Articolo metodologico

Larve di pesce zebra come modello per valutare potenziali radiosensibilizzanti o protettori

DOI:

10.3791/64233

⸱

25 agosto 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Tumor microenvironment and animal models lab, Institute of Life Sciences, 2Vascular Biology lab, Institute of Life Sciences, 3Regional Centre for Biotechnology, 4School of Biotechnology, KIIT University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Il pesce zebra è stato recentemente sfruttato come modello per convalidare potenziali modificatori di radiazioni. Il presente protocollo descrive i passaggi dettagliati per utilizzare embrioni di zebrafish per esperimenti di screening basati su radiazioni e alcuni approcci osservazionali per valutare l'effetto di diversi trattamenti e radiazioni.

Abstract

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Il pesce zebra è ampiamente utilizzato in diversi tipi di ricerca perché è uno dei modelli di vertebrati di facile manutenzione e presenta diverse caratteristiche di un sistema modello unico e conveniente. Poiché le cellule altamente proliferative sono più suscettibili ai danni al DNA indotti dalle radiazioni, gli embrioni di zebrafish sono un modello in vivo di prima linea nella ricerca sulle radiazioni. Inoltre, questo modello proietta l'effetto delle radiazioni e di diversi farmaci in un breve lasso di tempo, insieme ai principali eventi biologici e alle risposte associate. Diversi studi sul cancro hanno utilizzato il pesce zebra e questo protocollo si basa sull'uso di modificatori di radiazioni nel contesto della radioterapia e del cancro. Questo metodo può essere facilmente utilizzato per convalidare gli effetti di diversi farmaci su embrioni irradiati e di controllo (non irradiati), identificando così i farmaci come farmaci radiosensibilizzanti o protettivi. Sebbene questa metodologia sia utilizzata nella maggior parte degli esperimenti di screening farmacologico, i dettagli dell'esperimento e la valutazione della tossicità con lo sfondo dell'esposizione alle radiazioni a raggi X sono limitati o solo brevemente affrontati, rendendone difficile l'esecuzione. Questo protocollo affronta questo problema e discute la procedura e la valutazione della tossicità con un'illustrazione dettagliata. La procedura descrive un approccio semplice per l'utilizzo di embrioni di zebrafish per studi di radioterapia e screening farmacologico basato su radiazioni con molta affidabilità e riproducibilità.

Introduzione

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Il pesce zebra (Danio rerio) è un noto modello animale che è stato ampiamente utilizzato nella ricerca negli ultimi 3 decenni. È un piccolo pesce d'acqua dolce facile da allevare e allevare in condizioni di laboratorio. Il pesce zebra è stato ampiamente utilizzato per vari studi sullo sviluppo e tossicologici 1,2,3,4,5,6,7,8. Il pesce zebra ha un'elevata fecondità e una breve generazione embrionale; Gli embrioni sono adatti a seguire le diverse fasi di sviluppo, sono visivamente trasparenti e sono suscettibili di manipolazioni genetiche e piattaforme di screening ad alto rendimento 9,10,11,12,13,14. Inoltre, il pesce zebra fornisce immagini in toto e dal vivo per le quali il suo processo di sviluppo e le diverse deformità in presenza di varie sostanze o fattori tossici possono essere facilmente studiati utilizzando la microscopia stereoscopica o fluorescente 7,15,16.

