Articolo metodologico

Implementazione della resezione minimamente invasiva del tumore cerebrale nei roditori per la raccolta di tessuti ad alta vitalità

DOI:

10.3791/64048

⸱

9 maggio 2022

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1Department of Neurosurgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Neurosurgery, University of Maryland School of Medicine, 3Marlene and Stewart Greenebaum Comprehensive Cancer Center, University of Maryland School of Medicine, 4Diagnostic Radiology and Nuclear Medicine, University of Maryland School of Medicine, 5Pontifical Catholic University of Parana, 6Department of Pathology, University of Maryland School of Medicine, 7Departments of Ophthalmology, Oncology and Biomedical Engineering, Johns Hopkins University School of Medicine

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il presente protocollo descrive una resezione standardizzata dei tumori cerebrali nei roditori attraverso un approccio minimamente invasivo con un sistema integrato di conservazione dei tessuti. Questa tecnica ha implicazioni per rispecchiare accuratamente lo standard di cura nei roditori e in altri modelli animali.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il presente protocollo descrive un paradigma standardizzato per la resezione del tumore cerebrale dei roditori e la conservazione dei tessuti. Nella pratica clinica, la resezione tumorale massimale è il trattamento standard di cura per la maggior parte dei tumori cerebrali. Tuttavia, la maggior parte dei modelli di tumore cerebrale preclinico attualmente disponibili non includono la resezione o utilizzano modelli di resezione chirurgica che richiedono molto tempo e portano a una significativa morbilità postoperatoria, mortalità o variabilità sperimentale. Inoltre, eseguire la resezione nei roditori può essere scoraggiante per diversi motivi, tra cui la mancanza di strumenti o protocolli chirurgici clinicamente comparabili e l'assenza di una piattaforma consolidata per la raccolta standardizzata dei tessuti. Questo protocollo evidenzia l'uso di un dispositivo di resezione multifunzionale e non ablativo e di un sistema integrato di conservazione dei tessuti adattato dalla versione clinica del dispositivo. Il dispositivo applicato nel presente studio combina l'aspirazione sintonizzabile e una lama cilindrica all'apertura per sondare, tagliare e aspirare con precisione il tessuto. Il dispositivo di resezione minimamente invasivo svolge le sue funzioni attraverso lo stesso foro di bava utilizzato per l'impianto iniziale del tumore. Questo approccio riduce al minimo le alterazioni dell'anatomia regionale durante la biopsia o gli interventi chirurgici di resezione e riduce il rischio di una significativa perdita di sangue. Questi fattori hanno ridotto significativamente il tempo operatorio (<2 min/animale), migliorato la sopravvivenza postoperatoria degli animali, minore variabilità nei gruppi sperimentali e si traducono in un'elevata vitalità dei tessuti e delle cellule resecati per analisi future. Questo processo è facilitato da una velocità della lama di ~ 1.400 cicli / min, che consente la raccolta dei tessuti in un sistema chiuso sterile che può essere riempito con una soluzione fisiologica di scelta. Data l'importanza emergente di studiare e modellare accuratamente l'impatto della chirurgia, la conservazione e la rigorosa analisi comparativa dei campioni di resezione tumorale regionalizzati e delle terapie somministrate all'interno della cavità, questo protocollo unico amplierà le opportunità di esplorare domande senza risposta sulla gestione perioperatoria e sulla scoperta terapeutica per i pazienti con tumore cerebrale.

Introduzione

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Il glioblastoma (GBM) è il tumore cerebrale primario più comune e aggressivo negli adulti. Nonostante i recenti progressi nella neurochirurgia, nello sviluppo mirato di farmaci e nella radioterapia, il tasso di sopravvivenza a 5 anni per i pazienti con GBM è inferiore al 5%, una statistica che non è migliorata significativamente in oltre tredecenni1. Quindi, c'è bisogno di strategie di trattamento più efficaci.

