Summary
秀丽隐杆线虫 是一个优秀的模型系统，具有强大而低成本的方法，用于测量健康寿命，寿命和对压力的适应能力。
Abstract
秀丽隐杆线虫作为模式生物的发现和发展对生物学产生了影响，特别是在衰老领域。许多历史和当代研究已经确定了数千种改变寿命的范式，包括基因突变，转基因基因表达和hormesis，这是一种有益的，低级的压力暴露。凭借其许多优点，包括寿命短，维护简单且成本低，以及与几乎三分之二的人类基因同源的完全测序基因组，秀丽隐杆线虫已迅速被采用为压力和衰老生物学的杰出模型。在这里，研究了几种用于测量寿命和健康寿命的标准化方法，这些方法可以很容易地适应几乎任何研究环境，特别是那些设备和资金有限的研究环境。秀丽隐杆线虫的令人难以置信的实用性，突出了在衰老生物学中进行强大遗传分析的能力，而无需广泛的基础设施。最后，讨论了每种分析的局限性和替代方法，以供考虑。
Introduction
自悉尼·布伦纳（Sydney Brenner）于1974年发表的“ 秀丽隐杆线虫的遗传学”发表以来，这种微观蠕虫一直被认为是研究生物学奥秘的杰出模型系统1。1977年，Michael R. Klass发表了测量 秀丽隐杆线虫 寿命的方法，并建立了这个模型系统来研究衰老2。了解压力与长寿之间关系的研究始于鉴定 1岁 基因中的单个突变，这导致 秀丽隐杆线虫3的寿命延长。此外，当代研究已经确定了其他寿命增加的突变，这些突变揭示了长寿的突变蠕虫，其对压力的抵抗力增加4，5，6。凭借其许多优点，包括寿命短，易于维护，完全测序的基因组，包含与约三分之二的人类致病基因的同源性，RNA干扰（RNAi）文库的可用性和易用性，以及与人类7，8，9的生理相似性， 秀丽隐杆线虫 已迅速被采用为压力和衰老生物学的杰出模型。
也许 秀丽隐杆线虫 的最大效用是其极低的维护成本，易于实验以及可用于研究的各种遗传工具。 秀丽隐杆线虫 通常生长在具有 大肠杆菌 食物来源的固体琼脂培养基上。两种常用 的大肠杆菌 菌株是标准OP50，一种可能是最常用的10的B菌株，以及HT115，一种K-12菌株，主要用于RNAi实验11，12。HT115 K-12菌株在RNAIII RNase中携带缺失，这是RNAi方法所必需的突变，其中使用表达与单个 秀丽隐杆线虫 基因相对应的dsRNA的质粒。dsRNA进料载体允许 对秀丽隐杆线虫 基因进行稳健的敲低，而无需复杂的杂交或基因组编辑，因为携带这些质粒的细菌可以直接喂入线虫。数以千计的这些细菌RNAi载体存在于HT115背景中，包括最受欢迎的Vidal RNAi文库，其中有>19，000个单独的RNAi构建体13 个，而Ahringer RNAi文库有16，757个RNAi构建体14个。然而，OP50和HT115细菌饮食在代谢谱方面存在重大差异，包括维生素B12的差异15，16。因此，如果可能的话，建议在单一细菌源上进行所有实验，以避免基因 - 饮食相互作用，如前面描述的17，18，19所述。由于其易用性，动物在这里描述的所有实验条件下都保持在OP50上，但所有实验都是在HT115上进行的，如前所述20。简而言之，将动物维持在OP50并转移到HT115同步后（漂白后），以保持RNAi与非RNAi实验之间的一致性。或者，也可以使用在 大肠杆菌 K12 HT115菌株中发现的具有类似RNAIII RNase缺失的RNAi主管OP50菌株21。
也许在 秀丽隐杆线虫 中RNAi实验的一个主要限制是对敲低效率的关注。虽然敲低效率 可以通过 qPCR或蛋白质印迹来验证，但这些需要昂贵的设备和试剂，并且仅限于批量分析。这更是关注特定细胞，例如神经元，它们对RNAi是难治的（不太敏感）。虽然 可以通过过表达 SID-1（dsRNA摄取所必需的跨膜蛋白22）来增强特定细胞中的RNAi效率，但这仍然局限于用于这些构建体的启动子的细胞类型特异性表达模式，因此基因敲除和突变是消耗基因功能的最万无一失的手段。除了RNAi介导的敲低之外， 秀丽隐杆线虫 也非常适合基于CRISPR的策略23，24，25和通过显微注射进行转基因构建体过表达的基因组编辑，可以选择通过辐照或基于转座子的整合来整合转基因构建体26，27，28，29.然而，这些方法需要昂贵的显微注射设备，并且指导RNA或Cas9酶的高成本可能在资金有限的机构中禁止这些方法。相反，成千上万的转基因品系和突变体在卡诺哈布迪炎遗传学中心（CGC）和国家生物资源项目（NBRP）都很容易获得。NBRP为大量 秀丽隐杆线虫 基因提供分离的突变体，包括已发表且因此经过验证的突变株，来自试点项目的突变体以及尚未表征的突变体。相比之下，CGC是研究界主要发表和建立的 秀丽隐杆线虫 系的存放处。它们都以非常合理的价格在全球范围内运送菌株，并为那些内部合成菌株能力有限的人提供了各种各样的选择。
这里提供了一个精选的方法集合，这可能是测定秀丽隐杆线虫寿命和健康状况的最低成本方法。这里介绍的所有方法都需要低成本的设备和用品，并且只利用CGC容易获得的菌株。对于秀丽隐杆线虫的长寿和存活测定，也许最令人望而却步的是线虫生长培养基（NGM）板的成本。由于秀丽隐杆线虫是雌雄同体的，并且具有自我受精性，因此标准的生存测定要求成年动物不断远离其后代，以避免后代的污染。该过程不仅耗时，而且由于每个条件需要大约100个板来运行单个寿命测定，因此可能会变得昂贵。这里提供了两种选择：利用对温度敏感的无种系突变体glp-4（bn2）或使用5-氟-2'-脱氧尿苷（FUDR）进行化学灭菌。glp-4编码戊基氨基酰基tRNA合成酶，并且由于蛋白质翻译减少30，31，温度敏感的glp-4（bn2）在限制性温度下生殖缺陷。FUDR是一种通过阻止DNA复制对秀丽隐杆线虫进行化学灭菌的可靠方法，从而抑制繁殖32。虽然FUDR对于一些实验室来说可能非常昂贵，但只需要少量的化学灭菌蠕虫，其粉末形式的稳定性可能使其适用于大多数组。利用温度敏感的glp-4（bn2）突变体当然是最便宜的选择，因为唯一的要求是将动物转移到限制性25°C的培养箱;然而，应该注意的是，在25°C下生长可能会引起轻微的热应激33，34。无论采用何种方法，使用无菌动物都可以显著降低年龄相关检测所需的耗材成本。
