Molti geni sovraregolati stimolano la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali, portando a una prognosi infausta. Determinare quali geni regolano la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali è fondamentale. Questo protocollo presenta un metodo per studiare gli effetti dell'aumentata espressione di un gene sulla migrazione e l'invasione delle cellule tumorali in tempo reale.
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Articolo metodologico
Misurazione quantitativa in tempo reale della migrazione e dell'invasione delle cellule tumorali in seguito alla trasfezione sintetica di mRNA
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule tumorali sono altamente mobili e invasive e mostrano modelli di espressione genica alterati. La conoscenza di come i cambiamenti nell'espressione genica regolano la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali è essenziale per comprendere i meccanismi di infiltrazione delle cellule tumorali nei tessuti sani vicini e le metastasi. In precedenza, è stato dimostrato che il knockdown genico seguito dalla misurazione in tempo reale basata sull'impedenza della migrazione e dell'invasione delle cellule tumorali consente l'identificazione dei geni necessari per la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali. Recentemente, i vaccini a mRNA contro SARS-CoV-2 hanno aumentato l'interesse per l'utilizzo di mRNA sintetico per scopi terapeutici. Qui, il metodo che utilizza l'mRNA sintetico è stato rivisto per studiare l'effetto della sovraespressione genica sulla migrazione e l'invasione delle cellule tumorali. Questo studio dimostra che l'elevata espressione genica con trasfezione sintetica di mRNA seguita da una misurazione in tempo reale basata sull'impedenza può aiutare a identificare i geni che stimolano la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali. Questo documento fornisce importanti dettagli sulle procedure per esaminare l'effetto dell'espressione genica alterata sulla migrazione e l'invasione delle cellule tumorali.
Introduzione
La motilità delle cellule tumorali gioca un ruolo cruciale nelle metastasi 1,2. La diffusione delle cellule tumorali ai tessuti sani vicini e remoti rende difficile il trattamento del cancro e contribuisce alla recidiva 3,4. Pertanto, è essenziale comprendere i meccanismi della motilità delle cellule tumorali e sviluppare strategie terapeutiche pertinenti. Poiché molte cellule tumorali hanno profili di espressione genica alterati, è fondamentale capire quali cambiamenti nel profilo di espressione genica portano ad un'alterazione della motilità
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Protocollo
1. Sintesi dell'mRNA
NOTA: Per la sintesi dell'mRNA, tutti i reagenti e le apparecchiature devono essere trattati in modo speciale per inattivare le RNasi prima dell'uso. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli su tutti i materiali, gli strumenti e i reagenti utilizzati in questo protocollo.
- Linearizzazione del DNA
NOTA: I cDNA murini di CrkI e CrkL sono stati clonati nel vettore di espressione pFLAG-CMV-5a per aggiungere il tag dell'epitopo FLAG all'estremità C e subclonati nel vettore pcDNA3.1/myc-His per incorporare il promotore T7, come descrittoin....
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Risultati
Le proteine Crk e CrkL svolgono un ruolo importante nella motilità di molti tipi di cellule, tra cui i neuroni22, le cellule T23, i fibroblasti 18,19 e una varietà di cellule tumorali13. Poiché le proteine Crk e CrkL sono state segnalate per essere elevate nel glioblastoma24,25,26, in questo lavoro sono stati studiati gli effetti della sovraespressione di CrkI, una var.......
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Discussione
La migrazione e l'invasione sono caratteristiche importanti delle cellule tumorali. La misurazione della motilità delle cellule tumorali e la comprensione del meccanismo sottostante che controlla la motilità delle cellule tumorali forniscono informazioni critiche sugli interventi terapeutici 2,27. Sono stati sviluppati diversi metodi per studiare la migrazione cellulare7. Il test di guarigione delle ferite che utilizza graffi o inserti di .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano il Medical Writing Center del Children's Mercy Kansas City per aver curato questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione A.R.T. di Natalie (a T.P.) e da una sovvenzione del Comitato Consultivo dei Partner MCA da parte del Children's Mercy Hospital (CMH) e del Centro Oncologico dell'Università del Kansas (KUCC) (a T.P.).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| AlphaImager HP | ProteinSimple | 92-13823-00 | Sistema di imaging su gel di agarosio |
| &alfa;-Tubulina anticorpo | Sigma | T9026 | Utilizzato per rilevare la proteina &alfa;-tubulina (diluizione 1:3.000) |
| CIM-piastra 16 | Agilent Technologies, Inc | 5665825001 | Piastre di invasione e migrazione cellulare |
| Anticorpo Crk | BD Biosciences | 610035 | Utilizzato per rilevare le proteine CrkI e CrkII (diluizione 1:1.500) |
| Anticorpo CrkL | Santa Cruz | sc-319 | Utilizzato per rilevare la proteina CrkL (diluizione 1:1.500) |