Per sviluppare nuove terapie, sta diventando sempre più evidente che i protocolli sperimentali devono (1) utilizzare modelli preclinici traducibili che ricapitolino accuratamente l'eterogeneità e il microambiente del tumore, (2) rispecchiare il regime terapeutico standard utilizzato nei pazienti con GBM, che attualmente include chirurgia, radioterapia e chemioterapia, e (3) tenere conto della differenza tra nucleo resecato e residuo, tessuti tumorali invasivi 2,3,4,5. Tuttavia, la maggior parte dei modelli di tumore cerebrale preclinico attualmente disponibili non implementano la resezione chirurgica o utilizzano modelli di resezione chirurgica che richiedono relativamente tempo, portando a una quantità significativa di perdita di sangue o mancanza di standardizzazione. Inoltre, eseguire la resezione dei tumori cerebrali dei roditori può essere difficile a causa della mancanza di strumenti o protocolli chirurgici clinicamente comparabili e dell'assenza diuna piattaforma 6 stabilita per la raccolta sistematica dei tessuti (Tabella 1).

Il presente protocollo mira a descrivere un paradigma standardizzato per la resezione del tumore cerebrale dei roditori e la conservazione dei tessuti utilizzando un sistema multifunzionale di resezione minimamente invasiva non ablativa (MIRS) e un sistema integrato di conservazione dei tessuti (TPS) (Figura 1). Si prevede che questa tecnica unica fornirà una piattaforma standardizzata che può essere utilizzata in vari studi nella ricerca preclinica per GBM e altri tipi di modelli di tumore cerebrale. I ricercatori che studiano le modalità terapeutiche o diagnostiche per i tumori cerebrali possono implementare questo protocollo per ottenere una resezione standardizzata nei loro studi.

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Protocollo

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Tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dall'Università del Maryland e dal Johns Hopkins University Institutional Animal Care and Use Committee. Per il presente studio sono stati utilizzati topi femmina C57BL/6, di età compresa tra 6 e 8 settimane. I topi sono stati ottenuti da fonti commerciali (vedi Tabella dei materiali). Sono state seguite tutte le normative di livello 2 (BSL-2), compreso l'uso di maschere, guanti e camici.

1. Impianto iniziale del tumore intracranico

  1. Nella fase iniziale dello studio, iniettare per via intracranica ogni topo con 100.000 cellule (linea cellulare GL261 murino glioma) sospese in 4 μL di soluzione salina tamponata fosfato (1x PBS) ad una profondità di 2,5 mm seguendo il rapporto precedentemente pubblicato7.
  2. Quantificare il segnale tumorale in ciascun topo utilizzando il sistema di imaging in vivo 8 9 giorni dopo l'impianto del tumore.
    NOTA: Se necessario, stratificare i topi in due gruppi in base al carico tumorale. Nel presente studio, i due gruppi erano: (1) topi con carico tumorale relativamente piccolo (segnale bioluminescente medio = 5,5e + 006 ± 0,1e + 006 fotoni / s, n = 10) e (2) topi con carico tumorale relativamente grande (segnale bioluminescente medio = 1,69e + 007 ± 0,2e + 007 fotoni / s, n = 10), (p < 0,05, test di Mann-Whitney) 9.
  3. Dividi ogni gruppo in due sottogruppi comparabili.
    NOTA: In questo studio, i due sottogruppi erano: topi non trattati (n = 5) e topi con tumori sottoposti a resezione chirurgica utilizzando il MIRS (n = 5), (p > 0,05, test di Mann-Whitney) 9.
  4. A partire dal giorno della resezione, monitorare la progressione del tumore utilizzando il sistema di imaging in vivo con una frequenza basata sul modello di crescita del tumore.
    NOTA: Per la linea cellulare GL261, monitorare la progressione del tumore il giorno della resezione e poi ogni 3-6 giorni.

