Implementazione della resezione minimamente invasiva del tumore cerebrale nei roditori per la raccolta di tessuti ad alta vitalità

Il glioblastoma (GBM) è il tumore cerebrale primario più comune e aggressivo negli adulti. Nonostante i recenti progressi nella neurochirurgia, nello sviluppo mirato di farmaci e nella radioterapia, il tasso di sopravvivenza a 5 anni per i pazienti con GBM è inferiore al 5%, una statistica che non è migliorata significativamente in oltre tre^decenni1. Quindi, c'è bisogno di strategie di trattamento più efficaci.

Per sviluppare nuove terapie, sta diventando sempre più evidente che i protocolli sperimentali devono (1) utilizzare modelli preclinici traducibili che ricapitolino accuratamente l'eterogeneità e il microambiente del tumore, (2) rispecchiare il regime terapeutico standard utilizzato nei pazienti con GBM, che attualmente include chirurgia, radioterapia e chemioterapia, e (3) tenere conto della differenza tra nucleo resecato e residuo, tessuti tumorali invasivi 2,3,4,5. Tuttavia, la maggior parte dei modelli di tumore cerebrale preclinico attualmente disponibili non implementano la resezione chirurgica o utilizzano modelli di resezione chirurgica che richiedono relativamente tempo, portando a una quantità significativa di perdita di sangue o mancanza di standardizzazione. Inoltre, eseguire la resezione dei tumori cerebrali dei roditori può essere difficile a causa della mancanza di strumenti o protocolli chirurgici clinicamente comparabili e dell'assenza di^{una piattaforma 6} stabilita per la raccolta sistematica dei tessuti (Tabella 1).

Il presente protocollo mira a descrivere un paradigma standardizzato per la resezione del tumore cerebrale dei roditori e la conservazione dei tessuti utilizzando un sistema multifunzionale di resezione minimamente invasiva non ablativa (MIRS) e un sistema integrato di conservazione dei tessuti (TPS) (Figura 1). Si prevede che questa tecnica unica fornirà una piattaforma standardizzata che può essere utilizzata in vari studi nella ricerca preclinica per GBM e altri tipi di modelli di tumore cerebrale. I ricercatori che studiano le modalità terapeutiche o diagnostiche per i tumori cerebrali possono implementare questo protocollo per ottenere una resezione standardizzata nei loro studi.

Tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dall'Università del Maryland e dal Johns Hopkins University Institutional Animal Care and Use Committee. Per il presente studio sono stati utilizzati topi femmina C57BL/6, di età compresa tra 6 e 8 settimane. I topi sono stati ottenuti da fonti commerciali (vedi Tabella dei materiali). Sono state seguite tutte le normative di livello 2 (BSL-2), compreso l'uso di maschere, guanti e camici.

1. Impianto iniziale del tumore intracranico

1. Nella fase iniziale dello studio, iniettare per via intracranica ogni topo con 100.000 cellule (linea cellulare GL261 murino glioma) sospese in 4 μL di soluzione salina tamponata fosfato (1x PBS) ad una profondità di 2,5 mm seguendo il rapporto precedentemente pubblicato⁷.
2. Quantificare il segnale tumorale in ciascun topo utilizzando il sistema di imaging in vivo ⁸ 9 giorni dopo l'impianto del tumore.
   NOTA: Se necessario, stratificare i topi in due gruppi in base al carico tumorale. Nel presente studio, i due gruppi erano: (1) topi con carico tumorale relativamente piccolo (segnale bioluminescente medio = 5,5e + 006 ± 0,1e + 006 fotoni / s, n = 10) e (2) topi con carico tumorale relativamente grande (segnale bioluminescente medio = 1,69e + 007 ± 0,2e + 007 fotoni / s, n = 10), (p < 0,05, test di Mann-Whitney) ⁹.
3. Dividi ogni gruppo in due sottogruppi comparabili.
   NOTA: In questo studio, i due sottogruppi erano: topi non trattati (n = 5) e topi con tumori sottoposti a resezione chirurgica utilizzando il MIRS (n = 5), (p > 0,05, test di Mann-Whitney) ⁹.
4. A partire dal giorno della resezione, monitorare la progressione del tumore utilizzando il sistema di imaging in vivo con una frequenza basata sul modello di crescita del tumore.
   NOTA: Per la linea cellulare GL261, monitorare la progressione del tumore il giorno della resezione e poi ogni 3-6 giorni.

