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Cancer Research

सिंथेटिक एमआरएनए अभिकर्मक के बाद ट्यूमर सेल माइग्रेशन और आक्रमण का वास्तविक समय मात्रात्मक माप

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/64274
Automatic Translation
1,2, 1
1Children’s Mercy Research Institute, Children’s Mercy Kansas City, 2Department of Pediatrics, University of Missouri-Kansas City School of Medicine

Summary

कई अनियमित जीन ट्यूमर सेल माइग्रेशन और आक्रमण को उत्तेजित करते हैं, जिससे खराब रोग का निदान होता है। यह निर्धारित करना कि कौन से जीन ट्यूमर सेल माइग्रेशन और आक्रमण को नियंत्रित करते हैं, महत्वपूर्ण है। यह प्रोटोकॉल वास्तविक समय में ट्यूमर कोशिकाओं के प्रवास और आक्रमण पर जीन की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति के प्रभावों की जांच के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है।

Abstract

ट्यूमर कोशिकाएं अत्यधिक गतिशील और आक्रामक होती हैं और परिवर्तित जीन अभिव्यक्ति पैटर्न प्रदर्शित करती हैं। जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन ट्यूमर सेल माइग्रेशन और आक्रमण को कैसे नियंत्रित करते हैं, इसका ज्ञान पड़ोसी स्वस्थ ऊतकों और मेटास्टेसिस में ट्यूमर सेल घुसपैठ के तंत्र को समझने के लिए आवश्यक है। पहले, यह प्रदर्शित किया गया था कि ट्यूमर सेल माइग्रेशन और आक्रमण के प्रतिबाधा-आधारित वास्तविक समय माप के बाद जीन वध ट्यूमर सेल माइग्रेशन और आक्रमण के लिए आवश्यक जीन की पहचान को सक्षम बनाता है। हाल ही में, सार्स-सीओवी-2 के खिलाफ एमआरएनए टीकों ने चिकित्सीय उद्देश्यों के लिए सिंथेटिक एमआरएनए का उपयोग करने में रुचि बढ़ाई है। यहां, सिंथेटिक एमआरएनए का उपयोग करने वाली विधि को ट्यूमर सेल माइग्रेशन और आक्रमण पर जीन ओवरएक्प्रेशन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए संशोधित किया गया था। यह अध्ययन दर्शाता है कि प्रतिबाधा-आधारित वास्तविक समय माप के बाद सिंथेटिक एमआरएनए अभिकर्मक के साथ ऊंचा जीन अभिव्यक्ति उन जीनों की पहचान करने में मदद कर सकती है जो ट्यूमर सेल प्रवास और आक्रमण को उत्तेजित करते हैं। यह विधि पत्र ट्यूमर सेल माइग्रेशन और आक्रमण पर परिवर्तित जीन अभिव्यक्ति के प्रभाव की जांच के लिए प्रक्रियाओं पर महत्वपूर्ण विवरण प्रदान करता है।

Introduction

ट्यूमर सेल गतिशीलता मेटास्टेसिस 1,2 में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। पड़ोसी और दूरस्थ स्वस्थ ऊतकों में ट्यूमर कोशिकाओं का प्रसार कैंसर के उपचार को मुश्किल बनाता है और पुनरावृत्ति में योगदान देताहै 3,4. इसलिए, ट्यूमर सेल गतिशीलता के तंत्र को समझना और प्रासंगिक चिकित्सीय रणनीतियों को विकसित करना आवश्यक है। चूंकि कई ट्यूमर कोशिकाओं ने जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल को बदल दिया है, इसलिए यह समझना महत्वपूर्ण है कि जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल में कौन से परिवर्तन ट्यूमर सेल गतिशीलता 5,6 को बदल देते हैं।

विट्रो में सेल माइग्रेशन को मापने के लिए कई परख विकसित किए गए हैं। कुछ परख केवल विशिष्ट समय बिंदुओं पर माप की अनुमति देने के कारण सीमित जानकारी प्रदान करते हैं, जबकि अन्य वास्तविक समय7 में ट्यूमर सेल गतिशीलता पर व्यापक जानकारी प्रदान करते हैं। यद्यपि इनमें से कई सेल गतिशीलता परख किसी दिए गए समय या समापन बिंदु पर मात्रात्मक परिणाम प्रदान कर सकते हैं, वे प्रयोगात्मक अवधि में सेल माइग्रेशन की दर में गतिशील परिवर्तनों पर पर्याप्त विस्तृत जानकारी प्रदान करने में विफल रहते हैं। इसके अलावा, प्रयोगात्मक डिजाइन, सेल प्रकार और सेल संख्या के आधार पर सेल माइग्रेशन दर में संभावित परिवर्तनों की जांच करना मुश्किल हो सकता है। इसके अलावा, पारंपरिक गतिशीलता परख ों के सरल परिमाणीकरण द्वारा सरल उपचार के प्रभावों की जांच की जा सकती है, लेकिन विभिन्नसंयुक्त उपचारों के जटिल प्रभावों का अध्ययन करने के लिए अधिक परिष्कृत परिमाणीकरण की आवश्यकता हो सकती है।

माइक्रोइलेक्ट्रोड से ढकी माइक्रोटिटर प्लेट के विद्युत प्रवाह की निगरानी के लिए एकउपकरण विकसित किया गया है। कुएं की सतह पर कोशिकाओं का आसंजन इलेक्ट्रॉन प्रवाह को बाधित करता है, और प्रतिबाधा कोशिकाओं के मात्रात्मक और गुणात्मक बंधन से संबंधित है। कुएं के तल पर माइक्रोइलेक्ट्रोड की उपस्थिति सेल आसंजन, प्रसार और प्रसार के माप की अनुमति देती है। ऊपरी कक्ष की एक माइक्रोपोरस झिल्ली के नीचे माइक्रोइलेक्ट्रोड की उपस्थिति निचले कक्ष में सेल माइग्रेशन और आक्रमण के माप की अनुमति देती है, जिसमें ऊपरी कक्ष को बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन के साथ लेपित किया जाता है ताकि आक्रमण10 की अनुमति मिल सके।

पहले, यह प्रदर्शित किया गया था कि ट्यूमर सेल माइग्रेशन और आक्रमण के प्रतिबाधा-आधारित वास्तविक समय माप पूरे प्रयोग के दौरान वास्तविक समय डेटा प्रदान करते हैं, साथ ही विभिन्नप्रयोगात्मक स्थितियों के तहत तत्काल तुलना और परिमाणीकरण भी प्रदान करते हैं। उस विधि पत्र में, जीन वध को ट्यूमर सेल माइग्रेशन और आक्रमण में रुचि के प्रोटीन की भूमिका का परीक्षण करने के लिए प्रेरित किया गया था। चूंकि परीक्षण की गई प्रयोगात्मक स्थितियों के तहत एक पूर्ण विकसित जीन वध प्रभाव में छोटे हस्तक्षेप करने वाले आरएनए (एसआईआरएनए) 8 के साथ इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद 3-4 दिन लगते हैं, इसलिए इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद कोशिकाओं को फिर से चढ़ाया गया और ट्यूमर सेल माइग्रेशन और आक्रमण के प्रतिबाधा-आधारित वास्तविक समय माप के लिए 3 दिन बाद फिर से काटा गया।

काइनेज (सीआरके) और सीआरके-जैसे (सीआरकेएल) के सीटी 10 नियामक एडाप्टर प्रोटीन हैं जो विभिन्न विकास कारक रिसेप्टर किनेज मार्गों और नॉनसेप्टर टायरोसिन किनेजमार्गों के डाउनस्ट्रीम प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन को मध्यस्थ करते हैं। सीआरके और सीआरकेएल प्रोटीन के ऊंचे स्तर ग्लियोब्लास्टोमा13 सहित कई मानव कैंसर में खराब रोग का निदान करने में योगदान करते हैं। हालांकि, यह स्पष्ट नहीं है कि कैसे ऊंचा सीआरके और सीआरकेएल प्रोटीन एक खराब रोग का कारण बनता है। इसलिए, ट्यूमर सेल कार्यों पर सीआरके और सीआरकेएल ओवरएक्प्रेशन के प्रभाव को परिभाषित करना महत्वपूर्ण है। इससे पहले, एक जीन वध अध्ययन यह प्रदर्शित करने के लिए किया गया था कि ग्लियोब्लास्टोमा सेल माइग्रेशन और आक्रमण8 के लिए सीआरके और सीआरकेएल प्रोटीन के अंतर्जात स्तर की आवश्यकता होती है। यहां, ट्यूमर सेल माइग्रेशन और आक्रमण पर सीआरके और सीआरकेएल ओवरएक्प्रेशन के प्रभाव को संबोधित करने के लिए एक संशोधित परख प्रणाली विकसित की गई है।

