Il presente protocollo descrive uno schema generalizzato e facile da implementare per la raccolta di dati a singola particella inclinata in esperimenti crio-EM. Tale procedura è particolarmente utile per ottenere una mappa EM di alta qualità per campioni che soffrono di distorsione di orientamento preferenziale a causa dell'aderenza all'interfaccia aria-acqua.
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Articolo metodologico
Raccolta dati Cryo-EM a singola particella con inclinazione dello stadio utilizzando Leginon
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'analisi a singola particella (SPA) mediante crio-microscopia elettronica (cryo-EM) è ora una tecnica mainstream per la biologia strutturale ad alta risoluzione. La determinazione della struttura da parte della SPA si basa sull'ottenimento di più viste distinte di un oggetto macromolecolare vetrificato all'interno di un sottile strato di ghiaccio. Idealmente, una raccolta di orientamenti di proiezione casuali uniformemente distribuiti equivarrebbe a tutte le possibili viste dell'oggetto, dando origine a ricostruzioni caratterizzate da risoluzione direzionale isotropa. Tuttavia, in realtà, molti campioni soffrono di particelle orientate preferenzialmente che aderiscono all'interfaccia aria-acqua. Ciò porta a distribuzioni di orientamento angolare non uniformi nel set di dati e a campionamenti disomogenei nello spazio di Fourier nella ricostruzione, traducendosi in mappe caratterizzate da risoluzione anisotropa. L'inclinazione dello stadio del campione fornisce una soluzione generalizzabile per superare l'anisotropia di risoluzione in virtù del miglioramento dell'uniformità delle distribuzioni di orientamento, e quindi dell'isotropia del campionamento dello spazio di Fourier. Il presente protocollo descrive una strategia di raccolta dati automatizzata a stadio inclinato utilizzando Leginon, un software per l'acquisizione automatica delle immagini. La procedura è semplice da implementare, non richiede alcuna attrezzatura o software aggiuntivo ed è compatibile con la maggior parte dei microscopi elettronici a trasmissione standard (TEM) utilizzati per l'imaging di macromolecole biologiche.
Introduzione
L'avvento dei rivelatori di elettroni diretti nell'ultimo decennio 1,2,3 ha stimolato un aumento esponenziale del numero di strutture ad alta risoluzione di macromolecole e assemblaggi macromolecolari risolti utilizzando crio-EM 4,5,6 a singola particella. Ci si aspetta che quasi tutte le specie macromolecolari purificate siano suscettibili di determinazione della struttura utilizzando la crio-EM, ad eccezione delle proteine più piccole di dimensioni ~ 10 kDa ....
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Protocollo
1. Preparazione del campione
- Utilizzare griglie contenenti lamina d'oro e supporto griglia d'oro 16 (vedi Tabella dei materiali) perché la raccolta dei dati inclinata può accentuare il movimento indotto dal fascio17.
NOTA: Per il presente studio, i campioni su griglie sono stati vetrificati utilizzando la tecnica manuale di immersione e tamponamento18 in una cella frigorifera umidificata (superiore all'80%) (~4 °C). - Evitare l'uso di griglie contenenti supporto di rame e foglio di carbonio o uno strato continuo di carbonio amorfo a meno che n....
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Risultati
DPS a 0,3 mg/ml è stato utilizzato per dimostrare l'imaging a inclinazioni di 0°, 30° e 60°. I dati provenienti da diversi angoli di inclinazione sono stati raccolti sulla stessa griglia in diverse regioni della griglia. La risoluzione CTF si adatta alle inclinazioni angolari più elevate tendono ad essere più scarse, come nel caso del confronto dei tre set di dati in questo studio. La Figura 4 mostra immagini rappresentative comparative e medie di classificazione 2D. Sebbene la concentrazion.......
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Discussione
L'orientamento preferito delle particelle causato dall'aderenza del campione all'interfaccia aria-acqua è uno degli ultimi principali colli di bottiglia per la determinazione di routine della struttura ad alta risoluzione utilizzando cryo-EM SPA 4,5,6. Lo schema di raccolta dei dati qui presentato fornisce una strategia facile da implementare per migliorare la distribuzione di orientamento delle particelle all'interno di un set .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Bill Anderson, Charles Bowman e Jean-Christophe Ducom (TSRI) per l'aiuto con la microscopia, le installazioni Leginon e l'infrastruttura di trasferimento dati. Ringraziamo anche Gordon Louie (Salk Institute) e Yong Zi Tan (National University of Singapore) per la lettura critica del manoscritto. Ringraziamo Chris Russo (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge) per averci fornito il plasmide per l'espressione della DPS. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del National Institutes of Health degli Stati Uniti (U54AI150472, U54 AI170855 e R01AI136680 a DL), la National Science Foundation (NSF MCB-2048095 a DL), le Hearst Foundations (a DL) e A....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Cryosparc Live v3.1.0+210216 | Structura Biotechnology | ||
| DPS protein | Purification adattato dal protocollo descritto in K.Naydenova et al IUCrJ. 2019 Nov 1; 6(Pt 6): 1086–1098. | ||
| K2 Summit Direct Electron Detector | Gatan | ||
| Leginon suite | software C Suloway et al Journal of Structural Biology 151 (1): pp. 41-60. | ||
| a tuffo manuale | Dispositivo a ghigliottina fatto in casa per la vetrificazione di griglie EM | ||
| Talos Arctica | FEI/Thermo Fisher | ||
| UltrAufoil R1.2/1.3 300 griglie a maglie | Quantifoil | N1-A14nAu30-01 |
Riferimenti
- Campbell, M. G., et al. Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron cryo-microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
- Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution from th....
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Ristampe e permessi