2. Resezione tumorale con MIRS

1. Anestetizzare il topo usando una miscela di gas isoflurano-O₂ in una camera di induzione o iniezione intraperitoneale di soluzione di xilazina/ketamina.
   1. Se si utilizza l'anestetico gassoso, impostare la portata del gas su 1,0 ml / min e il vaporizzatore sul 2,0% per l'induzione dell'anestesia, che richiede in genere 3-5 minuti nella camera (vedi Tabella dei materiali).
   2. Se si utilizza l'anestetico iniettabile, anestetizzare i topi iniettando 0,2 ml di soluzione anestetica (80-100 mg/kg di ketamina e 10-12,5 mg/kg di xilazina, vedere Tabella dei materiali) per via intraperitoneale.
2. Valutare l'animale per un'adeguata sedazione pizzicando la punta. Applicare unguento oftalmico agli occhi per evitare la secchezza della cornea. Somministrare un analgesico (0,03-0,06 mg/kg di buprenorfina per via sottocutanea) prima della procedura.
3. Posizionare il mouse sulla cornice stereotassica (vedere Tabella dei materiali) una volta confermata la sedazione completa.
   NOTA: Se si utilizza l'anestetico gassoso, posizionare il naso del topo in un cono nasasale dove continuerà a ricevere la miscela di isoflurano-O₂ durante la procedura (1,5%).
4. Rimuovere la graffetta precedente, quindi rimuovere i capelli con una crema depilatoria o radendosi i capelli. Disinfettare la pelle con cicli alternati di uno scrub a base di clorexidina/betadina e alcool. Quindi, utilizzando un bisturi sterile, creare un'incisione longitudinale della linea mediana di 1 cm lungo la precedente cicatrice chirurgica.
5. Fissare il manipolo MIRS al braccio stereotassico tramite l'adattatore da palcoscenico/supporto del manipolo per una maggiore stabilità e precisione.
6. Impostare la macchina MIRS (vedere Tabella dei materiali) utilizzando le seguenti impostazioni (Figura 1).
   1. Inserire il cavo di alimentazione impostato sul pannello posteriore nella presa del cavo di alimentazione. Accendere o spegnere il sistema attivando o disattivando (1 = ON, 0 = OFF).
   2. Inserire un'estremità del tubo dell'azoto (fornito con la console) nel raccordo maschio sul pannello posteriore della console. Ruotare il dado di connessione in senso orario per stringere la connessione.
      NOTA: l'estremità opposta del tubo deve essere collegata all'alimentazione di azoto.
   3. Prima di collegare il tubo all'alimentazione di azoto, verificare che la pressione di alimentazione non superi i 100 psig, che è la pressione di alimentazione in ingresso consigliata per la console.
      NOTA: la console genera la propria aspirazione quando viene attivata dal pedale una volta che l'azoto è stato fornito alla console.
   4. Fissare il coperchio della porta del vuoto e sigillarlo per evitare perdite nel sistema di aspirazione. Eventuali perdite nel sistema di aspirazione influiranno sulle prestazioni della console MIRS.
   5. Se l'aspirazione è inferiore a 17 durante la configurazione o l'adescamento, verificare che la manopola di aspirazione sulla parte anteriore della console sia impostata al livello massimo (100), assicurarsi che non vi siano perdite nel sistema di aspirazione e verificare che la pressione di alimentazione in ingresso dell'azoto sia corretta.
   6. Per collegare il pedale alla console, inserire il connettore grigio del pedale nella sua presa grigia finché non scatta e si adatta alla posizione.
      NOTA: il connettore del pedale si collega alla console con un unico orientamento ed è digitato.
   7. Per collegare il manipolo alla console, inserire il connettore blu del manipolo nella sua presa blu finché non scatta e si inserisce in posizione.
      NOTA: il connettore del manipolo si collega alla console con un orientamento ed è digitato.
   8. Innescare ogni manipolo prima di utilizzare il sistema aspirando il fluido sterile da una piccola ciotola nell'apertura, attraverso il tubo e il manipolo e quindi nel contenitore per garantire che l'interno del tubo e del manipolo sia lubrificato per ridurre le occlusioni tissutali.
   9. Prepararsi per l'aspirazione da sola o l'aspirazione con taglio selezionando la modalità appropriata sul pannello frontale della console. Iniziare utilizzando il pedale.
7. Inserire la cannula MIRS da 23 G nel foro di bava fino a una profondità di 2,5 mm.
8. Avviare il processo di resezione premendo il pedale collegato alla cannula. Eseguire un ciclo completo (360°) o più di resezione utilizzando la manopola di controllo nel manipolo.
   NOTA: Più cicli vengono eseguiti, maggiore è il volume di tessuto tumorale resecato.
9. Una volta completato il processo di resezione, estrarre la cannula MIRS da 23 G dal foro di bava e utilizzare 5 ml di 1x PBS per lavare il tubo e rimuovere eventuali residui di detriti.
10. Rimuovere il mouse dalla cornice stereotassica e chiudere la ferita con una pinzatrice o materiale di sutura 4-0 (vedere Tabella dei materiali).
11. Posizionare il mouse su una piastra elettrica o sotto una luce riscaldante durante il recupero dall'anestesia prima di riportarlo nella sua gabbia.
12. Al termine dell'esperimento, eliminare la cannula tramite lavaggio. Alternare con mezzi refrigerati e aria per "spingere" tutto il tessuto resecato al contenitore di raccolta. Rimuovere il contenitore di raccolta dal sistema e chiudere con il tappo fornito.
13. Dopo aver completato il passaggio 2.12, posizionare la punta distale della cannula in 3%H 2 O₂ e applicare l'aspirazione a 24-25 in Hg per riempire la linea di aspirazione fino al contenitore di raccolta dell'aspirazione e lasciare riposare per 60-90 s. Sciacquare con fluidi sterili che pulsano aria e media a intermittenza.
14. Monitorare i topi per eventuali segni neurologici (movimenti irregolari anomali o convulsioni) dopo la procedura.
15. Eutanasia i topi con gravi disturbi neurologici (diventano letargici, hanno un aspetto scarno, schiena curva o hanno movimenti irregolari).
    NOTA: Per il presente studio, 200 mg/kg di una soluzione di eutanasia disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali) sono stati utilizzati per eutanasia ogni topo.

