Summary
Her presenterer vi en protokoll for å isolere kjerner fra hjernen til den kortvarige virveldyrmodellen Nothobranchius furzeri for nedstrøms applikasjoner som enkeltkjerne RNA-sekvensering eller enkeltkjerneanalyse for transposase-tilgjengelig kromatin med sekvensering (ATAC-seq).
Abstract
Å studere hjernens aldring ved enkeltcelleoppløsning i vertebratsystemer er fortsatt utfordrende på grunn av kostnader, tid og tekniske begrensninger. Her demonstrerer vi en protokoll for å generere enkeltkjerne RNA-sekvensering (snRNA-seq) biblioteker fra hjernen til den naturlig kortvarige vertebraten afrikanske turkise killifish Nothobranchius furzeri. Den afrikanske turkise killifish har en levetid på 4-6 måneder og kan plasseres på en kostnadseffektiv måte, og reduserer dermed kostnads- og tidsbarrierer for å studere vertebrat hjerne aldring. Imidlertid er det behov for skreddersydde protokoller for å isolere kjerner av tilstrekkelig kvalitet for nedstrøms enkeltcelleforsøk fra hjernen til ung og eldre fisk. Her demonstrerer vi en empirisk optimalisert protokoll for isolering av høykvalitets kjerner fra hjernen til voksen afrikansk turkis killifish, et kritisk skritt i genereringen av høykvalitets enkeltkjerner omiske biblioteker. Videre viser vi at trinnene for å redusere forurensende bakgrunns-RNA er viktige for å tydelig skille celletyper. Oppsummert demonstrerer denne protokollen muligheten for å studere hjernens aldring i ikke-tradisjonelle vertebratmodellorganismer.
Introduction
Å forstå mekanismene for vertebrat hjerne aldring er avgjørende for å håndtere aldersrelaterte neurodegenerative sykdommer som Alzheimers og demens1. Den afrikanske turkise killifish (Nothobranchus furzeri) er den korteste levde vertebraten som kan avles i fangenskap, og på grunn av sin korte levetid og aldersassosierte kognitive svekkelse, er det en utmerket hjerne aldringsmodell 2,3,4,5. Nylig har adventen av encellede "omics" -teknologier, som enkeltkjerner RNA-seq (snRNA-seq) og enkeltkjerneanalyse for transposase-tilgjengelig kromatin med sekvensering (snATAC-seq), tillatt forskere å forhøre den aldrende hjernen med en enestående oppløsning 6,7,8. Disse metodene er avhengige av kjerneisolering, siden gjenoppretting av hjerneceller som nevroner ofte er for utfordrende til å isolere 6,7,8,9,10. Imidlertid er de fleste publiserte kjerneisolasjonsprotokoller optimalisert for pattedyrmodellorganismer 11,12,13,14,15. Siden det for tiden er et udekket behov for å isolere hjernekjerner i killifish som en kommende ny modellorganisme innen aldringsforskning2, er målet med denne protokollen å etablere en metode for å isolere høykvalitetskjerner fra frosset hjerne killifish vev.
Her etableres en strømlinjeformet og robust arbeidsflyt som bruker allment tilgjengelige materialer for å isolere kjerner av høy kvalitet fra killifish hjerner. Denne protokollen ble modifisert fra en 10x Genomics-protokoll for musehjerner for å imøtekomme hjernene med lavere myelininnhold i afrikanske turkise killifish, skjørheten til frosset vev og behovet for å redusere innholdet av omgivende rusk for sekvenseringsrelaterte applikasjoner16. Faktisk fører tidligere optimaliserte protokoller for pattedyrs hjernevev17,18 til dårlig kjernekvalitet (dvs. overlyse) og / eller høyt ruskinnhold når de brukes på frosne killifish-hjerner, noe som gjør dem uegnet til bruk med snRNA-seq i henhold til anbefalinger for enkeltkjerner RNA-seq ved bruk av mikrofluidikk (supplerende figur 1).
I tillegg til kjerneisolering demonstrerer vi hvordan man vurderer kjernekvalitet og utbytte ved mikroskopi og flowcytometri. Denne artikkelen gir eksempler på både optimale og suboptimale resultater og diskuterer feilsøking. Denne protokollen ble designet og optimalisert for frosne killifish hjerner, men kan også brukes uten store modifikasjoner på nydissekerte killifish prøver. Killifish hjernekjerner isolert ved hjelp av denne metoden er optimalisert for bruk i enkeltkjerne RNA-seq (snRNA-seq) som en nedstrøms applikasjon, men bør også være egnet for bruk i snATAC-seq og bulk ATAC-seq.
Protocol
Dyrepleie og dyreforsøk ble utført i samsvar med University of Southern California IACUC under godkjente protokoller # 21215. For ethvert arbeid som bruker denne protokollen, er det nødvendig å innhente godkjenning fra institusjonens IACUC før man starter et forskningsarbeid på virveldyr.
MERK: En fullstendig gjennomgang av protokollen som starter fra flashfrosset hjernevev (starter fra trinn 3) bør ta ~ 2,5 timer for seks prøver (figur 1).
1. Dissekere killifish hjerner
- Avlive killifish humant ved hjelp av en løsning på 1,5 g/l metanosulfonat/trikain (MS-222) i systemvannet.
- Bruk skarp saks for raskt å halshugge killifish etter at all kropps- og gjellebevegelse har opphørt.
- Disseker det halshuggede hodet på en ren petriskål som tidligere beskrevet19.