La radioterapia è una delle principali modalità terapeutiche utilizzate nel trattamento del cancro 17,18,19,20,21,22,23,24. Tuttavia, la radioterapia del cancro richiede potenziali radioprotettori per proteggere le cellule sane normali dalla morte mentre uccidono le cellule maligne o salvaguardare la salute umana durante la terapia che coinvolge radiazioni ad alta energia 25,26,27,28,29. Al contrario, potenti radiosensibilizzanti sono anche in fase di studio per aumentare l'efficienza delle radiazioni nell'uccidere le cellule maligne, specialmente nelle terapie mirate e di precisione30,31,32,33. Pertanto, per convalidare potenti radioprotettori e sensibilizzanti, è molto richiesto un modello adatto per lo screening di farmaci a semi-alto rendimento e che mostri in modo misurabile gli effetti delle radiazioni. Diversi modelli disponibili sono utilizzati negli studi sulle radiazioni e coinvolti negli esperimenti di screening farmacologico. Tuttavia, i vertebrati superiori e anche il modello in vivo più comunemente usato, i topi, non sono adatti per lo screening farmacologico su larga scala perché è dispendioso in termini di tempo, costoso e impegnativo progettare tali esperimenti di screening con questi modelli. Allo stesso modo, i modelli di coltura cellulare sono ideali per varietà di esperimenti di screening farmacologico ad alto rendimento34,35. Tuttavia, gli esperimenti che coinvolgono la coltura cellulare non sono sempre pragmatici, altamente riproducibili o affidabili poiché le cellule in coltura possono cambiare notevolmente il loro comportamento in base alle condizioni di crescita e alla cinetica. Inoltre, varietà di tipi cellulari mostrano una sensibilizzazione differenziale alle radiazioni. In particolare, i sistemi di coltura cellulare 2D e 3D non rappresentano lo scenario dell'intero organismo e, pertanto, i risultati ottenuti potrebbero non ricapitolare l'effettivo livello di radiotossicità36,37. A questo proposito, il pesce zebra offre diversi vantaggi nello screening di nuovi radiosensibilizzanti e radioprotettori. La facilità d'uso, le grandi dimensioni della covata, la breve durata della vita, il rapido sviluppo embrionale, la trasparenza dell'embrione e le piccole dimensioni del corpo rendono il pesce zebra un modello adatto per lo screening farmacologico su larga scala. Grazie ai vantaggi di cui sopra, gli esperimenti possono essere facilmente ripetuti in breve tempo e l'effetto può essere osservato facilmente al microscopio da dissezione in piastre a più pozzetti. Quindi, il pesce zebra sta guadagnando popolarità nella ricerca sullo screening dei farmaci che coinvolge studi sulle radiazioni38,39.

Il potenziale del pesce zebra come modello in buona fede per lo screening dei modificatori delle radiazioni è stato dimostrato in vari studi 40,41,42,43,44,45. L'effetto radioprotettivo di potenziali radiomodificatori, come la nanoparticella DF1, l'amifostina (WR-2721), le proteine di riparazione del DNA KU80 e ATM e le cellule staminali ematopoietiche trapiantate, e gli effetti dei radiosensibilizzanti, come flavopiridol e AG1478, nel modello di zebrafish sono stati riportati 19,41,42,43,44,45,46 . Utilizzando lo stesso sistema, è stato valutato l'effetto radioprotettivo di DF-1 (nanoparticella di fullerene) sia a livello sistemico che organo-specifico, ed è stato ulteriormente esplorato anche l'uso di embrioni di pesce zebra per lo screening radioprotettore47. Recentemente, il miele di Kelulut è stato segnalato come radioprotettore negli embrioni di zebrafish ed è stato scoperto che aumenta la sopravvivenza dell'embrione e previene il danno organo-specifico, il danno al DNA cellulare e l'apoptosi48.

Allo stesso modo, gli effetti radioprotettivi dei polimeri generati tramite la reazione di Hantzsch sono stati verificati su embrioni di zebrafish in uno screening ad alto rendimento e la protezione è stata conferita principalmente proteggendo le cellule dai danni al DNA49. In uno degli studi precedenti, la statina lipofila fluvastatina è stata trovata come potenziale radiosensibilizzante utilizzando il modello del pesce zebra con questo approccio50. Allo stesso modo, le nanoparticelle d'oro sono considerate un radiosensibilizzante ideale e sono state utilizzate in molti studi51,52.