3. Raccolta dei tessuti tramite TPS

1. Immergere il campione tumorale in un piatto di coltura tissutale contenente un mezzo di lisi dei globuli rossi (vedere Tabella dei materiali) per 5 minuti a temperatura ambiente.
   NOTA: Il tessuto raccolto dal MIRS nel TPS sarà principalmente sotto forma di singole cellule insieme a piccoli pezzi di tessuto.
2. Posizionare un filtro da 70 μm (vedere Tabella dei materiali) su un tubo conico da 50 mL e utilizzare uno stantuffo di una siringa da 5 mL per far passare il campione tumorale attraverso il filtro.
3. Con una pipetta di trasferimento, utilizzare il supporto RPMI-1640 per facilitare il passaggio delle cellule e di qualsiasi massa tissutale attraverso il filtro.
4. Centrifugare a 428 x g per 5 minuti a 4 °C. Eliminare il surnatante con una pipetta.
5. Risospendere ciascun campione in 5 mL di terreno RPMI-1640 preparato.
6. Per aumentare la vitalità del tessuto, specialmente se vengono visualizzati grandi pezzi di tessuto all'impronta iniziale, aggiungere i volumi richiesti del cocktail enzimatico (contenente DNAsi I, collagenasi IV, dispasi, papaina ed EDTA, vedi Tabella dei materiali) a ciascun campione. Usa il vortice per mescolare le soluzioni.
   NOTA: il passaggio 3.6 è facoltativo. La composizione del cocktail enzimatico (per un volume totale di 5 ml/campione): 300 μL di DNAsi I Grado II, 150 μL di Collagenasi/Dispasi (scindole fibronectina, collagenasi IV, I e amminoacidi non polari), 250 μL di Papaina (proteasi non specifica) e 6 μL di 0,5 M EDTA.
7. Porre i campioni in un incubatore agitatore impostato a 200 giri/min, 37 °C per 20 minuti.
8. Dopo 20 minuti, ruotare i campioni a 428 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante.
9. Filtrare le singole cellule attraverso un filtro cellulare da 70 μm e ruotare verso il basso a 274 x g per 3 minuti a 4 °C. Condurre un'analisi di vitalità cellulare¹⁰ con Trypan Blue ed Emocitometro (vedere Tabella dei materiali).
   NOTA: la vitalità del giorno 0 varia dal 30% al 70% e aumenta significativamente entro 2-3 giorni.
10. Procedere ai passaggi 4, 5 o 6, a seconda del test di fattibilità necessario.

