Summary
単離されたラット筋細胞におけるカルシウム(Ca2+)過渡測定とともに、サルコメア長検出による収縮機能の測定を説明する一連のプロトコルが提示されています。心不全の動物モデルでの研究へのこのアプローチの適用も含まれています。
Abstract
収縮性機能障害およびCa2+ 過渡性は、心臓誘発性損傷および/またはリモデリングの包括的な評価の一環として、細胞レベルで分析されることがよくあります。これらの機能的変化を評価するための1つのアプローチは、初代成人心筋細胞におけるアンロード短縮およびCa2+ 過渡分析を利用する。このアプローチでは、成体筋細胞をコラゲナーゼ消化によって単離し、Ca2+ 耐性にしてから、ラミニンコーティングされたカバーガラスに接着し、続いて無血清培地で電気ペーシングを行います。一般的なプロトコルは、成体ラット心筋細胞を利用しますが、他の種からの初代筋細胞に対して容易に調整することができます。損傷した心臓からの筋細胞の機能的変化は、偽の筋細胞および/または in vitro 治療と比較することができます。この方法論には、筋細胞のペーシングに必要な重要な要素と、細胞室およびプラットフォームコンポーネントが含まれています。このアプローチの詳細なプロトコルには、サルコメア長検出による無負荷短縮の測定、およびレシオメトリックインジケータFura-2 AMで測定されたセルラーCa2+ 過渡現象の測定、および生データ分析の手順が組み込まれています。
Introduction
心臓ポンプ機能の解析には、特に心不全(HF)の動物モデルについて、適切な洞察を得るためにさまざまなアプローチが必要になることがよくあります。心エコー検査または血行動態測定は、in vivo心機能障害1への洞察を提供しますが、in vitroアプローチは、機能障害が筋フィラメントおよび/または結合興奮に関与するCa2+過渡性の変化、または収縮機能(例えば、興奮収縮[E-C]結合)に起因するかどうかを特定するためにしばしば採用されます。in vitroアプローチはまた、費用のかかるおよび/または面倒なin vivo治療戦略を追求する前に、神経ホルモン、ベクター誘発性遺伝子変化、および潜在的な治療薬2に対する機能的応答をスクリーニングする機会を提供します。
インビトロ収縮機能を調査するために、無傷の小柱3または透過処理された筋細胞4での力測定、ならびにHF 5,6の存在下および非存在下での無傷の筋細胞における無負荷短縮およびCa2+過渡現象を含むいくつかのアプローチが利用可能です。これらのアプローチのそれぞれは、心臓ポンプ機能に直接関与する心筋細胞収縮機能に焦点を当てています2,7。しかしながら、収縮およびE−C結合の両方を一緒に分析することは、単離されたCa2+耐性成体筋細胞における筋肉長の短縮およびCa2+過渡性を測定することによって最も頻繁に行われる。実験室は、このステップ8のためにラット心臓から筋細胞を単離するために詳細に公開されたプロトコルを利用します。
Ca2+一過性および筋フィラメントの両方が、無傷の筋細胞の短縮および再延長に寄与し、収縮機能障害に寄与する可能性がある2,7。したがって、このアプローチは、in vitro機能解析で、Ca2+サイクリング機構と筋フィラメントを含む無傷の筋細胞が必要な場合に推奨されます。例えば、無傷の単離された筋細胞は、遺伝子導入9を介して筋フィラメントまたはCa2+サイクリング機能を改変した後の収縮機能を研究するために望ましい。さらに、下流のセカンドメッセンジャーシグナル伝達経路および/または治療薬への応答の影響を研究する際に、神経ホルモンの機能的影響を分析するために、無傷の筋細胞アプローチが提案されています2。単一筋細胞における負荷依存力の代替測定は、ほとんどの場合、低温(≤15°C)での膜透過処理(またはスキニング)後に行われ、Ca2+過渡寄与を除去し、筋フィラメント機能に焦点を当てます10。無傷の筋細胞における負荷依存力とCa2+過渡現象の測定は、特に神経ホルモンシグナル伝達に対する応答の測定や治療薬のスクリーニングなど、より高いスループットが必要な場合に、アプローチ11の複雑で技術的な課題のために主にまれです。心臓小柱の解析は、これらの技術的課題を克服しますが、非筋細胞、線維症、および/または細胞外マトリックスリモデリングの影響を受ける可能性があります2。新生児筋細胞および誘導多能性幹細胞(iPSC)由来の筋細胞は、成体筋フィラメントタンパク質の完全な補体をまだ発現しておらず、通常、成体桿体状筋細胞に存在する筋フィラメント組織のレベルを欠いているため、上記の各アプローチは成体筋細胞を含む調製物を必要とする2。現在までに、iPS細胞における証拠は、成体アイソフォームへの完全な移行が培養で134日以上を超えることを示しています12。
このコレクションの焦点がHFであることを考えると、プロトコルには、障害のある無傷の筋細胞と失敗していない無傷の筋細胞における収縮機能を区別するためのアプローチと分析が含まれています。代表的な例は、腎上縮窄の18〜20週後に研究されたラット筋細胞から提供され、5、13に記載される。次に、偽処理ラットの筋細胞と比較します。
ここで説明するプロトコルとイメージングプラットフォームは、HFの発生中の桿体状心筋細胞における短縮およびCa2+過渡現象の変化を分析および監視するために使用されます。この解析では、前述のように、2 x 104 Ca2+耐性の棒状筋細胞を22 mm2ラミニンコーティングガラスカバースリップ(CS)に播種し、一晩培養します8。このイメージングプラットフォーム用に組み立てられたコンポーネントは、最適なイメージングに使用されるメディアとバッファーとともに、材料の表に記載されています。ソフトウェアを使用したデータ分析のガイドと代表的な結果もここに提供されています。全体的なプロトコルは別々のサブセクションに分割され、最初の3つのセクションでは単離されたラット筋細胞とデータ分析に焦点を当て、続いて細胞Ca2+一過性実験と筋細胞におけるデータ分析が続きます。