| Dulbecco' s Aquila modificata' s Medium (DMEM) | ATCC | 302002 | Terreno di coltura cellulare |
| Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS) | Corning | 21-031-CV | Tampone utilizzato per lavare le cellule |
| Siero fetale bovino (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | Integratore di terreno di coltura |
| Heracell VIOS 160i Incubatore a CO2 | Thermo Scientific | 51030285 | |
| IRDye 800CW capra anticorpo secondario IgG anti-topo | Li-Cor | 926-32210 | Anticorpo secondario per analisi Western blot (diluizione 1:10.000) |
| IRDye 800CW capra anti-coniglio Anticorpo secondario | IgG Li-Cor | 926-32211 | Anticorpo secondario per analisi Western blot (diluizione 1:10.000) |
| Cloruro di litio | Invitrogen | AM9480 | Utilizzato per la precipitazione dell'RNA |
| Matrice Matrigel | Corning | 354234 | Gel per matrice extracellulare (ECM) |
| Kit di trascrizione MEGAscript T7 | Invitrogen | AM1334 | Utilizzato per la sintesi di RNA |
| Marcatori di RNA Millennium | Invitrogen | AM7150 | Utilizzato per l'elettroforesi su gel di agarosio di formaldeide |
| Mini centrifuga | ISC BioExpress | C1301P-ISC | Utilizzato per lo spin-down delle cellule |
| Cervello di topo QUICK-Clone cDNA | TaKaRa | 637301 | Fonte di geni (inserti) per la clonazione |
| NanoQuant | Tecan | M200PRO | Sistema di quantificazione degli acidi nucleici |
| Sistema di elettroporazione al neon | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Sistema di elettroporazione1 |
| Sistema di trasfezione al neon 10 & micro; Kit a L | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | Kit di elettroporazione |
| Sistema di trasfezione al neon 100 µ Kit L | ThermoFisher Scientific | MPK10096 | Kit per elettroporazione |
| NorthernMax tampone gel denaturante | Invitrogen | AM8676 | Utilizzato per l'elettroforesi su gel di formaldeide |
| NorthernMax colorante con carica di formaldeide | Invitrogen | AM8552 | Utilizzato per l'elettroforesi su gel di formaldeide e agarosio |
| NorthernMax tampone da corsa | Invitrogen | AM8671 | Utilizzato per l'elettroforesi su gel di agarosio di formaldeide |
| Acqua priva di nucleasi | Teknova | W3331 | Utilizzato per varie reazioni durante la sintesi dell'mRNA |
| Odyssey CLx Imager | Li-Cor | Imager per l'analisi Western blot | |
| pcDNA3.1/myc-His | Invitrogen | V80020 | Il vettore in cui sono stati clonati gli inserti (cDNA CrkI e CrkL di topo) |
| pFLAG-CMV-5a | Millipore Sigma | E7523 | Fonte dell'etichetta dell'epitopo FLAG |
| Fenolo:cloroformio:alcol isoamilico | Sigma | P2069 | Utilizzato per |
| PmeI | New England BioLabs | R0560L | Utilizzato per linearizzare i plasmidi per la sintesi dell'mRNA |
| Kit di coda Poly(A) | Invitrogen | AM1350 | Utilizzato per la reazione della coda di poli(A) |
| Piatto di coltura tissutale in polistirene (stile 100 x 20 mm) | Corning | 353003 | Utilizzato per la coltura di cellule prima della trasfezione |
| Piastra per colture tissutali in polistirene (stile 35 x 10 mm) | Corning | 353001 | Utilizzato per la coltura di cellule trasfettate |
| Proteinasi K | Invitrogen | 25530049 | Utilizzato per rimuovere le proteine nella miscela di reazione |
| Purificatore Assioma Classe II, Tipo C1 | Labconco Corporation | 304410001 | Armadio di biosicurezza per la manipolazione sterile di cellule |
| Tampone di risospensione R | ThermoFisher Scientific | Un tampone incluso nei kit di elettroporazione, MPK1025 e MPK10096. Il tampone viene utilizzato per ricostituire le cellule prima dell'elettroporazione e la sua composizione è costituita da informazioni proprietarie. | |
| RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | Soluzione di decontaminazione dell'RNA |
| Scettro | Millipore | C85360 | Contatore cellulare automatizzato portatile |
| ScriptCap Kit 2'-O-metiltransferasi | Cellscript | C-SCMT0625 | Utilizzato per la reazione di tappatura |
| ScriptCap m7G Sistema di tappatura | Cellscript | C-SCCE0625 | Utilizzato per la reazione di tappatura |
| Soluzione di sodio dodecil solfato | Invitrogen | 15553-035 | Detergente utilizzato per la reazione della proteinasi K |
| Centrifuga Sorvall Legend XT | Thermo Scientific | 75004532 | Centrifuga da banco per la centrifuga delle cellule |
| Tripsina-EDTA | Gibco | 25300-054 | Utilizzata per la dissociazione delle cellule |
| U-118MG | ATCC | HTB15 | Una linea cellulare aderente derivata da un paziente affetto da glioblastoma umano |
| Anticorpo vinculina | Sigma | V9131 | Utilizzato per rilevare la proteina vinculina (diluizione 1:100.000) |
| xCELLigence RTCA DP | Agilent Technologies, Inc | 380601050 | Strumento utilizzato per l'analisi |
| cellulare in tempo reale1I parametri di elettroporazione e altre informazioni correlate per varie linee cellulari sono disponibili sulla homepage del produttore (https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html?). |
Riferimenti
- Palmer, T. D., Ashby, W. J., Lewis, J. D., Zijlstra, A. Targeting tumor cell motility to prevent metastasis. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (8), 568-581 (2011).
- Eccles, S. A., Box, C., Court, W. Cell migration/invasion assays and their application in....
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Ristampe e permessi
