Method Article

Misurazione quantitativa in tempo reale della migrazione e dell'invasione delle cellule tumorali in seguito alla trasfezione sintetica di mRNA

DOI:

10.3791/64274

⸱

June 23rd, 2023

 , 
1Children’s Mercy Research Institute, Children’s Mercy Kansas City, 2Department of Pediatrics, University of Missouri-Kansas City School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Molti geni sovraregolati stimolano la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali, portando a una prognosi infausta. Determinare quali geni regolano la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali è fondamentale. Questo protocollo presenta un metodo per studiare gli effetti dell'aumentata espressione di un gene sulla migrazione e l'invasione delle cellule tumorali in tempo reale.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le cellule tumorali sono altamente mobili e invasive e mostrano modelli di espressione genica alterati. La conoscenza di come i cambiamenti nell'espressione genica regolano la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali è essenziale per comprendere i meccanismi di infiltrazione delle cellule tumorali nei tessuti sani vicini e le metastasi. In precedenza, è stato dimostrato che il knockdown genico seguito dalla misurazione in tempo reale basata sull'impedenza della migrazione e dell'invasione delle cellule tumorali consente l'identificazione dei geni necessari per la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali. Recentemente, i vaccini a mRNA contro SARS-CoV-2 hanno aumentato l'interesse per l'utilizzo di mRNA sintetico per scopi terapeutici. Qui, il metodo che utilizza l'mRNA sintetico è stato rivisto per studiare l'effetto della sovraespressione genica sulla migrazione e l'invasione delle cellule tumorali. Questo studio dimostra che l'elevata espressione genica con trasfezione sintetica di mRNA seguita da una misurazione in tempo reale basata sull'impedenza può aiutare a identificare i geni che stimolano la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali. Questo documento fornisce importanti dettagli sulle procedure per esaminare l'effetto dell'espressione genica alterata sulla migrazione e l'invasione delle cellule tumorali.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La motilità delle cellule tumorali gioca un ruolo cruciale nelle metastasi 1,2. La diffusione delle cellule tumorali ai tessuti sani vicini e remoti rende difficile il trattamento del cancro e contribuisce alla recidiva 3,4. Pertanto, è essenziale comprendere i meccanismi della motilità delle cellule tumorali e sviluppare strategie terapeutiche pertinenti. Poiché molte cellule tumorali hanno profili di espressione genica alterati, è fondamentale capire quali cambiamenti nel profilo di espressione genica portano ad un'alterazione della motilità delle cellule tumorali 5,6.

Sono stati sviluppati diversi saggi per misurare la migrazione cellulare in vitro. Alcuni test forniscono solo informazioni limitate a causa della possibilità di misurazioni solo in punti temporali specifici, mentre altri offrono informazioni complete sulla motilità delle cellule tumorali in tempo reale7. Sebbene molti di questi saggi di motilità cellulare possano fornire risultati quantitativi in un dato momento o nel punto finale, non riescono a fornire informazioni sufficientemente dettagliate sui cambiamenti dinamici nel tasso di migrazione cellulare durante il periodo sperimentale. Inoltre, può essere difficile esaminare i potenziali cambiamenti nel tasso di migrazione cellulare a seconda del disegno sperimentale, dei tipi di cellule e del numero di cellule. Inoltre, gli effetti di trattamenti non complicati possono essere studiati con la semplice quantificazione dei tradizionali saggi di motilità, ma può essere necessaria una quantificazione più sofisticata per studiare gli effetti complessi di vari trattamenti combinati8.

E' stato messo a punto uno strumento per monitorare la corrente elettrica di una piastra per microtitolazione sul fondo di un pozzetto ricoperto di microelettrodi9. L'adesione delle cellule alla superficie del pozzetto ostacola il flusso di elettroni e l'impedenza è correlata al legame quantitativo e qualitativo delle cellule. La presenza dei microelettrodi sul fondo del pozzetto consente di misurare l'adesione, la diffusione e la proliferazione cellulare. La presenza dei microelettrodi sotto una membrana microporosa della camera superiore consente di misurare la migrazione e l'invasione cellulare nella camera inferiore, con la camera superiore rivestita con proteine della matrice extracellulare (ECM) per consentire l'invasione10.

In precedenza, è stato dimostrato che le misurazioni in tempo reale basate sull'impedenza della migrazione e dell'invasione delle cellule tumorali forniscono dati in tempo reale durante l'intero esperimento, nonché confronti e quantificazioni istantanei in varie condizioni sperimentali11. In quel documento, il knockdown genico è stato indotto per testare il ruolo delle proteine di interesse nella migrazione e nell'invasione delle cellule tumorali. Poiché un effetto di knockdown genico in piena regola nelle condizioni sperimentali testate ha richiesto 3-4 giorni dopo l'elettroporazione con piccoli RNA interferenti (siRNA)8, le cellule sono state ripiastrate dopo l'elettroporazione e riraccolte 3 giorni dopo per la misurazione in tempo reale basata sull'impedenza della migrazione e dell'invasione delle cellule tumorali.