हाल ही में, एमआरएनए के इन विट्रो संश्लेषण और इसके चिकित्सीय अनुप्रयोगों ने सार्स-सीओवी-2 के खिलाफ एमआरएनए टीकों के विकास के कारण नए सिरे से ध्यान आकर्षित किया है (वर्बेके एट अल.14 द्वारा समीक्षा की गई)। इसके अलावा, कैंसर औरअन्य बीमारियों में सिंथेटिक एमआरएनए का उपयोग करने में उल्लेखनीय प्रगति हुई है। कोशिकाओं का विद्युतीकरण सिंथेटिक एमआरएनए देने और क्षणिक आनुवंशिक संशोधन को प्रेरित करने के लिए एक प्रभावी तरीका है (कैम्पिलो-डेवो एट अल .17 द्वारा समीक्षा की गई), और सिंथेटिक एमआरएनए का उपयोग अमर फाइब्रोब्लास्ट18 में तेजी से और कुशल जीन अभिव्यक्ति को सक्षम बनाता है। यह विधि पेपर ट्यूमर सेल माइग्रेशन और आक्रमण का अध्ययन करने के लिए वास्तविक समय सेल विश्लेषण के साथ सिंथेटिक एमआरएनए का उपयोग करके जीन ओवरएक्प्रेशन को जोड़ती है। हालांकि, एसआईआरएनए के लिए उपयोग की जाने वाली प्रयोगात्मक योजना सिंथेटिक एमआरएनए अभिकर्मक के साथ काम नहीं करती है, क्योंकि बहिर्जात प्रोटीन का स्तर तेजी से बढ़ता है और सिंथेटिक एमआरएनए अभिकर्मक18 पर धीरे-धीरे घटता है। इसलिए, कोशिकाओं को अतिरिक्त रूप से संवर्धन किए बिना अभिकर्मक के ठीक बाद सेल माइग्रेशन और आक्रमण का वास्तविक समय विश्लेषण करने के लिए विधि को संशोधित किया गया है।

यह विधि पत्र दर्शाता है कि सिंथेटिक एमआरएनए के साथ ट्यूमर कोशिकाओं के अभिकर्मक के साथ प्रतिबाधा-आधारित वास्तविक समय माप का संयोजन ट्यूमर सेल माइग्रेशन और आक्रमण पर जीन अपरेगुलेशन के प्रभावों का तेजी से और व्यापक विश्लेषण प्रदान करता है। यह विधि पत्र यह मापने के लिए विस्तृत प्रक्रियाओं का वर्णन करता है कि कैसे ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं का प्रवास और आक्रमण सीआरके और सीआरकेएल के अतिवृद्धि से प्रभावित होता है। ट्यूमर सेल माइग्रेशन पर सिंथेटिक एमआरएनए के एकाग्रता-निर्भर प्रभावों की जांच करके, पेपर स्पष्ट रूप से वर्णन करता है कि प्रोटीन के स्तर में वृद्धि ट्यूमर सेल माइग्रेशन को कैसे उत्तेजित करती है। इसके अलावा, ट्यूमर सेल आक्रमण पर जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन के प्रभावों का आकलन करने के लिए ईसीएम जेल की एकाग्रता को बदलने का एक दृष्टिकोण प्रस्तुत किया गया है।

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Protocol

1. एमआरएनए का संश्लेषण

नोट: एमआरएनए संश्लेषण के लिए, सभी अभिकर्मकों और उपकरणों को विशेष रूप से उपयोग से पहले RNases को निष्क्रिय करने के लिए इलाज किया जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों, उपकरणों और अभिकर्मकों के बारे में विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।

  1. डीएनए का रैखिककरण।
    नोट: सीआरकेआई और सीआरकेएल के माउस सीडीएनए को सी-टर्मिनस पर फ्लैग एपिटोप टैग जोड़ने के लिए पीएफएलएजी-सीएमवी -5 ए अभिव्यक्ति वेक्टर में क्लोन किया गया था और टी 7 प्रमोटर को शामिल करने के लिए पीसीडीएनए 3.1/माइक-हिज वेक्टर में सबक्लोन किया गया था, जैसा कि पहले वर्णित18,19 बताया गया था।
    1. प्रतिबंध एंजाइम के साथ प्लास्मिड डीएनए को रैखिक बनाने के लिए एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 10 μL 10x प्रतिक्रिया बफर, 1.5 μL PmeI (10,000 यूनिट / एमएल) और प्लास्मिड डीएनए के 10 μg जोड़ें। प्रतिक्रिया की मात्रा को 100 μL तक लाने के लिए न्यूक्लियस-मुक्त पानी जोड़ें।
    2. टैप करके मिलाएं, नीचे घुमाएं, और रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया मिश्रण को इनक्यूबेट करें।
    3. नीचे घुमाएं, और प्रतिक्रिया मिश्रण में 10% सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) के 5 μL और प्रोटीन के (20 मिलीग्राम / एमएल, आरएनए ग्रेड) के 1 μL जोड़ें। टैप करके मिलाएं, नीचे घुमाएं, और 30 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    4. फ्यूम हुड के तहत, निष्कर्षण के लिए प्लास्मिड प्रतिक्रिया मिश्रण में फिनोल: क्लोरोफॉर्म: आइसोमाइल अल्कोहल के निचले चरण के 100 μL जोड़ें। भंवर, और फिर कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 18,800 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज। ऊपरी चरण को एक नई ट्यूब में ले जाएं।
    5. क्लोरोफॉर्म के साथ चरण 1.1.4 दोहराएं: आइसोमाइल अल्कोहल 24: 1 पर।
    6. नई ट्यूब में, न्यूक्लियस-मुक्त पानी के 200 μL जोड़कर प्रतिक्रिया की मात्रा को 300 μL तक लाएं, और फिर 3 M सोडियम एसीटेट के 30 μL और 100% इथेनॉल के 600 μL जोड़ें।
    7. भंवर द्वारा मिलाएं, और फिर डीएनए के इथेनॉल वर्षा के लिए 30-60 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 18,800 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज, सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें, और 70% इथेनॉल के 1 एमएल के साथ गोली को कुल्ला करें। 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन दोहराएं, और फिर सतह पर तैरनेवाला को पूरी तरह से हटा दें।
    9. 2 मिनट के लिए टोपी खोलने के साथ सुखाएं, 30 μL न्यूक्लियस-मुक्त पानी जोड़ें, और डीएनए गोली को फिर से निलंबित करें।
    10. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके डीएनए एकाग्रता निर्धारित करें।
    11. एगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करके रैखिक डीएनए के आकार और मात्रा को सत्यापित करें।
  2. टी 7 आरएनए पोलीमरेज़ का उपयोग करके आरएनए संश्लेषण
    1. 10x ट्रांसक्रिप्शन बफर, एटीपी, जीटीपी, यूटीपी, सीटीपी, और टी 7 में से प्रत्येक 2 μL और एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में एक रैखिक डीएनए के 1 μg जोड़ें। प्रतिक्रिया की मात्रा को 20 μL तक लाने के लिए न्यूक्लियस-मुक्त पानी जोड़ें।
    2. आरएनए संश्लेषण के लिए 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया मिश्रण को टैप करके, स्पिन करके और इनक्यूबेट करके मिलाएं।
    3. नीचे घुमाएं, DNase (2 U / μL) का 1 μL जोड़ें, और टेम्पलेट डीएनए को हटाने के लिए 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  3. आरएनए की लिथियम क्लोराइड वर्षा।
    1. प्रतिक्रिया मिश्रण में लिथियम क्लोराइड (7.5 एम) के 10 μL जोड़ें। टैप करके मिलाएं, नीचे घुमाएं, और 30 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया मिश्रण को इनक्यूबेट करें।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 18,800 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज, सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें, और 70% इथेनॉल के 500 μL के साथ गोली को कुल्ला करें। 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन दोहराएं, और फिर सतह पर तैरनेवाला को पूरी तरह से हटा दें।
    3. 2 मिनट के लिए टोपी खोलने के साथ सुखाएं, 30 μL न्यूक्लियस-मुक्त पानी जोड़ें, और आरएनए गोली को फिर से निलंबित करें।
  4. कैपिंग
    1. आरएनए नमूने को 10 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें, और फिर इसे ठंडा करने के लिए बर्फ पर रखें।
    2. 10x कैपिंग बफर, 10 mM GTP, और 1 mM (10x) S-एडेनोसिलमेथिओनिन (SAM), कैपिंग एंजाइम मिश्रण और O-मिथाइलट्रांसफेरेज़ एंजाइम मिश्रण के 2 μL प्रत्येक, और RNase अवरोधक के 1.25 μL जोड़ें। टैप करके मिलाएं, नीचे घुमाएं, और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया मिश्रण को इनक्यूबेट करें।
  5. पॉली (ए) टेलिंग
    1. नमूने को नीचे घुमाएं, और फिर 6 μL न्यूक्लियस-मुक्त पानी, 5x E-PAP बफर के 20 μL, 25 mM MnCl2 के 10 μL, 10 mM ATP के 10 μL, और E-PAP पॉली (A) टेलिंग एंजाइम के 4 μL जोड़ें। टैप करके मिलाएं, नीचे घुमाएं, और 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया मिश्रण को इनक्यूबेट करें।
  6. लिथियम क्लोराइड वर्षा और सिंथेटिक एमआरएनए का परिमाणीकरण।
    1. लिथियम क्लोराइड (7.5 एम) के 50 μL जोड़ें, और चरण 1.3.1-1.3.3 में वर्णित लिथियम क्लोराइड वर्षा करें।
    2. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके एमआरएनए की एकाग्रता को मापें।
    3. फॉर्मलाडेहाइड (1% -2%) एगारोस (1%) जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करके एमआरएनए के आकार और मात्रा को सत्यापित करें।

