Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Generering, høy gjennomstrømningsscreening og biobanking av menneskeskapte pluripotente stamcelleavledede hjertesfæroider

Published: March 10, 2023 doi: 10.3791/64365
Automatic Translation
1, *1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, *1, *1
1Utrecht Regenerative Medicine Center, Circulatory Health Laboratory, University Utrecht, Department of Cardiology, University Medical Center Utrecht, 2Amsterdam Cardiovascular Sciences, Department of Physiology, Amsterdam University Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

Presentert her er et sett med protokoller for generering og kryopreservering av hjertesfæroider (CS) fra humaninduserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter dyrket i et multidimensjonalt format med høy gjennomstrømning. Denne tredimensjonale modellen fungerer som en robust plattform for sykdomsmodellering, screening med høy gjennomstrømning, og opprettholder funksjonaliteten etter kryopreservering.

Abstract

Menneskeinduserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter (hiPSC-CMs) er av avgjørende betydning for human hjertesykdomsmodellering og terapi. Vi publiserte nylig en kostnadseffektiv strategi for massiv utvidelse av hiPSC-CMs i to dimensjoner (2D). To store begrensninger er celle umodenhet og mangel på tredimensjonal (3D) arrangement og skalerbarhet i HTS-plattformer (High Throughput Screening). For å overvinne disse begrensningene danner de utvidede kardiomyocyttene en ideell cellekilde for generering av 3D-hjertecellekultur og vevsteknikkteknikker. Sistnevnte har stort potensial innen kardiovaskulær felt, og gir mer avansert og fysiologisk relevant HTS. Her beskriver vi en HTS-kompatibel arbeidsflyt med enkel skalerbarhet for generering, vedlikehold og optisk analyse av hjertesfæroider (CS) i et 96-brønns format. Disse små CS-ene er avgjørende for å fylle gapet som finnes i dagens in vitro sykdomsmodeller og/eller generering for 3D-vevstekniske plattformer. CS-ene presenterer en svært strukturert morfologi, størrelse og cellulær sammensetning. Videre viser hiPSC-CMs dyrket som CSs økt modning og flere funksjonelle egenskaper i det menneskelige hjertet, for eksempel spontan kalsiumhåndtering og kontraktil aktivitet. Ved å automatisere hele arbeidsflyten, fra generering av dataemner til funksjonsanalyse, øker vi reproduserbarheten internt og mellom partier, som demonstrert av HT-avbildning (High Throughput (HT) og kalsiumhåndteringsanalyse. Den beskrevne protokollen tillater modellering av hjertesykdommer og vurdering av medikamentelle / terapeutiske effekter på enkeltcellenivå i et komplekst 3D-cellemiljø i en helautomatisk HTS-arbeidsflyt. I tillegg beskriver studien en enkel prosedyre for langsiktig bevaring og biobanking av hele sfæroider, og gir dermed forskere muligheten til å skape neste generasjons funksjonell vevslagring. HTS kombinert med langtidslagring vil vesentlig bidra til translasjonsforskning på et bredt spekter av områder, inkludert legemiddelforskning og testing, regenerativ medisin og utvikling av personlige terapier.

Introduction

Oppdagelsen av menneskeskapte pluripotente stamceller (hiPSCs) ga enestående muligheter til å studere menneskelig utvikling og sykdom på mobilnivå. I løpet av det siste tiåret, ved hjelp av utviklingstimer, har ulike protokoller blitt etablert for å sikre effektiv differensiering av hissc i kardiomyocytter (CMs)1,2,3,4. hiPSC-avledede kardiomyocytter (hiPSC-CMs) kan tjene som en ressurs for modellering av genetisk arvelige kardiovaskulære sykdommer (CVD), testing av hjertesikkerhet for nye legemidler og hjerteregenerative strategier 5,6,7,8. Til tross for den rettede hjertedifferensieringen av hissc, forblir ubestemt CM-tall en utfordring i hjertefeltet, siden modne hiPSC-CM generelt er ikke-proliferative, og primære humane celler ikke er tilgjengelige i høye mengder.