- Plasser parabolen under et dissekeringsmikroskop (ved hjelp av et 8x-35x forstørrelsesområde). Vri hodet slik at branchiostegalstrålene er i fokus
- Bruk saks, kutt gjennom dentary slik at branchiostegalstrålene og kraniet blir avslørt.
- Bruk tang, hold nede branchiostegalstrålene på hver side av kraniet. Bruk et annet par tang for å fjerne eventuelle gjenværende vevsfragmenter fra kraniet. Den V-formede optiske chiasmen som forbinder hjernen og øynene skal bli synlig.
- Klipp den optiske chiasmen ved hjelp av saks for å løsne begge øynene fra hjernen. Bruk tang for å forsiktig frigjøre kraniet.
- Snu kraniet over og bruk tang til å skrape muskelen fra dorsalsiden av kraniet.
- Bruk ett par tang for å holde kraniet på plass og et annet par tang for å forsiktig fjerne beinene i kraniet, og avsløre hjernen.
- Hjernen ser hvit og myk ut. Når det er synlig, er det ikke nødvendig å fjerne alle kraniale bein. Fjern hjernen med rene tang ved å løfte og skrape forsiktig.
- Flash fryser hjernen ved å plassere den i et mikrosentrifugerør lagret på tørris.
MERK: Det frosne hjernevevet kan lagres ved -80 °C til alle prøver som skal behandles sammen er samlet inn for å begrense batcheffekter ved behandling for bibliotekgenerering. Mens prøver lagret ved -80 ° C ikke kan lagres på ubestemt tid, har denne protokollen blitt utført på killifish hjerner lagret i opptil 12 måneder uten merkbart fall i kvalitet.
2. Forbered ferske buffere
- Forbered kjernevaskebuffer (2% bovint serumalbumin [BSA] i 1x PBS, fosfatbufret saltvann pH 7,4 og 0,2 U / μL RNasehemmer) og oppbevar på is. Forbered 250 ml kjernevaskebuffer for opptil åtte prøver. For 250 ml, bruk 50 ml 10% BSA-stamløsning, 25 ml av en 10x PBS-lagerløsning, 1,25 ml av 40 U / μL RNase-hemmerlageret, og bring deretter volumet til 250 ml med RNAse-fri ddH2O.
- Forbered kjernelysisbuffer (10 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl 2, 0,01875% v / v NP-40 og0,2 U / μL RNaseinhibitor) og lagre på is. Forbered 10 ml kjernelysebuffer for opptil åtte prøver. For 10 ml, bruk 100 μL av 1 M Tris-HCl pH 7,4 stamløsning, 20 μL 5 M NaCl-stamløsning, 30 μL av 1 M MgCl 2 stamløsning, 18,75 μL av en 10% NP-40 stamløsning, 50 μL av 40 U / μL RNase-hemmerlageret, og bring deretter volumet til 10 ml med RNAse-fri ddH2 O.
3. Isoler kjerner
- Hvis du bruker frosne prøver, tine dem på is i 10 minutter. Hvis du bruker nydissekerte hjerner, gå direkte til trinn 3.2
MERK: Selv om denne protokollen kan fungere på enkelthjerner, vil mindre prøver fra ungfisk (5-6 uker gammel) ha dårligere utbytte. Tilstrekkelig avling kan alltid oppnås ved å behandle to hjerner som en prøve, uavhengig av fiskens alder og kjønn (tabell 1). Denne protokollen har vellykket isolert høykvalitetskjerner fra fisk i alderen 5-26 uker, inkludert dyr fra både GRZ- og ZMZ1001-stammer. Det forventes ingen problemer med å bruke denne protokollen på andre stammer. - Dounce hjernen i 1 ml iskalde kjerner lysis buffer i en 2 ml Dounce homogenisator. Hold homogenisatoren på is og unngå å generere bobler mens du lyser prøven. Dounce med en omtrentlig hastighet på 0,5 s/downstroke og 0,5 s/upstroke med en 180° vridning per syklus. Dounce bruker den løse pestle for 15 slag, eller til vev / lysis buffer blandingen vises homogen hvis ytterligere slag er nødvendig.
MERK: Dounce homogenisatorer skal vaskes, skylles med destillert vann og steriliseres med standard tørre autoklavsteriliseringssykluser mellom bruk.- Dounce bruker den stramme pestle for 30 slag med små pauser, 30 s til 1 min, hver 10 slag. Dounce med en omtrentlig hastighet på 0,5 s/downstroke og 0,5 s/upstroke med en 180° vridning per syklus. La prøven hvile på is i Dounce homogenisatoren i 2 min.
MERK: Denne inkubasjonstiden sikrer tilstrekkelig lysis, men bør forkortes hvis kjernefysisk overlysis observeres.
- Dounce bruker den stramme pestle for 30 slag med små pauser, 30 s til 1 min, hver 10 slag. Dounce med en omtrentlig hastighet på 0,5 s/downstroke og 0,5 s/upstroke med en 180° vridning per syklus. La prøven hvile på is i Dounce homogenisatoren i 2 min.
- Sil prøven gjennom et 70 μm cellefilter til et 15 ml konisk rør forhåndsbelagt i 5% BSA.
- Tilsett 4 ml kjernevaskebuffer i prøven ved å pipettere vaskebufferen over 70 μm cellefilter fra trinn 3.3 og bland forsiktig ved inversjon fem ganger.