2. सेल आक्रमण और माइग्रेशन (सीआईएम) प्लेटों की बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) जेल कोटिंग।

नोट: एक सेल आक्रमण और प्रवासन (सीआईएम) प्लेट प्रतिबाधा-आधारित वास्तविक समय सेल विश्लेषण के लिए व्यावसायिक रूप से निर्मित 16-वेल प्लेट है। सेल आक्रमण परख के लिए, ईसीएम जेल के साथ सीआईएम प्लेटों को कोट करें, जैसा कि पहले वर्णित है लेकिन कुछ संशोधनों के साथ11।

  1. फ्रीजर से ईसीएम जेल स्टॉक का एक एलिकोट निकालें और इसे बर्फ पर रखें।
  2. एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 10 μL ईसीएम जेल के साथ डलबेकको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) (सीरम या एंटीबायोटिक दवाओं के बिना) के 990 μL को मिलाकर ईसीएम जेल (10 मिलीग्राम / एमएल) को एक कार्यशील एकाग्रता (100 μg / mL) में पतला करें। कोमल पाइपिंग द्वारा मिलाएं।
  3. सीआईएम प्लेट के ऊपरी कक्ष के 16 कुओं में से प्रत्येक में पतला ईसीएम जेल के 60 μL जोड़ें। हवा के बुलबुले20,21 से बचते हुए रिवर्स पाइपिंग विधि लागू करें।
    नोट: प्रत्येक सेल लाइन के लिए ईसीएम जेल की एकाग्रता का अनुकूलन करें। ग्लियोब्लास्टोमा सेल लाइनों के लिए, अनुकूलन के लिए 0.1 μg / μL से 1 μg / μL ईसीएम जेल का उपयोग किया गया था।
  4. सीआईएम प्लेट के ऊपरी कक्ष को प्लेट कवर के साथ एक सुरक्षात्मक प्लास्टिक शीट पर लगभग 4 घंटे के लिए सीओ2 इनक्यूबेटर के अंदर एक जेल परत बनाने के लिए रखें।
    सावधानी: ईसीएम जेल के साथ सीआईएम प्लेट की कोटिंग के दौरान, सीआईएम प्लेट के ऊपरी कक्ष के इलेक्ट्रोड का प्रयोगकर्ता के हाथों या उपकरणों की सतहों के साथ सीधा संपर्क नहीं होना चाहिए, जिसमें जैव सुरक्षा कैबिनेट या सीओ2 इनक्यूबेटर शामिल हैं।

3. ट्यूमर कोशिकाओं की तैयारी

नोट: सभी सेल संस्कृति सामग्री को बाँझ रखा जाना चाहिए। उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) के साथ जैविक सुरक्षा कैबिनेट के तहत ट्यूमर कोशिकाओं की कटाई और इलेक्ट्रोपोरेट करें, जैसा कि पहले वर्णित है लेकिन कुछसंशोधनों के साथ।

  1. ट्यूमर कोशिकाओं की संस्कृति
    1. डीएमईएम के 10 एमएल में कल्चर यू -118 एमजी कोशिकाओं में 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% एंटीबायोटिक्स प्रति 100 मिमी x 20 मिमी पॉलीस्टाइनिन टिश्यू कल्चर डिश 5% सीओ2 इनक्यूबेटर (कल्चर कंडीशन) में 37 डिग्री सेल्सियस पर होता है।
  2. ट्यूमर कोशिकाओं की सीरम की कमी
    नोट: एफबीएस में मौजूद केमोअट्रैक्टेंट्स के लिए कोशिकाओं के जोखिम को एफबीएस की उच्च सांद्रता का उपयोग करके सेल माइग्रेशन और आक्रमण परख से पहले कम से कम किया जाना चाहिए।
    1. पुराने माध्यम को हटा दें, और 10 मिलीलीटर प्रीवार्म्ड डीएमईएम जोड़ें जिसमें 0.5% एफबीएस और 1% एंटीबायोटिक्स प्रति डिश (कम-सीरम माध्यम) हों।
    2. चरण 3.2.1 दोहराएँ।
    3. 4 घंटे या उससे अधिक समय के लिए 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  3. ट्यूमर कोशिकाओं की कटाई
    1. पुराने माध्यम को हटा दें, प्रति डिश 8 मिलीलीटर प्रीवार्म्ड डलबेकको के फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (डीपीबीएस) जोड़ें, डीपीबीएस को हटा दें, सतह को कवर करने के लिए पहले से गर्म 0.05% ट्रिप्सिन-ईडीटीए (2 एमएल / डिश) जोड़ें, और 30 सेकंड के लिए सीओ2 इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।
    2. ट्रिप्सिन-ईडीटीए को ध्यान से एस्पिरेट करें, कम-सीरम माध्यम (7 एमएल / डिश) जोड़ें, और फिर कोशिकाओं को 50 एमएल या 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में इकट्ठा करें।
    3. कोशिकाओं की एक छोटी मात्रा को एलिकोट करें, और कोशिकाओं को गिनने के लिए एक हैंडहेल्ड स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करें।
    4. कोशिकाओं की कुल संख्या और 10,000 कोशिकाओं / μL के लिए आवश्यक मात्रा की गणना करें।
    5. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 100 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करके कोशिकाओं को घुमाएं, सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें, 0.5% एफबीएस (एंटीबायोटिक दवाओं के बिना) युक्त डीएमईएम की गणना की गई मात्रा जोड़ें, और धीरे से सेल गोली को फिर से निलंबित करें।
    6. प्रत्येक उपचार के लिए एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 1.1 मिलियन कोशिकाओं वाले सेल निलंबन के 110 μL को स्थानांतरित करें।
    7. चार अलग-अलग उपचारों के लिए कोशिकाओं को चार माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करने के लिए चरण 3.3.6 दोहराएं।
      नोट: एक सीआईएम प्लेट में कुल 16 कुएं हैं। तुलना के लिए चार अलग-अलग उपचार डिजाइन करें ताकि सीआईएम प्लेट के चार कुओं को प्रत्येक उपचार के लिए सौंपा जा सके। निम्नलिखित प्रयोगों के लिए इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं का उपयोग करें: पश्चिमी धब्बा विश्लेषण (प्रति 35 मिमी ऊतक संवर्धन डिश में 0.3 मिलियन कोशिकाएं), वास्तविक समय सेल माइग्रेशन परख के चार कुएं (0.1 मिलियन कोशिकाएं / प्रयोगात्मक डिजाइन में परिवर्तन होने पर इलेक्ट्रोपोरेट करने की आवश्यकता वाली कोशिकाओं की संख्या को समायोजित करें।