Nylig beskrev vi at samtidig Wnt-signalaktivering med lav celletetthetskultur resulterte i en massiv proliferativ respons (opptil 250 ganger) av hiPSC-CMs 9,10. Denne kostnadseffektive strategien for massiv utvidelse av hiPSC-CMs via seriepassering i kulturkolbeformat letter standardisering og kvalitetskontroll av et stort antall funksjonelle hiPSC-CMer. I tillegg, for å holde tritt med etterspørselen etter store partier av hiPSC-CMs fra ulike givere, har biobanking av hiPSC-CMs blitt beskrevet10. Imidlertid er kardiomyocytmonolag sådd i disse standardkulturrettene ikke representative for den komplekse 3D-strukturen som er tilstede i hjertet. Videre har umodenhet av hiPSC-CMs forblitt et hinder, og dermed kommet til kort i å etterligne den biologiske og fysiologiske fenotypen av in vivo kardiovaskulære miljø.

Nye 3D in vitro-modeller har blitt utviklet der hiPSC-CMs viser nærmere fysiologisk oppførsel som selvorganisering 11,12, ekstracellulær matrise (ECM) remodeling 13, forbedret modning 14,15,16 og synkronisert sammentrekning17,18,19 . 3D-modeller har blitt brukt til narkotikaoppdagelse, medikamentkardiotoksisitetstesting, sykdomsmodellering, regenerative terapier og til og med de første kliniske forsøkene 20,21,22,23,24. En av de mest brukte modellene er fibrinbasert konstruert hjertevev (EHT), som viser et vevslignende arrangement og hjertekontraktilitet13,17,25. Tidligere viste vi at EHT-er generert fra utvidede hiPSC-CM-er viste sammenlignbar kontraktilitet med de fra ikke-utvidede hiPSC-CM-er, noe som demonstrerte kompromissløs cellulær funksjonalitet etter utvidelse9. Likevel, selv om genereringen av EHT-er fra hiPSC-CM-er er godt etablert, forventes det videre utvikling med hensyn til etableringen av en HT-vurderingsplattform. Her tillater den raske genereringen av et stort antall selvaggregerende hjertesfæroider (CS) i 96-brønnformat en forbedring i 3D-forhold for HTS-formål (High Throughput Screening).

Samlet sett er fordelen med datavitenskap som 3D-cellekultur deres høye reproduserbarhet og skalerbarhet. Spesielt kan CS-er kombinert med robotprøvehåndtering standardisere og automatisere CS-kultur, narkotikabehandling og analyse med høyt innhold20. Her beskriver vi optimaliserte protokoller for å generere CS-er av høy renhet og høy kvalitet, som effektivt kan kryopreserveres og screenes for hjertefunksjon ved å utføre Ca2+ forbigående målinger ved hjelp av et optisk kalsiumoppkjøps- og analysesystem. Denne modellen gir et enkelt, men kraftig verktøy for å utføre skjermer med høy gjennomstrømning på hundrevis til tusenvis av sfæroider17,18.

Protocol

MERK: hiPSC-CMs brukt i denne studien ble generert i henhold til tidligere beskrevet hiPSC dyrking og CM differensiering protokoller26,27. Eventuelt kan hiPSC-CM-ene utvides og kryopreserveres som nylig publisert før du starter CS-protokollen (seksjon 4)10.