CT10 regolatore della chinasi (Crk) e Crk-like (CrkL) sono proteine adattatrici che mediano le interazioni proteina-proteina a valle di varie vie chinasici del recettore del fattore di crescita e vie tirosin-chinasici non recettoriali12. Livelli elevati di proteine Crk e CrkL contribuiscono a una prognosi infausta in diversi tumori umani, tra cui il glioblastoma13. Tuttavia, non è chiaro come le proteine Crk e CrkL elevate portino a una prognosi infausta. Pertanto, è importante definire l'effetto della sovraespressione di Crk e CrkL sulle funzioni delle cellule tumorali. In precedenza, è stato eseguito uno studio di knockdown genico per dimostrare che i livelli endogeni delle proteine Crk e CrkL sono necessari per la migrazione e l'invasione delle cellule di glioblastoma8. Qui, è stato sviluppato un sistema di analisi modificato per affrontare l'effetto della sovraespressione di Crk e CrkL sulla migrazione e l'invasione delle cellule tumorali.

Recentemente, la sintesi in vitro dell'mRNA e le sue applicazioni terapeutiche hanno attirato una rinnovata attenzione a causa dello sviluppo dei vaccini a mRNA contro SARS-CoV-2 (revisionato da Verbeke et al.14). Inoltre, sono stati compiuti notevoli progressi nell'uso dell'mRNA sintetico nel cancro e in altre malattie15,16. L'elettroporazione delle cellule è un metodo efficace per fornire mRNA sintetico e indurre modificazioni genetiche transitorie (revisionato da Campillo-Davo et al.17), e l'uso di mRNA sintetico consente un'espressione genica rapida ed efficiente nei fibroblasti immortalizzati 18. Questo documento combina la sovraespressione genica utilizzando l'mRNA sintetico con analisi cellulari in tempo reale per studiare la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali. Tuttavia, lo schema sperimentale utilizzato per i siRNA non funziona con la trasfezione di mRNA sintetico, poiché il livello di proteine esogene aumenta rapidamente e diminuisce gradualmente dopo la trasfezione di mRNA sintetico18. Pertanto, il metodo è stato modificato per eseguire l'analisi in tempo reale della migrazione e dell'invasione cellulare subito dopo la trasfezione senza coltivare ulteriormente le cellule.

Questo documento dimostra che la combinazione di misurazioni in tempo reale basate sull'impedenza con la trasfezione di cellule tumorali con mRNA sintetici fornisce un'analisi rapida e completa degli effetti della sovraregolazione genica sulla migrazione e sull'invasione delle cellule tumorali. Questo documento descrive procedure dettagliate per misurare come la migrazione e l'invasione delle cellule di glioblastoma sono influenzate dalla sovraespressione di Crk e CrkL. Esaminando gli effetti dipendenti dalla concentrazione dell'mRNA sintetico sulla migrazione delle cellule tumorali, l'articolo descrive chiaramente come un aumento dei livelli proteici stimoli la migrazione delle cellule tumorali. Inoltre, viene presentato un approccio di variazione della concentrazione del gel ECM per valutare gli effetti dei cambiamenti nell'espressione genica sull'invasione delle cellule tumorali.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Sintesi dell'mRNA

NOTA: Per la sintesi dell'mRNA, tutti i reagenti e le apparecchiature devono essere trattati in modo speciale per inattivare le RNasi prima dell'uso. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli su tutti i materiali, gli strumenti e i reagenti utilizzati in questo protocollo.