4. ट्यूमर कोशिकाओं का इलेक्ट्रोपोरेशन

  1. माध्यम को हटाने के लिए, प्रत्येक ट्यूब में सेल सस्पेंशन में 1 एमएल डीपीबीएस जोड़ें, मिनी सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करके ट्यूब को हर 10 सेकंड में 180 डिग्री घुमाते हुए सेल सस्पेंशन को हर बार 10 सेकंड के लिए तीन बार स्पिन करें, और माइक्रोपिपेट का उपयोग करके सुपरनैटेंट को हटा दें।
    नोट: एक कॉम्पैक्ट लेकिन आसानी से पुन: प्रयोज्य सेल गोली बनाना महत्वपूर्ण है।
  2. 10 μL में 0.1 मिलियन कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए सेल गोली में 110 μL रीसस्पेंशन बफर R जोड़ें।
  3. वांछित अभिव्यक्ति स्तर के आधार पर 0.2-20 एनजी / μL की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए सेल गोली में सिंथेटिक एमआरएनए जोड़ें। टैप या सौम्य पाइपिंग द्वारा सेल गोली को धीरे से मिलाएं और पुन: निलंबित करें।
    नोट: सिंथेटिक एमआरएनए की विभिन्न सांद्रता का उपयोग करें, पश्चिमी धब्बा विश्लेषण का उपयोग करके प्रोटीन अभिव्यक्ति की जांच करें, और सिंथेटिक एमआरएनए की एकाग्रता निर्धारित करें जो प्रोटीन अभिव्यक्ति और जैविक प्रभावों के बीच विशिष्ट सहसंबंध की जांच करने के लिए वांछित अभिव्यक्ति स्तर की ओर जाता है।
  4. हर बार तीन दालों के साथ 10 एमएस के लिए 1,350 वी पर इलेक्ट्रोपोरेशन सिस्टम के साथ सेल सस्पेंशन के 10 μL इलेक्ट्रोपोरेट करें।
  5. इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं को 1.1 एमएल डीएमईएम के साथ एक नए माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 0.5% एफबीएस होता है।
  6. इलेक्ट्रोपोरेशन को तब तक दोहराएं जब तक कि बाकी सेल सस्पेंशन इलेक्ट्रोपोरेट न हो जाए। 1.1 एमएल में 1.1 मिलियन कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं को मिलाएं।
    नोट: 100 μL और 10 μL इलेक्ट्रोपोरेशन युक्तियों दोनों का उपयोग बड़ी मात्रा में कोशिकाओं को इलेक्ट्रोपोरेट करने के लिए किया जा सकता है, लेकिन 10 μL और 100 μL के लिए इलेक्ट्रोपोरेशन युक्तियां दो अलग-अलग किट ों में शामिल हैं और उन्हें अलग से खरीदने की आवश्यकता है। दोनों किट में रिसस्पेंशन बफर आर शामिल है।
  7. सभी संबंधित इलेक्ट्रोपोरेशन को पूरा करने पर, पूल की गई कोशिकाओं को धीरे से पुन: निलंबित करें।
  8. 35 मिमी x 10 मिमी पॉलीस्टाइनिन टिशू कल्चर डिश में प्लेट 0.3 मिलियन कोशिकाओं को 2 मिलीलीटर डीएमईएम के साथ 5% एफबीएस युक्त होता है, और कुल सेल लाइसेट तैयारी और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए संस्कृति की स्थिति के तहत 1 दिन के लिए कोशिकाओं को कल्चर करता है।
  9. शेष इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं को कमरे के तापमान पर रखें जब तक कि वास्तविक समय सेल विश्लेषण प्रणाली तैयार न हो जाए।

5. वास्तविक समय सेल विश्लेषक, प्रोग्राम और सीआईएम प्लेटों की स्थापना

नोट: वास्तविक समय सेल विश्लेषक और दो सीआईएम प्लेटें तैयार करें, जैसा कि पहले वर्णित11 है।

  1. वास्तविक समय सेल विश्लेषक का संतुलन
    1. संस्कृति की स्थिति के तहत सिस्टम को संतुलित करने के लिए उपयोग करने से कई घंटे पहले वास्तविक समय सेल विश्लेषक को सीओ2 इनक्यूबेटर में ले जाएं।
  2. विश्लेषण प्रोग्राम सेट करना
    1. डेस्कटॉप पर रीयल-टाइम सेल विश्लेषण सॉफ़्टवेयर आइकन पर डबल-क्लिक करके विश्लेषण प्रोग्राम खोलें।
    2. डिफ़ॉल्ट प्रयोग पैटर्न सेटअप विकल्प खुलने के बाद, तीन प्रयोगों को अलग-अलग चलाने के लिए विकल्प का चयन करें।
      नोट: प्रत्येक पालने में एक अलग खिड़की होती है। माप अंतराल और अवधि, डेटा विश्लेषण और अन्य प्रयोगात्मक स्थितियों को सेट करने के लिए अलग-अलग टैब हैं।
    3. संख्या टैब पर क्लिक करके प्रत्येक पालना खोलें।
    4. प्रयोग नोट्स टैब पर क्लिक करें, उस फ़ोल्डर का चयन करें जिसमें डेटा सहेजा जाएगा, और प्रयोग का नाम दर्ज करें।
    5. लेआउट टैब पर क्लिक करें, एक समय में चार कुओं का चयन करके और नमूना जानकारी दर्ज करके प्रत्येक उपचार स्थिति के लिए चतुष्कोणीय कुएं सेट करें, और फिर लागू करें पर क्लिक करें।
    6. शेड्यूल टैब पर क्लिक करें | सेल प्रतिबाधा माप के दो-चरण मोड को सेट करने के लिए एक चरण जोड़ें। फिर, पहला चरण सेट करने के लिए लागू करें पर क्लिक करें।
    7. फिर से एक चरण जोड़ें पर क्लिक करें, अंतराल के लिए 10 मिनट और माइग्रेशन और आक्रमण के लिए अवधि के लिए 48 घंटे दर्ज करें, और दूसरा चरण सेट करने के लिए लागू करें पर क्लिक करें।
      नोट: पहला कदम एक बार बेसलाइन माप लेता है (1 मिनट के अंतराल के साथ एक स्वीप)। दूसरा चरण पालने में प्रयोग के लिए सेल प्रतिबाधा को मापता है (उदाहरण के लिए, 48 घंटे के लिए 10 मिनट के अंतराल के साथ 289 स्वीप)। प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर अंतराल और अवधि समायोजित करें।
    8. अगले पालने पर जाएं, और चरण 5.2.3-5.2.7 को दोहराकर इसे सेट करें।
  3. सीआईएम प्लेटों की तैयारी
    1. सेल प्रतिबाधा माप शुरू होने से एक घंटे पहले, सीआईएम प्लेट के निचले कक्ष के कुओं को डीएमईएम के 160 μL के साथ भरें जिसमें 10% सीरम या अन्य केमोअट्रैक्टेंट्स होते हैं।
    2. ऊपरी कक्ष को इकट्ठा करें जिसमें निचले कक्ष के साथ ईसीएम जेल-लेपित कुएं (आक्रमण के लिए) या बिना लेपित कुएं (प्रवास के लिए) शामिल हैं।
    3. सेल माइग्रेशन परख के लिए सीआईएम प्लेट के ऊपरी कक्ष के कुओं में कम-सीरम माध्यम के 50 μL जोड़ें, और सिस्टम के पालने में सीआईएम प्लेट रखें।
    4. संदेश टैब पर क्लिक करें, और सुनिश्चित करें कि कनेक्शन ठीक संदेश प्रदर्शित होता है। सीआईएम प्लेट अब प्रयोग के लिए तैयार है।
    5. सीआईएम प्लेट को कल्चर स्थिति में बदलने के लिए वास्तविक समय सेल विश्लेषण से पहले 30-60 मिनट के लिए सीओ2 इनक्यूबेटर में इकट्ठी सीआईएम प्लेट को प्रीइनक्यूबेट करें।

6. वास्तविक समय सेल विश्लेषण और डेटा निर्यात

नोट: बेसलाइन रीडिंग, सेल सीडिंग, सेल प्रतिबाधा माप, और डेटा निर्यात करें जैसा कि पहले वर्णित11 है।

  1. बेसलाइन रीडिंग
    नोट: सीआईएम प्लेट के एक्क्लाइमेटेड होने के बाद और ऊपरी कक्ष के कुओं में कोशिकाओं को जोड़ने से पहले बेसलाइन को पढ़ा जाना चाहिए।
    1. प्रत्येक पालने के लिए प्रारंभ बटन पर क्लिक करें। जब इस रूप में सहेजें विंडो प्रकट होती है, तो बेसलाइन रीडिंग करने के लिए प्रयोगात्मक फ़ाइल सहेजें।
  2. सेल सीडिंग;
    1. क्रैडल से सीआईएम प्लेट को हटा दें, और इसे प्लेट धारक पर जैव सुरक्षा कैबिनेट में रखें।
    2. नियंत्रण इकाई में कार्यक्रम के अनुसार सीआईएम प्लेट के ऊपरी कक्ष के कुओं में इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं के 100 μL (100,000 कोशिकाओं से युक्त) जोड़ें। हवा के बुलबुले से बचते हुए रिवर्स पाइपिंग विधि लागू करें।
    3. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए बायोसेफ्टी कैबिनेट के तहत सीआईएम प्लेट को छोड़ दें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि कोशिकाएं कुएं के तल पर समान रूप से फैलती हैं।
  3. सेल प्रतिबाधा माप
    1. पूरी तरह से इकट्ठे सीआईएम प्लेट को संबंधित पालने में वापस ले जाएं। दूसरे चरण के लिए सेल प्रतिबाधा माप शुरू करने के लिए क्रैडल स्टार्ट बटन पर क्लिक करें।
    2. प्लॉट टैब पर क्लिक करें, फिर सभी जोड़ें बटन पर क्लिक करें, और वास्तविक समय में डेटा की कल्पना करने के लिए औसत और एसटीडी डीईवी बॉक्स का चयन करें।
      नोट: डिफ़ॉल्ट प्लॉटिंग विकल्प x-अक्ष के लिए समय और y-अक्ष के लिए सेल इंडेक्स है। प्लॉट चयन अनुभाग उपयोगकर्ता को वाई-अक्ष के लिए वैकल्पिक विकल्पों का चयन करने की अनुमति देता है: सामान्यीकृत सेल इंडेक्स या डेल्टा सेल इंडेक्स। एक बार अंतिम स्वीप किए जाने के बाद, प्रयोग पूरा हो जाता है, और परिणाम स्वचालित रूप से सहेजे जाते हैं।
  4. विश्लेषण के लिए डेटा का निर्यात
    1. प्लॉट टैब पर क्लिक करें और प्रत्येक कुएं के लिए व्यक्तिगत रूप से डेटा कॉपी करने के लिए औसत और एसटीडी डीईवी बॉक्स का चयन करें।
    2. प्लॉट क्षेत्र पर राइट-क्लिक करें, और सूची प्रारूप में डेटा कॉपी करें का चयन करें।
    3. कोई रिक्त स्प्रेडशीट फ़ाइल खोलें, डेटा चिपकाएँ, और तब फ़ाइल सहेजें.
    4. विश्लेषण कार्यक्रम पर वापस जाएं, प्रत्येक पालने के लिए प्लेट टैब पर क्लिक करें, और पालने के लिए प्रयोग को बंद करने के लिए रिलीज़ का चयन करें।
    5. स्प्रेडशीट फ़ाइल पर वापस जाएं, और कच्चे डेटा के समय को समायोजित करें ताकि दूसरे चरण में प्रारंभ समय माप के लिए वास्तविक प्रारंभ समय बन जाए।