1. Fremstilling av cellekulturmedier, løsninger og alikoter

  1. Forbered basal medium
    1. Øk penicillin-streptomycin og mediet (RPMI 1640) til romtemperatur (RT) og sørg for at det har tint helt. Bland 500 ml av mediet og 5 ml penn/streptokokker. Oppbevares ved 4 °C i opptil 8 uker. likevekter til 37 °C før bruk.
  2. Forbered RPMI + B27
    1. Likevekt B27 supplement og basal medium til RT. Sørg for å tine supplement helt. Bland 490 ml av basalmediet og 10 ml av 50x B27-tilskuddet. Oppbevares ved 4 °C i opptil 2 uker. likevekter til 37 °C før bruk.
  3. Forbered hiPSC-CM re-plating media
    1. Legg til Rho-assosiert, spiralholdig proteinkinasehemmer (ROCK) (2 μM sluttkonsentrasjon) og 10% knockout serumerstatning (KSR) til RPMI + B27 medier. Legg til ROCK-hemmer direkte til RM-mediet etter behov. Ikke oppbevar kulturmedier når de er supplert.
  4. Klargjøre CM-tinemedier
    1. Legg til en 1:100 konsentrasjon av celleoverlevelsestilskudd (f.eks. Revitacell) og 20% KSR til RPMI + B27 medier og likevekt til 37 ° C før bruk.
  5. Forbered modningstilskudd
    1. Den tidligere beskrevne modningsmediumformel28 består av: 3 mM glukose, 10 mM L-laktat, 5 mg/ml vitamin B12, 0,82 mM biotin, 5 mM kreatinmonohydrat, 2 mM taurin, 2 mM L-karnitin, 0,5 mM askorbinsyre, 1x NEAA, 0,5% (w/v) albumax, 1x B27 og 1% KOSR. For å forberede en full flaske (500 ml) modningstilskudd, fjern 65 ml fra en flaske DMEM uten glukose og suppler med 2,7 g glukose, 5,6 g L-laktat, 0,025 mg vitamin B12, 1 mg biotin, 3,73 g kreatinmonohydrat, 1,25 g taurin, 1,975 g L-karnitin, 0,7125 g askorbinsyre, 50 ml NEAA, 12,5 g albumax og 5 ml penicillin-streptomycin.
    2. Filtrer gjennom en steril engangsfilterenhet med en 0,22 μm pore polyetersulfon (PES) membran.
    3. Aliquot i 45 ml (for å forberede 500 ml modningsmedium) eller 4,5 ml (for å forberede 50 ml modningsmedium). Oppbevares ved 20 °C i opptil 6 måneder.
  6. Klargjøre modningsmedier
    1. Equilibrate B27 supplement, knockout SR, penicillin-streptomycin, modningstilskudd28, og DMEM no-glukose medium ved RT. Sørg for å tine supplement helt. Bland 435 ml av DMEM ingen glukosemedium med 10 ml av 50x B27 supplement, 5 ml penicillin-streptomycin, 5 ml knockout SR og 45 ml modningstilskudd. Oppbevares ved 4 °C i opptil 2 uker. likevekt ved 37 °C før bruk.
  7. Forbered fluor lyst medium
    1. Equilibrat penicillin-streptomycin og DMEM fluorobrite medium ved RT. Sørg for at tillegget er helt tint. Bland 500 ml av DMEM-fluorbritmediet med 5 ml penicillin-streptomycin. Oppbevares ved 4 °C i opptil 1 måned; likevekt ved 37 °C før bruk.
  8. Forbered den ikke-ioniske vaskemiddelløsningen
    1. Bland 20 % w/v ikke-ionisk vaskemiddelpulver (f.eks. F-127) med PBS. Filtrer med et 0,22 μm filter og oppbevar ved 4 °C i opptil 6 måneder; likevekt ved RT før bruk.
  9. Forbered kalsiumfargestoff medium
    1. Bland den ikke-ioniske vaskemiddeloppløsningen (sluttkonsentrasjon på 0,04 % v/v) og 0,1x kalsiumfargestoffet (f.eks. Cal520 AM) i fluorsterkt medium. I et 50 ml konisk rør tilsettes 10 μL Cal520 og 20 μL av den ikke-ioniske vaskemiddelløsningen. Bland til helt oppløst. Hold løsningen i mørket før du legger til cellene.

2. Forberedelse av buffere

  1. Forbered permeabiliserings- og blokkeringsbuffer: Denne bufferen inneholder 10 ml PBS, 5 % vekt/v BSA og 0,3 % v/v Triton-X-100.
  2. Forbered flowcytometribufferen: Denne bufferen inneholder 50 ml PBS, 1 % vekt/v BSA og 0,3 % v/v Triton-X-100.
  3. Vaskebuffer for flowcytometri: Denne bufferen inneholder 50 ml PBS og 1 % vekt/v BSA.
  4. Sfæroid vaskebuffer (SWB): Denne bufferen inneholder 1 ml Triton-X-100, 2 ml 10% (w / v i DPBS) SDS og 2 g BSA i 1 liter PBS.
    MERK: SWB kan oppbevares ved 4 °C i opptil 2 uker.
  5. Forbered innebyggingsløsningen (ES): For å forberede 100 ml av innebyggingsløsningen, bland 50 ml glyserol med 9,09 mldH2O, 1 ml Tris-buffer (1 M, pH 8,0) og 200 μL EDTA (0,5 M). Tilsett 22,7 g fruktose og bland ved RT i mørket til det er oppløst. Når det er klart, tilsett 22,2 g fruktose og bland til det er oppløst. Tilsett deretter 15 g urea og bland til det er oppløst (oppbevares ved 4 °C i mørket).
  6. Forbered PBT (PBS med Tween-20) buffer. Denne bufferen inneholder PBS/Tween-20 (0,1 % v/v). For 1 liter PBS, tilsett 1 ml Tween-20.