MERK: Dette gjør det mulig å gjenopprette kjerner som kan være fanget på filteret og forbedrer utbyttet. - Sentrifuge med en svingbar bøtterotor ved 500 x g, 4 °C, i 10 minutter. Kast supernatanten ved å helles forsiktig i en flytende avfallsbeholder. Sett prøven loddrett og fjern den gjenværende vaskebufferen med en P1000-pipette.
MERK: Kjernepelleten vil sannsynligvis være synlig når du starter fra to hjerner i en prøve. Men når du behandler enkelthjerner fra unge dyr (5-6 uker gamle), forventes et lavere utbytte, og pellets kan ikke alltid være synlige. I dette tilfellet bør supernatanten fjernes forsiktig mens den antar pelletens posisjon i bunnen av røret. - Resuspender umiddelbart kjernene i 1 ml kjernevaskebuffer med en bredboret P1000 pipettespiss.
- Bring prøven til 5 ml ved å tilsette 4 ml kjernevaskebuffer og bland forsiktig ved inversjon fem ganger. Sentrifuge med en svingbar bøtterotor ved 500 x g, 4 °C, i 10 minutter, og kast supernatanten.
- Resuspend kjernene i 1 ml kjernevaskbuffer med en bred borepipettespiss og overfør til et flowcytometri (FACS) rør.
- Tilsett 300 μL fjerning av rusk (Table of Materials) og bland grundig ved pipettering med en bred borespiss til blandingen er homogen.
- Legg forsiktig over 1 ml kjernevaskebuffer på toppen av kjerneoppløsningen fremstilt i trinn 3.9 ved hjelp av en P1000-pipette og hold røret i en liten vinkel (supplerende figur 2). Ruskfjerningsløsningsfraksjonen og kjernevaskebufferfraksjonen skal danne et klart grensesnitt hvis de er lagdelt riktig.
- Sentrifuge i en svingbar bøtterotor ved 3000 x g, 4 °C, i 10 min. Kast de to øverste fasene fullstendig med en P1000-pipette.
MERK: Det klare FACS-røret tillater visualisering av de tre forskjellige fasene etter sentrifugering (topp, interfase, bunn). For å lette maksimal fjerning av rusk, anbefales det å være mer aggressiv enn konservativ når det gjelder å fjerne de to øverste fasene (dvs. å fjerne en liten mengde av bunnfasen er å foretrekke fremfor å overføre noen av de øverste fasene; Supplerende figur 2). I tillegg kan interfaselaget være for tynt til å visualisere. I dette tilfellet fjerner du det øverste (tilsynelatende) laget, som inneholder interfaselaget. Det nederste laget som beholdes, skal inneholde ~ 1 ml totalt volum. - Overfør bunnlaget til et 15 ml konisk rør forhåndsbelagt med 5% BSA.
- I det koniske røret, bring volumet til 15 ml med kjernevaskebuffer og inverter tre ganger for å blande.
- Sentrifuge i en svingbar bøtterotor ved 1000 x g, 4 °C, i 10 min. Fjern supernatanten forsiktig.
- Resuspender umiddelbart i 150 μL kjernevaskebuffer ved hjelp av en bred borepipettespiss.
- Bytt til en standard borepipettespiss satt til ~300 μL. Ta opp hele prøven og fest deretter et 40 μm filter på tuppen til enden av pipettespissen, pass på at prøven ikke fjernes.
MERK: On-tip-filtre er nødvendige for å oppnå mindre volumer, som er nødvendige for å opprettholde tilstrekkelig kjernekonsentrasjon for nedstrøms applikasjoner. For eksempel, for snRNA-seq ved bruk av mikrofluidikk, anbefales en minimumskonsentrasjon på >300 kjerner / μL, selv om det optimale området er 700-1200 kjerner / μL18. Høyere konsentrasjoner av kjerner kan også lett fortynnes om nødvendig. - Filtrer prøven ved å tvinge prøven gjennom filteret inn i et lavt DNA-bindende 1,5 ml mikrosentrifugerør. Det endelige elueringsvolumet skal være 120-150 μL.
MERK: Noe skumming kan skyldes filtrering. Dette ser ikke ut til å påvirke kjernekvaliteten.
4. Vurder kjernekvalitet ved mikroskopi
- I et separat mikrosentrifugerør blandes 10 μL av den filtrerte prøven med 10 μL 0,4% trypanblå løsning ved mild pipettering. Prøver krever ingen utvidet inkubasjonstid og er klare for visualisering umiddelbart etter blanding med trypanblå løsning.
- Innskudd 10 μL av de fargede kjernene i et kammer av et tellekammerglid.
MERK: Alternativt kan du deponere 10 μL av den fargede kjerneprøven på et hemocytometer eller mikroskopi lysbilde og dekke med et deksel. - Vurder kjernekvaliteten ved lysmikroskopi.
MERK: Lavere forstørrelser bør bare brukes til å zoome inn på kjerner, siden kjernefeil bare vil være visuelt synlige ved høyere forstørrelser (dvs. 60x eller høyere). Dette trinnet kan gjøres raskt for å vurdere suksessen til kjernepreparasjon og krever ikke sekundær analyse utover visuell inspeksjon. Intakte kjerner av høy kvalitet vil ha en skarpt definert grense20 (figur 2A). Kjerner av dårlig kvalitet vil ha forstyrret kjernemembraner, flekkvis trypanblå farging nær kjernemembranen som indikerer potensiell nukleinsyrelekkasje, og / eller bevis på blebbing20 (figur 2B). Sunne kjerner forventes å være 10-15 μm i diameter.