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Representative Results

सीआरके और सीआरकेएल प्रोटीन कई सेल प्रकारों की गतिशीलता में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, जिनमें न्यूरॉन्स 22, टी कोशिकाएं23, फाइब्रोब्लास्ट18,19 और विभिन्न प्रकार की ट्यूमर कोशिकाएं13 शामिल हैं। चूंकि सीआरके और सीआरकेएल प्रोटीन को ग्लियोब्लास्टोमा24,25,26 में ऊंचा बताया गया है, इसलिए इस काम में ग्लियोब्लास्टोमा सेल माइग्रेशन पर सीआरकेआई, सीआरके के एक स्प्लिस संस्करण के ओवरएक्प्रेशन के प्रभावों का अध्ययन किया गया था। यू -118 एमजी कोशिकाओं को सिंथेटिक सीआरकेआई एमआरएनए की विभिन्न सांद्रता के साथ इलेक्ट्रोपोरेट किया गया था और प्रोटीन के स्तर और सेल माइग्रेशन के लिए विश्लेषण किया गया था। सिंथेटिक सीआरकेआई एमआरएनए की अलग-अलग सांद्रता के साथ यू -118 एमजी ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं के इलेक्ट्रोपोरेशन के परिणामस्वरूप अभिकर्मक के 1 दिन बाद फ्लैग-टैग किए गए सीआरकेआई प्रोटीन में एकाग्रता-निर्भर वृद्धि हुई (चित्रा 1 ए)। जबकि 0.2 ng/μL और 2 ng/μL mRNA ने बहिर्जात CrkI प्रोटीन की एक अज्ञात या मामूली अभिव्यक्ति का नेतृत्व किया, 20 ng / μL mRNA के परिणामस्वरूप अंतर्जात CrkI प्रोटीन की तुलना में बहुत अधिक अभिव्यक्ति स्तर हुआ।

रियल-टाइम सेल विश्लेषण प्रणाली का उपयोग करके सेल माइग्रेशन परख के परिणामों ने संकेत दिया कि 0.2 एनजी / μL या 2 ng / μL CrkI एमआरएनए के साथ इलेक्ट्रोपोरेशन ने सेल माइग्रेशन को बहुत प्रभावित नहीं किया। हालांकि, 20 ng / μL CrkI mRNA के साथ इलेक्ट्रोपोरेशन ने सेल माइग्रेशन की एक स्पष्ट उत्तेजना को जन्म दिया, जिसमें अधिक कोशिकाएं 2 घंटे और 13 घंटे के बीच माइग्रेट करती हैं (चित्रा 1 बी)। सीआरकेआई प्रोटीन स्तर और सेल माइग्रेशन के बीच तुलना से पता चला कि ग्लियोब्लास्टोमा सेल माइग्रेशन सीआरकेआई प्रोटीन स्तर में वृद्धि से प्रेरित था। ऐसा प्रतीत होता है कि सेल माइग्रेशन की पर्याप्त उत्तेजना पैदा करने के लिए सीआरकेआई प्रोटीन का स्तर एक निश्चित सीमा से अधिक होना चाहिए। यदि सेल माइग्रेशन को विशिष्ट समय बिंदुओं पर माइग्रेटेड कोशिकाओं को गिनने या निरीक्षण करने के लिए अलग-अलग तरीकों से मापा गया था, तो सेल माइग्रेशन में इस तरह के परिवर्तन की पहचान करने के लिए बहुत अधिक प्रयास की आवश्यकता हो सकती है।

यह अध्ययन करने के लिए कि ईसीएम प्रोटीन की विभिन्न सांद्रता के साथ ईसीएम जेल परतों के माध्यम से सीआरकेएल ओवरएक्प्रेशन ग्लियोब्लास्टोमा सेल आक्रमण को कैसे प्रभावित करता है, यू -118 एमजी कोशिकाओं को सिंथेटिक सीआरकेएल एमआरएनए के साथ इलेक्ट्रोपोरेट किया गया और ईसीएम जेल परत के माध्यम से प्रोटीन के स्तर और सेल आक्रमण के संदर्भ में विश्लेषण किया गया। सिंथेटिक सीआरकेएल एमआरएनए के साथ यू -118 एमजी ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं के इलेक्ट्रोपोरेशन ने अभिकर्मक (चित्रा 2 ए) के 1 दिन बाद फ्लैग-टैग किए गए सीआरकेएल प्रोटीन की एक मजबूत अभिव्यक्ति का नेतृत्व किया। जैसे-जैसे ईसीएम प्रोटीन की एकाग्रता में वृद्धि हुई, नियंत्रण कोशिकाओं का आक्रमण धीमा हो गया (चित्रा 2 बी)। सीआरकेएल-ओवरएक्सप्रेसिंग कोशिकाओं ने सेल आक्रमण में ईसीएम जेल एकाग्रता-निर्भर कमी भी दिखाई (चित्रा 2 सी)। विभिन्न ईसीएम जेल सांद्रता में नियंत्रण और सीआरकेएल-ओवरएक्सप्रेसिंग कोशिकाओं के बीच तुलना ने संकेत दिया कि सीआरकेएल ओवरएक्प्रेशन ने आमतौर पर ईसीएम जेल परत (चित्रा 2 डी-जी) के माध्यम से सेल आक्रमण को उत्तेजित किया। हालांकि, ईसीएम जेल एकाग्रता के आधार पर दो सेल आबादी के बीच का अंतर अलग-अलग समय बिंदुओं पर स्पष्ट हो गया।

0.1 μg / μL ECM जेल के लिए, सेल आक्रमण की Crkl ओवरएक्प्रेशन-मध्यस्थता उत्तेजना 8 घंटे और 20 घंटे (चित्रा 2 डी) के बीच स्पष्ट थी, लेकिन 32 घंटे के बाद सेल आक्रमण में अंतर नगण्य था। 0.2 μg / μL ECM जेल के लिए, CrkL ओवरएक्प्रेशन के साथ और बिना सेल आक्रमण में अंतर हर समय न्यूनतम था (चित्रा 2E)। 0.5 μg / μL ईसीएम जेल के लिए, सेल आक्रमण में अंतर 24 घंटे और 36 घंटे (चित्रा 2 एफ) के बीच स्पष्ट था। 1 μg / μL ईसीएम जेल के लिए, सेल आक्रमण पर CrkL ओवरएक्प्रेशन प्रभाव 48 घंटे (चित्रा 2 जी) पर थोड़ा स्पष्ट हो गया। परिणाम बताते हैं कि नियंत्रण और सीआरकेएल-ओवरएक्सप्रेसिंग कोशिकाओं के बीच अंतर का पता लगाने की खिड़की बाद के समय में बदल जाती है क्योंकि ईसीएम जेल की एकाग्रता बढ़ जाती है। परिणाम यह भी बताते हैं कि दो सेल आबादी अलग-अलग समय बिंदुओं पर ईसीएम जेल एकाग्रता में वृद्धि से अलग-अलग प्रभावित हुई थी। उदाहरण के लिए, 12 घंटे में, सीआरकेएल-ओवरएक्सप्रेसिंग कोशिकाओं ने केवल 0.1 μg / μL ईसीएम जेल (चित्रा 2 एच) पर काफी अधिक आक्रमण दिखाया। हालांकि, 24 घंटे में, सीआरकेएल-ओवरएक्सप्रेसिंग कोशिकाओं ने परीक्षण किए गए ईसीएम जेल सांद्रता (चित्रा 2 आई) में थोड़ा अधिक या समान आक्रमण दिखाया। इसलिए, सीआरकेएल ओवरएक्प्रेशन के साथ और बिना दो सेल आबादी के बीच अंतर का व्यापक दृष्टिकोण प्राप्त करने के लिए सेल आक्रमण में समय-निर्भर और ईसीएम जेल एकाग्रता-निर्भर अंतर दोनों की जांच करना महत्वपूर्ण है। इन परिणामों से पता चलता है कि प्रतिबाधा-आधारित वास्तविक समय सेल विश्लेषण के साथ सिंथेटिक एमआरएनए का उपयोग करके क्षणिक ओवरएक्प्रेशन का संयोजन जीन ओवरएक्प्रेशन और ट्यूमर सेल माइग्रेशन और आक्रमण के बीच संभावित सहसंबंध का विश्लेषण करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है। सिंथेटिक एमआरएनए और ईसीएम जेल में एकाग्रता भिन्नताओं के प्रभावों की जांच अधिक सटीक और विस्तृत जानकारी प्रदान करेगी।