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Protocol
げっ歯類で行われた研究は、実験動物の人道的ケアと使用に関する公衆衛生サービスの方針に従い、ミシガン大学施設動物管理および使用委員会によって承認されました。この研究のために、筋細胞を、体重200g5≥3〜34ヶ月齢のSprague-DawleyおよびF344BNラットから単離した。男性と女性の両方の料金が使用されました。
1. 収縮機能研究のための筋細胞ペーシング
- 単離された筋細胞の各セットに対して新鮮なM199ベースの培地を作成します(材料表)。ペーシングの1日前に、前述のように、22 mm 2ラミニンコーティングガラスカバースリップ(CS)上に2 x 104 Ca2+耐性の棒状筋細胞をプレートします8。
- チャンバーを準備するには、各チャンバーを10%漂白剤に1時間浸します。次に、チャンバーを水道水で30〜45分間洗い流し、続いて蒸留水を5分ごとに30分間交換し、続いて脱イオン水を5分ごとに30分間交換し、最後に脱イオン水ですすいでください。
- チャンバーをきれいな面で20〜30分間乾燥させます(補足図1A-C)。次に、バイオセーフティキャビネット内のチャンバーを各方向に5分間UV処理します(合計= 20分)。このステップは、滅菌済みのチャンバーには必要ありません。
注意: UV曝露を最小限に抑えるために、その領域を離れてください。 - チャンバーからカバーを取り外し、3 mLのM199ベースの培地(材料表を参照)を各ウェルに追加し(補足図1B)、カバーを交換し、5%CO2と20%O2を含む37°Cのインキュベーターでチャンバーを予熱します。
- ホットビーズ滅菌器で鉗子を250°Cで20〜25秒間滅菌します。予熱した刺激チャンバーをインキュベーターからバイオセーフティキャビネットに移します。
- 心筋細胞を含む各カバーガラス(CS)を、滅菌鉗子を使用して刺激チャンバー内の個々のウェルに移します。CSを一度に4つ移し、続いて10分間加熱してから残りの4つのCSを移し替えて媒体の温度を維持します。
- バナナジャックを一方の端の刺激室(補足図1C)ともう一方の端の刺激装置(補足図1D)に取り付けます。
- 刺激装置の周波数を0.2Hzに設定し、電圧(~12V)を設定して、ウェル内のすべての棒状心筋細胞の~10%〜20%の収縮を達成します。収縮筋細胞の数を決定するには、チャンバーを4倍から10倍の倍率の倒立顕微鏡の下に置きます。
- 刺激チャンバーを5%CO2 中37°Cのインキュベーターに入れる(補足図1E)。37°C、5%CO2インキュベーターで予熱した培地を使用して、12 時間ごとに20〜25分間培地を交換します。12時間ごとに培地を交換した状態で、最大3日間電気刺激を継続します。
2. 成体ラット心筋細胞の収縮機能解析
- 実験の前に、ゲルパックと培地を37°Cのインキュベーターで30分間予熱します。
- 深赤色(590 nm)フィルターを備えた倒立顕微鏡を備えた防振表(補足図2A-1)およびCCDコントローラーに接続されたCCDカメラ(補足図2A-4)(補足図2A-5および 補足図2C-5)およびPCコンピュータと統合(補足図2B-14)。
- チューブを蠕動ポンプに組み立てます(補足図2A-8;補足図2A-8)、予熱したゲルパックをチューブホルダーに移し(補足図2A-9)、真空をオンにし(補足図2A-11)、細胞刺激装置の電源を入れます(補足図2B-13)。
- 培地の入った50 mLチューブを断熱チューブホルダーに入れ(補足図2A-9)、蠕動ポンプチューブを通して~0.5 mL / minで灌流を開始します(補足図2E-8)。
- 少量の予熱された媒体を小さな計量ボート(~2 mL)に加えます。筋細胞を含む1つのCSを刺激チャンバーから計量ボートに移します。刺激チャンバーを5%CO2 インキュベーター内で37°Cに戻す。
- 計量ボートからCSを取り外し、下側をそっと拭きます。CSを新たにグリースを塗ったCSチャンバー(補足図2A、F-10、黒い矢印)に移し、CSに培地(~200 μL)を静かに加えます。
- CSの上にプラチナ電極マウントを置き(補足図2F、灰色の矢印)、鉗子を使用して新しいCSを上に置きます。CSサンドイッチの上にトップマウント(補足図2F、白い矢印)を置き、2つまたは4つの#0なべネジを取り付けてチャンバーの組み立てを完了します。
- 媒体がポンプチューブ全体に存在したら、チューブを予熱器に取り付け、予熱器をステップ2.7で組み立てたCSチャンバーに接続します。0.5 mL / minで灌流を開始し、チャンバーの下に組織ワイプを置いて、漏れがないことを確認します。
- CSチャンバーをステージアダプターに配置します。灌流された媒体は、真空システムに接続されたチューブでチャンバーの反対側の端に集められます。加熱システム(補足図2A、D-7)をオンにし、チャンバー、対物レンズ、予熱器を~5〜10分間平衡化して、37°Cの一定の媒体温度を達成します。 この平衡化時間中に、顕微鏡上の40倍の水浸対物レンズで筋細胞を視覚化します。
- 電圧を棒状細胞の80%が収縮するために必要な設定(通常は35〜40 V)の1.5倍に設定して、ペーシング刺激装置をアクティブにします(補足図2B-13)。 刺激周波数を0.2Hzに設定して、収縮機能と筋細胞の生存を最適化します。