为了研究衰老，标准寿命测定是传统的，因为改变寿命的范式对衰老有直接影响。然而，健康跨度和压力耐受性的测量提供了有关生物体健康状况的额外信息。这里提供了几种测量健康跨度的方法：1）生育率作为生殖健康的衡量标准;2）育雏大小作为下岗后代发育健康和生存能力的衡量标准;3）运动行为作为肌肉功能和运动的衡量标准，两者都与衰老直接相关。此外，还提供应激耐受性测定：ER应激存活率，线粒体/氧化应激和热应激存活。事实上，对ER应激35，36，线粒体应激37和热应激38 的抵抗力增加的动物表现出更长的寿命。ER应激是通过使 秀丽隐杆线虫暴露于长 春霉素来施加的，其阻断N-连锁糖基化并导致错误折叠蛋白质的积累39。线粒体/氧化应激是由暴露于百草枯引起的，百草枯会特别在线粒体40 中诱导超氧化物的形成。通过在34-37°C 33，41下孵育动物施加热应激。这里描述的所有测定都可以用最少的设备和资金进行，并提供各种工具来研究不同群体的衰老。
Protocol
1. 秀丽隐杆线虫的生长和维持
- 浇注线虫生长培养基 （NGM） 板
- 在标准2%琼脂平板上生长 秀丽隐杆线虫 生长，线虫生长培养基（NGM），由1 mM CaCl2，5μg/ mL胆固醇，25 mM KPO4 （pH 6.0），1 mM MgSO4，0.25%w / v肽酮和51.3 mM NaCl组成。
- 对于1LNG琼脂平板，将2.5g蛋白胨，3.0gNaCl和20g琼脂量量入1 L烧瓶中，并用搅拌棒。
注意：建议对特定的琼脂来源进行标准化，因为我们已经看到品牌之间刚度的变化，这可能会影响可重复性。在这里，严格使用白细胞琼脂。此外，建议将琼脂直接加入到被高压灭菌的烧瓶中，因为琼脂在没有加热的情况下不会完全溶解，并且转移含有琼脂的溶液会导致琼脂的损失和浓度错误。 - 添加 dH2O 至 970 mL。
注意：灭菌后30 mL液体添加剂将使最终体积达到1 L。在我们的手中，需要约951毫升dH2O才能达到970毫升的最终体积。 - 使用标准高压灭菌器或培养基灭菌器对NGM琼脂溶液进行灭菌，以实现高效灭菌。
注意：此时，无菌NGM琼脂可以在室温下储存数月。如果储存，NGM-琼脂可以在具有15-45 s脉冲的微波炉中重新提振，以防止溶液沸腾，或在热水浴中。 - 让溶液搅拌，直到冷却至60-75°C。 冷却时搅拌对于防止冷却不均匀非常重要，这可能会导致一些琼脂凝固。
- 当溶液冷却时，将水浴或珠浴加热至65-70°C。
- 一旦溶液冷却至60-75°C，加入液体添加剂：2.0 mL 0.5 M CaCl2，1 mL 5mg / mL胆固醇，25 mL 1 M KPO4 （pH 6.0）和0.5 M MgSO4（参见 表1 了解所有试剂的配方），并让溶液混合约5分钟以确保完全混合。
注意：药物也可以包含在这里的平板中（例如，加入 1 mL 100 mg/mL 羧苄青霉素和 1 mL 1 M IPTG，加入 10 mL 2.5 mg/mL 长尼卡霉素，加入 10 mL 400 mM 百草枯）。 - 将含有NGM-琼脂的浸没式烧瓶放入65-70°C水浴中，以防止NGM琼脂在倒入板中时凝固。
- 将9-11 mL溶液移入每个60 mm板中，或将20-30 mL溶液移入每个100 mm板中。
注意：建议使用最小的移液器体积，以避免移液器中空气膨胀引起的NGM泄漏。移液比添加到每个板中的培养基多1-2 mL，以避免完全排空移液器，这将有助于防止气泡形成。或者，可以将培养板直接从瓶子中手动倒入板中，但强烈建议移液以确保板具有相等的体积。当使用将溶液直接施加在板顶部的方法时，等体积的板对于确保相似浓度的溶液非常重要（参见步骤1.1.17）。相等的体积还允许轻松的显微镜检查在板之间保持相似的焦平面。 - 将移液器放回加热的溶液中以保持温度并防止NGM琼脂凝固。
- 对所有板重复上述两个步骤。
- 让NGM琼脂平板凝固过夜。
- 板固化后，将板在4°C下储存长达3个月，或继续步骤1.1.14以接种带有细菌的板。将印版存放在密封的容器中，以帮助保持水分以保持印版质量。
- 在环境温度（~22-25°C）下，在溶血肉汤（LB）或选择的等效培养基中培养24-48小时培养OP50，或在LB +抗生素中培养HT115（推荐氨苄西林/碳水化合物+四环素用于HT115），并在37°C下振荡12-16小时。
注意：建议在室温下生长OP50，因为在37°C时发现了OP50的更具侵略性的生长，这会影响 秀丽隐杆线虫的 寿命。相比之下，HT115的生长速度较慢，培养密度较低;因此，建议在37°C下摇动HT115。 - 将体积为100-200μL的饱和OP50 / HT115培养物接种到60 mm平板上，或将1 mL用于100 mm板。
- 让盘子在台面上干燥一夜，如果盘子仍然潮湿，则允许额外的一天干燥。将板储存在4°C的密封容器中约2个月。
- 可选：将药物直接添加到接种的NGM琼脂平板上（例如，100μL 10mg / mL FUDR溶液）以对蠕虫进行化学灭菌。
- 维持秀丽隐杆线虫种群
- 正确标记种子NGM琼脂平板的底部。在板底部的边缘贴上标签，以防止阻碍光线在标准解剖显微镜上的通过。
- 使用标准解剖显微镜，将所选细菌舀到 秀丽隐杆线虫 身上。
注意：在该协议中，使用了由连接到玻璃巴斯德移液器末端的90%/10%铂/铱丝组成的镐线的镐头。 - 使用细菌，收集10-20个卵，L1，L2或L3动物，并将它们转移到新标记的种子NGM琼脂平板上。
注意：最好收集年幼的动物;根据作者的经验，对于标准的野生型动物，移动10-20个卵/幼年动物将允许板在15°C下生长而不会挨饿。对于繁殖力下降的转基因或突变动物，应将更多动物移入板中。 - 对于具有野生型繁殖力并在15°C下生长的动物，每7天重复步骤1.2.1-1.2.3以保持每周库存。对于在20°C下生长的动物，每4-5天重复步骤1.2.1-1.2.3以防止饥饿。
- 同步蠕虫 via 漂白
注意：一个完整的60毫米NGM琼脂板（例如，在15°C下生长的1周龄的储备板）将为所描述的大多数标准测定提供足够数量的动物。一般来说，一个成年（满是鸡蛋的成年人）会提供10-15个鸡蛋。42，一个完整的60毫米NGM琼脂板有100-200个妊娠成虫，提供约1000-2000个卵。- 对于需要更多动物的更大规模的实验，将一个完整的60毫米NGM-琼脂切成四到六个相等的碎片，并将它们切块到100毫米的接种板上以进行膨胀。
注意：在这里，分块是指切割含有蠕虫的NGM琼脂板的一块，并将整个琼脂+蠕虫块移动到新板上，蠕虫面向下以使蠕虫爬到新板上。作为参考框架，具有野生型繁殖力的动物如果在分块后在20°C下生长2-3天，将产生完整的100毫米板。 - 要开始收集线虫，将少量M9溶液（表1）倒入含有蠕虫的平板上，注意不要过量填充培养皿。轻轻旋转M9溶液，使细菌草坪上的蠕虫松动。
- 用血清学移液器收集妊娠成虫，注意不要用移液器尖端刺穿琼脂。