  1. Linearizzazione del DNA
    NOTA: I cDNA murini di CrkI e CrkL sono stati clonati nel vettore di espressione pFLAG-CMV-5a per aggiungere il tag dell'epitopo FLAG all'estremità C e subclonati nel vettore pcDNA3.1/myc-His per incorporare il promotore T7, come descrittoin precedenza 18,19.
    1. Aggiungere 10 μL di tampone di reazione 10x, 1,5 μL di PmeI (10.000 unità/mL) e 10 μg di DNA plasmidico a una provetta per microcentrifuga per linearizzare il DNA plasmidico con l'enzima di restrizione. Aggiungere acqua priva di nucleasi per portare il volume di reazione a 100 μL.
    2. Miscelare picchiettando, centrifugare e incubare la miscela di reazione a 37 °C per una notte.
    3. Centrifugare e aggiungere 5 μL di sodio dodecil solfato (SDS) al 10% e 1 μL di proteinasi K (20 mg/mL, grado RNA) alla miscela di reazione. Miscelare alla spina, centrifugare e incubare a 50 °C per 30 min.
    4. Sotto la cappa aspirante, aggiungere 100 μL della fase inferiore di fenolo:cloroformio:alcol isoamilico alla miscela di reazione plasmidica per l'estrazione. Vortex, quindi centrifugare a 18.800 × g per 5 minuti a temperatura ambiente. Spostare la fase superiore su un nuovo tubo.
    5. Ripetere il passaggio 1.1.4 con cloroformio: alcol isoamilico a 24:1.
    6. Nella nuova provetta, portare il volume di reazione a 300 μL aggiungendo 200 μL di acqua priva di nucleasi, quindi aggiungere 30 μL di acetato di sodio 3 M e 600 μL di etanolo al 100%.
    7. Mescolare mediante vortice, quindi porre a -20 °C per 30-60 minuti per la precipitazione dell'etanolo del DNA.
    8. Centrifugare a 18.800 × g per 20 minuti a 4 °C, eliminare il surnatante e sciacquare il pellet con 1 ml di etanolo al 70%. Ripetere la centrifugazione per 10 minuti, quindi rimuovere completamente il surnatante.
    9. Asciugare con il tappo aperto per 2 minuti, aggiungere 30 μL di acqua priva di nucleasi e risospendere il pellet di DNA.
    10. Determinare la concentrazione di DNA utilizzando uno spettrofotometro.
    11. Verificare la dimensione e la quantità del DNA linearizzato utilizzando l'elettroforesi su gel di agarosio.
  2. Sintesi dell'RNA mediante T7 RNA polimerasi
    1. Aggiungere 2 μL ciascuno di 10 tamponi di trascrizione, ATP, GTP, UTP, CTP e T7 e 1 μg di DNA linearizzato a una provetta per microcentrifuga. Aggiungere acqua priva di nucleasi per portare il volume di reazione a 20 μL.
    2. Miscelare picchiettando, centrifugare e incubare la miscela di reazione a 37 °C per 2 ore per la sintesi dell'RNA.
    3. Centrifugare, aggiungere 1 μL di DNasi (2 U/μL) e incubare a 37 °C per 15 minuti per rimuovere il DNA stampo.
  3. Precipitazione del cloruro di litio dell'RNA
    1. Aggiungere 10 μL di cloruro di litio (7,5 M) alla miscela di reazione. Miscelare picchiettando, centrifugare e incubare la miscela di reazione a -20 °C per 30 minuti.
    2. Centrifugare a 18.800 × g per 20 minuti a 4 °C, eliminare il surnatante e sciacquare il pellet con 500 μL di etanolo al 70%. Ripetere la centrifugazione per 10 minuti, quindi rimuovere completamente il surnatante.
    3. Asciugare con il tappo aperto per 2 minuti, aggiungere 30 μL di acqua priva di nucleasi e risospendere il pellet di RNA.
  4. Tappatura
    1. Riscaldare il campione di RNA a 65 °C per 10 minuti, quindi metterlo sul ghiaccio per il raffreddamento.
    2. Aggiungere 5 μL ciascuno di 10x tampone di capping, 10 mM GTP e 1 mM (10x) S-adenosilmetionina (SAM), 2 μL ciascuno di una miscela di enzimi di capping e una miscela di enzimi O-metiltransferasi e 1,25 μL di inibitore della RNasi. Miscelare picchiettando, centrifugare e incubare la miscela di reazione a 37 °C per 1 ora.
  5. Coda in polietilene (A)
    1. Centrifugare il campione, quindi aggiungere 6 μL di acqua priva di nucleasi, 20 μL di tampone E-PAP 5x, 10 μL di MnCl2 da 25 mM, 10 μL di ATP 10 mM e 4 μL di enzima di coda poli(A) E-PAP. Miscelare picchiettando, centrifugare e incubare la miscela di reazione a 37 °C per 2 ore.
  6. Precipitazione del cloruro di litio e quantificazione dell'mRNA sintetico
    1. Aggiungere 50 μL di cloruro di litio (7,5 M) ed eseguire la precipitazione del cloruro di litio come descritto nei passaggi 1.3.1-1.3.3.
    2. Misurare la concentrazione dell'mRNA utilizzando uno spettrofotometro.
    3. Verificare la dimensione e la quantità di mRNA utilizzando l'elettroforesi su gel di formaldeide (1%-2%) agarosio (1%).

2. Rivestimento in gel della matrice extracellulare (ECM) delle piastre di invasione e migrazione cellulare (CIM)

NOTA: Una piastra CIM (Cell Invasion and Migration) è una piastra a 16 pozzetti prodotta commercialmente per l'analisi cellulare in tempo reale basata sull'impedenza. Per il saggio di invasione cellulare, rivestire le piastre CIM con gel ECM, come descritto in precedenza, ma con alcune modifiche11.

  1. Rimuovere un'aliquota di brodo di gel ECM dal congelatore e conservarla sul ghiaccio.
  2. Diluire il gel ECM (10 mg/mL) a una concentrazione di lavoro (100 μg/mL) mescolando 990 μL di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (senza siero o antibiotici) con 10 μL di gel ECM in una provetta per microcentrifuga. Miscelare mediante pipettaggio delicato.
  3. Aggiungere 60 μL di gel ECM diluito a ciascuno dei 16 pozzetti della camera superiore della piastra CIM. Applicare il metodo di pipettaggio inverso evitando le bolle d'aria20,21.
    NOTA: Ottimizzare la concentrazione del gel ECM per ogni linea cellulare. Per le linee cellulari di glioblastoma, per l'ottimizzazione è stato utilizzato gel ECM da 0,1 μg/μL a 1 μg/μL.
  4. Posizionare la camera superiore della piastra CIM con il coperchio della piastra su un foglio di plastica protettiva all'interno di un incubatore di CO2 per circa 4 ore per formare uno strato di gel.
    ATTENZIONE: Durante il rivestimento della piastra CIM con gel ECM, gli elettrodi della camera superiore della piastra CIM non devono avere contatto diretto con le mani dello sperimentatore o le superfici dell'apparecchiatura, compresa la cabina di biosicurezza o l'incubatore di CO2 .