2. Resezione tumorale con MIRS

  1. Anestetizzare il topo usando una miscela di gas isoflurano-O2 in una camera di induzione o iniezione intraperitoneale di soluzione di xilazina/ketamina.
    1. Se si utilizza l'anestetico gassoso, impostare la portata del gas su 1,0 ml / min e il vaporizzatore sul 2,0% per l'induzione dell'anestesia, che richiede in genere 3-5 minuti nella camera (vedi Tabella dei materiali).
    2. Se si utilizza l'anestetico iniettabile, anestetizzare i topi iniettando 0,2 ml di soluzione anestetica (80-100 mg/kg di ketamina e 10-12,5 mg/kg di xilazina, vedere Tabella dei materiali) per via intraperitoneale.
  2. Valutare l'animale per un'adeguata sedazione pizzicando la punta. Applicare unguento oftalmico agli occhi per evitare la secchezza della cornea. Somministrare un analgesico (0,03-0,06 mg/kg di buprenorfina per via sottocutanea) prima della procedura.
  3. Posizionare il mouse sulla cornice stereotassica (vedere Tabella dei materiali) una volta confermata la sedazione completa.
    NOTA: Se si utilizza l'anestetico gassoso, posizionare il naso del topo in un cono nasasale dove continuerà a ricevere la miscela di isoflurano-O2 durante la procedura (1,5%).
  4. Rimuovere la graffetta precedente, quindi rimuovere i capelli con una crema depilatoria o radendosi i capelli. Disinfettare la pelle con cicli alternati di uno scrub a base di clorexidina/betadina e alcool. Quindi, utilizzando un bisturi sterile, creare un'incisione longitudinale della linea mediana di 1 cm lungo la precedente cicatrice chirurgica.
  5. Fissare il manipolo MIRS al braccio stereotassico tramite l'adattatore da palcoscenico/supporto del manipolo per una maggiore stabilità e precisione.
  6. Impostare la macchina MIRS (vedere Tabella dei materiali) utilizzando le seguenti impostazioni (Figura 1).
    1. Inserire il cavo di alimentazione impostato sul pannello posteriore nella presa del cavo di alimentazione. Accendere o spegnere il sistema attivando o disattivando (1 = ON, 0 = OFF).
    2. Inserire un'estremità del tubo dell'azoto (fornito con la console) nel raccordo maschio sul pannello posteriore della console. Ruotare il dado di connessione in senso orario per stringere la connessione.
      NOTA: l'estremità opposta del tubo deve essere collegata all'alimentazione di azoto.
    3. Prima di collegare il tubo all'alimentazione di azoto, verificare che la pressione di alimentazione non superi i 100 psig, che è la pressione di alimentazione in ingresso consigliata per la console.
      NOTA: la console genera la propria aspirazione quando viene attivata dal pedale una volta che l'azoto è stato fornito alla console.
    4. Fissare il coperchio della porta del vuoto e sigillarlo per evitare perdite nel sistema di aspirazione. Eventuali perdite nel sistema di aspirazione influiranno sulle prestazioni della console MIRS.
    5. Se l'aspirazione è inferiore a 17 durante la configurazione o l'adescamento, verificare che la manopola di aspirazione sulla parte anteriore della console sia impostata al livello massimo (100), assicurarsi che non vi siano perdite nel sistema di aspirazione e verificare che la pressione di alimentazione in ingresso dell'azoto sia corretta.
    6. Per collegare il pedale alla console, inserire il connettore grigio del pedale nella sua presa grigia finché non scatta e si adatta alla posizione.
      NOTA: il connettore del pedale si collega alla console con un unico orientamento ed è digitato.
    7. Per collegare il manipolo alla console, inserire il connettore blu del manipolo nella sua presa blu finché non scatta e si inserisce in posizione.
      NOTA: il connettore del manipolo si collega alla console con un orientamento ed è digitato.
    8. Innescare ogni manipolo prima di utilizzare il sistema aspirando il fluido sterile da una piccola ciotola nell'apertura, attraverso il tubo e il manipolo e quindi nel contenitore per garantire che l'interno del tubo e del manipolo sia lubrificato per ridurre le occlusioni tissutali.
    9. Prepararsi per l'aspirazione da sola o l'aspirazione con taglio selezionando la modalità appropriata sul pannello frontale della console. Iniziare utilizzando il pedale.
  7. Inserire la cannula MIRS da 23 G nel foro di bava fino a una profondità di 2,5 mm.
  8. Avviare il processo di resezione premendo il pedale collegato alla cannula. Eseguire un ciclo completo (360°) o più di resezione utilizzando la manopola di controllo nel manipolo.
    NOTA: Più cicli vengono eseguiti, maggiore è il volume di tessuto tumorale resecato.
  9. Una volta completato il processo di resezione, estrarre la cannula MIRS da 23 G dal foro di bava e utilizzare 5 ml di 1x PBS per lavare il tubo e rimuovere eventuali residui di detriti.
  10. Rimuovere il mouse dalla cornice stereotassica e chiudere la ferita con una pinzatrice o materiale di sutura 4-0 (vedere Tabella dei materiali).
  11. Posizionare il mouse su una piastra elettrica o sotto una luce riscaldante durante il recupero dall'anestesia prima di riportarlo nella sua gabbia.
  12. Al termine dell'esperimento, eliminare la cannula tramite lavaggio. Alternare con mezzi refrigerati e aria per "spingere" tutto il tessuto resecato al contenitore di raccolta. Rimuovere il contenitore di raccolta dal sistema e chiudere con il tappo fornito.
  13. Dopo aver completato il passaggio 2.12, posizionare la punta distale della cannula in 3%H 2 O2 e applicare l'aspirazione a 24-25 in Hg per riempire la linea di aspirazione fino al contenitore di raccolta dell'aspirazione e lasciare riposare per 60-90 s. Sciacquare con fluidi sterili che pulsano aria e media a intermittenza.
  14. Monitorare i topi per eventuali segni neurologici (movimenti irregolari anomali o convulsioni) dopo la procedura.
  15. Eutanasia i topi con gravi disturbi neurologici (diventano letargici, hanno un aspetto scarno, schiena curva o hanno movimenti irregolari).
    NOTA: Per il presente studio, 200 mg/kg di una soluzione di eutanasia disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali) sono stati utilizzati per eutanasia ogni topo.

