Summary
Denne protokollen beskriver den påfølgende implantasjonen av en osmotisk pumpe for å indusere abdominal aortaaneurisme ved angiotensin II-frigjøring i apolipoprotein E (ApoE) mangelfulle mus og av en vaskulær tilgangsport med et jugulært venekateter for gjentatt legemiddelbehandling. Overvåking av aneurismeutvikling ved 3D-ultralyd utføres effektivt til tross for dorsale implantater.
Abstract
Siden farmasøytiske behandlingsalternativer mangler i den kliniske behandlingen av abdominal aortaaneurisme (AAA), brukes dyremodeller, spesielt musemodeller, for å fremme forståelsen av sykdomspatogenesen og for å identifisere potensielle terapeutiske mål. Testing av nye legemiddelkandidater for å blokkere AAA-vekst i disse modellene krever vanligvis gjentatt legemiddeladministrasjon i løpet av forsøket. Her beskriver vi en kompilert protokoll for AAA-induksjon, innsetting av intravenøst kateter for å muliggjøre langvarig behandling og seriell AAA-monitorering ved 3D-ultralyd. Aneurysmer induseres i apolipoprotein E (ApoE) mangelfulle mus ved angiotensin II-frigjøring over 28 dager fra osmotiske minipumper implantert subkutant i musen tilbake. Deretter utføres den kirurgiske prosedyren for ekstern jugularvenekateterisering for å muliggjøre daglig intravenøs legemiddelbehandling eller gjentatt blodprøvetaking via en subkutan vaskulær tilgangsknapp. Til tross for de to dorsale implantatene, blir overvåkingen av AAA-utviklingen lett tilrettelagt ved sekvensiell semi-automatisert 3D-ultralydanalyse, som gir omfattende informasjon om utvidelse av aortadiameter og volum og om aneurysmmorfologi, som illustrert ved eksperimentelle eksempler.
Introduction
En abdominal aortaaneurisme (AAA) er en patologisk dilatasjon av et fartøy på grunn av inflammatoriske og vevsdestruktive prosesser i aortaveggen som til slutt kan føre til brudd og pasientdød. Til tross for betydelige prestasjoner i kirurgisk AAA-reparasjon, mangler en konservativ medisinbehandling for å blokkere utviklingen av aneurismeutvidelse og potensielt redusere risikoen for brudd til dags dato. Dyremodeller er utviklet for å belyse utløsere og mediatorer av sykdommen og for å teste nye tilnærminger til terapi. Musemodeller av AAA er mye brukt og dekker de forskjellige observasjonene fra menneskelig vev. På grunn av deres pathomechanistiske forskjeller brukes ofte mer enn én modell for å undersøke den spesielle funksjonen til molekyler / veier eller effekten av potensielle terapeutiske legemidler 1,2. Blant de mest brukte modellene av AAA-induksjon er angiotensin-II (Ang-II) administrasjon i apolipoprotein E-mangelfulle (ApoE KO) mus3, som har mer kronisk patogenese i forhold til modeller som er avhengige av aneurysmdannelse fra en akutt fornærmelse mot aortaveggen 4,5. Dermed synes Ang-II-modellen spesielt egnet for å overvåke sykdomsprogresjon og ble nylig vist å ligne menneskelig AAA-sykdom med hensyn til metabolske og inflammatoriske responser6. Spesielt har Ang-II-modellen ikke bare AAA-utvikling, men også thoraxaneurismedannelse, samt aortadisseksjon med intramural trombusdannelse.
Behandlinger som tar sikte på å målrette utviklingen av allerede etablert AAA i stedet for å forhindre initiering av sykdommen, kan ha høyere translasjonsverdi ettersom pasienter presenterer en eksisterende tilstand som krever behandling 7,8. For et sammenlignbart eksperimentelt design må aortastørrelsen overvåkes før og etter AAA-induksjon for å definere en terskel for sykdomsutvikling og potensielt stratifisere mus i behandlingsgrupper.
Modusen for legemiddeladministrasjon avhenger av opptaket og stabiliteten til det respektive stoffet. Intraperitoneale (i.p.) injeksjoner brukes oftest på grunn av deres brukervennlighet, som ikke krever bedøvelse, og mangelen på injeksjonsvolumbegrensninger9. Farmakokinetikk må imidlertid vurderes ved valg av administrasjonsvei, da substanser som administreres intrap. primært absorberes gjennom leverportalsirkulasjonen og kan gjennomgå levermetabolisme før sirkulasjon nås, noe som kan resultere i varierende plasmakonsentrasjoner avhengig av first pass effekt10. Intravenøs (i.v.) injeksjon gir den høyeste biotilgjengeligheten av stoffer, og utfordringen med repeterende intravenøs tilgang kan omgås ved bruk av katetre og vaskulære tilgangsporter for daglig administrasjon11,12,13. Med hensyn til AAA-innstillingen letter legemiddeldistribusjon i omløp direkte aneurismeeksponering ved definerte konsentrasjoner.
Her beskriver vi en arbeidsflyt for å indusere AAA i Ang-II-musemodellen via subkutan implantasjon av en osmotisk pumpe, for daglig intravenøs medikamentell behandling via en vaskulær tilgangsport koblet til et kateter satt inn i den ytre jugulære venen, samt for overvåking av aneurismestørrelse via 3D-ultralyd14 til tross for tilstedeværelsen av to dorsale implantater.