注意：建议使用玻璃血清移液器，因为 秀丽隐杆线虫 倾向于粘附在塑料上。如果没有玻璃移液器，建议从比所需数量更多的动物开始，因为有些动物会因为粘在塑料移液器上而丢失。 - 通过以1，100 x g 离心30秒来沉淀动物。吸出上清液。
注意： 秀丽隐杆线虫 颗粒非常松散，因此在吸出上清液时请注意不要摇晃或破坏颗粒。 - 当动物离心时，每个菌株准备5 mL漂白溶液（有关配方详细信息，请参见 表1 ）;对于 5 mL 溶液，混合 1.5 mL 6% 次氯酸钠（漂白剂）、0.75 mL 5 M NaOH 或 KOH 和 2.75 mL dH2O。
注意：次氯酸钠和高浓度氢氧化物溶液具有腐蚀性，因此建议在处理时戴上手套和实验室外套。 - 向蠕虫颗粒/ M9混合物中加入5 mL漂白溶液。
- 每隔几分钟在解剖显微镜下检查蠕虫，直到所有成虫体都溶解，混合物中只剩下卵。用力摇动蠕虫/漂白剂混合物，以加快漂白过程。
注意：将鸡蛋长时间留在漂白剂混合物中会导致鸡蛋损坏，并会影响动物的生存能力。对于野生型动物，漂白通常需要4-6分钟，摇晃。因此，建议从4分钟标记开始，每隔30秒在显微镜下检查动物。 - 通过将鸡蛋/漂白剂混合物以1，100 x g 旋转30秒来沉淀鸡蛋。
注意：一些 15 mL 锥形管在管内侧有梯度线。对于这些管子，建议以更高的速度旋转鸡蛋（例如，在2，000 x g下旋转30 秒），以确保鸡蛋沉淀到管的底部并且不会保持在梯度线上。 - 吸出漂白溶液。
注意：卵颗粒比蠕虫颗粒更硬，但仍然很容易被破坏。因此，请注意离心后不要摇晃管子。 - 通过添加高达15 mL的M9溶液并将管倒置四到五次来洗涤鸡蛋，以确保鸡蛋完全分散在M9溶液中。
- 通过以1，100× g 离心30秒来沉淀鸡蛋，并吸出M9溶液。
- 重复上述两个步骤，总共洗涤四次，以消除鸡蛋混合物中的任何漂白剂。
- 最终洗涤后，将卵重悬于100μL至2mL的M9溶液中（即，取决于漂白的蠕虫总数）。彻底摇晃鸡蛋以分解团块，并确保颗粒完全重悬。
- 或者，动物可以被L1阻止以进行更紧密的时间同步;对于L1阻滞，在15 mL锥形管中将M9溶液加入蛋丸中至〜10 mL。让蠕虫在旋转器中在20°C或环境温度下旋转长达24小时。L1动物通常比步骤1.3.16中描述的卵时间少半天即可成年。
- 通过将4μL鸡蛋/ M9混合物移液到接种有细菌的NGM板上来近似卵子浓度（或L1浓度，参见步骤1.3.14）。计数并计算每个μL电镀中存在多少个卵子。重复计数三到四次以改善近似值。
注意：近似鸡蛋浓度将确保将足够的动物接种到适当的样品量用于实验，而不会过度电镀，这将导致饥饿。 - 根据近似值，将适当数量的卵铺在接种了所选细菌的NGM琼脂平板上。对于OP50板，在60 mm板上最多接板200只动物，在100 mm板上接板最多1，000只动物。对于HT115板，在60毫米板上最多接板150只动物，在100毫米板上接盘600只动物。
注意：这些是基于我们实验室条件的近似数字，数字可能会根据细菌草坪的厚度而变化。在15°C下生长的卵需要〜5天才能达到成年期的第1天（〜140小时才能达到产卵最大值，妊娠成虫阶段）。在20°C下生长的卵需要〜4天才能达到成年期的第1天（〜96小时才能达到产卵最大值，妊娠成虫阶段）。在25°C下生长的卵需要约3.5天才能达到成年期的第1天（约62小时才能达到产卵最大，妊娠成虫阶段）。
- 对于需要更多动物的更大规模的实验，将一个完整的60毫米NGM-琼脂切成四到六个相等的碎片，并将它们切块到100毫米的接种板上以进行膨胀。
- 产卵作为同步 秀丽隐杆线虫 种群的替代方法
- 如果漂白方案不可行（例如，没有可用的离心机），作为同步 秀丽隐杆线虫种群的替代方法，请执行产卵程序。请记住，该协议更加劳动密集型，将导致动物产量降低。
- 对于产卵，将8-12个妊娠成虫放在接种有所选细菌的标准NGM-琼脂平板上，并记录放置在板上的确切数量的动物。
注意：蛋产程序应在将用于实验的温度下进行。 - 让动物产卵4-8小时。
注意：动物留在盘子上的持续时间可以在需要时进行调整。例如，当可用时间较少时，可以将大量动物放在盘子上以缩短产卵时间。 秀丽隐杆线虫 通常成群结队地产卵，对于野生型繁殖力为43的动物，可以估计出大约5个卵/小时的速度。遵循步骤1.3.16中的建议，以避免过度电镀动物。 - 从盘子里取出所有成年动物。
注意：留在盘子上的任何成年动物将继续产卵，导致种群不同步。 - 将卵置于15°C下约5天或20°C下约4天，以达到第1天成年期。
2. 测量秀丽隐杆线虫的寿命
- 标准使用寿命
- 通过用100μL所选细菌接种板来制备NGM琼脂平板。为了保持一致性，请确保在所有重复中使用相同的细菌。由于蠕虫在成年期的产卵阶段每天移动，因此在生命周期内播种五到七组NGM琼脂平板，每个菌株两到四个板将动物生长到成年期（即，如果使用8个15只动物的板，则需要在每个条件下播种40-56个板）。
- 让盘子干燥过夜后再储存。
注意：建议将板储存在4°C，并且每天从冷库中取出所需数量的板，以防止细菌形成厚厚的草坪，使移动/计算寿命变得困难。确保在电镀蠕虫之前加热板。 - 使用步骤1.3和1.4中描述的标准漂白测定法收集 秀丽隐杆线虫 的同步群体。
- 将10-15天1成年动物移动到每个8-12个盘子上。对于标准寿命，从~120只动物开始，以确保样本量在审查事件发生后不会下降到100以下（例如，15只动物的8个板= 120个动物，12个10个动物的12个板= 120个动物）。
注意：在目前的病例中，对于大多数研究人员来说，10-15只动物是一个可控的数字，尽管六盘20只动物也可以降低消耗品的成本。 - 在最初的7-8天或直到后代不再可见，每1-2天将成年动物移离其后代。
注意：动物可以每隔一天移动一次以保存材料，但必须注意确保卵/幼虫动物不会与成虫一起转移，以防止成虫与后代一起污染。在这项研究中，最简单的方法是每天从产卵量达到最大值的第1-3天移动动物，然后在产卵最少的第5-8天切换到每隔一天移动一次动物。使用这种方法，在第1-3天防止卵/幼虫动物的转移并不是必须的，因为成虫每天都会移动，卵/幼虫不能在1天内发育到成年期。 - 在动物停止产生后代后，每隔一天对寿命进行评分，直到所有动物都被计为死亡或被审查。从盘子中取出所有死亡或被审查的动物，以避免混淆和叙述同一只动物。
注意：死亡被计为动物，当用镐头轻轻触摸时，它们不会表现出任何动作。审查被计为袋装的动物，表现出外阴/肠道突起，或爬到干燥的板的侧面。