3. Raccolta dei tessuti tramite TPS

  1. Immergere il campione tumorale in un piatto di coltura tissutale contenente un mezzo di lisi dei globuli rossi (vedere Tabella dei materiali) per 5 minuti a temperatura ambiente.
    NOTA: Il tessuto raccolto dal MIRS nel TPS sarà principalmente sotto forma di singole cellule insieme a piccoli pezzi di tessuto.
  2. Posizionare un filtro da 70 μm (vedere Tabella dei materiali) su un tubo conico da 50 mL e utilizzare uno stantuffo di una siringa da 5 mL per far passare il campione tumorale attraverso il filtro.
  3. Con una pipetta di trasferimento, utilizzare il supporto RPMI-1640 per facilitare il passaggio delle cellule e di qualsiasi massa tissutale attraverso il filtro.
  4. Centrifugare a 428 x g per 5 minuti a 4 °C. Eliminare il surnatante con una pipetta.
  5. Risospendere ciascun campione in 5 mL di terreno RPMI-1640 preparato.
  6. Per aumentare la vitalità del tessuto, specialmente se vengono visualizzati grandi pezzi di tessuto all'impronta iniziale, aggiungere i volumi richiesti del cocktail enzimatico (contenente DNAsi I, collagenasi IV, dispasi, papaina ed EDTA, vedi Tabella dei materiali) a ciascun campione. Usa il vortice per mescolare le soluzioni.
    NOTA: il passaggio 3.6 è facoltativo. La composizione del cocktail enzimatico (per un volume totale di 5 ml/campione): 300 μL di DNAsi I Grado II, 150 μL di Collagenasi/Dispasi (scindole fibronectina, collagenasi IV, I e amminoacidi non polari), 250 μL di Papaina (proteasi non specifica) e 6 μL di 0,5 M EDTA.
  7. Porre i campioni in un incubatore agitatore impostato a 200 giri/min, 37 °C per 20 minuti.
  8. Dopo 20 minuti, ruotare i campioni a 428 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante.
  9. Filtrare le singole cellule attraverso un filtro cellulare da 70 μm e ruotare verso il basso a 274 x g per 3 minuti a 4 °C. Condurre un'analisi di vitalità cellulare10 con Trypan Blue ed Emocitometro (vedere Tabella dei materiali).
    NOTA: la vitalità del giorno 0 varia dal 30% al 70% e aumenta significativamente entro 2-3 giorni.
  10. Procedere ai passaggi 4, 5 o 6, a seconda del test di fattibilità necessario.