Protocol
Dyreforsøk ble godkjent av den lokale etiske komiteen og det østerrikske vitenskapsdepartementet (BMWFW-66.009/0355-WF/V/3b/2016), i samsvar med EU-direktivet 2010/63 / EU om beskyttelse av dyr som brukes til vitenskapelige formål og den østerrikske dyreforsøksloven 2012. Humane endepunkter ble satt som følger: tap av ≥15 % kroppsvekt, unngå mat- og/eller vanninntak, redusert aktivitet (hypokinesi) eller dyskinesi, eller langvarig risting, kloring, anstrengt respirasjon eller bøyd holdning til tross for smerte/symptombehandling. Om nødvendig avlives et dyr under dyp anestesi, dvs. en overdosecocktail av ketamin (ca. 100 mg / kg) og xylazin (ca. 5 mg / kg), eller ved cervikal dislokasjon. Ved kirurgiske inngrep benyttes aseptisk teknikk og sterile/rene hansker hele veien.
1. Pumpe implantasjon
- Anestesi
- Hold ApoE mangelfulle mus (B6.129P2-Apoetm1Unc/J) på et normalt kosthold og inkluder helst 12-14 uker gamle hanndyr i forsøkene for å representere den mannlige overvekten ved human sykdom3.
- 1 dag før kirurgi (d-1, pre-OP), klargjør og fyll de osmotiske pumpene med ønsket konsentrasjon av angiotensin II i henhold til musevekt etter produsentens protokoll og inkuber pumpene i saltvann ved 37 °C over natten15.
Eksempel: For en 25 g mus, ved hjelp av osmotiske pumper (se materialtabell) med en leveringshastighet på 1000 ng / kg / min og en pumpehastighet på 0,25 μL / t i 28 dager, oppløs 1,8 mg Ang-II i 300 μL saltvann (6000 ng / μL konsentrasjon for å levere 1500 ng / t Ang-II). Legg oppløsningen med den butte påfyllingsnålen inn i pumpen, og sett deretter inn strømningsmoderatoren for å lukke pumpen. - Plasser musen i anestesikammeret ved 3%-4% isofluran blandet med 2 l / min O2 til bevisstløs. Flytt musen til et oppvarmet bord (37 °C) i utsatt stilling og oppretthold isofluranbedøvelse ved 1,8% -2% gjennom en nesekegle.
- Påfør øye smøremiddel til begge øynene for å forhindre tørrhet.
- Injiser musen med 2,5% buprenorfin i saltvann ved 10 μL / g mus subkutant og kontroller anestesidybden ved en tåklemme.
- Barber et lite område øverst til venstre på musen tilbake over skulderbladet. Påfør 10% (w / v) povidon-jodoppløsning for desinfeksjon av det barberte området.
- Pumpeinnsetting (5-7 min, utført uten mikroskop)
- Kontroller at musen er fullstendig bedøvet av tåklemme og gjør et 1 cm tverrgående snitt i huden på øvre del av ryggen med en skalpell mellom midspinal og venstre scapular linje.
- Hold huden opp med tang og bruk butt, buet saks for å lage en subkutan lomme ved å skyve mot venstre bakre lem. Åpne saksen, trekk den åpnede saksen ut av kuttet og gjenta for å utvide lommen.
- Sett pumpen forsiktig inn i lommen med strømningsmoderatoren mot halen (for å minimere potensiell forstyrrelse av Ang-II-frigjøring av snittstedet).
MERK: Lommen skal ikke bare være bred nok til at pumpen settes inn, men også at huden ikke skal være stram rundt pumpen, og det skal være minst 5 mm mellom pumpen og snittstedet for å muliggjøre optimal sårheling. - Lukk såret med 4-0 absorberbare avbrutte suturer.
- Injiser musen med 10 % glukose i saltvann ved 10 μL/g mus subkutant.
- Påfør povidon-jod sårspray på det lukkede såret og la musen gjenopprette bevisstheten under en varmelampe, og returner den deretter til buret med 7,5 mg piritramid (for utvidet smertebehandling) og 20 ml 5% glukose i 200 ml drikkevann i 3 dager etter operasjonen.
- Sjekk på musene flere ganger om dagen for tegn på smerte eller nød.
MERK: Siden aortabrudd forekommer med en 20% -40% hastighet og hovedsakelig innen de første 3-10 dagene etter operasjonen, må risikoen for langvarig alvorlig smerte eller nød minimeres ved hyppig dyreovervåking. Hovedindikasjonene for overhengende ruptur inkluderer: separasjon fra gruppen, bøyd stilling, nedsatt mobilitet (i omfanget av lammelse av bakre lemmer) og redusert eller ikke-respons under håndtering.
2. Jugular venekateterisering
MERK: Denne kirurgiske prosedyren krever et mikroskop med 8x-10x forstørrelse.
- Ved hjelp av det vaskulære tilgangssystemet (se materialtabellen), klargjør kateteret ved å kutte 3Fr-siden til ønsket lengde (~ 5-7 mm før silikonankeret) og skyve kateteret over 22 G metallkontakten til det vaskulære tilgangssystemet (VAS) med minst 3 mm overlapping. Plasser aluminiumsdekselet på knappen for å beskytte porten.
- Forbered 1-1,5 cm lange 6-0 silkeligaturer.
- Plasser musen i anestesikammeret ved 3%-4% isofluran blandet med 2 l / min O2 til bevisstløs.
- Flytt musen til et oppvarmet bord (37 °C) i en liggende stilling og oppretthold isofluranbedøvelse ved 1,8% -2% gjennom en nesekegle.
- Påfør øye smøremiddel til begge øynene for å forhindre tørrhet.
- Injiser musen med 2,5 % buprenorfin i saltvann ved 10 μL/g mus subkutant.
- Barber pelsen fra høyre side av nakken på ventralsiden og på høyre side av øvre del av ryggen (venstre side vil ha den implanterte osmotiske pumpen).