5. Kvantifiser singletkjerner, rusk og multipletandel ved flowcytometri
MERK: Den spesifikke terminologien og grensesnittet til flowcytometerprogramvaren kan variere basert på maskinens merke, men disse trinnene bør enkelt tilpasses andre systemer om nødvendig.
- I et FACS-rør resuspenderer du 10 μL av den filtrerte kjerneprøven i 90 μL av bufferen som anbefales for flowcytometri for en fortynning på 1:10. Til dette formål brukes 0,22 μm filtrert sterilisert PBS, pH 7,2, med 2 mM EDTA og 0,5% BSA i denne studien.
MERK: Selv om denne fortynningen vil fungere for de fleste kjernepreps, kan det være nødvendig med en lavere fortynning (f.eks. 1:5) for å prøve nok kjerner for kvalitetsvurdering i tilfelle en prøve med lavere utbytte (dvs. <30 kjerner / μL i den fortynnede prøven). - Flekk prøvene med propidiumjodid (PI) ved en endelig konsentrasjon på 1 μg / ml. Ingen inkubasjonstid er nødvendig, og kjerner kan analyseres umiddelbart.
MERK: Alternativt kan du farge prøvene med en endelig konsentrasjon på 0,1 μg/ml DAPI. Merk at DAPI bør leses på en annen fluorescenskanal enn PI (Vioblue-A V1-A-kanal; eksitasjon ved 405 nm, utslipp ved 450/50 nm). - Analyser prøvene på et flowcytometer som følger:
- Konfigurere et arbeidsområde:
- Ha flowcytometeret i oppkjøpsmodus. Klikk på Fil, og velg deretter Nytt arbeidsområde fra rullegardinmenyen. Under Eksperiment-fanen i panelet til venstre skriver du inn Navn på prosjekt og Eksempel-ID i de respektive feltene.
- Øverst til venstre på verktøylinjen klikker du på Nytt analysevindu-knappen (punkttegneikon). Klikk på boksen med tre plott (Plot 4t) fra hurtigmenyen. Tre tomter vises på skjermen. Klikk på Analysemodus-knappen øverst til venstre på verktøylinjen (A-ikonet) slik at den er grå og ikke oransje.
- Definere analyseplott:
- Endre aksene for de tre plottene som følger, ordnet som henholdsvis X-akse og Y-akse:
Plott 1: X-aksen: FSC-A, Y-aksen: SSC-A
Plott 2: X-akse: HDR-T, Y-akse: SSC-A
Plott 3: X-akse: PerCP-Vio700-A B3-A, Y-akse: SSC-A - Endre aksene ved å klikke på akseetiketten og velge ønsket kanal fra rullegardinmenyen.
- Angi at plottene skal være fargekodet ved å klikke på det firkantede grå "i" -ikonet som vises ved siden av øvre høyre hjørne av hvert plott. Et Egenskaper-vindu åpnes med et panel med knapper til venstre. I vinduet Egenskaper klikker du på Scatterplot-ikonet (andre øverst til venstre i panelet). Klikk på OK.
MERK: PerCP-Vio700-A B3-A fluorescenskanalen tilsvarer en eksitasjon ved 488 nm, og utslipp i området 650-730 nm.
- Endre aksene for de tre plottene som følger, ordnet som henholdsvis X-akse og Y-akse:
- Sett opp instrumentinnstillinger:
- Klikk på kanalfanen i venstre panel. En liste over alle kanaler vises med tre bokser til høyre. Sett B3, FSC-A og SSC-A til Hlog ved å klikke på pil ned på de respektive første boksene til høyre og velge Hlog fra rullegardinmenyen. Sett spenningen til SSC til 640 V, FSC til 300 V og B3 til 480 V ved å skrive inn disse tallene i de respektive midtboksene til høyre og trykke Enter-tasten . Legg merke til at den tredje boksen til høyre er en bryter som kan brukes vekselvis for å skrive.
- Under Trigger-overskriften setter du FSC-utløseren til 4 og SSC- og B3-utløseren til 0 ved å klikke på pil ned, velge dem fra rullegardinmenyen til venstre, skrive inn tallet i boksen til høyre og deretter trykke Enter-tasten . Merk at det er en veksleboks til høyre som kan brukes alternativt til å skrive.
MERK: PMT-spenninger må optimaliseres for hver enkelt flowcytometrimaskin, men utløseren for kjerner må være lavere enn det som vanligvis brukes til celler. Videre bør akseskalaen settes til h-log.
- Skriv inn 100 μL i tekstboksen Eksempelvolum og 50 μL i tekstboksen Opptaksvolum på venstre side av flytprogramvarevinduet. Kontroller at Mix Sample-parameteren er satt til Mix Gentle for å unngå lysing av kjerner på dette trinnet. Trykk på trekanten i en sirkel (Spill av-ikonet ) nederst til høyre for å starte flyten.
- Kontroller flytkvaliteten:
- Bruk sidespredningsområde (SSC-A) versus HDR-T for å se etter luftbobler eller klumper i prøven. Sørg for at dette plottet er et jevnt kontinuum av poeng. Luftbobler eller klumper vil resultere i tomme områder i SSC-A versus HDR-T-plottet.
- Kontroller sidespredningen (SSC-A) versus fremoverspredningen (FSC-A) for å bekrefte at spenningene som brukes er riktige for prøven.
MERK: I motsetning til celler, vil kjerner ikke fullt ut løse fra rusk i en side scatter vs fremover scatter plot. Imidlertid bør det være en klynge av hendelser med høy tetthet mot midten av plottet som tilsvarer kjerner (varmere farget) med en lavere tetthet av hendelser (kjøligere farget) i bakgrunnen som tilsvarer rusk.