Lo sviluppo embrionale nel pesce zebra comporta la scissione nelle prime 3 ore in cui uno zigote unicellulare si divide per formare 2 cellule, 4 cellule, 8 cellule, 16 cellule, 32 cellule e 64 cellule che sono facilmente identificabili con uno stereomicroscopio. Quindi, raggiunge lo stadio di blastula con 128 cellule (2,25 h post-fecondazione, hpf), dove le cellule raddoppiano ogni 15 minuti e procedono attraverso queste seguenti fasi: 256 cellule (2,5 hpf), 512 cellule (2,75 hpf) e raggiungendo 1.000+ cellule in sole 3 ore (Figura 1). A 4 ore, l'uovo raggiunge lo stadio di sfera, seguito dalla formazione di una forma a cupola nella massa embrionale 7,53,54. La gastrulazione nel pesce zebra parte da 5,25 hpf54, dove raggiunge lo stadio di scudo. Lo scudo indica chiaramente il rapido movimento di convergenza delle cellule su un lato dell'anello germinale (Figura 1) ed è una fase prominente e distinta degli embrioni gastrulanti che può essere facilmente identificata53,54. Sebbene l'esposizione alle radiazioni agli embrioni possa essere effettuata in qualsiasi fase del loro sviluppo, l'esposizione alle radiazioni durante la gastrulazione potrebbe avere cambiamenti morfologici più distinti che facilitano una migliore lettura delle tossicità indotte dalle radiazioni55; Allo stesso modo, la somministrazione di farmaci agli embrioni può essere iniziata già a partire da 2 HPF54.

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Protocollo

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Il presente studio è stato condotto con la previa approvazione e seguendo le linee guida dell'Institutional Animal Ethical Committee, Institute of Life Sciences, Bhubaneswar. Tutti gli interventi di mantenimento e riproduzione del pesce zebra sono stati condotti in un impianto di coltura a temperatura ambiente a 28,5 °C e gli embrioni sono stati mantenuti in un'incubatrice a domanda biologica di ossigeno (BOD) a una temperatura di 28,5 °C. In questo caso, è stato utilizzato il ceppo AB del pesce zebra e la stadiazione è stata eseguita secondo Kimmel et al.54. La radiazione a raggi X è stata somministrata a 6 hpf (stadio di schermatura) e sono stati osservati diversi fenotipi fino a 120 hpf.

1. Allevamento e raccolta embrionale

  1. Impostare le vasche di allevamento (costituite da policarbonato, capacità 1 L, vedi Tabella dei Materiali). Versare l'acqua del sistema (pH, 6,8-7,5; conducibilità, 500 μS; e temperatura, 28,5 °C) nelle vasche di allevamento coprendo quasi il 40% del suo volume. Posiziona il divisore nella vasca per creare due camere, una per le femmine e l'altra per i maschi.
  2. Dalle vasche madri, raccogliere con cura due femmine sane e un maschio sano con l'aiuto di una rete, metterli nelle rispettive metà e tenerli al buio per una notte (minimo 10 ore) a 28,5 °C.
  3. La mattina dopo, rimuovete il divisorio e lasciate che i pesci si accoppino senza disturbare le vasche di allevamento.
    NOTA: Le femmine inizieranno a deporre le uova e le uova saranno viste sdraiate sul fondo della vasca entro 10-15 minuti dopo che i pesci sono stati autorizzati ad accoppiarsi56,57,58.
  4. Riportare i pesci nelle loro vasche dopo la deposizione delle uova, raccogliere gli embrioni dalla vasca di riproduzione utilizzando un colino, lavarli accuratamente con l'acqua del sistema e conservare le uova raccolte in una piastra di Petri con terreno E-3 (4,94 mM di NaCl, 0,17 mM di KCl, 0,43 mM di CaCl 2 , 0,85 mM di sali di MgCl2, 1% p/v di blu di metilene, vedi Tabella dei Materiali).
  5. Osservare gli ovuli al microscopio da dissezione, rimuovere gli embrioni non fecondati o morti utilizzando una pipetta Pasteur e conservare le piastre di Petri contenenti uova fecondate nel terreno E-3 a 28,5 °C in un'incubatrice per la loro corretta crescita e mantenimento.
    NOTA: Gli ovuli non fecondati possono essere identificati con un aspetto bianco latte con un corion coagulato o con cellule rotte all'interno del corion. Insieme agli ovuli non fecondati, gli ovuli non sottoposti a scissione e gli ovuli con deformità come irregolarità durante la scissione, ad esempio asimmetria, formazione di vescicole o lesioni del corion, o che non si sviluppano attivamente, devono essere scartati per mantenere sani gli embrioni raccolti e per mantenere puliti i terreni 7,56.