- Påfør povidon-jodoppløsningen for desinfeksjon av det barberte området.
- Kontroller at musen er fullstendig bedøvet ved tåklemming.
- Jugular vene forberedelse (5-10 min, utført under mikroskopet)
- Lag et 0,5 cm tverrgående supraklavikulært hudinnsnitt på høyre side av nakken over høyre krageben.
- Bruk stump mikrokirurgisk pinsett for å skille bindevev og fett, og utsetter den ytre jugulære venen. Unngå å rive fra hverandre små blodkar i fettet.
- Isoler minst 5 mm av karet, nær brystmusklene.
- Blunt dissekere vev under venen ved hjelp av bøyd mikropinsett og passere gjennom 2-3 av 6-0 ligaturer.
MERK: Hvis noen sidegrener er identifisert i interesseområdet, bør enten ligaturen settes inn for å være kaudal til sidegrenen eller sidegrenen skal ligeres permanent ved å isolere og binde av med en 6-0 ligatur. - Tuck i ligaturene og legg til en dråpe saltvann til stedet.
- Knappimplantasjon (5-7 min, utført uten mikroskop)
- Snu musen og legg den i utsatt stilling; Kontroller anestesidybden ved en tåklemme og påfør povidon-jodoppløsningen for å desinfisere det barberte området.
- Lag et 1 cm sagittal snitt på øvre del av ryggen med en skalpell mellom midspinal og høyre scapular linjer.
- Bruk stump buet saks for å lage en sirkulær lomme bare litt større enn størrelsen på VAS rundt snittstedet ved stump disseksjon.
- Bruk den butte buede saksen til å tunnelere kranialt over høyre skulder mot det ventrale snittet i nakken ved å åpne saksen litt, deretter trekke den åpnede saksen ut og gjenta handlingen når den skyves lenger inn.
MERK: Musen kan slås på venstre side for dette trinnet. - Når tunnelen har nådd ventral snitt, passere gjennom kirurgiske klemmer fra ventral til dorsal snitt.
- Fest 3Fr-enden av kateteret til klemmen og trekk kateteret gjennom tunnelen slik at det er ute av ventralhalssnittet og VAS er på plass ved dorsalsnittet.
- Sett inn VAS kirurgiske filtskive subkutant ved snittet på baksiden.
- Løsne kateteret og skyll med saltvann eller fosfatbufret saltvann uten kalsium og magnesium (PBS-/-), kontroller om patency ved å bruke gaffelenden av håndteringsverktøyet for å fjerne den beskyttende aluminiumshetten, og bruk deretter den magnetiske enden til å holde knappen og injiser med en 1 ml sprøyte festet til den tilsvarende injektoren til væsken lekker fra 1Fr-enden.
MERK: Kateterspyling kan alternativt utføres i trinn 2.1. - Trykk på knappen kaudalt i lommen og lukk huden over filtskiven til VAS, under flensen på VAS, med minst to 4-0 avbrutte suturer kranialt.
MERK: Pass på at det ikke strammes i huden rundt knappen.
- Venekateterisering (7-10 min, utført under mikroskopet)
- Vend musen tilbake til den bakre posisjonen, kontroller anestesidybden med en tåklemme, og legg til en dråpe saltvann til kuttstedet.
- Bind den første ligaturen rundt kateteret og vena jugularis med 2-3 knop så langt kranialt som mulig for å ligate venen og forankre kateteret til utsiden. Flytt den andre ligaturen så nært som mulig til brystmusklene.
- Forkort kateteret til ønsket lengde slik at ~ 3-5 mm av kateteret er i venen ved å kutte med mikrosaks i diagonal vinkel for å skape en skarp ende.
- Pierce et hull i venen ved hjelp av en 27 G nål festet til en 1 ml sprøyte fylt med saltvann ved å trekke på den sikrede kranialligaturen og skyve nålen parallelt med venen.
MERK: Hvis blod fra tilbakestrømning lekker fra venen, bruk en bomullspinne for å påføre trykk til blødningen stopper. - Sett kateteret inn i venen på samme måte ved å trekke på den sikrede kranialligaturen og skyve kateteret inn i venen ved hjelp av den bøyde pinsetten. Skyv kateteret til det er på linje med venen.
- Bind den andre ligaturen over regionen der kateteret settes inn i venen med 2-3 knop og kontroller at det ikke er blodlekkasje. En tredje ligatur og noe av det lokale fettvevet kan brukes til å sikre kateteret i tillegg.
- Klipp av den overskytende enden av begge ligaturene med mikrosaks og tilsett en dråpe saltvann.
- Lukk huden med 4-0 absorberbare avbrutte suturer.
- Injiser musen med 10 % glukose i saltvann ved 10 μL/g mus subkutant.
- Injiser musen med ønsket volum inhibitor eller PBS / saltvann ved å bruke gaffelenden av håndteringsverktøyet for å fjerne den beskyttende aluminiumshetten og deretter den magnetiske enden for å holde knappen og injisere med en 1 ml sprøyte festet til injektoren.
MERK: Forsikre deg om at det ikke er luft eller luftbobler i injeksjonssprøyten ved å trykke på stempelet til en dråpe væske kommer ut før injisering. Oppretthold positivt trykk på stempelet mens du kobler sprøyten med injektoren fra VAS for å forhindre at blod trekkes inn i kateterspissen og forårsaker kateterblokkering. - Påfør en povidon-jod sårspray på det lukkede såret og la musen gjenopprette bevisstheten under en varmelampe, og returner den deretter til buret med 7,5 mg piritramid (for utvidet smertebehandling) og 20 ml 5% glukose i 200 ml drikkevann i 3 dager etter operasjonen.
- Sjekk på musene flere ganger om dagen for tegn på smerte eller nød.