3. Preparazione delle cellule tumorali

NOTA: Tutti i materiali di coltura cellulare devono essere mantenuti sterili. Prelevare ed elettropolizzare le cellule tumorali in una cabina di sicurezza biologica con adeguati dispositivi di protezione individuale (DPI), come descritto in precedenza ma con alcune modifiche11.

  1. Coltura delle cellule tumorali
    1. Coltura di cellule U-118MG in 10 mL di DMEM contenente il 5% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di antibiotici per piastra di coltura tissutale in polistirene da 100 mm x 20 mm a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 (condizione di coltura).
  2. Deplezione sierica delle cellule tumorali
    NOTA: L'esposizione delle cellule ai chemioattrattivi presenti in FBS deve essere ridotta al minimo prima dei saggi di migrazione e invasione cellulare utilizzando un'alta concentrazione di FBS.
    1. Rimuovere il vecchio terreno e aggiungere 10 ml di DMEM preriscaldato contenente lo 0,5% di FBS e l'1% di antibiotici per piatto (terreno a basso contenuto di siero).
    2. Ripetere il passaggio 3.2.1.
    3. Incubare le cellule a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 per 4 ore o più.
  3. Raccolta delle cellule tumorali
    1. Rimuovere il vecchio terreno, aggiungere 8 mL di soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS) preriscaldata per piatto, rimuovere il DPBS, aggiungere tripsina-EDTA allo 0,05% preriscaldato (2 mL/piatto) per coprire la superficie e incubare nell'incubatore CO2 per 30 secondi.
    2. Aspirare con cautela la tripsina-EDTA, aggiungere terreno a basso contenuto di siero (7 ml/piatto), quindi raccogliere le cellule in una provetta da centrifuga da 50 ml o 15 ml.
    3. Quotare un piccolo volume di celle e utilizzare un contatore di cellule automatizzato portatile per contare le cellule.
    4. Calcola il numero totale di celle e il volume richiesto per 10.000 cellule/μL.
    5. Centrifugare le cellule centrifugandole a 100 × g per 5 minuti a temperatura ambiente, aspirare il surnatante, aggiungere il volume calcolato di DMEM contenente lo 0,5% di FBS (senza antibiotici) e risospendere delicatamente il pellet cellulare.
    6. Trasferire 110 μL della sospensione cellulare, contenente 1,1 milioni di cellule, in una provetta per microcentrifuga per ogni trattamento.
    7. Ripetere il passaggio 3.3.6 per trasferire le cellule in quattro provette per microcentrifuga per quattro diversi trattamenti.
      NOTA: Una piastra CIM ha un totale di 16 pozzetti. Progettare quattro diversi trattamenti per il confronto in modo che sia possibile assegnare quattro pozzetti della piastra CIM per ciascun trattamento. Utilizzare le celle elettroporate per i seguenti esperimenti: analisi western blot (0,3 milioni di cellule per piastra di coltura tissutale da 35 mm), quattro pozzetti di saggi di migrazione cellulare in tempo reale (0,1 milioni di cellule/pozzetto) e quattro pozzetti di saggi di invasione cellulare in tempo reale (0,1 milioni di cellule/pozzetto) per ciascun trattamento. Regolare il numero di celle che devono essere elettroporate se il progetto sperimentale cambia.

4. Elettroporazione delle cellule tumorali

  1. Per rimuovere il terreno, aggiungere 1 mL di DPBS alla sospensione cellulare in ciascuna provetta, far ruotare la sospensione cellulare tre volte per 10 secondi ogni volta ruotando la provetta di 180° ogni 10 secondi utilizzando una mini centrifuga e rimuovere il surnatante utilizzando una micropipetta.
    NOTA: È importante formare un pellet cellulare compatto ma facilmente rispendibile.
  2. Aggiungere 110 μL di tampone di risospensione R al pellet cellulare per ottenere 0,1 milioni di cellule in 10 μL.
  3. Aggiungere mRNA sintetico al pellet cellulare per ottenere una concentrazione di 0,2-20 ng/μL a seconda del livello di espressione desiderato. Miscelare e risospendere delicatamente il pellet cellulare picchiettando o pipettando delicatamente.
    NOTA: Utilizzare diverse concentrazioni di mRNA sintetico, esaminare l'espressione proteica utilizzando l'analisi western blot e determinare la concentrazione di mRNA sintetico che porta al livello di espressione desiderato al fine di indagare la correlazione specifica tra l'espressione proteica e gli effetti biologici.
  4. Elettroporare 10 μL della sospensione cellulare con un sistema di elettroporazione a 1.350 V per 10 ms con tre impulsi ogni volta.
  5. Trasferire le celle elettroporate in una nuova provetta per microcentrifuga con 1,1 mL di DMEM contenente lo 0,5% di FBS.
  6. Ripetere l'elettroporazione fino a quando il resto della sospensione cellulare non è elettroporato. Combinare le celle elettroporate nella provetta per microcentrifuga per ottenere 1,1 milioni di cellule in 1,1 mL.
    NOTA: Sia i puntali per elettroporazione da 100 μL che quelli da 10 μL possono essere utilizzati per elettroporare un grande volume di cellule, ma i puntali per elettroporazione da 10 μL e 100 μL sono inclusi in due kit separati e devono essere acquistati separatamente. Il tampone di risospensione R è incluso in entrambi i kit.
  7. Dopo aver completato tutte le rispettive elettroporazioni, risospendere delicatamente le celle raggruppate.
  8. Piastra di 0,3 milioni di cellule in un piatto di coltura tissutale in polistirene da 35 mm x 10 mm con 2 mL di DMEM contenente il 5% di FBS e coltivare le cellule per 1 giorno in condizioni di coltura per la preparazione del lisato cellulare totale e le analisi western blot.
  9. Mantenere il resto delle celle elettroporate a temperatura ambiente fino a quando il sistema di analisi delle celle in tempo reale non è pronto.