- 継続的に灌流およびペースの速まった筋細胞から収縮短縮および再延長トレースを収集します。短縮測定を行うには、CCDコントローラに接続されたCCDカメラ(補足図2A-4)(補足図2B-5,C)と、I/Oコントローラボードを備えた専用コンピュータ(補足図2B-14;材料表を参照)を使用します。このプラットフォームは、ラット筋細胞のサルコメア短縮を測定しますが、筋細胞の縦方向の端から収集された筋細胞測定からも同様の結果が得られます(Ecklerleら14を参照)。
- サルコメア短縮トレースを収集するには、コンピューターでソフトウェアを開き、[ OK]、[ ファイル] > [新規作成] の順に選択します。[トレース] > [ サルコメアの長さ] > [ユーザー制限の編集] を選択し、最大値と最小値 (通常は 2.0 μm から 1.5 μm) を設定して、画面テンプレートを準備します。筋細胞で測定を行う前に、0.01 mmの経緯線でCCDカメラを校正します(図1D)。
- サルコメアの長さトレースを記録するには、[ ファイル] > [新規作成] を選択します。収縮筋細胞を特定し、横紋パターンが垂直になるようにカメラの縦軸に沿って筋細胞を配置します(図1B)。
- コンピュータのマウスを使用して、筋細胞の上に関心領域(ROI)ボックス(ピンクのボックス)を配置します(図1C)。 [収集 して 開始 ] を選択して、収縮機能を記録します。低刺激周波数(≤0.5 Hz)で各筋細胞から60秒間の短縮を記録します。
- CSあたり5〜10細胞からのサルコメア短縮を記録します。 研究にアゴニスト/アンタゴニストによる治療が含まれている場合は、1細胞/ CSで測定を実行します。マルチチャンネルの蠕動ポンプにロードされた別々の予熱媒体と別の専用の灌流チューブを準備し、手順2.9.〜2.14に従います。筋細胞収縮機能に対する薬物または神経ホルモン送達の影響を測定するため。
- 周波数の範囲にわたって短縮を測定するには、各周波数で筋細胞をペースアップして、記録する前に定常状態の短縮を取得します5。これらの研究では、灌流速度を2倍にし、新しい周波数で刺激後15〜20秒の記録を開始して、0.2Hzおよび2Hzの範囲の周波数に対して一貫した定常状態の収縮反応を取得します。 通常、特定の刺激周波数の範囲で短縮するために、2つ以下の筋細胞/ CSを記録します。
- 記録を分析するときに信頼できる信号平均データを取得するために、少なくとも7つの収縮/セルを記録します(ステップ3を参照)。
3. 単離筋細胞における収縮機能に関するデータ解析
- 開始するには、[ ファイル] を選択し、記録されたトレースを選択して、[ 開く] を選択します。ベース トレースの タブ 1 (左側) を選択し、トレースの上部にある黄色のパネルを Sarc-Length に設定します。[ トレース ] を選択し、手順 2.12 で準備した画面テンプレートを選択します。
- 解析テンプレートを準備するには、[t0 の定義]ボックスで[操作]、[単調過渡解析オプション]、[TTLイベントマーク]を選択し、メニューから次のオプションを選択します。 ベースライン(静止サルコメア長)、 t0に対する出発速度(dep v)、 ピーク(ピーク高さおよび%ピーク高さ/ベースラインまたはbl%ピークh)、 tPeakに対する戻り速度(ret v)、 t0 を使用してピークまでの時間 50% (TTP 50%)、tPeak を使用してベースラインまでの時間 50% (TTR50%)。これらの分析オプションを保存するには、[テンプレート] > [識別子付きの分析テンプレートを保存] を選択します。各トレースを分析する前に、この分析テンプレートをロードします。
- データ分析を開始するには、[ ゲート>マーク]>[非定常を追加]>[イベントマーク>分析範囲から変換]を選択します。次に、0.2 Hzでペースを合わせた筋細胞の時間範囲を-0.01秒から1.20秒に設定します(図2A、生の痕跡の下部にある赤いマーク)。より高い周波数で刺激された筋細胞については、より短い時間範囲を選択します。
- シグナル平均トレースを生成するには 、[操作] > [平均イベント] を選択します。信号平均化された記録が元のベーストレースの下に表示されます。
- 信号平均トレースのタブ1(画面の左側)を選択し、上部メニューのマークを選択してから、トランジェントの追加を選択します。トップメニューと単調過渡解析から操作を選択して、ベースラインサルコメア長、ピーク高さ、bl%ピークh、dep v、ret v、TTP 50%、TTR50%の信号平均値を信号平均表示パネルに表示します。
- [単調過渡解析>>クリップボード電流のエクスポート]を選択して、複数の筋細胞の複合解析のために各サルコメア 過渡解析をスプレッドシート転送します。このデータを各トレースのスプレッドシートに貼り付けます。
- 信号平均トレースをコピーするには、[ 現在のトレース>>エクスポートクリップボード>オプション ]を選択し、小数点以下の桁数を5に設定してから 、[タブ区切り文字]を選択し、[ OK]、[ OK]の順にクリックします。記録する各筋細胞のシグナル平均トレースを2番目のスプレッドシートに貼り付けます。
4.ラット成体心筋細胞におけるCa2+ 過渡現象の記録
- Ca2+トランジェントを測定する前に、ステップ2.2で説明したプラットフォームコンポーネントと追加の蛍光イメージングコンポーネントをオンにします(材料表のCa2+イメージング分析の追加コンポーネントを参照)。補足図2A-5,6; 2B-12)。
- ジメチルスルホキシド(DMSO)溶液中の1 mMフラ-2AMと0.5 Mプロベネシドを含むFura-2AMストック溶液を調製します。プロベネシドはFura-2AMの漏れを最小限に抑えます 15.