- Daglige injeksjoner (<5 min)
- For daglig injeksjon, plasser musen i anestesikammeret ved 3% -4% isofluran blandet med 2 l / min O 2 til den er bevisstløs og pustefrekvensen er redusert, injiser deretter som i trinn 2.12.10. Kontroller nakken for tegn på hevelse etter injeksjon, noe som indikerer at kateteret ikke lenger er satt inn i venen. Vær også oppmerksom på at injeksjon ikke vil være mulig hvis kateteret er okkludert.
MERK: En injeksjon på 10 μL/g mus 1x per dag tolereres godt av musene.
- For daglig injeksjon, plasser musen i anestesikammeret ved 3% -4% isofluran blandet med 2 l / min O 2 til den er bevisstløs og pustefrekvensen er redusert, injiser deretter som i trinn 2.12.10. Kontroller nakken for tegn på hevelse etter injeksjon, noe som indikerer at kateteret ikke lenger er satt inn i venen. Vær også oppmerksom på at injeksjon ikke vil være mulig hvis kateteret er okkludert.
3.3D ultralyd
- Forbered ultralydbildesystemet, varmebordet og gelvarmeren, fest transduseren til systemet og sett opp over scenen i tverrstilling (dvs. vinkelrett på museryggen).
- Bruk ultralydprogramvaren til å justere innstillingene for å få 30 dB, bildedybde på 9,0 mm og bildebredde på 8,08 mm.
- Plasser musen i anestesikammeret ved 3%-4% isofluran blandet med 2 l / min O2 til bevisstløs. Flytt musen til et oppvarmet bord (37 °C) i liggende stilling og oppretthold isofluranbedøvelse ved 1,8 %-2 % gjennom en nesekjegle.
- Påfør øye smøremiddel til begge øynene for å forhindre tørrhet.
- Barber pelsen på musens mage. Påfør hårfjerningskrem i 1 min om nødvendig, tørk deretter av og rengjør med fuktig gasbind.
- Legg til en dråpe elektrodegel til hver av de fire elektrokardiogramelektrodene (EKG) på scenen og tape museekstremitetene til dem.
- Spred varm ultralydgel på musens underliv og senk senderen for å sette den i kontakt med dyret.
- Identifiser aorta som et sirkulært raskt pulserende fartøy.
MERK: Den nedre vena cava (IVC) vil bli plassert ved siden av aorta, og hvis sonden presses godt ned, vil IVC komprimeres mens aorta forblir stabil. Bekreftelse på at det analyserte fartøyet er aorta i stedet for IVC kan oppnås ved bruk av pulsbølgedoppler (PW-modus), med en vinkel på 65 °. Aorta vil ha høy pulsbølgehastighet. - Finn venstre nyrearterie og undersøk området manuelt opp til 12 mm kranialt for å sikre at det ikke er noen forstyrrelser i interesseområdet (dvs. suprarenal aorta). Gå tilbake til venstre nyrearterie og sett sonden på 6 mm kranialt fra venstre nyrearterie.
MERK: 3D-ultralydet vil registrere den angitte lengden (dvs. 12 mm) som starter halvveis (6 mm) kaudalt fra opprinnelsesstedet og opp den angitte lengden (12 mm) kranialt. Feilsøkingstrinn for interferens inkluderer å trykke litt ned med transduseren, løfte og deretter senke transduseren igjen, bruke mer ultralydgel og vippe vinkelen på scenen. - 3D ultralyd oppkjøp
- Sett respiratorisk gating til 25% forsinkelse og et vindu på 50% og EKG-utløseren (T1) til 50 ms (for å registrere topp systolisk dilatasjon av aorta).
MERK: Respiratorisk gating kan optimaliseres for hvert dyr basert på respirasjonsfrekvensen og innsatsen for å sikre at bevegelsesartefakter fjernes. - Fra 3D-alternativene setter du skanneavstanden til 11,96 mm med en trinnstørrelse på 0,076 mm, noe som resulterer i 157 bilder.
- Programmet vil automatisk anskaffe 157 bilder i ca 1-2 min. Bla gjennom for å se etter bildekvalitet, gjenta hvis subpar, og lagre deretter bildet.
- Sett respiratorisk gating til 25% forsinkelse og et vindu på 50% og EKG-utløseren (T1) til 50 ms (for å registrere topp systolisk dilatasjon av aorta).
- Oppkjøp av 2D-diameter
- Slå av respiratorisk gating- og EKG-utløser, og lokaliser manuelt området med størst diameter i 12 mm-strekningen av suprarenal aorta.
- Skaff deg et B-modusbilde16.
- I tillegg, uten å flytte transduseren, skaff deg et EKV-bilde (EKV) med systemets standardinnstillinger på samme sted.
- Avslutte skanningen
- Tørk ultralydgelen fra magen og returner musen til buret. Overvåk musen til den kommer seg helt.
4. Ultralyd analyse
- Volum analyse
- I analyseprogramvaren åpner du 3D-modusbildet, og under Image Processing-menyen trykker du på Last inn i 3D, som vil kompilere de 157 2D-rammene til et 3D-bilde (dvs. kube).
- I menyen Volummåling velger du Parallelle og rotasjonsmetoder, og deretter viser programvaren 3D-bildet i en enkelt rute.
- Under Volum trykker du på Start og tegner den første konturen rundt aortas indre vegg ved å klikke for å legge til det første punktet, flytte markøren rundt aorta og deretter høyreklikke for å fullføre konturen.
- Hopp over 9-10 bilder (0,75-1 mm), og tegn deretter en annen kontur på samme måte. Gjenta disse trinnene til det siste bildet er nådd. Dette bør resultere i 16-17 konturer.