5. Impostazione dell'analizzatore di celle in tempo reale, del programma e delle piastre CIM

NOTA: Preparare l'analizzatore di celle in tempo reale e due piastre CIM, come descritto in precedenza11.

  1. Equilibratura dell'analizzatore di celle in tempo reale
    1. Spostare l'analizzatore di cellule in tempo reale in un incubatore di CO2 diverse ore prima dell'uso per bilanciare il sistema in condizioni di coltura.
  2. Impostazione del programma di analisi
    1. Aprire il programma di analisi facendo doppio clic sull'icona del software di analisi cellulare in tempo reale sul desktop.
    2. Una volta aperta l'opzione Impostazione modello di esperimento predefinito , selezionare l'opzione per eseguire tre esperimenti separatamente.
      NOTA: Ogni base ha una finestra separata. Sono disponibili diverse schede per impostare l'intervallo e la durata della misurazione, l'analisi dei dati e altre condizioni sperimentali.
    3. Aprire ogni base facendo clic sulla scheda Numero .
    4. Fare clic sulla scheda Note esperimento, selezionare la cartella in cui verranno salvati i dati e immettere il nome dell'esperimento .
    5. Fare clic sulla scheda Layout , impostare i pozzetti quadruplicati per ciascuna condizione di trattamento selezionando quattro pozzetti alla volta e inserendo le informazioni sul campione, quindi fare clic su Applica.
    6. Fare clic sulla scheda Pianificazione | Aggiungere un passo per impostare la modalità a due fasi delle misurazioni dell'impedenza della cella. Quindi, fai clic su Applica per impostare il primo passaggio.
    7. Fare nuovamente clic su Aggiungi un passaggio, immettere 10 minuti per l'intervallo e 48 ore per la durata per la migrazione e l'invasione, quindi fare clic su Applica per impostare il secondo passaggio.
      NOTA: Il primo passaggio richiede una misurazione di base una tantum (una scansione con un intervallo di 1 minuto). La seconda fase misura l'impedenza cellulare per l'esperimento (ad esempio, 289 sweep con un intervallo di 10 minuti per 48 ore) nella culla. Regolare l'intervallo e la durata in base al disegno sperimentale.
    8. Passare alla base successiva e configurarla ripetendo i passaggi 5.2.3-5.2.7.
  3. Preparazione delle lastre CIM
    1. Un'ora prima dell'inizio della misurazione dell'impedenza cellulare, riempire i pozzetti della camera inferiore della piastra CIM con 160 μL di DMEM contenente il 10% di siero o altri chemioattrattivi.
    2. Assemblare la camera superiore che contiene i pozzetti rivestiti di gel ECM (per l'invasione) o i pozzetti non rivestiti (per la migrazione) con la camera inferiore.
    3. Aggiungere 50 μL di terreno a basso contenuto di siero ai pozzetti della camera superiore della piastra CIM per il saggio di migrazione cellulare e posizionare la piastra CIM nella culla del sistema.
    4. Fare clic sulla scheda Messaggio e assicurarsi che venga visualizzato il messaggio Connessioni ok . La piastra CIM è ora pronta per l'esperimento.
    5. Preincubare la piastra CIM assemblata nell'incubatore di CO2 per 30-60 minuti prima dell'analisi cellulare in tempo reale per acclimatare la piastra CIM alle condizioni di coltura.

6. Analisi delle celle in tempo reale ed esportazione dei dati

NOTA: Eseguire una lettura della linea di base, la semina delle celle, la misurazione dell'impedenza cellulare e l'esportazione dei dati come descritto in precedenza11.