3. Fremstilling av små molekyler

  1. Rekonstituer tiazovivinpulver (ROCK-hemmer) i 10 ml alikoter á 50 μL i DMSO og oppbevares ved -20 °C i opptil 6 måneder. Beskytt mot lys.
  2. Forbered 2,5 mM alikoter på 10 μL hver Cal-520 AM i DMSO og oppbevar dem ved -20 °C i opptil 6 måneder. Beskytt mot lys.

4. Hjerte sfæroid generasjon

MERK: For større mengder CS, frø opptil 1 million CM i en 6-brønns ultra-lav festeplate med 2 ml hiPSC-CM re-plating media. Denne studien brukte minimum 2,500 (2.5k CS) opp til 20,000 (20k CS) hiPSC-CMs per brønn på en 96-brønnplate.

  1. For en 96-brønnsplate, lag en cellekultur som inneholder minimum 2 x 106 menneskeinduserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter (hiPSC-CMs)10.
  2. Når de dyrkede hiPSC-CMene når samløp, tilsettes 0,1 ml/cm2 steril hjerteløsrivelsesløsning (f.eks. tryple) til hver brønn. Inkuber platen ved 37 °C i 15 minutter.
  3. Bruk en 5 ml pipette, og dissosiere cellene mekanisk ved å skylle med 2 ml varmt basalmedium for å lage en enkeltcellesuspensjon. Bekreft løsningen med et lysfeltmikroskop (4x forstørrelse); Cellene vil se hvite ut og ha en rund form.
  4. Overfør cellesuspensjonen til et 15 ml konisk rør og sentrifuge i 3 minutter ved 300 x g.
  5. Aspirer supernatanten og resuspender cellene i 1 ml hiPSC-CM re-plating media.
  6. Bruk en 1000 μL pipetspiss til å desosiere cellepelleten mekanisk. Løsningen virker homogen etter tre eller fire blandinger. Tell cellene. Overfør riktig mengde celler i 100 μL av re-plating medium til hver ultra-lav vedlegg rundbunn 96-brønn brønn.
  7. Plasser platen av CSs på en orbital shaker ved 70 o / min i inkubatoren i 24 timer. Sett inkubatorforholdene til 37 ° C, 5% CO 2, 21% O2 og 90% fuktighet.
  8. Aspirer 50 μL medium fra hver brønn og tilsett 100 μL RPMI + B27 medium per brønn de første 48 timene.
    MERK: Hold alltid 50 μL av mediet i 96-brønnplaten for å unngå utilsiktet aspirasjon og sfæroidbrudd.
  9. Aspirer 100 μL av mediet fra hver brønn og tilsett 100 μL av modningsmediet per brønn. Oppretthold cellene i modningsmediet og oppdater mediet hver 2-3 dag.

5. Kryopreservering av CSs

MERK: CS kan kryopreserveres for langtidslagring. Kryopreservering kan utføres fra dag 3 etter generering av CS. CS kan kryopreserveres direkte i brønnene på en 96-brønnsplate eller som en CS-suspensjon i kryovialer.

  1. Forkjøl platen ved å legge platen på is i 10 min.
  2. Sentrifuge sfæroidplaten i 3 minutter ved 70 x g.
  3. Fjern supernatanten til 50 μL gjenstår og tilsett 200 μL iskaldt hisc-frysemedium per brønn.
    MERK: Hold CS-suspensjonen på is under hele prosedyren. I tilfelle av en 6-brønnsplate med sfæroider, frys en brønn i et 500 μL frysemedium kryovial.
  4. Forsegl platen med plateforseglingsfilm.
    MERK: 96-brønnsplaten må lagres i en polystyrenboks eller, når den ikke er tilgjengelig, kan en silisiumform lages som beskrevet i trinn 5.5.1.
  5. For å sikre jevn varmeveksling mellom brønnplaten og fryseren, plasser platen forsiktig i en polystyrenboks eller i en silisiumform.
    1. For å forberede silisiumformen: Bland kraftig to komponenter i silisiumelastomersettet i forholdet 10: 1. De-boble løsningen ved hjelp av en vakuumpumpe i 15-20 minutter. Deretter støpes løsningen inne i den nederste delen av brønnplaten og debobles ved hjelp av en vakuumpumpe i 10 minutter. Sett formen inn i en ovn og herd ved 60 °C i 8 timer for å oppnå en halvfleksibel elastomer som avskalles av platen.
  6. Frys platen ved -80 °C i minimum 4 timer i isoporboksen eller den tilberedte silisiumformen.
  7. Overfør platen til en tank med flytende nitrogen eller en fryser på -150 °C for langtidsoppbevaring.