2. Monitoraggio degli embrioni e selezione per esperimenti di radioterapia

  1. Monitorare gli embrioni in crescita al microscopio da dissezione, identificare lo stadiocorretto 7,54 e rimuovere eventuali embrioni morti o malati. Garantire un'adeguata stadiazione dell'embrione poiché le dosi di radiazioni e farmaci saranno somministrate in una particolare fase di gastrulazione.
    NOTA: Ogni giorno, controllare il livello e la qualità dei terreni nei piatti di coltura. Cambiare il terreno ogni 24 ore, oltre a rimuovere gli embrioni morti. Le pipette Pasteur sono preferite per essere utilizzate per il prelievo di embrioni o per il cambio di terreno.
  2. Prima di iniziare l'esperimento, distribuire accuratamente gli embrioni sani nelle piastre sperimentali con l'aiuto di una pipetta Pasteur. Per ogni gruppo sperimentale, prelevare 15-20 embrioni.
    NOTA: Collocare nella piastra sperimentale solo embrioni sani degli stadi di sviluppo desiderati. Supponiamo che il trattamento farmacologico debba essere fatto con embrioni a 6 hpf, quindi iniziare a seminarli in piastre sperimentali almeno 30-60 minuti prima.

3. Trattamento farmacologico

  1. Aggiungere farmaci della concentrazione desiderata agli embrioni di zebrafish. Preparare il terreno E-3 contenente il farmaco con largo anticipo. Assicurarsi che la soluzione madre del farmaco non contenga farmaco non disciolto prima di preparare il terreno di lavoro per il trattamento degli embrioni di zebrafish.
  2. Prima di aggiungere qualsiasi farmaco a un mezzo per lo screening radioattivo, controllare l'effetto citotossico del farmaco con i gradi di concentrazione del farmaco. Seguire le linee guida dell'OCSE per valutare la LC 50 dei farmaci in valutazione 59,60,61.
    NOTA: Prestare attenzione durante lo spostamento delle piastre e delle stoviglie durante l'irradiazione o il tempo di osservazione. Ci sono molte possibilità che le piastre vengano disturbate durante questa manipolazione, causando la fuoriuscita del terreno dai pozzetti o la fuoriuscita degli embrioni dai rispettivi pozzetti, contaminando potenzialmente i pozzi vicini e rovinando l'esperimento.

4. Irradiazione a raggi X

  1. Durante l'impostazione di un esperimento sulle radiazioni, includere un gruppo di controllo/non irradiato e un gruppo di sole radiazioni. Allo stesso modo, durante l'esecuzione di uno screening farmacologico, includere un altro gruppo in cui i farmaci verranno somministrati con la stessa concentrazione di quelli somministrati nell'esperimento di screening insieme alle radiazioni.
    NOTA: Etichettare sia il coperchio che la base delle piastre a pozzetti o delle piastre di coltura in modo che i coperchi non vengano smarriti.
  2. Distribuire gli embrioni in una piastra a pozzetti se gli schermi antiradiazioni possono coprire e proteggere i pozzetti extra dalle radiazioni mentre gli altri pozzetti sono esposti a una particolare dose di radiazioni; In caso contrario, utilizzare piastre o dischi individuali per seminare gli embrioni per dose di radiazioni.
  3. Accendere l'irradiatore a raggi X (vedere la tabella dei materiali) e avviare l'inizializzazione e il riscaldamento della macchina.
    NOTA: Il valore della distanza dalla sorgente al soggetto (SSD) deve essere di 50 cm; è possibile utilizzare SSD diversi ancora una volta, il che richiede la standardizzazione.
  4. Posizionare la piastra sperimentale sotto l'irradiatore all'interno della macchina al centro, assicurandosi che la piastra sia direttamente sotto la sorgente di raggi X, quindi impostare la dose (ad es. 5 GY) e avviare la radiografia.
    NOTA: Sigillare le piastre con pellicola di paraffina per evitare fuoriuscite o contaminazioni indesiderate durante il trasporto delle piastre dall'incubatore all'irradiatore e viceversa.
  5. Al termine dell'irradiazione, estrarre le piastre, chiudere il programma della macchina, spegnere la macchina e controllare le piastre al microscopio subito dopo la radiazione. Rimuovere gli embrioni morti e rimettere le piastre nell'incubatrice a 28,5 °C. Registrare il numero di embrioni morti dopo averli valutati al microscopio da dissezione.
    NOTA: Irradiare i diversi gruppi di embrioni con dosi di radiazioni designate senza troppi ritardi tra i singoli gruppi, poiché l'effetto delle radiazioni può essere significativamente influenzato dalla differenza nella fase di sviluppo.
    ATTENZIONE: Durante il funzionamento della macchina a raggi X, adottare misure di protezione adeguate.