MERK: Den første og siste rammen må ha konturer tegnet for at riktig volum over 12 mm skal beregnes. - Velg den første konturen fra menyen, og velg Finjuster. Dette vil starte kantdeteksjonsalgoritmen for å passe linjen tett til fartøyets vegg. Flytt punktene på konturen ved å dra dem til en ny posisjon slik at konturen nøyaktig dekker aortas indre veggkant.
MERK: I Ang-II-modellen kan en intramural trombus være til stede. Siden dette er et vanlig trekk ved denne modellen, bør volummåling inkludere tromben. - Finjuster alle konturene, og trykk Fullfør for å lagre analysen. Det beregnede volumet vises nederst til venstre.
- Diameter analyse
MERK: Diametermålinger kan utføres fra indre til indre vegg, ytre til yttervegg eller indre til ytre vegg, men må være konsistente for alle målinger. I Ang-II-modellen kan det imidlertid være en intramural trombus som bør inkluderes i analysen.- Fra 3D-modusbildet: Evaluer de 157 rammene for å identifisere maksimal diameter ved visuell inspeksjon. Deretter velger du Lineær fra Måling-menyen og tegner flere linjer over aorta for å bestemme den største diameteren.
- Fra B-modus eller EKV (EKG-gated kilohertz visualisering) bilde: I cine-sløyfen, identifiser maksimal utvidelse av aorta (ved systole) ved visuell inspeksjon. Deretter velger du Lineær fra Måling-menyen og tegner flere linjer over aorta for å bestemme den største diameteren.
MERK: EKG kan brukes til å bestemme hjertesyklusen, men visuell identifikasjon gir nøyaktige resultater.
Representative Results
Representative resultater viser utvikling og progresjon av suprarenale aneurismer overvåket med ultralyd ved baseline, dag 8 og dag 27 (figur 1A). En trikrom flekk (figur 1B) av dag 27 aorta i figur 1A illustrerer videre morfologien til den dannede aneurismen med veggdisseksjon og intramural trombus. Aortavolum (mm3) ble bestemt over en strekning på 12 mm14, og maksimal aortadiameter ble i tillegg målt fra EKV-bildene. En terskel på 125 % volumvekst fra baseline til dag 8 ble satt for å definere initial utvikling av aneurisme. Basert på data samlet inn over 2 år (2020-2021, n = 157), klarte bare 9% av dyrene ikke å danne en AAA i henhold til denne avskjæringen. Imidlertid opplevde 35 % av musene aortabrudd (thorax eller buk) før kateterimplantasjon på dag 9, noe som resulterte i totalt 56 % av de gjenværende dyrene med etablert AAA-sykdom som kunne stratifiseres i behandlingsgrupper (figur 1C). Merk at blant våre historiske PBS-kontroller (n = 21) utviklet aneurismer i varierende grad (område: 128% -314%, gjennomsnittlig 199% ± 55% SD aortavolumvekst på dag 8). Det er viktig å merke seg at det ble observert en omvendt sammenheng mellom den første ekspansjonen og videre sykdomsprogresjon, dvs. 55 % av raskt progredierende aneurismer (>200 % volumvekst ved dag 8) ikke utviklet seg videre før dag 27, mens 80 % av de andre aneurismene (>125 % og <200 % volumvekst ved dag 8) fortsatte å ekspandere til slutten av eksperimentet (figur 1D).
Som nylig rapportert 14,17, har de beskrevne metodene blitt vellykket etablert, validert og implementert, for eksempel for å dokumentere den terapeutiske effekten av en histon-citrullinasjonshemmer (GSK484, for inhibering av nøytrofil ekstracellulær felledannelse) for å blokkere progresjonen av etablert AAA. ApoE-mangelfulle mus fikk Ang-II ved 1000 ng/kg/min ved subkutant implanterte osmotiske pumper over 28 dager. Dyrene ble stratifisert 1:1 til GSK484 (0,2 μg/g/dag) eller PBS-behandling basert på aortavolumet målt på dag 8 og gjennomgikk prosedyre for jugularvenekateterisering dag 9. Legemiddelinjeksjoner ble utført daglig i et volum på 10 μL / g musevekt til slutten av studien17. Figur 2 viser eksemplariske (n = 2/gruppe) ultralydresultater (tidsforløp med absolutt og relativ volum- eller diameterutvidelse), og viser at GSK484-behandling hemmet AAA-progresjon, mens aneurismene fortsatte å forstørre hos kontrollmus.