  1. Lettura di base
    NOTA: La linea di base deve essere letta dopo che la piastra CIM è stata acclimatata e prima che le cellule vengano aggiunte ai pozzetti della camera superiore.
    1. Fare clic sul pulsante Start per ogni base. Quando viene visualizzata la finestra Salva con nome , salvare il file sperimentale per eseguire la lettura della linea di base.
  2. Semina cellulare
    1. Rimuovere la piastra CIM dalla base e posizionarla nell'armadio di biosicurezza sul supporto della piastra.
    2. Aggiungere 100 μL (contenenti 100.000 celle) di celle elettroporate ai pozzetti della camera superiore della piastra CIM secondo il programma nell'unità di controllo. Applicare il metodo di pipettaggio inverso evitando la formazione di bolle d'aria.
    3. Lasciare la piastra CIM sotto l'armadio di biosicurezza per 30 minuti a temperatura ambiente per assicurarsi che le cellule si distribuiscano uniformemente sul fondo del pozzetto.
  3. Misura dell'impedenza delle celle
    1. Riportare la piastra CIM completamente assemblata nella rispettiva base. Fare clic sul pulsante Start della base per iniziare la misurazione dell'impedenza della cella per il secondo passaggio.
    2. Fare clic sulla scheda Grafico , quindi fare clic sul pulsante Aggiungi tutto e selezionare le caselle Media e STD DEV per visualizzare i dati in tempo reale.
      NOTA: L'opzione di stampa di default è Tempo per l'asse x e Indice cella per l'asse y. La sezione Selezione grafico consente all'utente di selezionare opzioni alternative per l'asse y: Indice cella normalizzato o Indice cella delta. Una volta eseguita la scansione finale, l'esperimento è completato e i risultati vengono salvati automaticamente.
  4. Esportazione dei dati per l'analisi
    1. Fare clic sulla scheda Grafico e selezionare le caselle Media e STD DEV per copiare i dati per ciascun pozzetto singolarmente.
    2. Fare clic con il pulsante destro del mouse sull'area del tracciato e selezionare Copia dati in formato elenco.
    3. Apri un foglio di calcolo vuoto, incolla i dati e salva il file.
    4. Tornare al programma di analisi, fare clic sulla scheda Piastra per ciascuna base e selezionare Rilascia per chiudere l'esperimento per la culla.
    5. Tornare al file del foglio di calcolo e regolare l'ora dei dati grezzi in modo che l'ora di inizio del secondo passaggio diventi l'ora di inizio effettiva della misurazione.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le proteine Crk e CrkL svolgono un ruolo importante nella motilità di molti tipi di cellule, tra cui i neuroni22, le cellule T23, i fibroblasti 18,19 e una varietà di cellule tumorali13. Poiché le proteine Crk e CrkL sono state segnalate per essere elevate nel glioblastoma24,25,26, in questo lavoro sono stati studiati gli effetti della sovraespressione di CrkI, una var...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La migrazione e l'invasione sono caratteristiche importanti delle cellule tumorali. La misurazione della motilità delle cellule tumorali e la comprensione del meccanismo sottostante che controlla la motilità delle cellule tumorali forniscono informazioni critiche sugli interventi terapeutici 2,27. Sono stati sviluppati diversi metodi per studiare la migrazione cellulare7. Il test di guarigione delle ferite che utilizza graffi o inserti di ...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori ringraziano il Medical Writing Center del Children's Mercy Kansas City per aver curato questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione A.R.T. di Natalie (a T.P.) e da una sovvenzione del Comitato Consultivo dei Partner MCA da parte del Children's Mercy Hospital (CMH) e del Centro Oncologico dell'Università del Kansas (KUCC) (a T.P.).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AlphaImager HPProteinSimple92-13823-00Sistema di imaging su gel di agarosio
&alfa;-Tubulina anticorpoSigmaT9026Utilizzato per rilevare la proteina &alfa;-tubulina (diluizione 1:3.000)
CIM-piastra 16Agilent Technologies, Inc5665825001Piastre di invasione e migrazione cellulare
Anticorpo CrkBD Biosciences610035Utilizzato per rilevare le proteine CrkI e CrkII (diluizione 1:1.500)
Anticorpo CrkLSanta Cruzsc-319Utilizzato per rilevare la proteina CrkL (diluizione 1:1.500)