5. Raccolta, imaging e analisi dei dati

  1. Raccogliere i dati a intervalli di tempo predeterminati, ad esempio ogni 24 ore dopo l'emissione della radiazione. Registrare tutte le possibili osservazioni come la sopravvivenza, l'efficienza della schiusa, lo stadio di sviluppo, il conteggio del battito cardiaco, la curvatura del corpo e della coda, l'edema pericardico, l'estensione del sacco vitellino, la microcefalia, lo sviluppo della vescica natatoria, la motilità o l'attività generale, ecc.62,63,64.
  2. Per acquisire le immagini, scegliere embrioni rappresentativi su un vetrino pulito, controllare gli embrioni al microscopio, orientarli in una direzione particolare e fare clic sulle immagini. Rinominare i file immagine in base al gruppo e all'ora.
    NOTA: È necessario utilizzare lo stesso ingrandimento e la stessa illuminazione durante l'acquisizione di immagini a intervalli di tempo diversi.

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Risultati

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Il layout generale del protocollo è illustrato nella Figura 2. L'effetto delle radiazioni e la caratterizzazione in modo dose-dipendente sono stati valutati con le seguenti analisi.

Valutazione delle tossicità indotte dai raggi X
Utilizzando uno stereomicroscopio, le seguenti anomalie sono state valutate e caratterizzate dopo il trattamento farmacologico e/o la radioterapia. Secondo le linee guida dell'OCSE 61, per la valutazio...

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Discussione

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I pesci zebra sono usati come modelli preziosi in molti studi, tra cui diversi tipi di ricerca sul cancro. Questo modello fornisce un'utile piattaforma per lo screening dei farmaci su larga scala67,68. Come qualsiasi altro metodo di valutazione della tossicità, la valutazione quantitativa dei principali cambiamenti biologici in seguito a radiazioni e/o trattamento farmacologico è la parte più cruciale di questo protocollo. In questo tipo di studi, la sopravvivenz...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno dichiarato interessi concorrenti.

Ringraziamenti

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Il laboratorio di SS e il laboratorio di RKS sono finanziati da sovvenzioni di DBT e SERB, India. APM ha ricevuto la borsa di studio ICMR, Governo dell'India. DP ha ricevuto la borsa di studio CSIR, Governo dell'India. L'ONU ha ricevuto la borsa di studio DST-Inspire, Governo dell'India. La Figura 2 è stata generata utilizzando Biorender (https://biorender.com).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Piastre a 6 pozzettiCorningCLS3335Polistirene
B.O.D IncubatoreOswaldJRIC-10
Cloruro di calcioFisher Scientific10101-41-4
Microscopio da dissezioneZeissStemi 2000
Vasca esterna per la vasca di allevamento da 1,0 LTecniplastZB10BTEpolicarbonato
Piastre di vetroBorosil3165A75
Vetro GraphpadPrismGraphPad Software, Inc.Versione 5.01
Vetrini concavità KlineHimediaGW092-1PK
Vetro Cloruro di magnesioSigma-AldrichM8266
Blu di metilene idratoSigma-Aldrich66720-100G
ParafilmTarsons380020Film di paraffina
Pipette PasteurHimediaPW1212-1X500NOPolietilene
Vasca interna forata in plastica per la vasca di allevamento da 1,0 LTecniplastZB10BTIPolicarbonato
Divisore in policarbonato per la vasca di allevamento da 1,0 lTecniplastZB10BTDPolicarbonato
Coperchio in policarbonato per la vasca di allevamento da 1,0 lTecniplastZB10BTL
Policarbonato Cloruro di potassioSigma-AldrichP5655
Cloruro di sodioSigma-AldrichS7653-5KG
Pellet di idrossido di sodioSRL1949181
Stereomicroscopio Leica M205FALeicaModello/PN MDG35/10 450 125
X-RAD 225 Raggi X di precisioneRaggi X di precisione X-RAD225XL

Riferimenti

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