विशिष्ट रिसेप्टर्स या अणुओं की भागीदारी को मापा जाएगा, तो कोकल्चर से पहले 30 मिनट के लिए प्रभावक कोशिकाओं के साथ विशिष्ट ब्लॉकिंग और आइसोटाइप नियंत्रण एंटीबॉडी (10 मिलीग्राम / एमएल) को इनक्यूबेट करें।

  1. कोशिकाओं को 96-अच्छी तरह से गोल-नीचे प्लेट में प्लेट करें। शुद्ध लिम्फोसाइट्स और सीएफएसई-लेबल आईआरबीसी को वांछित प्रभावक-लक्ष्य सेल अनुपात में 200 μL की अंतिम मात्रा में जोड़ें और होमोजेनाइज़ करें। प्रत्येक शर्त को तीन प्रतियों में तैयार करें।
    नोट: हम आईआरबीसी एकाग्रता को 1-5 x 104 कोशिकाओं / एमएल में समायोजित करने और शुद्ध सेल संख्या (जैसे, 0.5: 1, 2.5: 1, और 5: 1) के आधार पर अनुपात चुनने का सुझाव देते हैं।
  2. किसी भी सहज लाइसिस का मूल्यांकन करने के लिए सहज लाइसिस नियंत्रण को शामिल करें, जो प्रभावक के बिना लक्ष्य आईआरबीसी है, क्योंकि इसका उपयोग 100% सेल व्यवहार्यता स्थिति का प्रतिनिधित्व करने के लिए किया जाएगा।
  3. सेल संपर्क को अधिकतम करने के लिए 360 x g पर 1 मिनट के लिए प्लेट को स्पिन करें। 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें।
    फाल्सीपेरम संस्कृति के लिए व्यवस्थित रूप से उपयोग की जाने वाली हाइपोक्सिया स्थितियों (कम ओ2) का उपयोग नहीं किया जाना चाहिए क्योंकि प्रभावक कोशिकाएं इस वातावरण में जीवित नहीं रहती हैं। इसके विपरीत, प्लास्मोडियम परजीवी 12 घंटे तक 5% सीओ2 में परिवेशी हवा में व्यवहार्य होते हैं।
  4. 850 x g पर 5 मिनट के लिए स्पिन करें और सतह पर तैरने वाले को हटाने के लिए प्लेट को पलटें।
    नोट: यदि वांछित है, तो सुपरनैटेंट का उपयोग कोकल्चर में जारी किसी भी घुलनशील कारकों को मापने के लिए किया जा सकता है।
  5. आरबीसी को एंटी-माउस टेर 119 1:200 (या मानव नमूनों के लिए एंटी-ह्यूमन सीडी 235 1:100) और सीडी 8 + टी कोशिकाओं को एंटी-सीडी 8 1: 200 या एंटी-सीडी 3 1: 200 एंटीबॉडी (एंटी-माउस या मानव) के साथ 3% एफबीएस (एफएसीएस बफर) वाले 1 x पीबीएस में 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए लेबल करें।
    सेल प्रसार अभिकर्मक (उदाहरण के लिए, सीएफएसई-लेबल आईआरबीसी, एपीसी-साइ 7 एंटी-टेर 119, और परसीपी-साइ 5.5 एंटी-सीडी 8 ए) के आधार पर एंटीबॉडी फ्लोरोफोरे का चयन किया जाना चाहिए।
  6. FACS बफर के साथ कोशिकाओं को धोएं और 850 x g पर 5 मिनट के लिए नीचे घुमाएं। नमूने को FACS ट्यूबों में स्थानांतरित करें और अलग-अलग ट्यूबों में 30 μL गिनती मोती जोड़ें । 30 सेकंड के लिए भंवर द्वारा गिनती मोतियों को समरूप करें।