- 使用 FUDR 进行化学灭菌的使用寿命
- 通过用100μL所选细菌接种板来制备NGM琼脂平板。为了保持一致性，请确保在所有重复中使用相同的细菌。每个菌株播种8-12个板用于寿命实验，每个菌株播种2-4个板以将动物生长到成年期。让盘子干燥过夜。
- 将100μL10mg / mL FUDR加入细菌草坪中间，用于8-12个板，用于寿命测定。记住要留下两到四个没有FUDR的盘子作为起始板，让动物长大成人。让盘子干燥过夜。
注意：FUDR会阻断DNA合成，因此建议在处理时戴手套。 - 使用步骤1.3和1.4中描述的标准漂白测定法收集 秀丽隐杆线虫 的同步群体。
注意：这些动物需要在没有FUDR的盘子上生长，因为FUDR会导致动物被捕/死亡。 - 将10-15天1成年动物移动到8-12个含有FUDR的盘子上。对于标准寿命，从~120只动物开始，以确保样本量在审查事件发生后不会下降到100以下（例如，15只动物的8个板= 120个动物，12个10个动物的12个板= 120个动物）。
注意：如果必须完全避免后代形成，动物也可以在L4阶段移动到FUDR上，但动物不能过早移动，因为这会导致动物面临更高的外阴/肠道突起风险，并会增加审查。 - 每隔一天对寿命进行评分，直到所有动物都被记为死亡或被审查。从盘子中取出所有死亡或被审查的动物，以避免混淆和叙述同一只动物。
注意：对于FUDR寿命，任何后代都可以被忽略，因为它们会在L1阶段被捕并最终死亡。
- 使用温度敏感型无菌突变体的寿命
- 通过用100μL所选细菌接种板来制备NGM琼脂平板。为了保持一致性，请确保在所有重复中使用相同的细菌。每个菌株播种8-12个板用于寿命实验，每个菌株2-4个板用于将动物生长到成年。让盘子干燥过夜。
- 使用步骤1.3和1.4中描述的标准漂白测定法收集 秀丽隐杆线虫 的同步群体。请记住在25°C的限制性温度下生长动物，以确保动物不育。
- 将10-15天1成年动物移动到每个8-12个盘子上。对于标准寿命，从~120只动物开始，以确保样本量在审查事件发生后不会下降到100以下（例如，15只动物的8个板= 120个动物，12个10个动物的12个板= 120个动物）。
- 每隔一天对寿命进行评分，直到所有动物都被记为死亡或被审查。从盘子中取出所有死亡或被审查的动物，以避免混淆和叙述同一只动物。
注意：在处理短寿命应变时，建议每天对寿命进行评分，因为在25°C下的寿命要短得多，因此动态范围有限。根据作者的经验，动物可以在第2天后移回20°C，如果最好在20°C下得分寿命，动物将保持不育状态。
3. 测量秀丽隐杆线虫的健康寿命
- 通过撞击测量运动行为
- 使用步骤1.3和1.4中描述的标准漂白测定法收集 秀丽隐杆线虫 的同步群体。
- 将第1天成虫的小菌落移动到解剖镜下的NGM-琼脂平板上，到10-20μLM9溶液上。建议将10-15只动物作为可管理的动物数量来计数。
- 一次聚焦一条蠕虫，计算样本在15秒内从凹形变为凸形的次数。使用手动计数器和计时器，以便在测定期间将焦点放在蠕虫上。
注意：可以录制板的视频，以便进行更彻底/更轻松的分析。例如，大多数智能手机和数码相机（15-30美元）都可以使用标准显微镜目镜附件，这些都是以低成本进行视频打击的绝佳选择。 - 对液体中的其他蠕虫重复步骤3.1.3，平均10-15个蠕虫的总运动速率。对于较高的样本数量，请重复步骤 3.1.2-3.1.4。
- 将蠕虫老化到所需的年龄。步骤2.1-2.3中描述的类似的寿命测定方法可用于老化蠕虫。重复步骤3.1.2-3.1.4以测定所需年龄的暴击。
注意：步骤3.1.2的替代方法是将〜30μL或更多的M9溶液加入板上的一组蠕虫上。这将节省手动转移蠕虫的时间，尽管由于蠕虫在单个板上的位置随机发生，因此不能保证一组蠕虫将保持在板上的单个点。
- 秀丽隐杆线虫繁殖力（卵数）的测量
- 使用步骤1.3和1.4中描述的标准漂白测定法收集 秀丽隐杆线虫 的同步群体。卵子计数的测定从L4阶段开始，即第1天成年期前约1天（L1被捕后在15°C下约3天或在20°C下约2天）。
- 将L4蠕虫单挑到单独的NGM琼脂平板上，接种有选择的细菌。建议使用约10-15只动物进行繁殖力测定。
注意：建议将所选细菌稀释50%（即，不是饱和培养物），以提高鸡蛋在细菌草坪中的可见度。 - 让动物在20°C下生长过夜。 确保新播种的一批盘子已准备好第二天。
- 在成年期的第1天，将成虫转移到接种有所选稀释细菌的新鲜NGM琼脂平板上。
注意：建议使用新鲜播种的板，或将板储存在4°C直至使用，以防止厚厚的细菌草坪。 - 计算每个NGM琼脂平板上产卵的总数。
注意：为了帮助扫描板，可以在板的盖子上绘制一个网格，并将其放置在正在划定鸡蛋的板下方。然后可以沿着网格线扫描板，以保持板移动时的方向，并防止任何鸡蛋的重计数。 - 重复步骤3.2.4-3.2.57-8天或直到鸡蛋在盘子上不再可见。
注意：对于产卵率高的第1-3天，建议至少每12小时移动一次动物，并每天测定两次卵计数。然而，这增加了消耗品的工作量和成本，因此移动动物和测量可以限制为每天一次，但必须注意确保所有卵和孵化的动物都正确计数。出于该测定的目的，任何孵化的动物都算作卵。
- 测量秀丽隐杆线虫后代的育雏大小（发育）
- 使用步骤1.3和1.4中描述的标准漂白测定法收集 秀丽隐杆线虫 的同步群体。育雏大小的测定从L4阶段开始，即成年期第1天前约1天（L1停滞后在15°C下约3天或在20°C下约2天）。
- 将L4蠕虫单挑到单独的NGM琼脂平板上，接种有选择的细菌。建议使用约10-15只动物进行繁殖力测定。
- 让动物在20°C下生长过夜。 确保新播种的一批盘子已准备好第二天。
- 在成年期的第1天，将成虫转移到接种有所选细菌的新鲜NGM琼脂平板上。
- 每12-24小时（每天2次或每天1次），将成虫转移到用所选细菌播种7-8天的新鲜NGM琼脂平板上或直到后代不再可见。将所有装有鸡蛋的盘子保持在20°C。
- 重复步骤3.3.57-8天或直到后代不再可见。将所有装有鸡蛋的盘子保持在20°C。
注意：后代板也可以储存在15°C，以延长需要评分之前的时间。 - 转移蠕虫两天后，在板上计数发育的后代。在L4阶段（即在20°C下孵化后2天）或更早地计数发育中的蠕虫，以确保F2生成（即后代的后代）不会混淆结果。数一数所有活着的蠕虫。
- 在计数时从板中取出所有蠕虫。在再次对板进行评分之前，将板再维护1-2天，以确保不会错过任何孵化/发育延迟的动物。
- 对收集的每个蛋底板重复步骤3.3.7。