- Analyser kjerneantall og kvalitet:
- Dobbeltklikk på plottet SSC-A vs. PerCp-Vio-700A for å få en forstørret visning. Klikk på knappen øverst til venstre med vinkelrette linjer (kvadrant) for å velge en kvadrantport. Klikk deretter hvor som helst i SSC-A vs. PerCp-Vio-700A-plottet , og kvadranter vises inne i plottet.
- Klikk hvor som helst på kvadrantskillelinjene, og skyv markøren for å endre kvadrantplasseringen. Plasser kvadrantene slik at øvre venstre kvadrant inneholder populasjonen lengst til venstre (rusk), og øvre høyre kvadrant inneholder flere dråpeformede klynger (kjerner) (se figur 3 for gateoppsett og eksempler på Flow-resultater for typiske resultater med preps inkludert eller ikke inkludert et ruskfjerningstrinn).
- Rusk versus kjerner teller:
- Klikk på det firkantede grå "i" -ikonet øverst til høyre på plottet for å åpne vinduet Egenskaper . Klikk på kategorien Regionfunksjoner ; Lister over plottregioner og funksjoner vises.
- Under Regioner-listen kontrollerer du en grønn hake ved siden av det øverste elementet, som angir at hele plottet er valgt. Under funksjonslisten klikker du på Antall/μL for å lage en grønn hake. Klikk på OK, og en telling/μL-metrisk vises i hver kvadrant.
- Hvis du vil vise råantall og prosenter, velger du Antall og %-T fra kategorien Områdefunksjoner hvis du vil. Tellingene/μL i øvre venstre og høyre kvadrant korresponderer med henholdsvis rusk og kjerneutbytte.
- Singlet teller:
- Den venstre dråpeformede klyngen i den nedre delen av øvre høyre kvadrant representerer singleter. Tegn en polygonal port rundt denne populasjonen ved å klikke mangekantknappen (Polygon) øverst til venstre på verktøylinjen.
- Klikk én gang, skyv musen for å begynne å tegne, og klikk på nytt for å fullføre et lineært segment av porten og begynne på den neste. Dobbeltklikk for å fullføre porten. Klikk på kanten av porten og skyv musen for å flytte porten.
- Klikk hjørnene på porten for å endre figuren. Tellinger/μL av den inngjerdede populasjonen (singleter) vil vises. Dette er konsentrasjonen av kjernene prep med den første fortynningen.
MERK: Det fremre spredningsområdet versus høyde 1: 1 lineært forhold, som vanligvis brukes til å bestemme singlethastighet når flytende celler, gjelder ikke for kjerner og kan ignoreres.
- Bruk konsentrasjonen av de fortynnede kjernene prep og fortynningsfaktoren, tilbakeberegne konsentrasjonen av den første prep (f.eks. For en 1:10 fortynning, multipliser den observerte konsentrasjonen med 10). Konsentrasjoner fra >300 kjerner/μL er egnet for snRNA-seq.
- Konfigurere et arbeidsområde:
Representative Results
Killifish hjernekjernens isolasjonsprotokoll beskrevet her er optimalisert spesielt for killifish og er oppsummert i figur 1. I tillegg til kjerneutvinning, beskriver protokollen forskjellige metoder for å vurdere kvaliteten og mengden av isolerte kjerner. Figur 2 viser eksempler på både friske (figur 2A) og usunne (figur 2B) kjerner vurdert ved lysmikroskopi. Friske kjerner egnet for nedstrømsanalyse (figur 2A) finnes som singumjerner med intakte membraner. Som vist i figur 2B, er den vanligste feilmodusen for denne protokollen (og andre kjerneisolasjonsprotokoller) genereringen av overlysede kjerner, som er preget av skadede kjernemembraner. Dette fører ofte til at kjerner klumper seg og kan bidra til bakgrunnssignaler i nedstrøms applikasjoner på grunn av lekkasje av nukleinsyrer fra de sprukne kjernene. Hvis det observeres overdreven klumping, anbefaler vi at du er mer forsiktig under dounce-trinnene og / eller reduserer inkubasjonstidene i lysisbufferen.
Denne protokollen bruker flowcytometri for å kvantifisere antall isolerte kjerner og bestemme den relative andelen av multipletkjerner i en prøve. I tillegg kan flowcytometri brukes til å vurdere det relative innholdet av forurensende rusk, ofte sprukne kjernefragmenter og annet cellulært rusk som kan påvirke nedstrømsanalyser i kjerneprøven negativt. Representative flytdata kan ses i figur 3. En høykvalitets kjerneisolasjonsprosedyre vil produsere: 1) en liten ruskfraksjon, og 2) en høy brøkdel av singlet versus multipletkjerner (> 80% av kjernefraksjonen). Bruken av PI-farging, som flekker nukleinsyrer, gjør at singletkjerner kan segregeres fra rusk og multipletkjerner. Figur 3A er et eksempel på en forberedelse forurenset av rusk, mens figur 3B er et eksempel på et eksperiment av høy kvalitet.