9. फ्लो साइटोमेट्री

  1. 405/488/561/640 लेजर उपकरण का उपयोग कर के नमूने का विश्लेषण करें।
  2. सीएफएसई (एफआईटीसी), पीई एंटी-ह्यूमन 3 टीसीआर और पीई-साइ 7 एंटी-ह्यूमन सीडी 235 ए एंटीबॉडी के साथ लेबल की गई मानव कोशिकाओं के लिए, तीन-लेजर (ब्लू, रेड, येलो-ग्रीन) कॉन्फ़िगरेशन साइटोमीटर में 530/30 (एफआईटीसी), 575/25 (पीई), और 780/60 (पीई-साइ 7) फिल्टर का उपयोग करें।
  3. CFSE (FITC), PerCP-Cy5.5 एंटी-माउस CD8a और APC-Cy7 एंटी-माउस Ter119 के साथ लेबल किए गए माउस कोशिकाओं के लिए, तीन-लेजर साइटोमीटर सेटअप में 530/30 (FITC), 695/40 (PerCP-Cy5.5), और 780/60 (APC-Cy7) फ़िल्टर का उपयोग करें।
  4. स्टॉप गेट में न्यूनतम 20,000 घटनाओं को प्राप्त करने के लिए स्टॉपिंग गेट के रूप में गिनती मोतियों की आबादी चुनें, जो सभी स्थितियों के लिए समान होना चाहिए। उचित फ्लो साइटोमेट्री अधिग्रहण / विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके विश्लेषण और मुआवजा करें।
  5. नीचे वर्णित के रूप में गेटिंग रणनीति सेट करें।
    1. एफएससी पीक ऊंचाई (एच) से क्षेत्र (ए) अनुपात का उपयोग करके मलबे को छोड़कर एकल कोशिकाओं (सिंगल्स) का चयन करें। आरबीसी का चयन करें और आरबीसी मार्कर (टेर 119 या सीडी 235 ए) और लिम्फोसाइट-विशिष्ट एंटीबॉडी (सीडी 8 ए) के प्रतिदीप्ति के आधार पर विश्लेषण से लिम्फोसाइटों को बाहर करें।
    2. पिछले आरबीसी गेटिंग में, सीएफएसई पॉजिटिव स्टेनिंग के आधार पर व्यवहार्य आरबीसी का चयन करें। प्रवाह साइटोमीटर डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ डेटा का विश्लेषण करें।

10. गणना और सांख्यिकी

  1. IRBC लाइसिस के प्रतिशत की गणना करने के लिए, चरण 9 में वर्णित गेटिंग रणनीति का पालन करें। व्यवहार्य आरबीसी का प्रतिशत टेर 119 (माउस) या सीडी 235 ए (मानव) सकारात्मक प्रतिदीप्ति के आधार पर आरबीसी गेट के अंदर सीएफएसई-पॉजिटिव कोशिकाओं की आवृत्ति है।
  2. आरबीसी सहज टूटने का अनुमान लगाने के लिए नियंत्रण के रूप में सहज लाइसिस नियंत्रण, प्रभावक कोशिकाओं के बिना आरबीसी, स्थिति का उपयोग करें। इस स्थिति को आरबीसी लाइसिस (100% व्यवहार्यता) माना जाएगा। प्रत्येक परीक्षण की गई स्थिति में आरबीसी लाइसिस के प्रतिशत की गणना करने के लिए निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करें:
    Equation 2
    नोट: कल्चर इनक्यूबेशन के दौरान, कुछ संक्रमित आरबीसी अनायास परजीवी द्वारा टूट सकते हैं या टूट सकते हैं। सहज लाइसिस स्थिति की सीएफएसई-पॉजिटिव आरबीसी आवृत्ति का उपयोग करें, जिसमें लिम्फोसाइट साइटोटॉक्सिसिटी के लिए आधार रेखा के रूप में कोई प्रभावकारक कोशिकाएं नहीं होती हैं।
  3. प्रत्येक स्थिति के लिए तीन प्रतियों के औसत की गणना करें और कई तुलनाओं में दो-तरफा एनोवा का उपयोग करके सांख्यिकीय महत्व निर्धारित करें।