Figur 1: AAA-dannelse og progresjon i Ang-II-musemodellen som påvist ved 3D-ultralyd . (A) Suprarenal aorta ble overvåket med 3D ultralyd ved baseline (BL), dag 8 (d8) og dag 27 (d27) etter Ang-II pumpeimplantasjon. Volumet ble målt over en 12 mm strekning av suprarenal aorta (157 rammer) basert på et 3D-rekonstruert bilde. Maksimal aortadiameter ble bestemt fra EKV-bilder. (B) Trikrom flekk av en tverrgående del av dagen 27 aorta etter museofring og orgelsamling. Tilstedeværelsen av en aortadisseksjon er indikert med L1 / L2 (lumen 1 og lumen 2), og den intramurale trombusen er betegnet med * i A og B. (C) Insidensrate for AAA (>125 % vekst i aortavolum fra BL) ved dag 8 og aortabrudd i løpet av de første 9 dagene (thorax eller buk) fra et datasett samlet inn over 2 år (n = 157). (D) Progresjonsfrekvens fra dag 8 til dag 27 av initialt hurtigdannende (>200 % vekst i aortavolum fra BL til dag 8) versus moderat voksende (>125 % og <200 % vekst i aortavolum fra BL til dag 8) aneurismer hos PBS kontrollbehandlede mus (n = 21). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Eksempler på resultater fra hemming av histon-citrullinering for å blokkere AAA-progresjon i Ang-II-modellen ved intravenøs injeksjon av GSK484 eller PBS via vaskulær tilgangsknapp . (A) Aortavolum (mm3) målt over en 12 mm strekning av suprarenal aorta. (B) Beregnet vekst i aortavolum fra baseline (BL = 100 %). (C) Maksimal aortadiameter som bestemt fra EKV-bilder. (D) Beregnet vekst i aortadiameter fra BL. GSK484-data ble hentet fra en tidligere publisert studie17. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Ang-II-modellen er en av de mest brukte musemodellene til AAA på grunn av dens lave tekniske krav og spesielle egenskaper som ligner menneskelig sykdom 3,6. Operasjonstiden er ca. 10 minutter per dyr, og den subkutane pumpeimplantasjonen tolereres godt av musene hvis den subkutane lommen er tilstrekkelig bred og plassert lavt på dyrets rygg, vekk fra snittstedet, for ikke å forstyrre sårheling. Når huden er stram rundt pumpen, kan vevsirritasjon oppstå, noe som kan forårsake betennelse og scabbing og potensielt forstyrre pumpens frigjøringsmekanisme ved osmotisk trykk. Måling av volumet av Ang-II som er igjen i pumpen på tidspunktet for dyreofring, gir innsikt i om Ang-II ble vellykket utgitt i løpet av de 28 dagene.
Ang-II-modellen har nylig blitt foreslått å være godt egnet til å studere aortaaneurisme og disseksjonsprogresjon, da den viser likhet med menneskelige egenskaper hos begge6. Det er viktig at testing av legemiddelkandidater for å blokkere aortautvidelse og påvirke ombygging vil samsvare med dagens kliniske etterspørsel. I vår eksperimentelle setting ble en cutoff for aneurismedannelse definert før behandlingsstart basert på 125 % volumvekst på dag 8 i forhold til baseline, noe som står for den naturlige variasjonen i absolutt aortastørrelse hos mus. Terskelen og tidspunktet ble avledet fra et innledende tidsforløp som bekreftet ødeleggelse av aortaveggen i histologi (data ikke vist) og resulterte i 35 % rupturer og 56 % observerte AAA før kateterimplantasjon. Mens en minimumsgrense for etablert sykdom ble brukt for studieinkludering, ble det senere observert at en høy grad av initial aortautvidelse også kan begrense eksperimentell anvendelighet. Aneurismer som utviklet seg raskt til >200 % volum ved dag 8, vokste ikke videre utover denne størrelsen i 55 % av tilfellene (figur 1D). Dette må tas i betraktning under eksperimentell design og beregning av prøvestørrelse, da det kan maskere behandlingens sanne effekt. En annen fasett av denne modellen er de hyppige aortabruddene (thorax eller abdominal), som forekommer med hastigheter på 20% -40% og for det meste innen de første 10 dagene etter Ang-II-pumpeimplantasjon 3,18,19. Ved å velge behandlingsstart til dag 9 ble det derfor oppnådd en høy frekvens av etablerte aneurismer, og jugularvenekateteriseringen ble i hovedsak utført på mus som var forventet å overleve til slutten av forsøket (bare 3/24 mus i vår historiske kontrollgruppe sprukket etter dag 9), og dermed spare tid, krefter, og kostnad.
Bortsett fra aortabruddene, som utgjør en alvorlig tilstand, ble den samtidige implantasjonen av kateteret med vaskulær tilgangsknapp og den osmotiske pumpen godt tolerert av musene, uten noen merkbar effekt på mobilitet eller atferd etter utvinning fra kirurgi. Prosedyren for jugularvenekateterisering bør ta ca. 30 minutter for trente forskere. Varigheten av eksponering for (isofluran) anestesi bør holdes på et minimum, og dyrets pustehastighet må overvåkes nøye for å forhindre pustedepresjon, noe som kan føre til dødelig utgang hvis det ikke går over20. Blodtap etter punktering av jugularvenen for kateterinnsetting - noe som fører til dyredød hvis det er stort - kan potensielt oppstå når jugularvenen ikke er riktig ligert kranialt eller en sidegren som fôrer inn i det isolerte området av fartøyet ikke er stengt av. I så fall bør trykk med en bomullspinne påføres punkteringsstedet til blodlekkasjen bremser eller stopper, da bør kateterinnsettingen og ligeringen gjøres så raskt som mulig; Et lite stykke av kollagen sår dressing kan midlertidig benyttes for å hjelpe med hemostase.