- ストック溶液を6ウェルプレートの1ウェルで2.5 mLの培地( 材料の表を参照)で5 μM Fura-2AMおよび2.5 mMプロベネシドに希釈します。プレート内の3つの追加ウェルに2.5 mL培地のみ(Fura-2AMなし)を加え、プレートをアルミホイルで覆い、培地を37°Cに予熱します。
- CS含有筋細胞をペーシングチャンバーからFura-2AMを含むウェルに移し、蓋をして、プレートを5%CO2 を含む37°Cのインキュベーターに4分間戻します。チューブを灌流ポンプに取り付け、手順2.4で説明されているように、Fura-2AMロード期間中にメディアを灌流します。
- 室内照明をオフまたは最小化して、蛍光光退色を減らし、蛍光シグナルを最適化します。インキュベーターから6ウェルプレートを取り出し、培地のみを含む3つのウェルのそれぞれでCSを10秒間洗浄します。CSを予熱した媒体(Fura-2AMを追加しない)を入れた小さな計量ボートに移します。
- CSの下側を軽く拭いた後、CSをグリースを塗ったばかりのCSチャンバーにCSを取り付けます。CSにメディアを静かに滴下し、次に電極マウントをCSの上に組み立て、続いて2番目のCSとトップマウントを組み立てます。#0なべネジを使用して、手順2.6〜2.7で説明されているように、セルチャンバーの組み立てを完了します。
- 手順2.8の説明に従って、媒体で満たされたポンプチューブを予熱器に接続し、予熱器をCSチャンバーに接続し、ステージアダプターに配置します。真空チューブシステムでメディアを収集し、加熱システム(補足図2A、D-7)をオンにして、手順2.8〜2.9で説明されているように、チャンバーを37°Cに平衡化します。
- 手順2.10の説明に従って、35〜40 Vおよび0.2Hzに設定されたペーシング刺激装置(補足図2B-13)をアクティブにします。
- Ca2+ トランジェントを記録する前に、コンピュータのキーボードの近くに取り付けられた小さな懐中電灯またはブックライトをオンにして、キーボードが見えるようにします。さらに、心筋細胞のない領域の蛍光バックグラウンドを記録します。開始するには、手順 2.12 の説明に従って、[ ファイル] > [新規作成] > を選択します。
- ROIを選択し、各タブの上部中央に定義された生の分子に1つのタブ(または左側のトレースバー)と生の分母に2番目のタブを設定します。背景を10〜20秒間記録します。マウスを右クリックし、1つのトレースバーパネルをドラッグして、生の信号平均分子と分母の値を取得します。[ 操作] > [定数] を選択してこれらの値を入力し、生の値を入力します。
- 短縮とCa2+ トランジェントの両方を収集するための新しい画面テンプレートを準備します。サルコメアの長さについては、 タブ1 を選択し、ステップ2.13で説明したのと同じプロセスを使用します。Ca2+ イメージングの場合は、[ Tab 2 >比 ] (タブの中央上部) > [トレース ] > [ ユーザー制限の編集 ] を選択して、比率の最小レベルと最大レベルを設定します (通常は 1 から 5 の間で設定されます)。同じプロセスを使用して、タブ 3 とタブ 4 (左側) の分子と分母の範囲を定義します。
- ステップ2.14の説明に従って、筋細胞画像の上にROIボックスを配置します。[ ファイル] > [新しい>収集] を選択します。次に、[ 開始 ]を選択して、短縮およびレシオメトリックCa 2+ データを収集します。シグナル平均分析のために≥7収縮/細胞を記録します。
- ステップ 4.10 で説明されているバックグラウンド・トレース記録を繰り返します。2〜4個の筋細胞を記録した後。通常、バックグラウンドの読み取り値に有意な変化がある場合は、4〜5個の筋細胞/ CS以下の筋細胞を記録します。
5.単離筋細胞におけるCa2+過渡現象のデータ解析。
- 分析するファイルを開き、[短縮> Ca2+ トランジェントを加算した [テンプレート] [画面テンプレート] を選択します。次に、タブ1と2(左)を選択して、サルコメアの長さとCa2+比をそれぞれ表示します。[演算] > [定数] を選択し、Ca2+ バックグラウンド トレースから分子と分母の値を入力します。
- 短縮とCa2+ 過渡データ用の解析テンプレートを準備します。タブ 1 (左側) を選択し、手順 3.2 で説明したのと同じプロセスを使用します。をクリックして、サルコメア長さ解析テンプレートを設定します。
- タブ 2 (左側) を選択し、操作、単調過渡解析オプション、[t0 の定義] ボックスの TTL イベント マーク、およびメニューから次のオプションを選択します。 ベースライン (基底比)、 t0 に対する出発速度 (dep v)、 ピーク (ピーク高さおよび %ピーク高さ/ベースラインまたは bl% ピーク h)、 tピークに対する減衰速度 (ret v)、 t0 を使用してピークまでの時間 50% (TTP 50%)、tPeak を使用してベースラインまでの時間 50% (TTR50%)。これらの分析オプションを保存するには、[テンプレート] を選択し、新しい識別子名を使用して [分析テンプレートを保存] を選択します。各トレースを分析する前に、この分析テンプレートをロードします。
- 手順 3.3.-3.6 で説明したのと同じプロセスを使用します。シグナルを平均化してからサルコメア長を分析し、続いてCa2+ トランジェントについても同じ手順を実行します。サルコメア長とCa2+ 過渡比トレースに別々のマークを設定します。
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Representative Results
収縮機能研究は、単離の翌日(2日目)から分離後4日までラット筋細胞に対して行われます。筋細胞は単離の翌日(すなわち、2日目)に記録することができるが、遺伝子導入または収縮機能を変更するための処理の後、より長い培養時間が必要になることが多い8。単離後18時間以上培養された筋細胞の場合、セクション1に記載されているペーシングプロトコルは、T尿細管を維持し、一貫した短縮および再延長の結果を維持するのに役立ちます。
短縮研究のための筋細胞を含むCSの代表的な部分を、ROIを設定する前に適切に配置された筋細胞とともに図1Aに示します(図1B)。ROIが特定されると(図1C、ピンクのボックス)、筋細胞の下に表示されるアルゴリズム情報は、記録前の筋細胞の位置決めを最適化するのにも役立ちます。具体的には、線形光学密度(LOD、黒線)はサルコメアの数と間隔の指標であり、高速フーリエ変換トレース(FFT、赤線)のシャープなパワースペクトルは、短縮と再延長の記録に最適な位置合わせを実現するのに役立ちます。サルコメア長の校正(およびエッジ検出)に使用される経緯線パターンを図1Dに示します。サルコメア長短縮の典型的なアライメント記録を図2A(上のパネル)と、セクション3(下のパネル)で説明したシグナル平均分析に示します。
機能障害は、動物モデルでin vivo機能障害がある場合に筋細胞で検出されることがよくあります。例えば、圧力過負荷(PO)13に応答して心エコー検査によって観察される収縮期機能障害は、筋細胞短縮研究でも検出されます5。データトレースを説明するために、偽ラット(図2A)およびPO処理(図2B)ラットの筋細胞について、0.2Hzで得られた代表的な生(図2;上のパネル)およびシグナル平均(図2;下のパネル)トレースを示します。PO後に筋細胞の機能が救出されるかどうかを試験するために、筋細胞単離時のウイルス媒介遺伝子導入も、サルコメア16における内因性心筋トロポニンI(cTnI)をリン酸模倣cTnI T144D置換(T144D)で置換するために使用した。最初の分析は、cTnIT144Dの遺伝子導入の4日後にPO筋細胞の偽レベルに向かって戻ったPO誘発性収縮機能の低下(表1、上のパネル)を示しています(表1、下のパネル)。