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Representative Results

यहां, साइटोटोक्सिक लिम्फोसाइटों के साथ एक कोकल्चर परख में सीएफएसई-लेबल प्लास्मोडियम-संक्रमित आरबीसी के अलगाव के लिए लागू पद्धति का वर्णन किया गया है। सबसे पहले, हम प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करने के तरीके का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व प्रदान करते हैं, पी विवैक्स (चित्रा 1) से संक्रमित मानव नमूनों को नियोजित करते हैं। फिर, पी योएली से संक्रमित सी 57बीएल /6 माउस का उपयोग करके मलेरिया प्रयोगात्मक मॉडल में प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ने के तरीके पर एक सचित्र फ्लोचार्ट (चित्रा 2)। चित्रा 3 में, प्रोटोकॉल के चरण 6 के लिए अपेक्षित परिणाम (पहले और बाद में) (चुंबकीय स्तंभों का उपयोग करके पी. योली-संक्रमित आरबीसी का संवर्धन) दिखाए गए हैं। अंत में, चित्रा 4 एक प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण दिखाता है, जिसमें आरबीसी लाइसिस के प्रतिशत का आकलन करने के लिए आवश्यक गेटिंग रणनीति का विवरण दिया गया है, जैसा कि चरण 9 में वर्णित है। इसलिए, यह खंड साइटोटोक्सिक लिम्फोसाइटों द्वारा आईआरबीसी हत्या का आकलन करने के लिए अधिग्रहण, असेंबली और डेटा विश्लेषण की पूरी प्रक्रिया का वर्णन करते हुए यहां उपयोग की जाने वाली विभिन्न तकनीकों पर प्रकाश डालता है।

साइटोटोक्सिक कोशिकाओं द्वारा मानव प्लाज्मोडियम-संक्रमित आरबीसी लाइसिस।
साइटोटोक्सिक कोशिकाओं द्वारा मानव प्लाज्मोडियम-संक्रमित आरबीसी की हत्या का मूल्यांकन करने के लिए प्रोटोकॉल का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व चित्रा 1 में दिखाया गया है। सेल लाइसिस को मापने के लिए, प्लास्मोडियम-संक्रमित रोगियों से पीबीएमसी को पृथक्करण माध्यम का उपयोग करके शुद्ध किया गया था, इसके बाद साइटोटोक्सिक लिम्फोसाइट (सीटीएल) की आबादी (जैसे, सीडी 8 + टी, 3 टी, एनके, आईएनकेटी, एमएआईटी कोशिकाओं, आदि) का चुंबकीय शुद्धिकरण किया गया था। पीबीएमसी अलगाव से शेष आरबीसी की गोली का उपयोग घनत्व ढाल पृथक्करण माध्यम (65% पी फाल्सीपेरम; 45% पी विवैक्स) का उपयोग करके प्लास्मोडियम-संक्रमित आरबीसी को समृद्ध करने के लिए किया गया था। आईआरबीसी को सीएफएसई के साथ लेबल किया गया था और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर 4 घंटे के लिए लिम्फोसाइटों के साथ या बिना इनक्यूबेट किया गया था। कोकल्चर अवधि के बाद, फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण से पहले सभी आरबीसी (संक्रमित या नहीं) को एंटी-ह्यूमन सीडी 235 ए एंटीबॉडी (आरबीसी के लिए) और सीटीएल-विशिष्ट एंटीबॉडी (जैसे, एंटी-सीडी 8, एंटी-3 टीसीआर, आदि) के साथ लेबल किया गया था। मानव नमूनों का अधिग्रहण और विश्लेषण चित्रा 4 में माउस के नमूनों के लिए प्रदर्शित किए गए समान थे।