Kateterpatency er en av de viktigste faktorene, da kateterkobling fra venen eller tilgangsknappen resulterer i feil legemiddellevering der stoffet lekker inn i det subkutane rommet. Etter produsentens anbefaling om minimum 3 mm overlapping mellom kateteret og metallbinderen, ble det bare registrert ett tilfelle av kateterfrakobling på knappesiden (indikert av den injiserte væsken som lekker fra snittstedet ved knappen) over 3 år i denne modellen (2020-2021, n = 73), som ble løst ved å åpne såret og gjenopprette forbindelsen i kirurgi. I tillegg ble det opplevd en kateterpatenssviktrate på rundt 10 % i vår historiske PBS-kontrollgruppe (2/21) på grunn av enten kateterokklusjon (som gjør det umulig å injisere), kateterfrakobling fra venen (indikert ved tilsynelatende hevelse i nakken under injeksjon) eller komplikasjoner med sårtilheling. Disse problemene kan være knyttet til selvpåførte skader, dvs. mus riper eller biter. Spesielt kan narkotikabehandlinger som forstyrrer sårheling øke feilfrekvensen. Feilsøkingstrinn for å forbedre patencyhastigheten inkluderer å øke lengden på kateteret som settes inn i venen, sikre at ligaturer knyttes tett rundt kateteret og venen, og bruke overtrykksteknikken etter produsentens anbefaling, som beskrevet i trinn 2.12.10., mens du injiserer. Kateterpatency bør i tillegg verifiseres på tidspunktet for dyreofring ved disseksjon og visuell inspeksjon under mikroskopet. Merk at det daglige volumet av injisert legemiddeloppløsning må vurderes nøye. Ettersom plasmavolumet regulerer blodtrykket, kan injeksjonsvolumet påvirke AAA-ekspansjonen, og derfor må kontrolldyr motta humbugprosedyren med bærervolum. Basert på vår erfaring (og upubliserte observasjoner), synes en daglig mengde på opptil 250 μL PBS å være godt tolerert. Til slutt, i likhet med pumpeimplantasjonen, kan hudirritasjon oppstå rundt den implanterte vaskulære tilgangsknappen. Hvis betennelse ledsaget av devitalisert eller nekrotisk vev observeres, bør sårdebridement utføres ved å fjerne ikke-levedyktig vev (nekrotisk vev vil ofte skille seg naturlig fra såret), og huden skal sutureres om nødvendig; Hvis betennelse og nekrose er omfattende, må dyrets velferd og humane endepunkter vurderes i henhold til retningslinjene.
Enkel og dobbel dorsal implantasjon av den osmotiske pumpen og / eller VAS forstyrret ikke ultralydsignalet eller med å sikre musen i en passende posisjon på ultralydstrinnet. Den automatiserte anskaffelsen av 157 bilder over 12 mm for å gjengi et 3D-bilde av aorta for volummåling er en enkel og rask prosedyre14, som bare krever at aorta er fri for forstyrrelser over interesseområdet. En fallgruve i denne sammenhengen er å legge for mye trykk med svingeren mens du prøver å fjerne bildet av interferens, noe som kan forstyrre den automatiserte målingen hvis pustefrekvensen påvirkes av kompresjonen av ribbeina når bilder av kranialenden av abdominal aorta registreres. Diameter måles tradisjonelt i bilder som er oppnådd ved hjelp av B-modus av operatøren som manuelt søker etter området med maksimal diameter mens han utfører ultralydanalysen. Et fremskritt på B-modus-bildene er EKV-bildene, som kan løse små aortabevegelser for å produsere et høykvalitets, redusert bilde av den pulserende aorta. Videre kan den maksimale aortadiameteren bestemmes fra de oppkjøpte 3D-rammene, hvor de 157 bildene gir en omfattende oversikt over aorta tatt ved systole (på grunn av den innstilte EKG-utløseren).
Avslutningsvis gir den presenterte kompilerte protokollen en pålitelig og reproduserbar arbeidsflyt for intravenøs legemiddeladministrasjon i en musemodell av Ang-II-indusert AAA og for overvåking av aortastørrelse ved 3D-ultralyd. Tidspunktene for overvåking og drift kan tilpasses de spesifikke behovene, og jugularvenekateteriseringen kan utføres separat for ethvert eksperimentelt oppsett som krever levering av spesifikke stoffer via intravenøse injeksjoner. VAS kan alternativt brukes til gjentatt blodprøvetaking hvis en kateterlåsløsning brukes for å forhindre koagulering. Den beskrevne 3D-ultralydprosedyren kan tilpasses for å måle infrarenal aorta, hvor aneurismer utvikles ved akutt fornærmelse i elastase eller CaCl2-baserte musemodeller av AAA. Mens 3D-ultralydoppkjøp har fordelen av å gi en oversikt over den berørte aortaregionen og aneurysmmorfologien, er bildeoppkjøpet mer tidkrevende og kan derfor være mer kostnadskrevende. En annen begrensning av protokollen som bør anerkjennes, er behovet for at dyrene skal bedøves kort for intravenøse injeksjoner, mens intraperitoneal administrering vanligvis utføres på bevisste mus.