このプラットフォームは、単離された筋細胞の短縮とともに、Ca2+過渡現象の測定にも使用できます。POはラット筋細胞のラミニン13への接着を低下させるため、短縮およびCa2+はPO後に記録されず、以前に類似したモデルでは、同様の時点でCa2+の取り扱いの変化が発達することを示した17。代わりに、2〜3ヶ月齢のラットから単離されたFura-2AM負荷筋細胞において代表的な実験を行った。代表的な記録トレースと信号平均トレースを図3に、データ解析を表2に示します。この一連の実験のために、成体ラットから単離された筋細胞を、cTnIT144Dまたは野生型cTnIのアデノウイルス媒介遺伝子導入(感染の多重度= 100)の4日後に研究した。サルコメア短縮とCa2+過渡現象の両方を、筋細胞にFura-2AMをロードした後に測定しました。cTnIT144Dの遺伝子導入は、これらの初期研究においてcTnIと比較してピーク短縮および拡張期Ca2+レベルの上昇を増強した(表2)。より広範な解析が必要ですが、初期の結果は、cTnIT144Dによるin vivo置換が、収縮機能とCa2+取り扱いの両方の経時的な変化により、複雑な心臓表現型を生み出す可能性があることを示唆しています。
図1:機能研究に用いた成体ラット心筋細胞。 (a)成体ラットから代表的な単離された心筋細胞(スケールバー=50μm)。矢印は、収縮機能解析のために画像化された代表的な筋細胞を指す。(B)ROI(ピンク色)が側面にある代表的な筋細胞(スケールバー= 20μm)。(C)ROIを有する代表的な筋細胞(上パネル)、この筋細胞のサルコメアパターン(下パネル、青、スケールバー=20μm)、およびパワースペクトルの鋭いピーク(下パネル、赤)。(D)短縮測定を校正するための0.01mmの経緯線のスクリーンキャプチャ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ラット筋細胞からの代表的な記録。 (A)偽および(B)圧力過負荷(PO)処理ラットの筋細胞で0.2Hzで記録された生の記録(上パネル)およびシグナル平均(下パネル)トレース。筋細胞は手術後18〜20週間で単離され、腎上縮窄によってPOが産生されました13。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:Fura-2AM負荷成体心筋細胞からのサルコメア長(SL)およびCa2+過渡現象の代表的な記録および分析。 (A)SLの生のトレース、Ca2+過渡比(比率)、およびCa2+過渡比を生成するために使用される分子と分母のトレース。(B)SL(上のトレース)とCa2+過渡比(下のトレース)の信号平均トレースの例。(C)トレースは、単調トレースアルゴリズムを使用して、サルコメア長(SL)とCa2+過渡比について分析されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| ラットグループ | シャム (n=30) | PO (n=32) |
| 安静時サルコメアの長さ(mm;SL) | 1.761 + 0.006 | 1.748 + 0.004 |
| ピーク高さ(ベースラインの%) | 9.003 + 0.409 | 6.680 + 0.552* |
| ピーク振幅(ミリメートル) | 0.159 + 0.007 | 0.117 + 0.010* |
| 短縮率 (mm/s) | -4.674 + 0.285 | -4.143 + 0.335 |
| 再延長速度(mm / s) | 3.251 + 0.223 | 2.706 + 0.273 |
| ピークまでの時間(ミリ秒;TTP) | 60 + 2 | 59 + 3 |
| 50%再延長までの時間(ms;TTR50%) | 35 + 2 | 37 + 3 |
| ラットグループ | シャム + cTnIT144D (n=14) | PO + cTnIT144D (n=17) |
| 安静時サルコメアの長さ(mm;SL) | 1.768 + 0.009 | 1.776 + 0.004 |
| ピーク高さ(ベースラインの%) | 9.038 + 1.339 | 8.414 + 0.960 |
| ピーク振幅(ミリメートル) | 0.160 + 0.023 | 0.149 + 0.016 |
| 短縮率 (mm/s) | -5.972 + 0.711 | -4.173 + 0.726 |
| 再延長速度(mm / s) | 3.925 + 0.577 | 3.055 + 0.403 |
| ピークまでの時間(ミリ秒;TTP) | 51 + 5 | 59 + 2 |
| 50%再延長までの時間(ms;TTR50%) | 31 + 3 | 32 + 2 |
表1:圧力過負荷(PO)と遺伝子導入に応答した心筋細胞の収縮機能の比較。筋細胞短縮の結果は、術後18〜20週間の偽ラットおよびPOラットの心臓からのものであり(上のパネル)5,13、およびcTnIT144D遺伝子導入の4日後の偽ラットおよびPOラットの筋細胞(下のパネル)からのものです。収縮機能は、すべてのグループで筋細胞単離/遺伝子導入の4日後に測定されます。結果はSEM±平均値(n=筋細胞数)として表す。偽データとPOデータの各セットは、スチューデントのt検定によって比較され、*p<0.05は統計的に有意と見なされます。偽およびPO筋細胞のみのピーク振幅結果は、Ravichandranらで以前に報告された5。
| サルコメア長解析 | ||
| 遺伝子導入群 | cTnI (n=21) | cTnIT144D (n=16) |
| 安静時サルコメアの長さ(mm;SL) | 1.81 + 0.01 | 1.81 + 0.01 |
| ピーク振幅(ミリメートル) | 0.11 + 0.01 | 0.14 + 0.02* |
| 短縮率 (mm/s) | -4.29 + 0.42 | -4.67 + 0.77 |
| 再延長速度(mm / s) | 2.92 + 0.43 | 3.71 + 0.64 |
| ピークまでの時間(ミリ秒;TTP) | 50 + 4 | 84 + 28 |
| 50%再延長までの時間(ms;TTR50%) | 37 + 4 | 35 + 6 |
| Ca2+ 過渡解析 | ||
| 遺伝子導入群 | cTnI (n=21) | cTnIT144D (n=19) |
| 静止Ca2+ 比 | 0.89 + 0.02 | 1.04 + 0.04* |
| ピークCa2+ 比 | 0.50 + 0.05 | 0.42 + 0.07 |
| Ca2+ 過渡速度 (D/秒) | 45.24 + 5.85 | 40.53 + 10.95 |
| Ca2+ 減衰率 (D/s) | -4.91 + 0.99 | -2.87 + 0.57 |
| ピークまでの時間Ca 2+ (ms;TTP) | 34 + 2 | 41 + 3 |
| 50%Ca2+ 崩壊までの時間(ms;TTD50%) | 101 + 8 | 117 + 6 |
表2:cTnIT144D遺伝子導入の4日後の成体ラット筋細胞における収縮機能およびCa2+ 一過性。 cTnIT144Dの遺伝子導入後の筋細胞における収縮機能(上パネル)およびCa2+ 過渡性(下パネル)の解析を野生型cTnIと比較した。筋細胞を2〜3ヶ月齢の成体ラットから単離し、データをSEM±平均値(n =筋細胞数)として提示する。収縮関数(左)とCa2+ 過渡現象(右)の統計的比較は、有意性が*p<0.05に設定された対応のないスチューデントのt検定を使用して実行されます。