साइटोटोक्सिक सीडी 8 + टी कोशिकाओं द्वारा पी. योली-संक्रमित आरबीसी लाइसिस।
प्रयोगात्मक मलेरिया मॉडल में साइटोटोक्सिक प्रभावकारक तंत्र का मूल्यांकन करने के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रिया का एक प्रवाह चार्ट चित्रा 2 में दिखाया गया है, साथ ही चित्रा 3 और चित्रा 4 में दिखाए गए प्रतिनिधि प्रयोगात्मक डेटा के साथ। C57BL/6 चूहों को 1 x 105P. yoelii (Py) iRBCs से संक्रमित किया गया था, और परजीवीता की निगरानी तब तक की गई जब तक कि यह लगभग 30% तक नहीं पहुंच गया। पाय-आईआरबीसी को चुंबकीय पृथक्करण का उपयोग करके रक्त से अलग किया गया था, क्योंकि परजीवी हीम उपउत्पाद, हेमोज़ोइन, लोहे से समृद्ध है औरचुंबकीय क्षेत्र में पैरामैग्नेटिक कणों के रूप में कार्य करता है। प्री-कॉलम नमूने (चित्रा 3) की तुलना में रक्त स्मीयर द्वारा समृद्ध नमूने की शुद्धता का विश्लेषण किया गया था। आईआरबीसी को तब सेल ट्रेसर अभिकर्मक सीएफएसई के साथ लेबल किया गया था। समानांतर में, साइटोटोक्सिक सीडी 8 + टी कोशिकाओं को चुंबकीय नकारात्मक चयन किट का उपयोग करके स्प्लेनोसाइट्स से शुद्ध किया गया था। एक नियंत्रण के रूप में, असंक्रमित चूहों से सीडी 8 + टी सेल शुद्धिकरण के लिए एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग किया गया था। प्रभावक (CD8+ T) और लक्ष्य (CFSE-लेबल Py-iRBC) कोशिकाओं को अलग-अलग प्रभावक: लक्ष्य अनुपात (E: T: 0.5: 1, 2.5: 1, और 5: 1) पर 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस 5%CO2 पर इनक्यूबेट किया गया था। कोकल्चर के अंत में, प्रत्येक स्थिति को आरबीसी के लिए एंटी-माउस टेर 119 और साइटोटोक्सिक कोशिकाओं के लिए एंटी-सीडी 8 ए के साथ लेबल किया गया था। गेटिंग रणनीति और नमूना परिणाम चित्रा 4 में दर्शाए गए हैं। 