Dulbecco' s Aquila modificata' s Medium (DMEM)ATCC302002Terreno di coltura cellulare
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS)Corning21-031-CVTampone utilizzato per lavare le cellule
Siero fetale bovino (FBS)HycloneSH30910.03Integratore di terreno di coltura
Heracell VIOS 160i Incubatore a CO2Thermo Scientific51030285
IRDye 800CW capra anticorpo secondario IgG anti-topoLi-Cor926-32210Anticorpo secondario per analisi Western blot (diluizione 1:10.000)
IRDye 800CW capra anti-coniglio Anticorpo secondarioIgG Li-Cor926-32211Anticorpo secondario per analisi Western blot  (diluizione 1:10.000)
Cloruro di litio InvitrogenAM9480Utilizzato per la precipitazione dell'RNA
Matrice MatrigelCorning354234Gel per matrice extracellulare (ECM)
Kit di trascrizione MEGAscript T7InvitrogenAM1334Utilizzato per la sintesi di RNA
Marcatori di RNA MillenniumInvitrogenAM7150Utilizzato per l'elettroforesi su gel di agarosio di formaldeide
Mini centrifugaISC BioExpressC1301P-ISCUtilizzato per lo spin-down delle cellule
Cervello di topo QUICK-Clone cDNATaKaRa637301Fonte di geni (inserti) per la clonazione
NanoQuantTecanM200PROSistema di quantificazione degli acidi nucleici
Sistema di elettroporazione al neon ThermoFisher ScientificMPK5000Sistema di elettroporazione1
Sistema di trasfezione al neon 10 & micro; Kit a LThermoFisher ScientificMPK1025Kit di elettroporazione
Sistema di trasfezione al neon 100 µ Kit LThermoFisher ScientificMPK10096Kit per elettroporazione
NorthernMax tampone gel denaturanteInvitrogenAM8676Utilizzato per l'elettroforesi su gel di formaldeide
NorthernMax colorante con carica di formaldeideInvitrogenAM8552Utilizzato per l'elettroforesi su gel di formaldeide e agarosio
NorthernMax tampone da corsaInvitrogenAM8671Utilizzato per l'elettroforesi su gel di agarosio di formaldeide
Acqua priva di nucleasiTeknovaW3331Utilizzato per varie reazioni durante la sintesi dell'mRNA
Odyssey CLx ImagerLi-CorImager per l'analisi Western blot
pcDNA3.1/myc-HisInvitrogenV80020Il vettore in cui sono stati clonati gli inserti (cDNA CrkI e CrkL di topo)
pFLAG-CMV-5aMillipore SigmaE7523Fonte dell'etichetta dell'epitopo FLAG
Fenolo:cloroformio:alcol isoamilico SigmaP2069Utilizzato per
PmeINew England BioLabsR0560LUtilizzato per linearizzare i plasmidi per la sintesi dell'mRNA
Kit di coda Poly(A)InvitrogenAM1350Utilizzato per la reazione della coda di poli(A)
Piatto di coltura tissutale in polistirene (stile 100 x 20 mm)Corning353003Utilizzato per la coltura di cellule prima della trasfezione
Piastra per colture tissutali in polistirene (stile 35 x 10 mm)Corning353001Utilizzato per la coltura di cellule trasfettate
Proteinasi KInvitrogen25530049Utilizzato per rimuovere le proteine nella miscela di reazione
Purificatore Assioma Classe II, Tipo C1Labconco Corporation304410001Armadio di biosicurezza per la manipolazione sterile di cellule
Tampone di risospensione RThermoFisher ScientificUn tampone incluso nei kit di elettroporazione, MPK1025 e MPK10096. Il tampone viene utilizzato per ricostituire le cellule prima dell'elettroporazione e la sua composizione è costituita da informazioni proprietarie.
RNaseZapInvitrogenAM9780Soluzione di decontaminazione dell'RNA
ScettroMilliporeC85360Contatore cellulare automatizzato portatile 
ScriptCap Kit 2'-O-metiltransferasiCellscriptC-SCMT0625Utilizzato per la reazione di tappatura
ScriptCap m7G Sistema di tappaturaCellscriptC-SCCE0625Utilizzato per la reazione di tappatura
Soluzione di sodio dodecil solfatoInvitrogen15553-035Detergente utilizzato per la reazione della proteinasi K
Centrifuga Sorvall Legend XTThermo Scientific75004532Centrifuga da banco per la centrifuga delle cellule
Tripsina-EDTAGibco25300-054Utilizzata per la dissociazione delle cellule
U-118MG ATCCHTB15Una linea cellulare aderente derivata da un paziente affetto da glioblastoma umano
Anticorpo vinculinaSigmaV9131Utilizzato per rilevare la proteina vinculina (diluizione 1:100.000)
xCELLigence RTCA DPAgilent Technologies, Inc380601050Strumento utilizzato per l'analisi
cellulare in tempo reale1I parametri di elettroporazione e altre informazioni correlate per varie linee cellulari sono disponibili sulla homepage del produttore (https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html?).
l'estrazione del DNA