注意：育雏尺寸测定可以与卵计数测定（步骤3.2）一起进行，通过从一个实验中收集两组数据，最大限度地减少劳动力和消耗品成本。这也将允许直接比较同一动物内的育雏大小和卵数。
4. 测量秀丽隐杆线虫的应力弹性
- 使用尤尼卡霉素测量ER应激敏感性
- 通过将含有长尾草霉素的板（参见步骤1.1.7，注）与100μL所选细菌的接种板来制备NGM琼脂平板。
注意：处理长春霉素时应戴手套。 - 为了保持一致性，请确保在所有重复中使用相同的细菌。每个菌株播种8-12个表尼卡霉素板用于生存测定，每个菌株2-4个没有长尼卡霉素的板，用于将动物生长到成年期。让盘子干燥过夜。
- 使用步骤1.3和1.4中描述的标准漂白测定法收集 秀丽隐杆线虫 的同步群体。
注意：动物必须在没有长春花霉素的培养皿上生长，直到成年期的第1天，因为动物会因长尼卡霉素而被捕/死亡。 - 将10-15天1成年动物移动到每个8-12个盘子上。对于标准生存测定，从~120只动物开始，以确保样本量在审查事件发生后不会下降到100以下（例如，15只动物的8个板= 120个动物，12个10个动物的12个板= 120个动物）。
注意：与FUDR测定类似，长尼卡霉素存活测定可以在不移动动物的情况下进行，因为长尼卡霉素会导致L1动物死亡/停滞。然而，当进行DMSO对照时，后代将在DMSO板上发育，因此动物需要每天移动或需要灭菌技术（第2节中用于寿命的相同方法可用于生存测定）。 - 生存测定的评分与寿命相似。从盘子中取出所有死亡或被审查的动物，以避免混淆和叙述同一只动物。
注意：虽然可以每隔一天对动物进行一次评分，但由于长春霉素死亡迅速发生，因此建议每天对生存测定进行评分。
- 通过将含有长尾草霉素的板（参见步骤1.1.7，注）与100μL所选细菌的接种板来制备NGM琼脂平板。
- 使用百草枯测量线粒体/氧化应激敏感性
- 通过播种含有百草枯的板来制备NGM琼脂平板（见步骤1.1.7;注）含有 100 μL 自选细菌。
注意：处理百草枯时应戴上手套，因为百草枯会对环境造成危害。请与机构的环境健康和安全部门核实丢弃要求，因为许多研究机构将要求对环境危害进行特定的丢弃说明。 - 为了保持一致性，请确保在所有重复中使用相同的细菌。每个菌株播种 8-12 个板用于生存测定，每个菌株播种 2 到 4 个不含百草枯的板，用于将动物生长到成年期。让盘子干燥过夜。
- 使用步骤1.3和1.4中描述的标准漂白测定法收集 秀丽隐杆线虫 的同步群体。
注意：切记在不含百草枯的盘子上生长动物，直到成年期的第 1 天。然而，有必要采用绝育技术或让成虫远离后代，因为有些动物可以在百草枯板上发育到成年期（参见步骤 2.2-2.3）。 - 将10-15天1成年动物移动到每个8-12个盘子上。对于标准生存测定，从~120只动物开始，以确保样本量在审查事件发生后不会下降到100以下（例如，15只动物的8个板= 120个动物，12个10个动物的12个板= 120个动物）。
- 生存测定的评分与寿命相似。从盘子中取出所有死亡或被审查的动物，以避免混淆和叙述同一只动物。
注意：虽然可以每隔一天对动物进行一次评分，但由于使用百草枯会迅速死亡，因此建议每天对生存检测结果进行评分。当使用在25°C下生长的 glp-4（bn2） 动物时尤其如此，因为死亡将非常迅速地发生。
- 通过播种含有百草枯的板来制备NGM琼脂平板（见步骤1.1.7;注）含有 100 μL 自选细菌。
- 使用高温测量热应力敏感性（耐热性）
- 使用步骤1.3和1.4中描述的标准漂白测定法收集 秀丽隐杆线虫 的同步群体。
- 通过将板放入37°C培养箱中至少1小时，将动物移动到板上之前，将NGM琼脂板预热至37°C。
- 将10-15天1成年动物移动到四到六个预热的盘子上。对于标准耐热性，从~60只动物开始（例如，15只动物的4个板= 60个动物，10个动物的6个板= 60个动物）
- 将动物放入37°C培养箱中，每2小时进行死亡评分。死亡被定义为在用镐头轻轻触摸时不表现出任何运动的动物。从盘子中取出所有死亡或被审查的动物，以避免混淆和叙述同一只动物。
- 确保在尽可能短的时间内从37°C培养箱中取出板，因为在划线时长时间在环境温度下放置的板会改变耐热性结果。
注意：建议一次只拉出一个菌株进行评分，因为琼脂的温度在对一个菌株进行评分所需的时间内不会发生巨大变化。 - 中值耐热性通常在7-9小时内完成;因此，确保在7小时，9小时和11小时进行适当的测定。
注意：虽然可以跳过1-5小时，但由于培养箱的可变性，板的厚度以及每个实验室中的其他混杂因素，如果计划跳过时间点，则在每个实验室中仔细滴定时间非常重要。有关耐热性的完整指南，请参见参考文献 44 。 - 或者，在34°C而不是37°C下进行耐热性测定。
注意：34°C时的中值耐热性发生得很晚（本研究中为10-14小时），这允许在深夜（置于34°C培养箱中）制备耐热性测定，并在第二天早些时候开始评分。这允许约8小时的持续评分，而不是37°C耐热性测定所需的典型12小时周期。
Representative Results
秀丽隐杆线虫 是衰老研究的优秀模式生物，因为绝大多数衰老机制都与人类一起保守。重要的是，它们的维护和实验成本非常低，对设备和消耗品的要求最低，使其成为资金有限的机构梦寐以求的模型系统。此外，大量具有浅学习曲线的简单检测方法使它们成为即使是经验很少或没有经验的最年轻研究者的绝佳系统。所有这些因素与 秀丽隐杆线虫 的强大遗传学相结合，包括易于基因组编辑，数千种可用的突变体和转基因动物，以及用于基因敲低几乎每个基因的可用RNAi文库，使它们成为本科机构的理想系统。在这里，研究了一些研究 秀丽隐杆线虫 衰老成本最低的方法，主要集中在设备和消耗成本最低以及学习曲线较浅的测定上。事实上，整个协议和数据收集都是由具有<5个月研究经验的初级研究人员编写/执行的，其中大多数是本科生。
秀丽隐杆线虫的长寿研究非常简单，因为动物的寿命很短，从14-20天不等。重要的是，寿命测定是高度标准化的，只需要培养箱，标准解剖显微镜，标准蠕虫蚯和用于制备NGM琼脂平板的耗材。也许秀丽隐杆线虫寿命测量中成本最高的方面是需要消耗品。这是因为秀丽隐杆线虫是自我受精的雌雄同体;因此，需要每天将正在跟踪的长寿测定的成年人从后代中移开。然而，可以通过将动物暴露于FUDR或使用突变体（例如在禁止性25°C下生长的无温度敏感种的无种系glp-4（bn2）突变体）来对动物进行灭菌，以减少所需的消耗品量30，31，32。在这里，使用FUDR或glp-4（bn2）无种系突变体进行寿命测定，其结果与在非无菌动物上进行的标准寿命相似。虽然由于FUDR45或25°C下生长对寿命2的影响，野生型寿命并不相同，但短寿命的hsf-1敲低动物可靠地显示出所有条件下寿命的显着降低（图1）。hsf-1编码热冲击因子-1转录因子，其参与热应激反应的调节，其敲低导致寿命显着缩短38，46。