Figure 1
चित्र 1. इन विट्रो किलिंग परख का योजनाबद्ध। परख प्रयोग को मारने का उदाहरण। प्लाज्मोडियम-संक्रमित रक्त को एक पृथक्करण ढाल माध्यम का उपयोग करके एकत्र और संसाधित किया जाता है। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, पीबीएमसी परत एकत्र की जाती है, और साइटोटोक्सिक कोशिकाओं (सीटीएल) को चुंबकीय मोतियों का उपयोग करके शुद्ध किया जाता है। आरबीसी परत को एक बार फिर घनत्व ढाल पृथक्करण मीडिया का उपयोग करके संसाधित किया जाता है। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, प्लाज्मोडियम-आईआरबीसी परत एकत्र की जाती है और सीएफएसई के साथ लेबल की जाती है। इसके बाद, शुद्ध सीटीएल और आईआरबीसी को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर 4 घंटे के लिए सह-संवर्धित किया गया, इसके बाद फ्लो साइटोमीटर में सेल-विशिष्ट लेबलिंग और विश्लेषण किया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2. परख को मारने के लिए प्रायोगिक मलेरिया मॉडल। सबसे पहले, C57BL/6 चूहों को 105 PyX17NL-संक्रमित लाल रक्त कोशिकाओं से संक्रमित किया गया था। फिर, परजीवीमिया की निगरानी रक्त स्मीयर द्वारा की जाती है, जब तक कि संक्रमण के चरम (30% -40% आईआरबीसी), संक्रमण के लगभग 12 दिन बाद (डीपीआई)। अगले दिन, चूहों को तिल्ली संग्रह के लिए लहूलुहान और इच्छामृत्यु दी गई। रक्त को संसाधित किया गया था, और संक्रमित आरबीसी को चुंबकीय पृथक्करण द्वारा समृद्ध किया गया था, इसके बाद सीएफएसई (ऊपरी दाएं) के साथ लेबलिंग की गई थी। चुंबकीय मोतियों का उपयोग करके नकारात्मक चयन करके, प्लीहा को साइटोटोक्सिक लिम्फोसाइटों अलगाव के लिए संसाधित किया गया था। बाद में, शुद्ध साइटोटोक्सिक लिम्फोसाइट्स और आईआरबीसी को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर 4 घंटे के लिए सह-संवर्धित किया गया, इसके बाद फ्लो साइटोमीटर में सेल-विशिष्ट लेबलिंग और विश्लेषण किया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3. चुंबकीय स्तंभों का उपयोग करके आईआरबीसी संवर्धन। आईआरबीसी को एलएस कॉलम का उपयोग करके पी योएली संक्रमित चूहों से शुद्ध किया गया था। शुद्धिकरण ( ए) से पहले और (बी) कॉलम संवर्धन के बाद एकत्र किए गए रक्त से रक्त स्मीयर द्वारा उजागर किया जाता है। स्केल बार = 10 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4. सीडी 8 + लिम्फोसाइटों द्वारा पी योइली-आईआरबीसी के सेल लाइसिस प्रतिशत का आकलन। सेल लाइसिस प्रतिशत के लिए गेटिंग रणनीति। (ए) गिनती मोतियों की आबादी (~ 20,000 घटनाओं) में स्टॉपिंग गेट सेट करें। (बी) लिम्फोसाइटों के बिना सहज लाइसिस, आईआरबीसी को नियंत्रित करें। एफएससी पीक ऊंचाई से क्षेत्र अनुपात के आधार पर मलबे को छोड़कर एकल कोशिकाओं का चयन करके गेटिंग रणनीति शुरू करें, इसके बाद एपीसी-साइ 7 टेर 119 पॉजिटिव और पीईआरसीपी-साइ 5.5 सीडी 8 नकारात्मक में आरबीसी आबादी का चयन करें। फिर सीएफएसई (एफआईटीसी) उच्च सकारात्मक के रूप में लाइव आईआरबीसी का चयन करें। (सी) विभिन्न प्रभावकों का उपयोग करके उदाहरण प्रयोग विश्लेषण: लक्ष्य अनुपात, सह-संस्कृति के बाद लाइव आरबीसी के प्रतिशत को प्रदर्शित करना। (डी) धारा 10 में वर्णित सूत्र के आधार पर गणना की गई आरबीसी लाइसिस प्रतिशत का ग्राफिकल प्रतिनिधित्व। समूहों (साइटोटॉक्सिक सीडी 8 या भोले सीडी 8) के बीच महत्व की तुलना का मूल्यांकन दो-तरफा एनोवा द्वारा कई तुलनाओं के साथ किया गया था। P < 0.0001 (***) कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यहां हम साइटोटोक्सिक लिम्फोसाइटों द्वारा प्लास्मोडियम संक्रमित लाल रक्त कोशिका की हत्या को मापने के लिए एक इन विट्रो परख का वर्णन करते हैं। यह परख मलेरिया परजीवी के एरिथ्रोसाइटिक चरण के लिए सेलुलर सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा के तंत्र को स्पष्ट करने में मदद कर सकती है। इस पद्धति का प्रमुख लाभ यह है कि यह आईआरबीसी की सेल-मध्यस्थता हत्या की मात्रात्मक परख प्रदान करता है जिसका उपयोग कई सवालों को संबोधित करने के लिए किया जा सकता है कि प्रतिरक्षा कोशिकाएं विभिन्न प्लास्मोडियम एसपीपी के साथ कैसे बातचीत करती हैं।

महत्वपूर्ण रूप से, इस विधि का उपयोग पी विवैक्स और अन्य प्लास्मोडियम परजीवी का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है जो इन विट्रो कल्चर14,15 में बनाए नहीं रखे जाते हैं। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल को किसी भी प्लास्मोडियम प्रजातियों और विभिन्न मेजबानों, जैसे मनुष्यों, चूहों और गैर-मानव प्राइमेट्स के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। फ्लो साइटोमेट्री-आधारित विधियों का व्यापक रूप से साइटोटोक्सिक सेल सक्रियण, साइटोकिन उत्पादन और अपघटन10,11,16 का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया जाता है, लेकिन वर्तमान विधि एकमात्र ऐसी है जो हत्यारे कोशिकाओं के साथ सीधे सेल संपर्क द्वारा आरबीसी लाइसिस की पड़ताल करती है।

माइक्रोस्कोपी, पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर), और फ्लो साइटोमेट्री जैसे कई तरीके भी हैं, जिनका उपयोग परजीवी, आक्रमण और एंटीमलेरियल गतिविधि को मापकर मलेरिया का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। हालांकि, आरबीसी के सेल-मध्यस्थता साइटोटॉक्सिसिटी का विश्लेषण करने के लिए, सीआर51 या हीमोग्लोबिन रिलीज का उपयोग करने वाले वर्तमान तरीके आरबीसी लाइसिस का मूल्यांकन करने के लिए पर्याप्त संवेदनशील नहीं हैं। एलडीएच रिलीज का उपयोग सीडी 8 + टी कोशिकाओं जैसे कुछ सीटीएल द्वारा आरबीसी हत्या का मूल्यांकन करने के लिए भी किया जा सकता है, लेकिन एलडीएच को मापना एक सटीक तरीका नहीं है क्योंकि सक्रिय जन्मजात या जन्मजात जैसी कोशिकाएं एक नियामक तंत्र के रूप में एक दूसरे को मार सकती हैं।