Disclosures
Forfatterne har ingen avsløringer.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke prof. Podesser og prof. Ellmeiers team (Institutt for biomedisinsk forskning og kjernefasilitet for laboratoriedyravl og husdyrhold, Medical University of Vienna) for hjelp i dyreforsøkene. AAA trikromfarging ble vennlig utført av Monika Weiss og prof. Peter Petzelbauer (Institutt for dermatologi, Medical University of Vienna). Dette arbeidet ble støttet av det østerrikske vitenskapsfondet [SFB-prosjekt F 5409-B21]. Marc Bailey er personlig støttet av British Heart Foundation [FS/18/12/33270].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 Polysorb sutures | Covidien | GL-46-MG | Braided absorbable suture CV-23 Taper |
| 6-0 Silk sutures | Ethicon | 639H | PERMA-HAND Silk |
| ALZET 2004 osmotic pumps | DURECT Corp | 298 | Osmotic mini pumps |
| Angiotensin-II | Bachem | 4006473.0100 | Angiotensin II acetate |
| Aquasonic Clear Ultrasound Transmission Gel | Parker Labs | PUSG-0308 | Ultrasound gel |
| Betadona Wound Spray | Mundipharma | Wound disinfectant spray (povidone-iodine spray) | |
| Betaisodona Solution | Mundipharma | 15973 | Wound disinfectant solution (povidone-iodine solution) |
| Catheter for mouse femoral vein/artery | Instech Laboratories Inc | C10PU-MFV1301 | 1 to 3Fr, 10.5 cm, collar @1.2 cm. Fits 22 G |
| Hair removal cream | |||
| Handling tool | Instech Laboratories Inc | VABMG | Handling tool for magnetic mouse Vascular Access Buttons |
| HYLO NIGHT Eye Oinment | URSAPHARM | 538922 | Eye lubricant cream |
| Needles and syringes of various sizes | 1 mL and 5 mL syringes, 27 G and 30 G needles | ||
| Olympus SZ51 Stereo microscope | Olympus Corporation | Dissection and inspection microscope | |
| PinPort injectors | Instech Laboratories Inc | PNP3M-50 | Injector for vascular access button |
| Protective aluminum cap | Instech Laboratories Inc | VABM1C | Protective aluminum cap for magnetic 1 channel mouse VAB |
| Signa Electrode Ultrasound Gel | Parker Labs | PE-1560 | Electrode gel |
| Small electric shaver | |||
| Surigcal and microsurgical equipment | |||
| Suprasorb C | Lohmann & Rauscher | 20482 | Collagen wound dressing |
| Vascular access button (VAB) | Instech Laboratories Inc | VABM1B/22 | Vascular Access Button for mouse, magnetic, 1 channel 22 G, injector |
| Vevo 3100 Imaging System | FUJIFILM VisualSonics Inc | 51073-51 | Ultrasound system |
| Vevo Lab 5.6.1 software | FUJIFILM VisualSonics Inc | Ultrasound analysis software | |
| Vevo MX550D transducer | FUJIFILM VisualSonics Inc | Linear Array Transducer For Vevo 3100 system | |
| Vevo Mouse Handling Table | FUJIFILM VisualSonics Inc | 11436 | Mouse heating, mouse core temperature capture and ECG pads for physiological monitoring |
References
- Busch, A., et al. Translating mouse models of abdominal aortic aneurysm to the translational needs of vascular surgery. JVS-Vascular Science. 2, 219-234 (2021).
- Golledge, J., Krishna, S. M., Wang, Y. Mouse models for abdominal aortic aneurysm. British Journal of Pharmacology. 179 (5), 792-810 (2022).
- Daugherty, A., Manning, M. W., Cassis, L. A. Angiotensin II promotes atherosclerotic lesions and aneurysms in apolipoprotein E-deficient mice. Journal of Clinical Investigation. 105 (11), 1605-1612 (2000).
- Bhamidipati, C. M., et al. Development of a novel murine model of aortic aneurysms using peri-adventitial elastase. Surgery. 152 (2), 238-246 (2012).
- Phillips, E. H., et al. Morphological and biomechanical differences in the elastase and AngII apoE -/- rodent models of abdominal aortic aneurysms. BioMed Research International. 2015, 413189 (2015).
- Gäbel, G., et al. Parallel murine and human aortic wall genomics reveals metabolic reprogramming as key driver of abdominal aortic aneurysm progression. Journal of the American Heart Association. 10 (17), 20231 (2021).
- Phie, J., Thanigaimani, S., Golledge, J. Systematic review and meta-analysis of interventions to slow progression of abdominal aortic aneurysm in mouse models. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (4), 1504-1517 (2021).
- Lu, H. S., Owens, A. P., Liu, B., Daugherty, A. Illuminating the importance of studying interventions on the propagation phase of experimental mouse abdominal aortic aneurysms. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (4), 1518-1520 (2021).
- Al Shoyaib, A., Archie, S. R., Karamyan, V. T. Intraperitoneal route of drug administration: Should it be used in experimental animal studies. Pharmaceutical Research. 37 (1), 1-17 (2020).
- Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).
- Derde, S., et al. Use of a central venous line for fluids, drugs and nutrient administration in a mouse model of critical illness. Journal of Visualized Experiments. (123), e55553 (2017).
- Lu, W., et al. Microsurgical skills of establishing permanent jugular vein cannulation in rats for serial blood sampling of orally administered drug. Journal of Visualized Experiments. (178), e63167 (2021).
- Jespersen, B., Knupp, L., Northcott, C. A. Femoral arterial and venous catheterization for blood sampling, drug administration and conscious blood pressure and heart rate measurements. Journal of Visualized Experiments. (59), e3496 (2012).
- Waduud, M. A., et al. High-frequency three-dimensional lumen volume ultrasound is a sensitive method to detect early aneurysmal change in elastase-induced murine abdominal aortic aneurysm. Aorta. 9 (6), 215-220 (2020).
- Lu, H., et al. Subcutaneous angiotensin II infusion using osmotic pumps induces aortic aneurysms in mice. Journal of Visualized Experiments. (103), e53191 (2015).
- Sawada, H., et al. Ultrasound imaging of the thoracic and abdominal aorta in mice to determine aneurysm dimensions. Journal of Visualized Experiments. (145), e59013 (2019).
- Eilenberg, W., et al. Histone citrullination as a novel biomarker and target to inhibit progression of abdominal aortic aneurysms. Translational Research. 233, 32-46 (2021).
- Saraff, K., Babamusta, F., Cassis, L. A., Daugherty, A. Aortic dissection precedes formation of aneurysms and atherosclerosis in angiotensin II-infused, apolipoprotein E-deficient mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 23 (9), 1621-1626 (2003).
- Trachet, B., Fraga-Silva, R. A., Jacquet, P. A., Stergiopulos, N., Segers, P. Incidence, severity, mortality, and confounding factors for dissecting AAA detection in angiotensin II-infused mice: A meta-analysis. Cardiovascular Research. 108 (1), 159-170 (2015).
- Cesarovic, N., et al. Isoflurane and sevoflurane provide equally effective anaesthesia in laboratory mice. Laboratory Animals. 44 (4), 329-336 (2010).