4. Cellule in crescita in coltura aderente

1. In una cappa a flusso laminare certificata, risospendere il pellet in un mezzo aderente contenente siero (come DMEM, siero bovino fetale al 10% (FBS) e soluzione di penicillina / streptomicina (P / S) all'1%) e cellule di piastra in un pallone cellulare aderente.
2. Mantenere le cellule in un ambiente incubato controllato (37 °C, 5% CO₂).

5. Cellule in crescita in coltura in sospensione (neurosfere)

1. In una cappa a flusso laminare certificata, risospendere il pellet in mezzo completo di cellule staminali¹¹ privo di siero e placcarlo in un pallone di sospensione.
2. Mantenere le cellule in un ambiente incubato controllato (37 °C, 5% CO 2) per_2-3 giorni per consentire la formazione della neurosfera.
3. Dopo la visualizzazione delle neurosfere nel terreno di coltura, utilizzare Tripsina-EDTA o Accutasi (vedi Tabella dei materiali) per ottenere sospensioni unicellulari per il passaggio.
   NOTA: Finché viene prestata particolare attenzione durante il raccolto e vengono utilizzati terreni appropriati che supportano le cellule staminali neurali, le cellule staminali nel tessuto raccolto devono formare neurosfere entro pochi giorni.

6. Preparare le cellule per il reimpianto

1. Risospendere il pellet ad una concentrazione di 100.000 cellule vive per 4 μL di 1x PBS.
2. Iniettare immediatamente in topi naïve utilizzando il metodo di impianto del tumore intracranico (fase 1).

7. Analisi istologica

1. Subito dopo la resezione, estrarre e fissare il cervello in paraformaldeide (PFA) al 4% per 24 h¹².
2. Trasferire il cervello in una soluzione di saccarosio al 30% fino a quando non sono saturi di saccarosio (affondato sul fondo del contenitore).
3. Trasferire il cervello in una soluzione di etanolo al 70%.
4. Eseguire l'incorporamento di blocchi di paraffina, il sezionamento e la colorazione standard di ematossilina ed eosina (H & E) seguendo il rapporto¹³ pubblicato in precedenza.
   NOTA: Lo spessore di ciascuna sezione prelevata per la colorazione era di 10 μm.

La resezione chirurgica con MIRS determina una significativa diminuzione del carico tumorale
Nel gruppo con un carico tumorale più piccolo, il segnale bioluminescente medio basale era di 5,5e+006 fotoni/s ± 0,2e+006 nel sottogruppo sottoposto a resezione. Dopo la resezione, il segnale bioluminescente medio è diminuito a 3,09e+006 fotoni/s ± 0,3e+006, (p <0,0001, test di Mann-Whitney)9 (Figura 2). Il segnale bioluminescente è aumentato nei giorni successivi fino a quando i topi sono stati eutanasiati. Allo stesso modo, nel gruppo con un carico tumorale maggiore, il segnale bioluminescente medio basale era 1,68e + 007 fotoni / s ± 0,1e + 007 nel sottogruppo sottoposto a resezione. Dopo la resezione, il segnale bioluminescente medio è diminuito a 5,19e+006 fotoni/s ± 0,2e+006, (p <0,0001, test di Mann-Whitney)9. Il segnale bioluminescente è aumentato nei giorni successivi fino a quando i topi sono stati eutanasiati.

La resezione mediante il MIRS può essere regolata per il volume di resezione desiderato
Nell'imaging pre-resezione dei tumori CT2A singeneici, il tumore può essere generalmente identificato come una massa eterogenea nel sito di inoculazione con architettura parenchimale interrotta ed edema peritumorale ed emorragia indicati da aree eterogenee di ipo- e iper-intensità pesata in T2 (T2w). La traccia dell'ago utilizzata per l'iniezione di cellule tumorali stereotassiche può essere identificata sulle scansioni MRI T2w14.