虽然长寿是衰老生物学中需要考虑的重要因素，但通常，长寿与健康状况的增加无关，即使在 秀丽隐杆线虫47中也是如此。因此，作为一种补充方法，我们提供几种测量生物体健康的方法，包括生殖健康，运动行为和压力弹性。生殖健康可以通过以下两种方式之一来衡量。首先，卵子数量的测量将直接测量单个自受精雌雄同体产下多少个卵子。然而，由于动物产生的卵母细胞比精子多，因此一些永远不会产生可存活后代的未受精卵也产下了48个。因此，为了更好地了解动物的真实繁殖能力，对育雏大小的测量可以衡量产生多少个可行的后代。通常，增加的压力弹性实际上会降低生殖能力，这可能是由于感知到的压力对生殖的固有影响49。同样，与野生型对照组相比， hsf-1 过表达动物的产卵数量和育雏大小均显着减少（图2A，B）。事实上，一些 hsf-1 过表达动物表现出完全不育，这证明生殖健康可以与长寿成反比。
虽然生殖健康对于了解种系健康，功能性减数分裂和生殖能力很重要，但一般来说，寿命与育雏大小50之间没有直接的相关性。因此，作为一种补充方法，运动行为被作为测定 秀丽隐杆线虫 在衰老期间健康状况的金标准方法51。有许多方法可以测量运动行为，但大多数方法都需要复杂的相机，跟踪软件或昂贵的化学品。相比之下，除标准 秀丽隐杆线虫 实验室配备的设备外，粉碎测定几乎不需要任何设备：解剖显微镜，蠕虫拾取，移液器和用于制造NGM琼脂平板的消耗品。殴打率为测量衰老期间的健康状况提供了一种可靠的方法，其衡量标准是与年轻动物相比，老年动物的殴打显着减少（图2C）。
最后，生存到压力测定是弹性的另一种生理测量。在衰老过程中，激活压力反应的能力通常会下降，使动物的弹性降低，对压力更敏感。因此，压力恢复能力可以用作生物体健康的可靠代理。这里提供了用于调查对1）ER应激响应于长霉素暴露的敏感性的方法，后者是一种阻断N连锁糖基化并导致ER中错误折叠蛋白质积累的化学试剂;2） 通过暴露于百草枯（一种诱导线粒体中形成超氧化物的化学试剂）而引起的线粒体/氧化应激;3）暴露于高温引起的热应力。对于长春霉素和百草枯检测，在平板生产过程中将药物掺入NGM-琼脂平板中。对于高浓度的地尼卡霉素，后代通常不会发展，因此不需要使用灭菌技术。这里提出的方案建议25ng / μL作为地卡霉素的最终浓度，但对于资金有限的人，10ng / μL也显示出存活率显着降低（图3A）。这两种浓度都限制了后代的发育，因此不需要灭菌方法，尽管DMSO控制将需要灭菌技术或将动物移动到新板上。这是因为长春霉素毒性阻止了后代的发育，但DMSO几乎是无毒的，这使得后代在长于长袍霉素时可以充分发育。
对于百草枯检测，需要使用灭菌技术或动物移动，因为百草枯处理不会阻止后代发育到成年期。高浓度的百草枯（4 mM）会显著缩短使用寿命，而低含量的百草枯（0.25 mM）会因杀虫作用而延长使用寿命（图 3B），这与之前公布的结果一致 52。最后，耐热性测定只需要一个可以达到30-37°C的培养箱，不需要额外的试剂。 hsf-1 的过表达增加了37°C时的耐热性（图3C），如前所述53。然而，正如其他人之前和现在的数据所表明的那样，耐热性测定的主要问题是它们的可变性。许多因素都可能导致耐热性测定的可变性，包括培养箱之间的差异以及动物在培养箱外花费的时间，同时每小时对耐热性进行评分。有关耐热性的完整指南，请参阅参考文献 41。
图1：有灭菌和没有灭菌的寿命测量的比较（A）在20°C下在用空载体（ev）或hsf-1 RNAi细菌接种的NGM-琼脂平板上生长的野生型N2线虫的寿命。 动物在成年后的第1天，第3天，第5天和第7天被移走。（B）在20°C下在接种空载体（ev）或hsf-1 RNAi细菌的NGM-琼脂-FUDR平板上生长的野生型N2线虫的寿命。 动物在标准ev或hsf-1 RNAi板上生长到成年期，然后在成年期的第1天移动到FUDR板中。（C）在25°C下用空载体（ev）或hsf-1 RNAi接种的NGM琼脂平板上生长的glp-4（bn2）突变动物的寿命。 对于所有情况，每2天对动物进行一次死亡评分，直到所有动物都被记录为死亡或被审查。外阴袋袋，突出或爆炸的动物，或爬到盘子侧面并干燥的动物受到审查。所有统计都是使用对数秩壁炉架-考克斯测试执行的，可以在表2中找到。请点击此处查看此图的大图。
图2：鸡蛋计数，育雏大小和殴打作为健康跨度的测量 （A）对在第1天（蓝色），第4天（红色）和第9天（绿色）动物在25°C下用空载体接种的NGM-琼脂平板上生长的ggm-4（ bn2 ）突变动物进行捣碎测定。在NGM琼脂平板上放入M9溶液的动物中对击打进行评分，使用安装在标准解剖镜目镜上的标准智能手机摄像头录制视频，并以慢动作进行击打以确保准确性。n = 每个条件15只动物。（B）在野生型N2（蓝色）和 sur-5p：：hsf-1 （红色）动物中测量卵计数。将动物在20°C下生长并移动到新鲜盘子上，每12小时计数一次卵。将产卵总数相加。n = 7 只动物用于野生型，9 只动物用于 sur-5p：：hsf-1。（C）在与（B）相同的动物上测量育雏测定，其中卵在20°C下生长2天以允许孵化，并对所有孵化的卵进行计数。= p < 0.001，使用非参数曼-惠特尼检验计算得出。每个点代表一只动物，线代表中位数和四分位间距。 请点击此处查看此图的大图。
图3：压力恢复力作为生物体健康的代理（A）在20°C下在空载体RNAi细菌上生长的N2动物的生存测定。 将动物移至含有1%DMSO，10ng / μL长霉素（TM）或25ng / μL TM的板中，在成年期的第1天。（B）在20°C下对生长在空载体RNAi细菌上的N2动物进行存活测定。 动物从孵化场开始，在含有水、0.25 mM 百草枯 （PQ） 或 4 mM PQ 的盘子上生长。对于A-B，每2天对动物进行一次死亡评分，直到所有动物都被记录为死亡或被审查。外阴袋袋，突出或爆炸的动物，或爬到盘子侧面并干燥的动物受到审查。所有统计均使用对数秩曼特尔考克斯测试进行（表2）。（C）野生型N2动物的所有37°C耐热性测定与hsf-1（sur-5p：：hsf-1）过表达的汇总数据。数据表示为在时间= 9 h的耐热性测定时的存活百分比，每条线代表在同一天进行的匹配实验。将动物在20°C的空载体RNAi细菌上生长，并在成年期的第1天移动到37°C进行测定。n = 每个菌株每次重复60只动物。请点击此处查看此图的大图。