Figure 1
चित्रा 1: ग्लियोब्लास्टोमा सेल माइग्रेशन पर सीआरकेआई ओवरएक्प्रेशन के प्रभाव। यू -118 एमजी कोशिकाओं को फ्लैग-टैग किए गए सीआरकेआई एमआरएनए की संकेतित सांद्रता (एनजी / μL) के साथ इलेक्ट्रोपोरेट किया गया था। (ए) पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए, कुल सेल लाइसेट तैयारी से पहले इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं को 1 दिन के लिए सुसंस्कृत किया गया था। सिंथेटिक सीआरकेआई एमआरएनए के साथ अभिकर्मक पर प्रोटीन के स्तर की तुलना की गई थी। एंटी-सीआरके और एंटी-सीआरकेएल एंटीबॉडी का उपयोग अंतर्जात और फ्लैग-टैग किए गए प्रोटीन दोनों का पता लगाने और अंतर्जात प्रोटीन और फ्लैग-टैग किए गए प्रोटीन के बीच अनुपात की तुलना करने के लिए किया गया था। विनकुलिन और α-ट्यूबुलिन का उपयोग लोडिंग नियंत्रण के रूप में किया गया था। (बी) सेल माइग्रेशन विश्लेषण के लिए, इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं को आगे की संस्कृति के बिना सीआईएम प्लेट पर चढ़ाया गया था। सेल इंडेक्स मान प्रत्येक नमूने के लिए चार कुओं से प्राप्त किए गए थे, और उनके औसत ± एसडी मान दिखाए गए हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: ग्लियोब्लास्टोमा सेल आक्रमण पर सीआरकेएल ओवरएक्प्रेशन के प्रभाव। यू -118 एमजी कोशिकाओं को न्यूक्लियस-मुक्त एच2ओ या 20 एनजी / (ए) पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए, कुल सेल लाइसेट तैयारी से पहले इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं को 1 दिन के लिए सुसंस्कृत किया गया था। सिंथेटिक सीआरकेएल एमआरएनए के साथ अभिकर्मक पर प्रोटीन के स्तर की तुलना की गई थी। एंटी-सीआरके और एंटी-सीआरकेएल एंटीबॉडी का उपयोग अंतर्जात और फ्लैग-टैग किए गए प्रोटीन दोनों का पता लगाने और अंतर्जात प्रोटीन और फ्लैग-टैग किए गए प्रोटीन के बीच अनुपात की तुलना करने के लिए किया गया था। विनकुलिन और α-ट्यूबुलिन का उपयोग लोडिंग नियंत्रण के रूप में किया गया था। (B-G) सेल आक्रमण विश्लेषण के लिए, इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं को आगे की संस्कृति के बिना ईसीएम जेल कोटिंग के साथ सीआईएम प्लेट पर चढ़ाया गया था। सेल इंडेक्स मान प्रत्येक नमूने के लिए चार कुओं से प्राप्त किए गए थे, और उनके औसत ± एसडी मान दिखाए गए हैं। (बी) विभिन्न ईसीएम जेल सांद्रता वाले नियंत्रण कोशिकाओं से सेल आक्रमण डेटा की तुलना की गई थी। (सी) विभिन्न ईसीएम जेल सांद्रता के साथ सीआरकेएल-ओवरएक्सप्रेसिंग कोशिकाओं से सेल आक्रमण डेटा की तुलना की गई थी। (D-G) संकेतित ईसीएम जेल एकाग्रता के लिए नियंत्रण और सीआरकेएल-ओवरएक्सप्रेसिंग कोशिकाओं के बीच सेल आक्रमण डेटा की तुलना की गई थी। (एच) नियंत्रण और सीआरकेएल-अतिरंजित कोशिकाओं के बीच 12 घंटे पर सेल आक्रमण की तुलना। (I) नियंत्रण और सीआरकेएल-अतिरंजित कोशिकाओं के बीच 24 घंटे में सेल आक्रमण की तुलना। संक्षेप: ईसीएम = बाह्य मैट्रिक्स; सीआईएम = सेल आक्रमण और प्रवासन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: जीन वध या जीन ओवरएक्प्रेशन के बाद प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के योजनाबद्ध आरेख । (ए) सीआरएनए अभिकर्मक के बाद वास्तविक समय सेल विश्लेषण की प्रयोगात्मक प्रक्रिया। चूंकि प्रयोगात्मक परिस्थितियों में सीआरएनए अभिकर्मक के बाद पूर्ण जीन वध को प्रेरित करने के लिए 3-4 दिनों की आवश्यकता होती है, इसलिए वास्तविक समय सेल विश्लेषण के लिए तैयार होने से पहले इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद कोशिकाओं को 3 दिनों के लिए फिर से चढ़ाया और सुसंस्कृत किया गया था। (बी) सिंथेटिक एमआरएनए अभिकर्मक के बाद वास्तविक समय सेल विश्लेषण के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रिया। चूंकि सिंथेटिक एमआरएनए अभिकर्मक से प्रोटीन अभिव्यक्ति तेजी से होती है, इसलिए इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं का उपयोग उसी दिन वास्तविक समय सेल विश्लेषण के लिए किया गया था। दो प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के बीच अंतर पर ध्यान दें; जबकि वास्तविक समय सेल विश्लेषण एसआईआरएनए का उपयोग करके जीन वध के लिए इलेक्ट्रोपोरेशन के 3 दिन बाद किया गया था, सिंथेटिक एमआरएनए के साथ जीन ओवरएक्प्रेशन के लिए इलेक्ट्रोपोरेशन के ठीक बाद वास्तविक समय सेल विश्लेषण किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

माइग्रेशन और आक्रमण ट्यूमर कोशिकाओं की महत्वपूर्ण विशेषताएं हैं। ट्यूमर कोशिकाओं की गतिशीलता को मापना और अंतर्निहित तंत्र को समझना जो ट्यूमर सेल गतिशीलता को नियंत्रित करता है, चिकित्सीय हस्तक्षेप 2,27 में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। सेल माइग्रेशन7 का अध्ययन करने के लिए कई तरीके विकसित किए गए हैं। खरोंच या कल्चर इंसर्ट का उपयोग करके घाव भरने की परख एक सरल और अक्सर उपयोग की जाने वाली विधि है जो गैप क्लोजर की विपरीत छवियां प्रदान करती है। व्यक्तिगत सेल-ट्रैकिंग परख को समय-चूक इमेजिंग के साथ व्यक्तिगत कोशिकाओं की निगरानी की आवश्यकता होती है, जिसके लिए कोशिकाओं को फ्लोरोसेंट रंगों के साथ टैग किया जा सकता है। घाव-चिकित्सा परख और व्यक्तिगत सेल-ट्रैकिंग परख दोनों कोशिकाओं के सहज आंदोलन को मापते हैं।

टाइम-लैप्स इमेजिंग और गहन पोस्ट-रिक्वायरमेंट डेटा प्रोसेसिंग की मदद से, दोनों परख नमूने28 के बीच मात्रात्मक तुलना प्रदान कर सकते हैं। हालांकि, ये परख ईसीएम प्रोटीन परत के माध्यम से सेल आक्रमण का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त नहीं हैं। इसके विपरीत, ट्रांसवेल माइग्रेशन और आक्रमण परख ईसीएम प्रोटीन परत के साथ या उसके बिना एक ट्रांसवेल इंसर्ट झिल्ली के माध्यम से निर्देशित सेल माइग्रेशन को मापते हैं। हालांकि, इन परखों के साथ निरंतर निगरानी संभव नहीं है क्योंकि माइग्रेटेड कोशिकाओं को एक निश्चित समय बिंदु पर एकत्र करने की आवश्यकता होती है, और ट्रांसवेल का उपयोग फिर से नहीं किया जा सकता है। इन सभी परखों को डेटा प्रोसेसिंग के लिए या कोशिकाओं को इकट्ठा करने और गिनने के लिए प्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण समय और प्रयास की आवश्यकता होती है, जिसके परिणामस्वरूप संभावित ऑपरेटर-संबंधित भिन्नताएं होती हैं। इन परखों के लिए सबसे बड़ी चुनौती विभिन्न समय बिंदुओं पर कई, संयुक्त उपचारों के बीच परिष्कृत मात्रात्मक तुलना करना है।