La cavità di resezione può essere identificata sulle scansioni MRI T2w post-resezione come una grande area ipointensa rotonda nel sito di inoculazione del tumore (Figura 3). La procedura di resezione non ha causato una significativa perdita di sangue o interruzione dell'architettura cerebrale circostante. In alcuni casi, il liquido si è accumulato nella cavità di resezione. Come mostrato nella Figura 4, il volume di resezione è aumentato significativamente da 9,4 mm 3 per una rotazione dell'apertura di taglio a 23,2 mm3 per due rotazioni (p = 0,0117), consentendo la regolazione della resezione del volume per ottimizzare un carico tumorale noto.

La resezione del tumore utilizzando il MIRS porta a un prolungamento di 7 giorni della sopravvivenza mediana dei topi portatori di tumore senza indurre alcun segno neurologico
Come mostrato nella Figura 5, c'è stato un prolungamento della sopravvivenza dei topi sottoposti a resezione chirurgica in entrambi i gruppi con tumori piccoli (6 giorni) e grandi (7 giorni). Nel gruppo con un carico tumorale più piccolo, la sopravvivenza mediana del sottogruppo di controllo è stata di 16 giorni, mentre la sopravvivenza mediana del sottogruppo sottoposto a resezione è stata di 22 giorni (p = 0,0044). Allo stesso modo, nel gruppo con un carico tumorale maggiore, la sopravvivenza mediana del sottogruppo di controllo è stata di 12 giorni, mentre la sopravvivenza mediana del sottogruppo sottoposto a resezione è stata di 19 giorni (p = 0,0043). Inoltre, nessuno dei topi sottoposti a resezione utilizzando il MIRS ha mostrato alcun segno di danno neurologico dopo la procedura. Ciò indica che il MIRS può ottenere una resezione sicura.

Il tessuto resecato utilizzando il MIRS ha un'elevata vitalità in vitro e in vivo
Le cellule estratte dal tessuto resecato sono state filtrate, quantificate e risospese nel mezzo appropriato (Figura 6) prima di condurre esperimenti di vitalità in vitro o in vivo . Per esaminare la vitalità in vitro delle cellule e per confermare la resezione del tumore e non il normale parenchima cerebrale, le cellule sono state coltivate in coltura in sospensione. La formazione della neurosfera, un indicatore del potenziale di inizio del tumore, si è verificata con una minima elaborazione tissutale post-resezione. Ciò ha suggerito che la piattaforma MIRS ha raccolto tessuto ben dissociato e ha avuto un impatto minimo sulla salute e sulla vitalità del tessuto resecato. I campioni prelevati direttamente dal TPS alla microscopia ottica sembravano essere principalmente sotto forma di singole cellule insieme alla presenza di alcuni piccoli pezzi di tessuto. La vitalità del giorno 0 variava dal 30% al 70% (questo rappresenta la vitalità dopo aver passato il campione attraverso un filtro da 70 μm e prima della placcatura). Il dispositivo di resezione ha un'apertura di taglio che può ruotare di 360° sull'asse della sonda di resezione, consentendo la resezione di volumi concentrici di tessuto. In media, 2-3 milioni di celle possono essere raccolte con un giro di 360° dell'apertura di taglio, circa 7 milioni di celle con due giri e un totale di 12-14 milioni di celle possono essere ottenute con tre giri a 360° dell'apertura di taglio. Dopo la placcatura in flaconi in sospensione contenenti mezzo completo di cellule staminali prive di siero, le neurosfere erano visibili al microscopio ottico il giorno 2 e ad occhio nudo entro il giorno 7 (Figura 7).

Per esaminare la vitalità in vivo, le cellule estratte sono state impiantate per via intracranica in topi naïve C57BL / 6 (n = 8 topi, 100.000 cellule vive / topo). La crescita del tumore è stata confermata utilizzando il sistema di imaging in vivo . Il segnale tumorale ha continuato ad aumentare fino a quando tutti gli animali sono stati eutanizzati entro il giorno 14 dopo l'impianto del tumore (sopravvivenza mediana di 11 giorni).