6. Tining av hjertesfæroider

MERK: Ikke tine mer enn én plate om gangen for å sikre en rask tineprosess.

  1. Tilbered 20 ml 37 °C forvarmet basalmedium i et 50 ml konisk rør.
  2. Samle celleplaten med CS fra flytende nitrogen og legg den i inkubatoren i 15 minutter. Sett inkubatorforholdene til 37 ° C, 5% CO 2, 21% O2 og 90% fuktighet.
  3. Fjern supernatanten og cellepelleten forblir, og resuspender hver brønn i et varmt basalmedium. Bruk 200 μL medium per brønn.
  4. Sentrifuge i 3 min ved 70 x g.
  5. Gjenta trinn 6.3 og 6.4.
  6. Fjern supernatanten til cellepelleten forblir og tilsett 200 μL CM tinemedium i hver brønn.
  7. Plasser platen av CSs på en orbital shaker ved 70 o / min i en inkubator i 24 timer. Sett inkubatorforholdene til 37 ° C, 5% CO 2, 21% O2 og 90% fuktighet.
  8. Aspirer 50 μL av mediet fra hver brønn og tilsett 100 μL RPMI + B27 medium per brønn de første 48 timene.
  9. Aspirer 100 μL av mediet fra hver brønn og tilsett 100 μL modningsmedium per brønn. Vedlikehold cellene i modningsmediet og oppdater mediet hver 2-3 dag.

7. Vurdering av intracellulære Ca2+ transienter

MERK: CSs er i kultur i totalt 3 uker; 2 uker før frysing, og 1 uke etter tining. De «ferske» kontrollene er aldersmatchede.

  1. Etter 1 ukes kultur er de tinte CSene optimale for kalsiumhåndtering optisk avbildning. Bruk et kalsiumfargestoff (f.eks. Cal520AM) for å vurdere opptak og frigjøring av Ca2+ fra cellene.
  2. Behandle dem med 100 μL kalsiumfargestoff medium per brønn og inkuber i 60 minutter i inkubatoren. Sett inkubatorforholdene til 37 ° C, 5% CO 2, 21% O2 og 90% fuktighet.
    MERK: Cal520AM er lysfølsom. Utfør alle lasteprosedyrer og eksperimenter i mørket.
  3. Forbered kalsiumoppkjøps- og analysesystemet.
    1. Strøm mikroskopet, slik at alternativet for miljøkontroll er på.
    2. Juster kameraets og innrammingens blenderåpningsdimensjoner for å minimere bakgrunnsområdet.
      MERK: Her ble Leica Thunder DMi8 mikroskop brukt; Andre mikroskopsystemer gjelder også til de tillater en samplingsfrekvens over 30 bilder / sekund (fps).
  4. Ta opp en video med en konsistent strøm av 2-10 topper innen 10 s og skann over 96-brønnplaten, flytt først til venstre, deretter nedover på en sikksakk-måte for å dekke hele platen. Mål kalsiumsignalet ved hjelp av en 488 nm laser; Sett kontrasten til en svart bakgrunn med et sterkt grønt signal under kalsiumfrigivelse.
  5. Etter å ha anskaffet Ca2+ -transientene, analyser dataene med fluorescenssporanalyseprogramvaren (f.eks. CyteSeer, Vala Sciences) i henhold til produsentens instruksjoner.

8. Flowcytometrianalyser av dissosierte hjertesfæroider

MERK: I denne studien ble flowcytometri brukt til å bestemme levedyktigheten til kreftskolene før og etter tineprosessen.