Figur 1: Killifish hjernekjerner isolasjon arbeidsflyt. Eksperimentell arbeidsflyt for kjerneisolering fra frosne eller ferske killifish hjerner. Når kjernene er isolert og vurdert, kan de brukes til ulike nedstrøms "omics"-analyser. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Vurdering av kjernekvalitet ved mikroskopi. Kjerner ble blandet 1: 1 i en løsning på 0,4% Trypan Blue og visualisert på et Echo Revolve-mikroskop ved lysfeltavbildning ved 60x. (A) Et eksempel på en kjerne av høy kvalitet. Kjernen er tilstede som en singlet og kjernemembranen er intakt. (B) Et eksempel på kjerner av dårlig kvalitet. Kjernemembranene er skadet, og kjerner klumper seg sammen til en dublett, sannsynligvis på grunn av lekkasje av klebrig DNA, som kan sees lekker fra toppen av den øverste kjernen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Kjernekvantifisering og renhetsvurdering etter flowcytometri. Kjerneprøver ble farget med en 1:100 fortynning av PI og kjørt på et flowcytometer. Kjerner er tilstede i singlet- og multipletformer i øvre høyre kvadrant av (A, B) med singlets som den laveste skyen av hendelser etterfulgt av dubletter, trillinger, etc. i stigende rekkefølge. Rusk er preget av hendelsene i de to kvadrantene lengst til venstre. (A) Et eksempel på en forberedelse av kjerner av lav kvalitet, der trinnet for fjerning av rusk ble utelatt og rusk utgjør >40% av hendelsene. (B) Et eksempel på en kjerneprøve av høy kvalitet, med det medfølgende trinnet for fjerning av rusk. I dette eksemplet utgjør rusk <10 % av alle hendelser registrert av flowcytometeret. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Eksempeltype (2 hjerner) | Gjennomsnittlig avkastning (4 uavhengige preps) |
| 5-ukers mannlige hjerner | 3,59 ± 1,76 x 105 |
| 10-ukers mannlige hjerner | 6,41 ± 1,33 x 105 |
| 15-ukers mannlige hjerner | 14,59 ± 2,05 x 105 |
| 5-ukers kvinnelige hjerner | 2,54 ± 0,75 x 105 |
| 10-ukers kvinnelige hjerner | 4,66 ± 1,29 x 105 |
| 15-ukers kvinnelige hjerner | 7,95 ± 3,51 x 105 |
Tabell 1: Gjennomsnittlig forventet avkastning fra to hjerner av afrikansk turkis killifish på tvers av kjønn og alder. Gjennomsnittlig avkastning uttrykt som 105 kjerner ± standardfeil av gjennomsnittet over fire uavhengige kjernepreparater i hver kategori.
Supplerende figur 1: Sammenligning av kjerneisolasjonskvalitet ved hjelp av standardprotokoller og vår optimaliserte protokoll om frosne killifishhjerner. (A) Kjernekvalitetsvurdering ved mikroskopi. Kjerner ble blandet 1: 1 i en løsning på 0,4% Trypan Blue og visualisert på et mikroskop ved lysfeltavbildning ved 60x. (B) Kvantifisering av kjerner og ruskbelastning ved flowcytometri. Kjerneprøver ble farget med en 1:100 fortynning av PI og kjørt på et flowcytometer. (C) Sammendrag av kvalitetsvurderingsmålinger ved mikroskopi og flowcytometri med de forskjellige benchmarked protokollene. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 2: Skjematisk fremstilling av trinnene for fjerning av rusk. (A) Ordning for fjerning av rusk lagvis før sentrifugering. (B) Ordning for fjerning av supernatant etter sentrifugering. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Protokollen som presenteres her kan brukes til å reproduserbart generere høykvalitets kjerner fra killifish hjerner. Denne protokollen måtte være spesielt designet for killifish-hjernen, da typiske pattedyrbaserte hjernekjerneisolasjonsprotokoller brukt på killifish-hjerner konsekvent resulterte i dårlig kjernekvalitet i våre hender. Vi mistenker at dette skyldes det lavere relative myelininnholdet i killifish-hjernen sammenlignet med deres pattedyrs kolleger, noe som vil lyse og klumpe seg som svar på de tøffe forholdene som kreves for pattedyrs hjernecellelyse. Denne protokollen er et fremskritt i aldrings- og killifish-feltene, da det letter utforskningen av hjernens aldring på enkeltcellenivå i en kostnads- og tidseffektiv modell av vertebrat hjerne aldring.
Denne protokollen er robust for ferske eller frosne prøver, selv om man må vurdere nedstrømsapplikasjonene når man bruker ferskt eller frosset vev. Frosset vev er ofte praktisk da det kan samles inn og lagres i flere måneder mens prøver samles inn. Slike prøver kan trygt brukes til applikasjoner som snRNA-seq. Frysing av prøver kan imidlertid forstyrre kjernestrukturen og dermed evnen til nøyaktig å måle kromatinlandskapet ved hjelp av ATAC-seq21. For nedstrøms applikasjoner som bulk ATAC-seq eller snATAC-seq anbefales det derfor å bruke nydissekerte hjerner i stedet for frosne hjerner. I tillegg, fordi alle trinn etter hjernehomogenisering kan utføres parallelt, er denne protokollen egnet til å kjøre flere prøver i en rimelig tidsramme, og dermed begrense RNA-nedbrytning forårsaket av langvarig inkubasjon på is.
Videre er det viktig å forberede buffere friske (innen timer) for å utføre kjerneutvinning. Vi fant ut at vaskemidler samt BSA må tilsettes buffere umiddelbart før protokollen begynner. Buffere som bare inneholder salter (PBS, NaCl, etc.) kan fremstilles som konsentrater, filtersteriliseres (0,22 μm) og lagres på ubestemt tid ved romtemperatur. BSA-stamløsninger kan fremstilles, steriliseres og oppbevares ved 4 °C innen dager etter at kjernene er ekstraksjon (hvis de fremstilles fra et pulver), men bør alltid tilsettes bufferne som brukes i denne protokollen umiddelbart før protokollen overtas. Vi anbefaler imidlertid å forberede BSA-løsninger på protokolldagen. Hvis du bruker forhåndslagde BSA-løsninger fra en tredjepart, anbefales det å bruke friske, uåpnede flasker. Bruk av fersk BSA fører generelt til lavere ruskinnhold i kjernepreps.