सीएफएसई का व्यापक रूप से कोशिकाओं को ट्रैक करने या फ्लो साइटोमेट्री या फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी17 में सेल प्रसार का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है। चूंकि आरबीसी18 का प्रसार नहीं करते हैं, इसलिए सीएफएसई प्रतिदीप्ति तीव्रता सेल लाइसिस के साथ कम होनी चाहिए। फ्लो साइटोमेट्री एक बहुत ही सटीक तकनीक है क्योंकि यह विशिष्ट मार्करों के बहुत कम स्तर का पता लगा सकती है, और इसलिए इसका व्यापक रूप से मलेरिया संक्रमण 19,20,21,22,23 में परजीवीऔर आक्रमण को ट्रैक करने के लिए उपयोग किया गया है। सबसे महत्वपूर्ण बात, फ्लो साइटोमेट्री एक ही सेल में कई मापदंडों को माप सकती है और कोशिकाओं को विभिन्न आबादी में क्रमबद्ध कर सकती है। प्रत्येक नमूने में मात्रात्मक मानक अभिकर्मकों (मोतियों की गिनती) को जोड़कर, कोई अधिग्रहित घटनाओं की संख्या को सामान्य कर सकता है और पूर्ण सेल गणना24 प्राप्त कर सकता है। यह विधि प्रयोगात्मक स्थितियों के बीच एक विश्वसनीय मात्रात्मक तुलना की अनुमति देती है, जो वर्तमान में प्रस्तावित प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण है।

इस प्रोटोकॉल के लिए कुछ महत्वपूर्ण कदमों में नमूना गुणवत्ता सुनिश्चित करना, उचित सेल धुंधला सुनिश्चित करना और गणना को सामान्य करने के लिए नियंत्रण शामिल करना शामिल है। संक्रमित आरबीसी को शुद्ध करने के लिए बड़ी मात्रा में ताजा रक्त के नमूनों की आवश्यकता होती है। घनत्व प्रवणता पृथक्करण माध्यम शुद्धिकरण को सावधानीपूर्वक संपर्क किया जाना चाहिए क्योंकि वांछित प्लाज्मोडियम आईआरबीसी प्राप्त करने के लिए इसकी एकाग्रता महत्वपूर्ण है। घनत्व ढाल पृथक्करण माध्यम पर रक्त ओवरले को भी यथासंभव धीरे-धीरे किया जाना चाहिए, और आईआरबीसी को खोने से बचने के लिए रिंग रेड-लेयर कटाई सावधानी से की जानी चाहिए। शुद्धिकरण प्रक्रिया को आसान बनाने के लिए, एक उच्च परजीवी रक्त के नमूने का उपयोग किया जाना चाहिए क्योंकि आईआरबीसी की मात्रा अधिक होगी। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि चुंबकीय क्षेत्रों का उपयोग करके आरबीसी अलगाव प्रोटोकॉल में, केवल परजीवी परिपक्व चरण (मध्य-देर चरण ट्रोफोज़ोइट्स या स्किज़ोन्ट्स) जो हेमोज़ोइन की महत्वपूर्ण मात्रा का उत्पादन करते हैं, उन्हें शुद्ध किया जाएगा। नतीजतन, कोई भी रिंग स्टेज एकत्र नहीं किया जाएगा, और यह अंतिम परिणाम को प्रभावित कर सकता है।