| 试剂 | 食谱 | ||
| 漂白剂溶液 | 1.8% （v/v） 次氯酸钠， 0.375 M KOH | ||
| 羧苄青霉素 | 100毫克/毫升储备溶液（1000x）在水中。在 4 °C 下储存长达 6 个月，或在 -20 °C 下长期储存 | ||
| 断续器 | 10毫克/毫升水溶液。储存在-20°C。 | ||
| 断续器 | 1 M溶液在水中。 | ||
| 溶血肉汤 （LB） | 在该协议中，使用了商业LB（参见材料表），但所有使用细菌 - 胰蛋白胨，酵母提取物和NaCl的标准LB自制配方都足够了。 | ||
| M9 解决方案 | 22 mM KH2PO4 单碱性， 42.3 mM Na2HPO4， 85.6 mM 氯化钠， 1 mM镁质4 | ||
| 线虫生长培养基 | 1 mM 氯化钙2， 5 微克/毫升胆固醇， 25 mM KPO4 pH 6.0， 1 mM 氯化镁4， 2% 琼脂， 0.25% （w/v） 巴托-胨， 51.3 mM 氯化钠 | ||
| 纳米管抗癌板 | 1 mM 氯化钙2，5 微克/毫升胆固醇，25 毫摩尔 KPO4 pH 6.0，1 mM 氯化镁4，2% 琼脂，0.25% （w/v） 巴托-肽酮，51.3 毫摩尔氯化钠，1 mM IPTG，100 微克/毫升羧苄青霉素/氨苄西林。在4°C的黑暗中储存长达3个月 | ||
| NGM RNAi DMSO | 1 mM 氯化钙2， 5 微克/毫升胆固醇， 25 毫摩尔千步蛋白4 pH 6.0， 1 mM 镁质4， 2% 琼脂， 0.25% （w/v） 巴托-胨蓿， 51.3 mM 氯化钠， 1 mM IPTG， 100 μg/mL 羧苄青霉素/氨苄西林;1% 非均点登录 | ||
| （对照组的尤尼霉素） | |||
| 新三元组 | 1 mM 氯化钙2， 5 微克/毫升胆固醇， 25 毫摩尔千步蛋白4 pH 6.0， 1 mM 镁质4， 2% 琼脂， 0.25% （w/v） 巴托-胨蓿， 51.3 mM 氯化钠， 1 mM IPTG， 100 μg/mL 羧苄青霉素/氨苄西林;1% DMSO， 25 纳克/微升长尼卡霉素 | ||
| 百草枯 | 400 mM溶液在水中 - 应新鲜制备 | ||
| 四环素 | 10毫克/毫升储备溶液（500x）在100%乙醇中。储存在-20°C | ||
| 丘尼霉素 | 2.5毫克/毫升储备溶液，100%DMSO。储存在-80°C长期储存。这是一个100x溶液（25纳克/微升工作溶液） | ||
表 1.实验方案的试剂和培养基配方。
| 对应的图面板 | 菌株， 治疗 | 中位寿命 | # 死亡人数/# 总数 | p 值 （日志排名） |
|
| 1安培 | N2， 载体 RNAi， 20 °C | 17 | 74/120 | -- | |
| N2， 氢氟-1 猪笼草， 20 °C | 11 | 65/120 | <0.001 | ||
| 10 亿 | N2， 载体 RNAi， 模糊不二极管， 20 °C | 19 | 120/120 | -- | |
| N2， HSF-1 RNAI， 20 °C | 11 | 116/120 | <0.001 | ||
| 1氧化碳 | N2， 肾小嗸呤核苷酸-4（十亿2）， 载体 RNAi， 25 °C | 13 | 115/121 | -- | |
| 氮气-4（十亿2）， 25 °C | 4 | 120/120 | < 0.001 | ||
| 2 安培 | N2， 载体 RNAi， 20 °C， 1% 甲基间物质吸附剂 | 19 | 85/120 | -- | |
| N2， 载体 RNAi， 20 °C， 10 纳克/微升缩微霉素 | 15 | 109/120 | <0.001 | ||
| N2， 载体 RNAi， 20 °C， 25 纳克/微升长烟霉素 | 12 | 117/120 | <0.001 | ||
| 20 亿 | N2， 载体 RNAi， 20 °C | 19 | 84/120 | -- | |
| N2， 载体 RNAi， 20 °C， 0.25 mM 百草枯 | 24 | 91/120 | <0.001 | ||
| N2， 载体 RNAi， 20 °C， 4 mM 百草枯 | 6 | 50/120 | <0.001 | ||
表 2.寿命和压力弹性的统计数据。
Discussion
寿命，最简单地定义为生命的持续时间，在大多数生物体中是一个明显的二元现象 - 生物体是活的，或者不是活的。然而，长寿并不总是与生物体的健康相关。例如，线粒体激素模型暴露于线粒体压力显着增加寿命通常是一些寿命最长的动物，但表现出发育迟缓和代谢功能下降37，54。同样，具有过度活跃的内质网应激反应的动物也表现出某些行为和表型，这些行为和表型可能与健康状况下降相关，尽管蛋白质稳态和寿命显着改善36，49。最后，模式生物中的许多长寿范式，包括增加的HSF-1功能55，增加的XBP-1功能56和改变的Foxo信号传导57 都与癌症风险的增加相关，并且无可争辩的是，如果一个生物体不断与癌症和其他健康疾病作斗争，那么延长寿命是没有益处的。因此，长寿不能成为衰老生物学中的独立衡量标准。
因此，健康跨度的概念已成为衰老生物学中一个不断发展的领域。健康跨度，松散地定义为一个人健康的一生时期，比长寿更难确定。然而，与长寿不同，“健康”的概念很复杂，因为对有机体健康有许多不同的读数：在有机体水平上，有肌肉功能/力量，神经元/认知功能，生殖健康等;在细胞水平上有蛋白质稳态，脂质稳态，葡萄糖稳态，代谢等。2014年，衰老生物学家已经明确地描述了衰老的生物学特征，其结构化定义是，它必须是在衰老过程中自然分解的东西，并且可以通过实验改变，使得实验恶化应该加速衰老，实验干预应该减缓衰老。衰老的这九个标志包括基因组不稳定，端粒损耗，表观遗传改变，蛋白质稳态丧失（蛋白平衡），干细胞耗尽，细胞间信号改变，线粒体功能障碍，营养传感失调和细胞衰老58。从那时起，许多研究认为应该包括其他因素，包括细胞外蛋白和全身生理学，如免疫和炎症59。最终，健康跨度的复杂定义要求使用多种不同的方法测量有机体健康。