Enten ferske eller frosne prøver brukes som input, er det viktig å vurdere kjernekvaliteten etter kjerneisolering. Selv om denne protokollen er spesielt utviklet for å unngå overlys, er dette den vanligste årsaken til tap av kjernekvalitet. Overlysis kan skyldes for mye tid brukt i lysisbufferen, altfor grov håndtering av kjernene, for eksempel overdreven pipettering med en standard borepipettespiss, eller for mye tid brukt mellom kjerneisolasjon og nedstrøms applikasjoner (>1 time). Overlyserte kjerner vil ofte ha skadede kjernefysiske periferier, som lekker DNA og forårsaker klumping (figur 2B). Dette vil føre til et økt antall multipleter og bidra med bakgrunnsnukleinsyrer som vil forstyrre nedstrøms applikasjoner, spesielt snRNA-seq. Begge kvaliteter kan vurderes ved mikroskopi etter kjerneisolering. Hvis overdreven kjernefysisk klumping observeres, anbefaler vi at du prøver å forkorte lysistrinnets inkubasjon for å redusere sjansen for overlys. Som en alternativ metode for å øke nuclei singlets, kan fluorescensassistert cellesortering (FACS) brukes til å berike for singleter nedstrøms for denne protokollen. Vi bemerker imidlertid at når du arbeider med allerede skjøre kjerner fra frosset vev, kan skjærspenningen som oppstår under sortering føre til økt nukleær ruptur og dermed økt omgivende RNA / DNA. I tillegg bemerker vi at tiden som kreves for å kjøre en FACS-utbyttesortering for kjerner ved behandling av flere prøver, vil kreve at alle kjerneprøver forblir på is i flere timer, mens andre prøver blir sortert. Dermed kan økte ventetider ved behandling av flere prøver parallelt med FACS-tilnærmingen også sannsynligvis føre til total redusert kjernekvalitet og øke risikoen for RNA-nedbrytning. Hvis FACS er ønsket for redusert dobbelhastighet, anbefaler vi derfor at ruskinnholdet kontrolleres igjen etter utbyttesorteringen, og at mulig redusert RNA-kvalitet tas i betraktning for enkeltcellede RNA-seq-applikasjoner som et potensielt forbehold.
Et nøyaktig estimat av kjernetall og singlet-andel er avgjørende for nesten alle nedstrøms "omics" -applikasjoner og er av største betydning. På grunn av muligheten til enkelt å portere og telle kjerner etter størrelse, er flowcytometri den mest nøyaktige metoden for å telle kjerner som vi har vurdert. Alternativt kan man kvantifisere kjerner ved hjelp av celletellere som Invitrogens grevinne 2 FL Automated Cell Counter eller DeNovix CellDrop Automated Cell Counter. For å merke seg, har Invitrogens grevinne 2 FL Automated Cell Counter, og i mye mindre grad DeNovix, en tendens til å overvurdere kjernetellinger ved å telle rusk som kjerner, noe som betyr at manuell størrelse gating kan være nødvendig. Videre gjør flowcytometeret det mulig å enkelt vurdere renheten til kjernene. Man kan skjelne den relative andelen singlet versus multiplet kjerner på en kvantitativ måte som er vanskelig ved mikroskopi. Dette er viktig for snRNA-seq og snATAC-seq, siden disse protokollene vil lide av et overskudd av multipletprøver, som må utelukkes fra nedstrømsanalyser. I tillegg til multipleter kan den relative andelen "rusk" (fragmenterte kjerner, cellulært rusk) kvantifiseres ved flowcytometri og må være relativt lav, siden dette materialet ofte inneholder forurensende nukleinsyrer som kan bidra med bakgrunnssignal og korrupte enkeltkjerne "omics" -data.