कोशिकाओं के नुकसान या लाइसिस से बचने के लिए सेल धुंधला पन सावधानी से किया जाना चाहिए। धुंधला होने से पहले लंबे समय तक भंडारण या निर्धारण से बचना चाहिए। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि प्रयोगात्मक स्थितियों को सीरियल प्रभावक: लक्ष्य अनुपात और उचित नियंत्रणों का उपयोग करके तीन प्रतियों में किया जाना चाहिए, जैसे कि एक अनलेबल, सहज लाइसिस स्थिति और एक परिकल्पना नियंत्रण। सेल काउंटिंग बीड्स के अलावा महत्वपूर्ण है क्योंकि यह प्रत्येक नमूने के लिए कोशिकाओं की एकाग्रता या पूर्ण सेल गणना निर्धारित करने का एक आसान तरीका प्रदान करता है। फ्लो साइटोमीटर अधिग्रहण के दौरान, कोकल्चर के बाद प्रत्येक नमूने में कोशिकाओं की संख्या को सामान्य करने के लिए गिनती मोतियों के गेट में एकत्र की जाने वाली घटनाओं की संख्या निर्धारित करना सुनिश्चित करें।

चूंकि कोकल्चर परख में लगातार परिणामों के लिए कम से कम 1 x 105 प्रभावक कोशिकाओं की आवश्यकता होती है, वर्णित पद्धति की एक संभावित सीमा शुद्धिकरण के बाद कोशिकाओं की सीमित संख्या है, जो विशेष रूप से दुर्लभ सेल आबादी के साथ काम करते समय चिंता का विषय हो सकती है। दरअसल, यह आईआरबीसी शुद्धिकरण पर लागू होता है, क्योंकि इसके लिए बहुत अधिक परजीवीता की आवश्यकता होती है जो इतनी आसानी से प्राप्त नहीं होती है, खासकर जब स्थानिक क्षेत्रों में मानव नमूनों के साथ काम करते हैं।

एक प्रोटोकॉल सुधार समय इनक्यूबेशन कोकल्चर हो सकता है। यद्यपि हमने पहले10,11 इनक्यूबेशन 12 घंटे का उपयोग किया था, हमने हाल ही में देखा कि प्रयोगात्मक स्थितियों को अलग करने के लिए 4 घंटे पर्याप्त है, इस प्रकार संभावित सहज लाइसिस के लिए समय कम हो जाता है और परिणामों की प्रजनन क्षमता में सुधार होता है।

प्लाज्मोडियम संक्रमित आरबीसी की प्रत्यक्ष हत्या में शामिल तंत्र को धीरे-धीरे उजागर किया जा रहा है। हमारा समूह यह दिखाने वाला पहला था कि सीडी 8 + टी कोशिकाएं संक्रमित सेल11 द्वारा एचएलए-आई प्रस्तुति के माध्यम से पी.विवैक्स-संक्रमित रेटिकुलोसाइट्स को पहचान और मार सकती हैं। हाल ही में, एक अन्य अध्ययन से पता चला है कि आईआरबीसी10 की सतह पर मौजूद एक अणु ब्यूटिरोफिलिन द्वारा फॉस्फोएंटीजन मान्यता के माध्यम से पी फाल्सीपेरम-संक्रमित आरबीसी को पहचानने वाली टी कोशिकाएं हैं। दोनों अध्ययनों में, आरबीसी लाइसिस ग्रैनुलिसिन और ग्रैनजाइम बी निर्भर है, और इंट्रासेल्युलर परजीवी हत्या की ओर जाता है।

यद्यपि परजीवी, आक्रमण, एंटीमलेरियल गतिविधि और छवि सेल इंटरैक्शन को मापने के लिए वर्षों से कई तरीके विकसित किए गए हैं, लेकिन कोई भी मात्रात्मक प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित परख 19,20,21 में साइटोटोक्सिक कोशिकाओं द्वारा आईआरबीसी की प्रत्यक्ष हत्या का विश्लेषण करने में सक्षम नहीं है। हमने प्लाज्मोडियम-संक्रमित आरबीसी के सीएफएसई लेबलिंग और लिम्फोसाइटों के साथ सह-संवर्धन की एक विशिष्ट अवधि में आईआरबीसी लाइसिस के मूल्यांकन द्वारा मलेरिया में सेल लाइसिस क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए एक अभिनव दृष्टिकोण का उपयोग किया। इसलिए, यह इन विट्रो किलिंग परख रक्त-चरण मलेरिया के लिए सेल-मध्यस्थता प्रतिरक्षा के तंत्र को स्पष्ट करने के लिए एक नई रणनीति प्रस्तुत करती है, जो नए चिकित्सीय लक्ष्यों के अध्ययन और मलेरिया के टीकों के विकास को आगे बढ़ाने में मदद करेगी।