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Palmer, T. D., Ashby, W. J., Lewis, J. D., Zijlstra, A. Targeting tumor cell motility to prevent metastasis. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (8), 568-581 (2011).
  2. Eccles, S. A., Box, C., Court, W. Cell migration/invasion assays and their application in cancer drug discovery. Biotechnology Annual Review. 11, 391-421 (2005).
  3. Kluiver, T. A., Alieva, M., van Vuurden, D. G., Wehrens, E. J., Rios, A. C. Invaders exposed: Understanding and targeting tumor cell invasion in diffuse intrinsic pontine glioma. Frontiers in Oncology. 10, 92(2020).
  4. Xie, Q., Mittal, S., Berens, M. E. Targeting adaptive glioblastoma: An overview of proliferation and invasion. Neuro-Oncology. 16 (12), 1575-1584 (2014).
  5. Wee, Y., Wang, T., Liu, Y., Li, X., Zhao, M. A pan-cancer study of copy number gain and up-regulation in human oncogenes. Life Sciences. 211, 206-214 (2018).
  6. Zhao, M., Liu, Y., Qu, H. Expression of epithelial-mesenchymal transition-related genes increases with copy number in multiple cancer types. Oncotarget. 7 (17), 24688-24699 (2016).
  7. Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107(2019).
  8. Park, T., Large, N., Curran, T. Quantitative assessment of glioblastoma phenotypes in vitro establishes cell migration as a robust readout of Crk and CrkL activity. The Journal of Biological Chemistry. 296, 100390(2021).
  9. Urcan, E., et al. Real-time xCELLigence impedance analysis of the cytotoxicity of dental composite components on human gingival fibroblasts. Dental Materials. 26 (1), 51-58 (2010).
  10. Limame, R., et al. Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays. PLoS One. 7 (10), e46536(2012).
  11. Mudduluru, G., Large, N., Park, T. Impedance-based real-time measurement of cancer cell migration and invasion. Journal of Visualized Experiments. (158), e60997(2020).
  12. Feller, S. M. Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles. Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).
  13. Park, T. Crk and CrkL as therapeutic targets for cancer treatment. Cells. 10 (4), 739(2021).
  14. Verbeke, R., Lentacker, I., De Smedt, S. C., Dewitte, H. The dawn of mRNA vaccines: The COVID-19 case. Journal of Controlled Release. 333, 511-520 (2021).
  15. Heine, A., Juranek, S., Brossart, P. Clinical and immunological effects of mRNA vaccines in malignant diseases. Molecular Cancer. 20 (1), 52(2021).
  16. Kwon, H., et al. Emergence of synthetic mRNA: In vitro synthesis of mRNA and its applications in regenerative medicine. Biomaterials. 156, 172-193 (2018).
  17. Campillo-Davo, D., et al. The ins and outs of messenger RNA electroporation for physical gene delivery in immune cell-based therapy. Pharmaceutics. 13 (3), 396(2021).
  18. Park, T., Koptyra, M., Curran, T. Fibroblast growth requires CT10 regulator of kinase (Crk) and Crk-like (CrkL). The Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).
  19. Park, T. J., Curran, T. Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility. Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).
  20. Chou, P. P., Jaynes, P. K., King, B. P., Chapman, E., Bailey, J. L. Precision comparison between conventional (method-I) and reverse (method-Ii) pipetting. Clinical Chemistry. 30 (6), 958(1984).
  21. Pushparaj, P. N. Revisiting the micropipetting techniques in biomedical sciences: A fundamental prerequisite in good laboratory practice. Bioinformation. 16 (1), 8-12 (2020).
  22. Park, T. J., Curran, T. Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway. The Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).
  23. Huang, Y., et al. CRK proteins selectively regulate T cell migration into inflamed tissues. The Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 1019-1032 (2015).
  24. Wang, L., et al. Signaling adaptor protein Crk is indispensable for malignant feature of glioblastoma cell line KMG4. Biochemical and Biophysical Research Communications. 362 (4), 976-981 (2007).
  25. Kumar, S., et al. Reciprocal regulation of Abl kinase by Crk Y251 and Abi1 controls invasive phenotypes in glioblastoma. Oncotarget. 6 (35), 37792-37807 (2015).
  26. Kumar, S., et al. Crk tyrosine phosphorylation regulates PDGF-BB-inducible Src activation and breast tumorigenicity and metastasis. Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).
  27. Raudenska, M., et al. Engine shutdown: Migrastatic strategies and prevention of metastases. Trends in Cancer. 9 (4), 293-308 (2023).
  28. Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration. Medicinal Research Reviews. 27 (2), 149-176 (2007).
  29. Farasani, A., Darbre, P. D. Long-term exposure to triclosan increases migration and invasion of human breast epithelial cells in vitro. Journal of Applied Toxicology. 41 (7), 1115-1126 (2021).
  30. Hanusova, V., Skalova, L., Kralova, V., Matouskova, P. The effect of flubendazole on adhesion and migration in SW480 and SW620 colon cancer cells. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (6), 837-846 (2018).
  31. Lago-Baameiro, N., et al. PARK7/DJ-1 inhibition decreases invasion and proliferation of uveal melanoma cells. Tumori. 109 (1), 47-53 (2023).
  32. Escalona, R. M., et al. Knock down of TIMP-2 by siRNA and CRISPR/Cas9 mediates diverse cellular reprogramming of metastasis and chemosensitivity in ovarian cancer. Cancer Cell International. 22 (1), 422(2022).
  33. Mosca, L., et al. Effects of S-adenosyl-L-methionine on the invasion and migration of head and neck squamous cancer cells and analysis of the underlying mechanisms. International Journal of Oncology. 56 (5), 1212-1224 (2020).
  34. Zhao, Q., et al. VEGI174 protein and its functional domain peptides exert antitumour effects on renal cell carcinoma. International Journal of Oncology. 54 (1), 390-398 (2019).
  35. Witte, D., et al. TGF-beta1-induced cell migration in pancreatic carcinoma cells is RAC1 and NOX4-dependent and requires RAC1 and NOX4-dependent activation of p38 MAPK. Oncology Reports. 38 (6), 3693-3701 (2017).
  36. Bui, L. C., et al. Regulation of aquaporin 3 expression by the AhR pathway is critical to cell migration. Toxicological Sciences. 149 (1), 158-166 (2016).
  37. Tsuji, K., et al. Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
  38. Frandsen, S. K., McNeil, A. K., Novak, I., McNeil, P. L., Gehl, J. Difference in membrane repair capacity between cancer cell lines and a normal cell line. The Journal of Membrane Biology. 249 (4), 569-576 (2016).

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