इस काम में प्रस्तुत वास्तविक समय सेल विश्लेषण प्रणाली का उपयोग सेल माइग्रेशन और आक्रमण को मापने के लिए मात्रात्मक, निरंतर और व्यापक निगरानी की अनुमति देता है, और इस प्रणाली में अन्य सरल सेल गतिशीलता परखों पर कई फायदे हैं, जो सीमित, निश्चित समय बिंदुओं पर परिणाम प्रदान करते हैं। अन्य परखों के साथ, वास्तविक समय सेल विश्लेषण की प्रयोगात्मक स्थितियों को प्रत्येक सेल लाइन के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता होती है, क्योंकि विभिन्न सेल लाइनों के प्रवास और आक्रमण को सेल संख्या से अलग-अलग प्रभावित किया जा सकता है। इसके अलावा, ईसीएम जेल की एकाग्रता बढ़ने के साथ सेल आक्रमण की दर कम हो जाती है (चित्रा 2 बी, सी)। इसलिए, विभिन्न ईसीएम जेल सांद्रता का परीक्षण करने और इन विभिन्न ईसीएम जेल सांद्रता के तहत सेल आक्रमण पर जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन के प्रभावों की तुलना करने की सिफारिश की जाती है।

वास्तविक समय सेल विश्लेषण प्रणाली के साथ, अनुकूलन आसान और सीधा है, क्योंकि परख प्रणाली वास्तविक समय में डेटा का उत्पादन करती है, जिसमें कोई हाथ से समय नहीं होता है। परख प्रणाली पहचानती है कि कोशिकाएं कितनी जल्दी पलायन या आक्रमण करती हैं और जब वे अधिकतम सेल माइग्रेशन या आक्रमण स्तर तक पहुंच जाती हैं। सेल गतिशीलता पर यह जानकारी प्राप्त करना विभिन्न उपचार समूहों के बीच विस्तृत तुलनात्मक विश्लेषण को सक्षम बनाता है, जो कार्यक्रम की अंतर्निहित विशेषताओं का उपयोग करके किया जा सकता है। इसके अलावा, वास्तविक समय परख प्रणाली की संवेदनशीलता एकाग्रता-निर्भर जीन अभिव्यक्ति द्वारा सेल माइग्रेशन और आक्रमण में सूक्ष्म परिवर्तनों की पहचान और परिमाणीकरण की अनुमति देती है, जैसा कि चित्र 1 और चित्रा 2 में दिखाया गया है।

इससे पहले, प्रतिबाधा-आधारित वास्तविक समय सेल विश्लेषण प्रणाली का उपयोग करके जीन वध के बाद ट्यूमर सेल माइग्रेशन और आक्रमण को मापने के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया प्रदान की गई थी। चूंकि कोशिकाओं को एसआईआरएनए के साथ इलेक्ट्रोपोरेट करने के बाद जीन वध में 3-4 दिन लगते हैं, इसलिए इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद कोशिकाओं को फिर से चढ़ाया गया। इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं को वास्तविक समय सेल विश्लेषण के लिए पुन: कटाई से पहले 3 दिनों के लिए सुसंस्कृत किया गया था, जिससे पूरे प्रयोग को दो-चरण प्रक्रिया बना दिया गया: दिन 1 पर इलेक्ट्रोपोरेशन और दिन 4 पर वास्तविक समय सेल विश्लेषण, जैसा कि चित्रा 3 में दिखाया गया है। इसके विपरीत, सिंथेटिक एमआरएनए के साथ कोशिकाओं के इलेक्ट्रोपोरेशन पर जीन अभिव्यक्ति तेजी से और कुशल है, क्योंकि जीएफपी के लिए सिंथेटिक एमआरएनए के साथ इलेक्ट्रोपोरेटेड फाइब्रोब्लास्ट ्स के टाइम-लैप्स विश्लेषण ने अभिकर्मक के 5 घंटे बाद एक मजबूत जीएफपी संकेत दिखाया; प्रतिदीप्ति तीव्रता अधिकतम 24 घंटे तक पहुंच गई, जिसके बाद प्रतिदीप्ति संकेत18 में धीरे-धीरे गिरावट आई।

इसके अलावा, इस काम में, यू -118 एमजी कोशिकाओं ने एक्सोजेनस प्रोटीन की मजबूत अभिव्यक्ति दिखाई जब सीआरकेआई (चित्रा 1 ए) और सीआरकेएल (चित्रा 2 ए) के लिए सिंथेटिक एमआरएनए के साथ इलेक्ट्रोपोरेट किया गया, जो पिछले अवलोकनों8 के अनुरूप था। इसलिए, इलेक्ट्रोपोरेशन के ठीक बाद वास्तविक समय सेल विश्लेषण करना उचित है। इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए कोशिकाओं की कटाई से पहले वास्तविक समय सेल विश्लेषण के लिए कुछ कदम किए जाने चाहिए। पूरा प्रयोग एक चरण की प्रक्रिया है जिसमें पहले दिन इलेक्ट्रोपोरेशन और रियल-टाइम सेल विश्लेषण शामिल है। प्रतिबाधा-आधारित रीयल-टाइम सेल विश्लेषण प्रणाली का उपयोग स्तन कैंसर29, कोलोरेक्टल कैंसर 30, मेलेनोमा 31, डिम्बग्रंथि के कैंसर 32, सिर और गर्दन स्क्वैमस कैंसर 33, गुर्दे की कोशिका कार्सिनोमा 34, अग्नाशयी कार्सिनोमा 35, हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा 36, और गैर-छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर कोशिकाओं 10 सहित विभिन्न ठोस ट्यूमर कोशिकाओं में ट्यूमर सेल माइग्रेशन और आक्रमण का अध्ययन करने के लिए बड़े पैमाने पर किया गया है।. इसलिए, एमआरएनए का उपयोग करके जीन ओवरएक्प्रेशन का संयुक्त उपयोग या एसआईआरएनए का उपयोग करके जीन वध सेल माइग्रेशन और आक्रमण के वास्तविक समय माप को अधिक उपयोगी और लागू बनाता है।

इस प्रोटोकॉल की सीमा यह है कि इस विधि को सेल माइग्रेशन और आक्रमण के माप से ठीक पहले कोशिकाओं को अलग करने और कटाई करने की आवश्यकता होती है। पृथक्करण, फसल और पुन: निलंबन के दौरान एंजाइमेटिक और यांत्रिक उपचार विश्लेषणको प्रभावित कर सकते हैं। इसके अलावा, सेल माइग्रेशन में देरी हो सकती है जबकि कोशिकाएं एंजाइमेटिक और यांत्रिक उपचार से ठीक हो जाती हैं। यह विधि उपयुक्त नहीं हो सकती है यदि कोशिकाएं एकल-कोशिका पृथक्करण और संग्रह के दौरान ट्रिप्सिनाइजेशन या अन्य यांत्रिक उपचार ों से आसानी से क्षतिग्रस्त हो जाती हैं या उन जोड़तोड़ के बाद लंबे समय तक वसूली समय की आवश्यकता होती है। यह सीमा ट्रांसवेल माइग्रेशन परख पर भी लागू होती है, जो निर्देशित सेल माइग्रेशन को मापने के लिए एक और विधि है। इसके अलावा, सेल की तैयारी के बाद इलेक्ट्रोपोरेशन कोशिकाओं को नुकसान के लिए अधिक संवेदनशील बना सकताहै। इसलिए, प्रत्येक सेल लाइन के लिए इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए स्थितियों को अनुकूलित करना और अधिक सटीक तुलना के लिए नियंत्रण कोशिकाओं को इलेक्ट्रोपोरेट करना भी महत्वपूर्ण है।