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Disclosures

लेखक ों ने कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

हम मलेरिया रोगी नामांकन और रक्त संग्रह के लिए डॉ धेलियो परेरा और रोंडोनिया के रिसर्च सेंटर फॉर ट्रॉपिकल मेडिसिन ऑफ रोंडोनिया (सीईपीईएम) के सदस्यों और पांडुलिपि संशोधन में मदद करने के लिए फेलिसिया हो को धन्यवाद देते हैं। निम्नलिखित अभिकर्मक बीईआई संसाधनों, एनआईएआईडी, एनआईएच के माध्यम से प्राप्त किया गया था: प्लास्मोडियम योइली सबएसपी योली, स्ट्रेन 17एक्सएनएल: पीवाईजीएफपी, एमआरए - 817, एना रोड्रिगेज द्वारा योगदान दिया गया। इस शोध को लेमन ब्राजील रिसर्च फंड, कॉन्सेलो नेशनल डी डेसेनवोल्विमेंटो साइंटिफिको ई टेक्नोलोजिको (सीएनपीक्यू) - 437851/2018-4, फैलोशिप (सीजे, जीसी, सीजी), और फंडाको डी एम्पारो डो एस्टाडो डी मिनास गेरैस (एफएपीईएमआईजी) - एपीक्यू -00653-16, एपीक्यू -02962-18 द्वारा समर्थित किया गया था; एपरफेइकोएटो डी पेस्सोअल डी निवेल सुपीरियर (सीएपीएस) - फैलोशिप (एलएल)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 μM cell strainer Corning 431752
96 Well Round (U) Bottom Plate  Thermo Scientific 12-565-65
Anti-human CD235a (Glycophorin A) Antibody Biolegend 349114 Used - APC anti-human CD235, dilution 1:100
Anti-human CD3 Antibody Biolegend 317314 Used - PB anti-human CD3, dilution 1:200
Anti-human CD8 Antibody Biolegend 344714 Used - APC/Cy7 anti-human CD8, dilution 1:200
Anti-human TCR Vδ2 Antibody Biolegend 331408 Used - PE anti-human TCR Vδ2, dilution 1:200
Anti-mouse CD8a Antibody  Biolegend 100733 Used- PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD8a, dilution 1:200
Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody Biolegend 116223 Used - APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119, dilution 1:200
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit Invitrogen C34554
Fetal Bovine Serum, qualified Gibco 26140079
Ficoll-Paque Plus  Cytiva 17144003 Lymphocyte Separation Medium (LSM)
Heparin Sodium Injection, USP meithel pharma 71228-400-003 Used - 2000 USP units/2mL
Isoflurane  Piramal critical care  66794-0013-25
LS MACS Column Miltenyi Biotec 130-042-401
LSRFortessa Cell Analyzer BD Bioscience 
Percoll Cytiva 17089101 Density Gradient Separation Medium (DGSM)
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976
RPMI 1640 Medium Gibco 11875093
Sodium bicarbonate, powder,  BioReagent Sigma-Aldrich   S5761
Syringe With Sub-Q needle - 1mL, 26 gauge;  BD 14-829-10F
Vacutainer Heparin Tube Glass Green 10 ml  BD 366480

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 186 मलेरिया प्लास्मोडियम रक्त-चरण साइटोटोक्सिक कोशिकाएं लाल रक्त कोशिका हत्या परख फ्लो साइटोमेट्री।
<em>इन विट्रो</em> साइटोटोक्सिक लिम्फोसाइटों द्वारा <em>प्लास्मोडियम-संक्रमित</em> लाल रक्त कोशिका की हत्या की परख
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de Lacerda, L., Castro, G., Gomes,… More

de Lacerda, L., Castro, G., Gomes, C., Junqueira, C. In Vitro Assay of Plasmodium-Infected Red Blood Cell Killing by Cytotoxic Lymphocytes. J. Vis. Exp. (186), e63987, doi:10.3791/63987 (2022).

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