補足図1:ラミニンコーティングCSに播種された筋細胞のペーシングシステムのコンポーネント。 (A)各チャンバーに白金電極を含むカスタムペーシングチャンバー。(B)最初の4つのチャンバーが媒体で満たされたペーシングチャンバー。(C)チャンバーに接続されているバナナジャックケーブルに取り付けられたペーシングチャンバーと(D)刺激装置。(E)刺激装置(右)と37°Cインキュベーター(左)の接続。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図2:筋細胞の収縮機能および/またはCa2+過渡測定に必要なコンポーネント。(A)各コンポーネントを示す収縮機能プラットフォーム、および番号付きの項目は、材料表でより詳細に説明されています。プラットフォームのコンポーネントには、防振テーブル、倒立明視野顕微鏡(#2,3)、CCDカメラ、CCDコントローラーとキセノン電源、デュアルエミッション光源、温度コントローラー、蠕動ポンプ、絶縁チューブホルダー、カバーガラスに取り付けられた灌流チャンバー(#10)、および真空システム(#11)が含まれます。(B)追加のコンポーネントには、蛍光インターフェース(#12)、チャンバー刺激装置(#13)、およびPCコンピューター(#14)が含まれ、これらは材料表でより詳細に説明されています。パネルAの番号付き項目の拡大図は、C-Fで表示されます。(C)キセノン電源(左)とCCDコントローラ(右)の図。(D)温度調節器。(E)蠕動ポンプ。(F)CS灌流室のベース(黒い矢印)、プラチナ電極マウント(灰色の矢印)、およびトップマウント(白い矢印)を#0なべネジで見た図。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ステップ1で概説した慢性ペーシングプロトコルは、単離された筋細胞を研究し、より長い治療の影響を評価するための有用な時間を延長します。私たちの研究室では、慢性ペースの筋細胞のサルコメア長を使用して収縮機能を測定すると、分離後4日まで一貫した結果が得られました。しかし、筋細胞の収縮機能は、筋細胞のペースを合わせるために1週間以上経過した培地を使用すると急速に悪化します。
収縮機能研究の場合、データはラットの体温に近い37°Cで収集されます。筋細胞の生存率を最適化し、各筋細胞の一貫した痕跡を得るために、これらの実験は、ラットの生理的心拍数~5Hzよりも低いペーシング周波数で実施されます。これらの設定は一貫した収縮機能データを生成しますが、短縮トレースが同じ治療グループの筋細胞を含む複数のCS間で一貫している場合は、チャンバー温度および/またはペーシング頻度を調整できます。さらに、ブレブがなく、CSに完全に接着し、棒状細胞の両端で収縮する筋細胞を選択することによって、最適な結果が得られます。片端のみに付着した細胞、複数のブレブを有する細胞、および/または片端のみで収縮する筋細胞は望ましくなく、バックグラウンドの動きのために記録がより困難になることがよくあります。これらの研究では、≥20サルコメアがROIに含まれており、シャープなパワースペクトルピーク、再現性のある静止サルコメア長、および短縮トレースの最適な信号/ノイズ比を実現します。わずか7つのサルコメアのROIは、パワースペクトルのピークが鋭いままであれば使用できます。単離されたラット筋細胞における静止サルコメアの長さは、通常2.00〜1.80μmの範囲である。静止サルコメアの長さが1.5μm未満の場合、サルコメア構造18 の理解に基づくと、活発な収縮は現実的ではなく、通常は筋細胞の配向が最適ではない結果です。
無傷の筋細胞におけるCa2+過渡測定の有無にかかわらず収縮機能の測定は、無傷の単一細胞における力測定に必要な技術的専門知識の開発により少ない投資を必要とする、より高いスループットアプローチである11。無傷の筋細胞研究はまた、多細胞製剤における他の細胞タイプの寄与なしに、筋細胞機能のみに焦点を当てています2。この分野の新たな分野は、より広範なin vivo分析の前に細胞レベルで治療薬のスクリーニングを加速するために、複数の無傷の筋細胞における短縮および/またはCa2+過渡現象を同時に測定することにより、より高いスループット分析の開発です。
収縮機能およびCa2+ 一過性測定は、マウスなどの他のげっ歯類モデルから単離された無傷の筋細胞でも可能であるが、ラット筋細胞と比較していくつかの重要な考慮事項および相違点がある。マウス筋細胞は24〜36時間の培養で生存可能であるが、生存率は48時間以上培養された筋細胞では徐々に低下する19。ベクターベースの遺伝子導入を使用する場合、特に半減期が20時間ではなく数日であるミオフィラメントタンパク質の場合、この短縮培養間隔を考慮する必要があります。ラット筋細胞とは異なり、マウス筋細胞の単離および培養の成功は、2,3−ブタンジオンモノオキシムまたはブレビスタチンなどのミオシンATPase阻害剤の培養培地への添加にも依存する19。その結果、慢性ペーシングはマウス筋細胞培養では実行可能な選択肢ではありません。単離されたマウス筋細胞に対するこれらのミオシン阻害剤の機能的影響を除去するために、15〜20分のより長い平衡化時間も必要である。最後に、マウス筋細胞を0.5 Hzで最適にペーシングし、ラット筋細胞に利用される0.2 Hzと比較して再現性のある短縮痕跡を取得します。
PO処理ラットの研究では、収縮機能障害はラット筋細胞の低周波ペーシングで一貫して検出されます。短縮のより大きな頻度依存的な減少は、in vivo収縮機能障害がある場合の偽ラットと比較して、PO後の筋細胞でも検出されます5,13。周波数の範囲を使用した研究では、適切な媒体を提供するためにポンプ速度を2倍にすると、刺激周波数を0.2〜2Hzに変更した後、15〜20秒以内に定常状態の短縮が生じました。 ラット筋細胞は、最大8Hzの高周波での短期間の刺激にも反応しますが、これらの高周波では細胞の生存率が急速に低下します。全体として、筋細胞収縮機能は、偽治療ラットと比較して、PO−などのラットモデルにおけるin vivo心機能障害を確認または検証するための再現可能なアプローチであることが証明されている(表1;Kimら13を参照されたい)。さらに、このプラットフォームは、より高価で面倒なin vivoアプローチを追求する前に、筋細胞を標的とする治療が収縮機能を回復または損なうかどうかをテストできます。このアプローチを使用すると、急性送達および治療薬への長期曝露および/または初代培養中の遺伝子送達後の両方が可能です。例えば、内因性cTnIをcTnIT144Dで置換する遺伝子導入実験は、偽ラット由来の筋細胞の短縮振幅に有意な変化を示さないことを示している。対照的に、cTnIT144Dは、PO処理ラットの筋細胞において、偽値に向かってピーク短縮振幅を回復させる(表1)。このアプローチの固有の弱点は、in vivo条件下で筋細胞に存在する典型的な負荷がないことです。その結果、応答は負荷依存の機能応答とは異なる可能性があり、実験例は、cTnIT144DがPO中の心機能を改善するかどうかをさらに調査するためにin vivoアプローチが必要であることを示しています。