4. Cellule in crescita in coltura aderente

  1. In una cappa a flusso laminare certificata, risospendere il pellet in un mezzo aderente contenente siero (come DMEM, siero bovino fetale al 10% (FBS) e soluzione di penicillina / streptomicina (P / S) all'1%) e cellule di piastra in un pallone cellulare aderente.
  2. Mantenere le cellule in un ambiente incubato controllato (37 °C, 5% CO2).

5. Cellule in crescita in coltura in sospensione (neurosfere)

  1. In una cappa a flusso laminare certificata, risospendere il pellet in mezzo completo di cellule staminali11 privo di siero e placcarlo in un pallone di sospensione.
  2. Mantenere le cellule in un ambiente incubato controllato (37 °C, 5% CO 2) per2-3 giorni per consentire la formazione della neurosfera.
  3. Dopo la visualizzazione delle neurosfere nel terreno di coltura, utilizzare Tripsina-EDTA o Accutasi (vedi Tabella dei materiali) per ottenere sospensioni unicellulari per il passaggio.
    NOTA: Finché viene prestata particolare attenzione durante il raccolto e vengono utilizzati terreni appropriati che supportano le cellule staminali neurali, le cellule staminali nel tessuto raccolto devono formare neurosfere entro pochi giorni.

6. Preparare le cellule per il reimpianto

  1. Risospendere il pellet ad una concentrazione di 100.000 cellule vive per 4 μL di 1x PBS.
  2. Iniettare immediatamente in topi naïve utilizzando il metodo di impianto del tumore intracranico (fase 1).

7. Analisi istologica

  1. Subito dopo la resezione, estrarre e fissare il cervello in paraformaldeide (PFA) al 4% per 24 h12.
  2. Trasferire il cervello in una soluzione di saccarosio al 30% fino a quando non sono saturi di saccarosio (affondato sul fondo del contenitore).
  3. Trasferire il cervello in una soluzione di etanolo al 70%.
  4. Eseguire l'incorporamento di blocchi di paraffina, il sezionamento e la colorazione standard di ematossilina ed eosina (H & E) seguendo il rapporto13 pubblicato in precedenza.
    NOTA: Lo spessore di ciascuna sezione prelevata per la colorazione era di 10 μm.

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Risultati

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La resezione chirurgica con MIRS determina una significativa diminuzione del carico tumorale
Nel gruppo con un carico tumorale più piccolo, il segnale bioluminescente medio basale era di 5,5e+006 fotoni/s ± 0,2e+006 nel sottogruppo sottoposto a resezione. Dopo la resezione, il segnale bioluminescente medio è diminuito a 3,09e+006 fotoni/s ± 0,3e+006, (p <0,0001, test di Mann-Whitney)9 (Figura 2). Il segnale bioluminesce...

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Discussione

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La resezione del tumore è una pietra miliare dei piani di trattamento oncologico neurochirurgico per i tumori cerebrali di basso grado e di alto grado. La citoriduzione e il debulking del tumore sono correlati con il miglioramento della funzione neurologica e della sopravvivenza globale nei pazienti con tumori cerebrali 1,2,5,6. Sebbene i protocolli per la resezione chirurgica siano stati prece...