因此，在本手稿中，提出了多种方法，使用线虫模型 秀丽隐杆线虫来衡量健康跨度的各个方面。我们使用撞击测定法测定运动行为，使用卵数和育雏大小测定生殖健康，以及对压力的敏感性。事实上，运动行为是测量健康跨度的黄金标准方法，因为生物体在51岁衰老期间表现出显着的运动和运动损失。运动行为的丧失可归因于衰老的多个标志，因为 秀丽隐杆线虫 的肌肉功能取决于适当的蛋白平衡60，线粒体功能障碍61和神经元肌肉信号传导62。虽然这份手稿侧重于运动行为的一种测量，但重要的是要注意存在许多其他方法，包括固体琼脂平板上动物的运动性，对触摸的反应51和趋化性测定63。然而，这些方法通常需要更复杂的记录设备，使用蠕虫跟踪软件，或使用昂贵，危险或挥发性化学品，所有这些都可能在某些研究环境中令人望而却步。
此外，卵数和育雏大小的测定被作为测量生殖健康的方法和测量成虫细胞分裂的最简单方法，因为成虫是有丝分裂后，只有生殖细胞和胚胎在成虫64内进行细胞分裂。作为细胞分裂的衡量标准，生殖健康可能与细胞衰老和干细胞衰竭的衰老标志有关。生殖健康可能受到许多因素的影响，包括致病性感染65 或暴露于压力49，尽管生殖健康与长寿之间没有直接的相关性。事实上，一些长寿的动物表现出育雏大小49的显着减少，甚至有可能长寿与育雏大小50之间存在负相关关系。这不是 秀丽隐杆线虫特有的现象，因为早在人类66，伴侣犬67和小鼠68中就观察到了繁殖对长寿的不利影响。尽管如此，我们仍然提供卵子数量和育雏大小作为衡量生殖健康的可靠且低成本的方法，但要注意生殖健康可能与寿命或健康寿命无关。
最后，生存测定作为生物体健康的间接衡量标准。重要的是，细胞应激反应，包括对热应激69和ER应激35的反应在衰老过程中迅速下降，并且与蛋白停止70，71的衰老标志直接相关。相比之下，过度激活的压力反应可以通过促进对压力的恢复力来显着延长寿命35，37，38。虽然本研究侧重于最简单和成本最低的方法，但存在大量针对耐热性41和氧化应激66的应力弹性测定的替代方法，每种方法都需要一套不同的设备和消耗品。除了简单的应激源暴露研究外，还可以根据设备的可及性进行其他生理方法。例如，细胞外通量分析仪可以监测线粒体功能和细胞呼吸73;荧光解剖显微镜将允许测量应激反应激活20的转录报告者;高分辨率复合或共聚焦显微镜可用于测量线粒体74，内质网75，76和肌动蛋白细胞骨架77的荧光探针的细胞器形态。
作为测量寿命的最后一个警示故事，虽然提供了用于对蠕虫进行绝育的化学和遗传方法来显着降低成本，但重要的是要注意，两者都会直接影响寿命。例如，以前曾报道过暴露于FUDR会影响寿命和耐热性45。虽然 glp-4（bn2） 突变体本身对寿命没有任何直接影响，但在25°C下生长是温和的热应激33，34 ，因此可以影响寿命2。还有其他方法可以对 秀丽隐杆线虫进行绝育，包括生长素介导的不育78 或替代的温度敏感精子缺陷突变体79。然而，所有方法都有一些警告，应注意利用每个实验室的科学需求的最低有害测定。长寿研究的最后一个限制是潜在的变异性，这种变异性可能是由于样本量低或仅仅是由于研究者的客观误差而发生的。随着新技术在自动化寿命技术80中诞生，这可以规避，但这些系统同样成本高昂，需要一些工程和计算设备和技能。最终，这里提供的方法集合是一套可靠的工具，可以在几乎任何机构中快速适应和学习，并为衰老生物学提供坚实的基础。
Disclosures
作者声明没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
G.G.由T32AG052374支持，R.H.S.由国家老龄化研究所的R00AG065200支持。我们感谢CGC（由NIH研究基础设施计划办公室资助的P40 OD010440）的菌株。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APEX IPTG | Genesee | 18-242 | for RNAi |
| Bacto Agar | VWR | 90000-764 | for NGM plates |
| Bacto Peptone | VWR | 97064-330 | for NGM plates |
| Calcium chloride dihydrate | VWR | 97061-904 | for NGM plates |
| Carbenicillin | VWR | 76345-522 | for RNAi |
| Cholesterol | VWR | 80057-932 | for NGM plates |
| DMSO | VWR | BDH1115-1LP | solvent for drugs |
| LB Broth | VWR | 95020-778 | for LB |
| Magnesium sulfate heptahydrate | VWR | 97062-132 | for NGM plates, M9 |
| Paraquat | Sigma-Aldrich | 36541 | for oxidative/mitochondrial stress |
| Potassium Chloride | VWR | 97061-566 | for bleach soluton |
| Potassium phosphate dibasic | VWR | EM-PX1570-2 | for NGM plates |
| Potassium phosphate monobasic | VWR | EM-PX1565-5 | for M9 |
| S7E Dissecting Scope | Leica | 10450840 | Standard dissecting microscope |
| Sodium Chloride | VWR | EM-SX0420-5 | for NGM plates, M9 |
| Sodium hypochlorite | VWR | RC7495.7-32 | for bleach solution |
| Sodium phosphate dibasic | VWR | 71003-472 | for M9 |
| Tetracycline hydrochloride | VWR | 97061-638 | for RNAi |
| Tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765-50MG | for ER stress |
References
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