同じ筋細胞における短縮とCa2+トランジェントの両方の測定は、このプラットフォームの利点です。例えば、Ca2+過渡現象では、収縮機能と比較して変化の方向が異なる場合があります。表2に示すように、ピーク短縮は、2〜3ヶ月齢のラットから筋細胞へのcTnIT144Dの遺伝子導入後に有意に増加する。この結果は、高齢の偽治療筋細胞で得られたデータとは異なり(表1)、ラットの5歳に関連している可能性があります。.ただし、この解釈を証明するには、さらにテストが必要です。表2のデータはまた、cTnIT144DがピークCa2+振幅を変化させず、代わりにCa2+減衰速度を遅くし、静止Ca2+を上昇させる傾向があることを示している。これらの知見は、cTnIT144D発現が収縮機能を高め、Ca2+サイクリング機構がこの効果を緩和することを示唆している。これらの結果は、収縮機能の変化とCa2+サイクリングを区別するこのアプローチの能力を強調しています。ここで提示された具体的な結果はまだ決定的なものではありませんが、心筋cTnIT144Dを発現する遺伝子動物モデルを開発し、その発現が将来POによって引き起こされる機能障害を鈍らせるかどうかを評価するための確固たる理論的根拠を提供します。Ca2+過渡データからの最終的な観察は、Fura-2AMなどの蛍光色素が筋細胞21の収縮機能動態を変化させることである。特定の治療または動物モデルによって生成される相対応答は、Fura-2負荷筋細胞内で同等ですが、これらの結果は、Fura-2AMの非存在下で行われた短縮測定と組み合わせるべきではありません。Ca2+過渡解析のためのFura-2AMの使用を最適化するために、実験室はほとんどの場合、Fura-2AMの非存在下で短縮を測定し、Ca2+過渡現象を測定するための実験のサブセットを実行します。
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Disclosures
著者には、競合する金銭的利益やその他の利益相反はありません。
Acknowledgments
この研究は、国立衛生研究所(NIH)の助成金R01 HL144777(MVW)によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEDIA | |||
| Bovine serum albumin | Sigma (Roche) | 3117057001 | Final concentration = 0.2% (w/v) |
| Glutathione | Sigma | G-6529 | Final concentration = 10 mM |
| HEPES | Sigma | H-7006 | Final concentration = 15 mM |
| M199 | Sigma | M-2520 | 1 bottle makes 1 L; pH 7.45 |
| NaHCO3 | Sigma | S-8875 | Final concentration = 4 mM |
| Penicillin/streptomycin | Fisher | 15140122 | Final concentration = 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin |
| REAGENTS SPECIFICALLY FOR Ca2+ IMAGING | |||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Fura-2AM | Invitrogen (Molecular Probes) | F1221 | 50 μg/vial; Prepare stock solution of 1 mM Fura-2AM + 0.5 M probenicid in DMSO; Final Fura2-AM concentration in media is 5 μM |
| Probenicid | Invitrogen (Fisher) | P36400 | Add 7.2 mg probenicid (0.5 M) to 1 mM Fura-2AM stock; Final concentration in media is 2.5 mM |
| MATERIALS FOR RAT MYOCYTE PACING | |||
| #1 22 mm2 glass coverslips | Corning | 2845-22 | |
| 3 x 36 inch cables with banana jacks | Pomona Electronics | B-36-2 | Supplemental Figure 1, panel C |
| 37oC Incubator with 95% O2:5% CO2 | Forma | 3110 | Supplemental Figure 1, panel E. Multiple models are appropriate |
| Class II A/B3 Biosafety cabinet with UV lamp | Forma | 1286 | Multiple models are appropriate |
| Forceps - Dumont #5 5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 1800-45 | |
| Low magnification inverted microscope | Leica | DM-IL | Position this microscope adjacent to the incubator to monitor paced myocytes for contraction at the start of pacing and after media changes; 4X and 10X objectives recommended |
| Pacing chamber | Custom | Supplemental Figure 1, panel A. The Ionoptix C-pace system is a commercially available alternative or see 22 | |
| Stimulator | Ionoptix | Myopacer | Supplemental Figure 1, panel D. |
| MATERIALS FOR CONTRACTILE FUNCTION and/or Ca2+ IMAGING ANALYSIS | ID in Supplemental Figure 2 & Alternatives/Recommended Options | ||
| Additional components for Ca2+ imaging analysis | Ionoptix | Essential system components: -- Photon counting system -- Xenon power supply with dual excitation light source -- Fluorescence interface | - The photon counting system contains a photomultiplier (PMT) tube and dichroic mirrorand is installed adjacent to the CCD camera (panel A #4). - The power supply for the xenon bulb light source (see panel A #5 and panel C, left) is integrated with a dual excitation interface (340/380 nm excitation and 510 nm emission) shown in panel A #6. - The fluorescence interface between the computer and light source is shown in panel B, #12. |