Som med tidligere beskrevne kjerneisolasjonsprotokoller, kan proporsjonene av celletyper i det opprinnelige vevet ikke rekapituleres trofast i kjernene prep19, og bør derfor tolkes med forsiktighet. For å merke seg, som alle teleosts, har afrikanske turkise killifish nukleerte erytrocytter, som også forventes å være representert i kjernene prep. Disse kjernene kan identifiseres i snRNA-seq og snATAC-seq datasett ved høyere uttrykk / tilgjengelighet av hemoglobingener og kan utelukkes beregningsmessig om ønskelig.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Noen paneler ble generert med BioRender.com. Dette arbeidet i laboratoriet vårt ble støttet av NIA T32 AG052374 Postdoctoral Training Grant til B.T., et stipend fra Simons Foundation som en del av Simons Collaboration for Plasticity in the Aging Brain, et pilotstipend fra Navigage Foundation, og en Hanson-Thorell Family-pris til B.A.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan Blue solution | Gibco | 15250061 | |
| 10x PBS | Bioland | PBS01-03 | |
| 15 mL Conicle Centrifuge Tube | VWR | 89039-664 | |
| 2 mL Tissue Grinder | Kimble | 885300-0002 | Dounce Homogenizer |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Falcon | 352054 | |
| 5M Sodium Chloride, Molecular Biology Grade | Promega | V4221 | |
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | This corresponds to 1x PBS pH 7.2, 2 mM EDTA (used for flow cytometry) |
| Debris Removal Solution | Miltenyi Biotec | 130-109-398 | |
| DNA LoBInd Tube | Eppendorf | 22431021 | |
| Echo Revolve microscope (fitted with 60x objective) | Echo | NA | No catalog number; Used to visually inspect nuclei. |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL | Falcon | 352052 | FACS tube |
| FLOWMI Cell Strainers, 40 μM | SP Bel-Art | 136800040 | Referred to as on-tip filters in Protocol |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | 258146-500 mL | Used to lower TRIS pH from 8.0 to 7.4 |
| Leica EZ4 dissecting scope | Leica | NA | No catalog number |
| MACS BSA stock solution | Miltenyi Biotec | 130091376 | |
| MACS SmartStrainers (70 μM) | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | |
| MACSQuant Analyzer 10 Flow Cytometer | Miltenyi Biotec | NA | No catalog number |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade (Powder) | Millipore | 442611 | |
| Megafuge 16R Centrifuge | ThermoScientific | 75003629 | |
| Micro Cover Glass | VWR | 48393081 | |
| Micro Slides Superfrost Plus | VWR | 48311-703 | |
| Nonidet P-40 Substitute | Roche | (Roche) 11332473001/ Catalog: 983739 P Code: -102368106 (Sigma Aldrich) | |
| NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution | ThermoFisher | 85124 | |
| Nuclease-Free HyPure Molecular Biology Grade Water | HyClone | SH30538.02 | |
| NxGen RNase Inhibitor (50,000 U) | Lucigen | 30281-2 | |
| Propidium Iodide solution | MBL | FP00010020 | |
| PureBlu DAPI Nuclear Staining Dye | Biorad | 1351303 | |
| TipOne RPT Pipette Tips (Ultra low retention, filtered) in 10 µL, 20 µL, 200 µL, and 1000 µL sizes | USA Scientific | #1181-3810; #1180-1810; #1180-8810; #1182-1830 | |
| Tricaine-S (MS 222) | Syndel | Tricaine10G | Syndel is an FDA-approved provider for pharmaceutical grade Tricaine |
| TRIS, 1 M, pH 8.0 | VWR | E199-500 mL | |
| Wide Bore Pipet Tips | Axygen | T-1005-WB-C |
References
- Yankner, B. A., Lu, T., Loerch, P.
- Hu, C. K., Brunet, A. The African turquoise killifish: A research organism to study vertebrate aging and diapause. Aging Cell. 17 (3), 12757 (2018).
- McKay, A., et al. An automated feeding system for the African killifish reveals effects of dietary restriction on lifespan and allows scalable assessment of associative learning. bioRxiv. , (2021).
- Valenzano, D. R., Terzibasi, E., Cattaneo, A., Domenici, L., Cellerino, A. Temperature affects longevity and age-related locomotor and cognitive decay in the short-lived fish Nothobranchius furzeri. Aging Cell. 5 (3), 275-278 (2006).
- Vanhunsel, S., et al. The killifish visual system as an in vivo model to study brain aging and rejuvenation. NPJ Aging and Mechanisms of Disease. 7 (1), 22 (2021).
- Armand, E. J., Li, J., Xie, F., Luo, C., Mukamel, E. A. Single-cell sequencing of brain cell transcriptomes and epigenomes. Neuron. 109 (1), 11-26 (2021).
- Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PLoS One. 13 (12), 0209648 (2018).
- Ziffra, R. S., et al. Single-cell epigenomics reveals mechanisms of human cortical development. Nature. 598 (7879), 205-213 (2021).
- Grindberg, R. V., et al.
- Kalish, B. T., et al. Single-nucleus RNA sequencing of mouse auditory cortex reveals critical period triggers and brakes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (21), 11744-11752 (2020).
- Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nature Medicine. 26 (5), 792-802 (2020).
- Ayhan, F., Douglas, C., Lega, B. C., Konopka, G. Nuclei isolation from surgically resected human hippocampus. STAR Protocols. 2 (4), 100844 (2021).
- Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10 (1), 2907 (2019).
- Narayanan, A., et al. Nuclei isolation from fresh frozen brain tumors for single-nucleus RNA-seq and ATAC-seq. Journal of Visualized Experiments. (162), e61542 (2020).
- Saunders, A., et al. Molecular diversity and specializations among the cells of the adult mouse brain. Cell. 174 (4), 1015-1030 (2018).
- Genomics, X. Isolation of Nuclei for Single Cell RNA Sequencing & Tissues for Single Cell RNA Sequencing. , Available from: https://support.10xgenomics.com/permalink/1dlB6Z91VqClgUmSC2OM8k (2021).
- Martin, C., et al. Frozen tissue nuclei extraction (for 10xV3 snSEQ) V.2. protocols.io. , (2020).
- Nuclei Isolation from Adult Mouse Brain Tissue for Single Cell RNA Sequencing. 10xGenomics. , Available from: https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-adult-mouse-brain-tissue-for-single-cell-ma-sequencing (2022).
- Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).
- What are the best practices for working with nuclei samples for 3' single-cell gene expression. 10xGenomics. , Available from: https://kb.10xgenomics.com/hc/en-us/articles/360050780051-What-are-the-best-practices-for-working-with-nuclei-samples-for-3-single-cell-gene-expression- (2022).
- Rocks, D., et al. Cell type-specific chromatin accessibility analysis in the mouse and human brain. Epigenetics. 17 (2), 202-219 (2022).