La sezione rappresentativa del tessuto H & E (Figura 3B) contiene una cavità di resezione circolare chiara con un bordo di prodotti sanguigni (rosa intenso), infiammazione e cellule tumorali residue (cellule viola scuro). Macroscopicamente, le cellule tumorali residue sono di natura mesenchimale e infiltrative, mostrando un'estesa invasione e proliferazione perivascolare. Microscopicamente, sono state identificate atipie nucleari marcate e figure mitotiche. I macrofagi associati al tumore sono stati identificati anche intorno alle aree di tessuto infartuato e microemorragie. L'architettura tissutale nel parenchima cerebrale circostante non sembra essere disturbata.

Figura 1: Configurazione del sistema MIRS. (A) Sistema di resezione minimamente invasiva (MIRS) per tumori cerebrali in modelli di roditori con un sistema integrato di conservazione dei tessuti. (B) Pannello frontale della console MIRS. 1 = Potenza del sistema, 2 = Pedale, 3 = Pulsante principale, 4 = Aspirazione, 5 = Manopola di controllo del livello di aspirazione, 6 = Indicatore del livello di aspirazione, 7 = Manipolo, 8 = Pulsante di attivazione della fresa. (C) Pannello posteriore della console MIRS. 1 = presa del cavo di alimentazione, 2 = interruttore automatico, 3 = ingresso alimentazione azoto. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Variazioni del carico tumorale medio nei topi con tumori non trattati rispetto ai topi sottoposti a resezione dei tumori da parte di MIRS. (A) Topi con piccolo carico tumorale basale e (B) topi con grande carico tumorale basale (p < 0,0001, SD ≤0,3e + 006 in tutti i gruppi in ogni punto temporale e troppo piccoli per essere visualizzati sul grafico). Gli animali hanno ceduto al carico tumorale o sono stati eutanasiati. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Risonanza magnetica e analisi H&E. (A) Immagini MRI cerebrali pesate in T2 pre e post-resezione e (B) una sezione rappresentativa del cervello coronale colorata con H & E che mostra una cavità di resezione circolare chiara con un bordo di prodotti sanguigni (rosa intenso), infiammazione e cellule tumorali residue (cellule viola scuro). Le immagini MRI e le sezioni H&E sono state ottenute immediatamente dopo la resezione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Determinazione del volume di resezione tumorale. I volumi medi calcolati dalle immagini MRI delle cavità di resezione create con uno vs. Due rotazioni dell'apertura di taglio, n = 4 per gruppo. p = 0,01, test T a due code. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 5: Curve di Kaplan-Meier di topi con tumori non trattati rispetto a topi sottoposti a resezione di tumori da parte di MIRS . (A) Topi con piccolo carico tumorale basale. (B) Topi con grande carico tumorale basale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 6: Test di vitalità delle cellule tumorali resecate . (A) Immagini rappresentative al microscopio ottico del tessuto prelevato con MIRS il giorno 0 a 20x. (B) Curva di Kaplan-Meier che descrive la sopravvivenza dei topi dopo impianto intracranico di cellule raccolte da tessuto resecato. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 7: Formazione delle neurosfere. Immagini rappresentative al microscopio ottico di neurosfere generate da tessuto resecato il giorno 2 post-resezione a (A) 20x e (B) 10x, e il giorno 7 post-resezione a (C) 20x e (D) 10x. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Tabella 1: Confronto tra il sistema di resezione minimamente invasiva (MIRS) e i modelli storici di resezione chirurgica.

BT ha un finanziamento per la ricerca da NIH ed è comproprietaria di Accelerating Combination Therapies*, e Ashvattha Therapeutics Inc. ha concesso in licenza uno dei suoi brevetti. GW ha finanziamenti NIH (R01NS107813). HB è un consulente retribuito di Insightec e presidente del Medical Advisory Board dell'azienda. Questo accordo è stato esaminato e approvato dalla Johns Hopkins University seguendo le sue politiche sul conflitto di interessi. HB ha finanziamenti per la ricerca da NIH, Johns Hopkins University e filantropia ed è consulente per CraniUS, Candel Therepeutics, Inc., Accelerating Combination Therapies*, Catalio Nexus Fund II, LLC*, LikeMinds, Inc*, Galen Robotics, Inc.* e Nurami Medical *. (*include azioni o opzioni).