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Dichiarazioni

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BT ha un finanziamento per la ricerca da NIH ed è comproprietaria di Accelerating Combination Therapies*, e Ashvattha Therapeutics Inc. ha concesso in licenza uno dei suoi brevetti. GW ha finanziamenti NIH (R01NS107813). HB è un consulente retribuito di Insightec e presidente del Medical Advisory Board dell'azienda. Questo accordo è stato esaminato e approvato dalla Johns Hopkins University seguendo le sue politiche sul conflitto di interessi. HB ha finanziamenti per la ricerca da NIH, Johns Hopkins University e filantropia ed è consulente per CraniUS, Candel Therepeutics, Inc., Accelerating Combination Therapies*, Catalio Nexus Fund II, LLC*, LikeMinds, Inc*, Galen Robotics, Inc.* e Nurami Medical *. (*include azioni o opzioni).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Siringhe da 1 mL BD309628
Provette coniche da 15 mLCorning430052
Etanolo a prova 200PharmCo111000200
Pipette da 5 mL CoStar4487
Filtro da 70 micronFisher08-771-2
AccutaseMillipore SigmaSIG-SCR005
Anased (iniezione di xilazina, 100 mg/mL)Covetrus33198
Sistema di anestesiaPatterson Scientific78935903
Contenitore per rifiuti di gas anesteticiPatterson Scientific78909457
Protezione da banco sottopadCovidien10328
C57Bl/6, topi di 6-8 settimaneRiver LaboratoriesCodice ceppo 027
ChroMini ProMoserTipo 1591-Q
Collagenasi-DispasiRoche#10269638001
Countess II Contatore di cellule automatizzatoThermo Fisher
Countess II FL Ematocitometro ThermoFisherA25750
Soluzione per la rimozione dei detriti MiltenyiBiotech#130-109-398
D-luciferinaGoldbioLUCK-1G
DMEM F12 mediaCorning10-090-CV
DMEM mediaCorning10-013-CV
DNAse ISigma Aldrich#10104159001
Eppendorf tubiPosi-Click1149K01
Soluzione per eutanasiaHenry Schein71073
FBSMillipore SigmaF4135
Siero fetale bovinoThermo Fisher10437-028
FormalinaInvitrogenINV-28906
GarzaHenry Schein101-4336
hEGFPeproTech EC100-15
EparinaSigmaH-3149
hFGF-bPeproTech EC1001-18B
Camera di induzionePatterson Scientific78933388
IsofluranoCovetrus11695-6777-2
Vaporizzatore di isofluranoPatterson Scientific78916954
KetaminaCovetrus11695-0703-1
Kopf Telaio stereotassico KopfInstruments5001
Microscopio a campo luminosoBioTekCytation 5
Unità di microiniezioneKopf5001
Trapano a micromotoreForedomF210418
Sistema di risonanza magneticaBruker7T Biospec Avance III Scanner
MRI NICO Myriad SystemNICO Corporation
Unguento oftalmicoUnguento
PapainSigma Aldrich#P4762
PBSInvitrogen#14190250
PenStrepMillipore SigmaN1638
Soluzione PercollSigma Aldrich #P4937
Pipetta ControllerFalconA07260
Soluzione di iodio povidoneAplicare52380-1905-08
ProgesteroneSigmaP-8783
PutrescineSigmaP-5780
RPMI MediaInvitrogenINV-72400120
Lama per bisturiCovetrus7319
Manico per bisturiStrumenti per scienze fini91003-12
Time Out marcatore cutaneoD538.851
Graffetta dispositivo di rimozioneMikRonACR9MM
CucitriceMikRonACA9MM
GraffeClay Adams427631
Telaio stereotassicoKopf Instruments5000
SuturaSucrose Sigma AldrichS9378
vicryl 4-0EthiconJ494H
T-75 palloneda colturaSarstedt83-3911-002
TheraPEAKTM ACK Tampone di lisi (1x)LonzaBP10-548E
Tripsina-EDTACorningMDT-25-053-CI
Charles veterinario Puralube,

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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