| CCD camera with image acquisition hardware and software (240 frames/s) | Ionoptix | Myocam with CCD controller | Myocam and CCD controller are shown in Supplemental Fig. 2, panel A #4 and panel A #5 & panel C #5 (right), respectively. The controller is integrated with a PC computer system (panel B #14). |
| Chamber stimulator | Ionoptix | Myopacer | Panel B, #13; Alternative: Grass model S48 |
| Coverslip mounted perfusion chamber | Custom chamber for 22 mm2 coverslip with silicone adapter and 2-4 Phillips pan-head #0 screws (arrow, panel F) | Panel A #10 & panel F; Chamber temperature is calibrated to 37oC using a TH-10Km probe and the TC2BIP temperature controller (see temperature controller). Commercial alternatives: Ionoptix FHD or C-stim cell chambers; Cell MicroControls culture stimulation system | |
| Dedicated computer & software for data collection and analysis of function/Ca2+ transients | Ionoptix | PC with Ionwizard PC board and software | Panel B, #14; Contractile function is measured using either SarcLen (sarcomere length) or SoftEdge (myocyte length) acquisition modules of the IonWizard software. The Ionwizard software also includes PMT acquisition software for ratiometric Ca2+ imaging in Fura-2AM-loaded myoyctes. - A 4 post electronic rack mount cabinet and shelves are recommended for housing the somputer and cell stimulator. The fluorescence interface for Ca2+ imaging also is housed in this cabinet (see below). |
| Forceps - Dumont #5 TI | Fine Science Tools | 11252-40 | Panel F |
| Insulated tube holder for media | Custom | Panel A #9; This holder is easily assembled using styrofoam & a pre-heated gel pack to keep media warm | |
| Inverted brightfield microscope | Nikon | TE-2000S | Install a rotating turret for epi-fluorescence (Panel A #2) for Ca2+ imaging. A deep red (590 nm) condenser filter also is recommended to minimize fluorescence bleaching during Ca2+ imaging. |
| Isolator Table | TMC Vibration Control | 30 x 36 inches | Panel A, #1; Desirable: elevated shelving, Faraday shielding |
| Microscope eyepieces & objective | Nikon | 10X CFI eyepieces 40X water CFI Plan Fluor objective | Panel A #3; 40X objective: n.a. 0.08; w.d. 2 mm. A Cell MicroControls HLS-1 objective heater is mounted around the objective (see temperature controller below). NOTE: water immersion dispensers also are now available for water-based objectives. |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | Panel A #8 and panel E |
| small weigh boat | Fisher | 08-732-112 | |
| Temperature controller | Cell MicroControls | TC2BIP | Panel A #7; Panel D. This temperature controller heats the coverslip chamber to 37oC. A preheater and objective heater are recommended for this platform. A Cell MicroControls HPRE2 preheater and HLS-1 objective heater are controlled by the TC2BIP temperature controller for our studies. |
| Under cabinet LED light with motion sensor | Sylvania | #72423 LED light | Recommended for data collection during Ca2+ transient imaging under minimal room light.. Alternative: A clip on flashlight/book light with flexible neck - multiple suppliers are available. |
| Vacuum line with in-line Ehrlenmeyer flask & protective filter | Fisher | Tygon tubing - E363; polypropylene Ehrlenmeyer flask - 10-182-50B; Vacuum filter - 09-703-90 | Panel A #11 |
References
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