इलेक्ट्रोपोरेशन सिस्टम के लिए निर्माता का मुखपृष्ठ इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए अनुशंसित पैरामीटर प्रदान करता है ( सामग्री की तालिका में फ़ुटनोट देखें)। प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए सेल पृथक्करण और पुन: निलंबन के दौरान लगातार और न्यूनतम हानिकारक प्रयोगात्मक स्थितियों का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, एमआरएनए अभिकर्मक के विशिष्ट और निरर्थक प्रभावों के बीच अंतर करने के लिए एमआरएनए की मात्रा, प्रोटीन स्तर और कोशिका गतिशीलता को सहसंबंधित करना महत्वपूर्ण है। इस काम में, यह देखा गया कि यदि एमआरएनए एकाग्रता एक निश्चित स्तर से अधिक हो गई, तो यह विशेष रूप से सेलुलर कार्यों को बाधित करती है, जिसमें सेल माइग्रेशन और आक्रमण (डेटा नहीं दिखाया गया है) शामिल है। इसलिए, एमआरएनए की एकाग्रता को टाइट करना महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, वास्तविक समय सेल विश्लेषण करना महत्वपूर्ण है जब प्रोटीन अभिव्यक्ति अपने चरम स्तर पर होती है, क्योंकि प्रोटीन अभिव्यक्ति एमआरएनए अभिकर्मक के साथ क्षणिक होती है। अन्य सेल गतिशीलता परखों के साथ, इस वास्तविक समय सेल विश्लेषण के परिणाम माइग्रेशन के दौरान कोशिकाओं के प्रसार से भ्रमित हो सकते हैं। इसलिए, सेल माइग्रेशन और आक्रमण परिणामों पर सेल प्रसार के प्रभाव को समझने के लिए अतिरिक्त रूप से सेल प्रसार परख करने की सिफारिश की जाती है।

कुछ प्रकार के मानव कैंसर में सीआरके और सीआरकेएल के प्रोटीन का स्तर ऊंचा होने के लिए जाना जाता है। चूंकि सीआरके और सीआरकेएल की अभिव्यक्ति विभिन्न ट्यूमर सेल कार्यों के साथ संबंधित है और उनके ओवरएक्प्रेशन खराब रोग का निदान करने में योगदान देते हैं, सीआरके और सीआरकेएल को कैंसर के उपचार के लिए चिकित्सीयलक्ष्य के रूप में प्रस्तावित किया गया है। इससे पहले, ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं में जीन वध को प्रेरित किया गया था ताकि यह प्रदर्शित किया जा सके कि ग्लियोब्लास्टोमा सेल माइग्रेशन और आक्रमण सीआरके और सीआरकेएल गतिविधि के मजबूत मार्कर हैं। वर्तमान अध्ययन सिंथेटिक एमआरएनए का उपयोग करके सीआरके और सीआरकेएल के ओवरएक्प्रेशन को प्रेरित करने के लिए एक व्यवस्थित जीन अभिव्यक्ति दृष्टिकोण प्रदान करता है। वास्तविक समय सेल विश्लेषण प्रणाली का उपयोग करके सीआरके और सीआरकेएल और ग्लियोब्लास्टोमा सेल माइग्रेशन और आक्रमण के प्रोटीन स्तर के बीच एक करीबी संबंध प्राप्त किया गया था। परिणाम इस परिकल्पना का समर्थन करते हैं कि सीआरके और सीआरकेएल ग्लियोब्लास्टोमा सेल माइग्रेशन और आक्रमण में आवश्यक भूमिका निभाते हैं। पिछले तरीकों के पेपर11 के साथ, यह अध्ययन जीन अभिव्यक्ति और ट्यूमर सेल माइग्रेशन और आक्रमण में परिवर्तन के बीच संभावित सहसंबंध की जांच के लिए एक सबूत-ऑफ-कॉन्सेप्ट दृष्टिकोण प्रदान करता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

लेखक इस पांडुलिपि को संपादित करने के लिए चिल्ड्रन मर्सी कैनसस सिटी में मेडिकल राइटिंग सेंटर को धन्यवाद देते हैं। इस काम को नताली के ए.आर.टी. फाउंडेशन (टी.पी.) और बच्चों के मर्सी अस्पताल (सीएमएच) और यूनिवर्सिटी ऑफ कंसास कैंसर सेंटर (केयूसीसी) (टी.पी.) से एमसीए पार्टनर्स एडवाइजरी बोर्ड अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AlphaImager HP ProteinSimple 92-13823-00 Agarose gel imaging system
α-Tubulin antibody Sigma T9026 Used to detect α-tubulin protein (dilution 1:3,000)
CIM-plate 16 Agilent Technologies, Inc 5665825001 Cell invasion and migration plates
Crk antibody BD Biosciences 610035 Used to detect CrkI and CrkII proteins (dilution 1:1,500)
CrkL antibody Santa Cruz sc-319 Used to detect CrkL protein (dilution 1:1,500)
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) ATCC 302002 Cell culture medium
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Corning 21-031-CV Buffer used to wash cells
Fetal bovine serum (FBS) Hyclone SH30910.03 Culture medium supplement
Heracell VIOS 160i CO2 incubator Thermo Scientific 51030285 CO2 incubator
IRDye 800CW goat anti-mouse IgG secondary antibody Li-Cor 926-32210 Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000)
IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG secondary antibody Li-Cor 926-32211 Secondary antibody for Western blot analysis  (dilution 1:10,000)
Lithium chloride  Invitrogen AM9480 Used for RNA precipitation
Matrigel matrix Corning 354234 Extracellular matrix (ECM) gel
MEGAscript T7 transcription kit Invitrogen AM1334 Used for RNA synthesis
Millennium RNA markers Invitrogen AM7150 Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
Mini centrifuge ISC BioExpress C1301P-ISC Used to spin down cells
Mouse brain QUICK-Clone cDNA TaKaRa 637301 Source of genes (inserts) for cloning
NanoQuant Tecan M200PRO Nucleic acid quantification system
Neon electroporation system  ThermoFisher Scientific MPK5000 Electroporation system1
Neon transfection system 10 µL kit ThermoFisher Scientific MPK1025 Electroporation kit
Neon transfection system 100 µL kit ThermoFisher Scientific MPK10096 Electroporation kit
NorthernMax denaturing gel buffer Invitrogen AM8676 Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
NorthernMax formaldehyde load dye Invitrogen AM8552 Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
NorthernMax running buffer Invitrogen AM8671 Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
Nuclease-free water Teknova W3331 Used for various reactions during mRNA synthesis
Odyssey CLx Imager Li-Cor Imager for Western blot analysis
pcDNA3.1/myc-His Invitrogen V80020 The vector into which inserts (mouse CrkI and CrkL cDNAs) were cloned
pFLAG-CMV-5a Millipore Sigma E7523 Source of the FLAG epitope tag
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol  Sigma P2069 Used for DNA extraction
PmeI New England BioLabs R0560L Used to linearize the plasmids for mRNA synthesis
Poly(A) tailing kit Invitrogen AM1350 Used for poly(A) tail reaction
Polystyrene tissue culture dish (100 x 20 mm style) Corning 353003 Used for culturing cells before transfection
Polystyrene tissue culture dish (35 x 10 mm style) Corning 353001 Used for culturing transfected cells
Proteinase K Invitrogen 25530049 Used to remove protein in the reaction mixture
Purifier Axiom Class II, Type C1 Labconco Corporation 304410001 Biosafety cabinet for sterile handling of cells
Resuspension Buffer R ThermoFisher Scientific A buffer included in the electroporation kits, MPK1025 and MPK10096. The buffer is used to resupend cells before electroporation, and its composition is proprietary information.
RNaseZap Invitrogen AM9780 RNA decontamination solution
Scepter Millipore C85360 Handheld automated cell counter 
ScriptCap 2'-O-methyltransferase kit Cellscript C-SCMT0625 Used for capping reaction
ScriptCap m7G capping system Cellscript C-SCCE0625 Used for capping reaction
Sodium dodecyl sulfate solution Invitrogen 15553-035 Detergent used for the proteinase K reaction
Sorvall Legend XT centrifuge Thermo Scientific 75004532 Benchtop centrifuge to spin down cells
Trypsin-EDTA Gibco 25300-054 Used for dissociation of cells
U-118MG  ATCC HTB15 An adherent cell line derived from a human glioblastoma patient
Vinculin antibody Sigma V9131 Used to detect vinculin protein (dilution 1:100,000)
xCELLigence RTCA DP Agilent Technologies, Inc 380601050 Instrument used for real-time cell analysis
1Electroporation parameters and other related information for various cell lines are available on the manufacturer's homepage (https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html?).

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कैंसर अनुसंधान अंक 196 ट्यूमर सेल माइग्रेशन आक्रमण सिंथेटिक एमआरएनए अभिकर्मक जीन अभिव्यक्ति पैटर्न ट्यूमर सेल घुसपैठ मेटास्टेसिस जीन वध प्रतिबाधा-आधारित माप एमआरएनए टीके चिकित्सीय उद्देश्य जीन ओवरएक्प्रेशन सिंथेटिक एमआरएनए अभिकर्मक उत्तेजना विधि पेपर परिवर्तित जीन अभिव्यक्ति।
सिंथेटिक एमआरएनए अभिकर्मक के बाद ट्यूमर सेल माइग्रेशन और आक्रमण का वास्तविक समय मात्रात्मक माप
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Park, T., Large, N. Real-Time Quantitative Measurement of Tumor Cell Migration and Invasion Following Synthetic mRNA Transfection. J. Vis. Exp. (196), e64274, doi:10.3791/64274 (2023).

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