  1. Samle CS i et 15 ml konisk rør ved hjelp av en 5 ml pipet for å unngå sfæroidskade og sentrifuge i 3 minutter ved 70 x g. Aspirer supernatanten og tilsett 1 ml PBS.
  2. Sentrifuge i 3 min ved 200 x g. Aspirer supernatanten og dissosiere CSene ved å legge til 1 ml hjerteløsrivelsesløsning (f.eks. tryple). Inkuber røret ved 37 °C i 15 minutter.
  3. Ved hjelp av en 5 ml pipet, dissosiere cellene mekanisk ved å skylle med 2 ml basalmedium til enkeltceller kan ses når de observeres under mikroskopet.
  4. Sentrifuge i 3 min ved 200 x g.
  5. Aspirer supernatanten og fikser CMs med 200 μL 4% paraformaldehyd (PFA) løsning i 1x PBS. Inkuber i 10 min ved RT.
  6. Sentrifuge i 3 min ved 200 x g. Aspirer supernatanten og tilsett 1 ml PBS.
    MERK: Pause punkt: De faste hiPSC-CMene kan oppbevares ved 4 °C i opptil 4 uker.
  7. Overfør cellesuspensjonen til et FACS-rør og sentrifuge i 3 minutter ved 200 x g. Aspirer supernatanten og resuspender 1 x 105 celler i 50 mikrol av permeabiliseringsbufferen.
  8. Inkuber cellene i 30 minutter ved 4 °C.
  9. For immunfluorescens flowcytometrianalyse, utfør trinn 8.9.1-8.9.4.
    1. Resuspender cellene i flowcytometribufferen (50 μL) som inneholder α-aktininantistoffet ved en fortynning på 1:300. I et annet FACS-rør, resuspender 1 x 105 celler i flowcytometribufferen (50 μL) med den respektive isotypekontrollen (f.eks. FITC-mus IgM, κ isotype [1:200 fortynning]). Tilsvarende resuspenderes 1 x 105 celler i 50 μL flowcytometribuffer for negativ kontroll.
    2. Inkuber cellene i 30 minutter ved 4 °C.
    3. Tilsett 2,5 ml flowcytometribuffer og sentrifuger cellene ved 200 x g i 3 minutter ved 4 °C; Kast supernatanten og gjenta dette vasketrinnet to ganger.
    4. Resuspender cellene i 50 μL flowcytometribuffer med sekundærantistoffet geit-anti-mus (1:300 fortynning).
      MERK: Plasser røret i mørket siden den sekundære antistoffløsningen er lysfølsom.
  10. For levedyktighetskontroll med propidiumjodid (PI), tilsett 150 μL PI per prøve (1:1000) og inkuber i 15 minutter.
    MERK: Plasser røret i mørket siden PI-oppløsningen er lysfølsom.
  11. Juster portene i henhold til standard gating-strategi som vist i tilleggsfigur 1 og analyser cellene med et flowcytometer.

9. Immunfluorescensfarging av hele 3D-sfæroider

MERK: Denne protokollen er basert på protokollen for høyoppløselig 3D-avbildning av hele organoider ved immunfluorescerende merking, som tidligere ble publisert29 og justert for hjertesfæroider. Under prosedyren kan alle pipetspisser og koniske rør belegges med 1% vekt/v BSA-PBS for å forhindre at sfæroidene fester seg til plast. For å belegge materialene, dypp i 1% BSA-PBS. Vær forsiktig så du ikke skader sfæroidene ved å bruke 5 ml pipet, slik at mekaniske forstyrrelser unngås.

  1. Samle CS i et 15 ml belagt rør med en 5 ml pipet. Sfæroidene er synlige for øyet. Samle ~ 20-50 sfæroider per antistoffkombinasjon. Sentrifuge i 3 min ved 70 x g og aspirer supernatanten.
  2. Resuspender sfæroidene forsiktig i 1 ml iskald 4 % paraformaldehydoppløsning (PFA) i 1x PBS ved bruk av en belagt 1 ml spiss.
  3. Fikses ved 4 °C i 45 minutter. Etter 20 minutter, resuspender sfæroidene forsiktig med en belagt 1 ml spiss. Dette jevner fiksering blant alle sfæroider.
  4. Tilsett 10 ml iskald PBS til røret og bland forsiktig ved å snu røret. Inkuber i 10 minutter ved 4 °C og sentrifugerer ved 70 x g i 3 minutter.
    MERK: Fra dette trinnet og fremover er belegg av spisser og koniske rør vanligvis ikke nødvendig, da CS-er ikke fester seg til spissen etter fiksering.
  5. Blokker CS-ene ved å resuspendere pelleten i iskald SWB (200 μL SWB per brønn) og overfør sfæroidene til en 24-brønns suspensjonskulturplate.
    MERK: CS fra en stor pellet kan deles over flere brønner for å utføre forskjellige flekker. Bruk ~ 20-50 CS per antistoff kombinasjon.
  6. Inkuber ved 4 °C i minst 15 minutter.
  7. Tilsett 200 μL av SWB i en tom brønn for å tjene som referansebrønn.
    MERK: For immunfluorescerende farging kan 48- eller 96-brønnsplater også brukes til å redusere antistoffbruk. Imidlertid kan flekk- og vaskeresultatene reduseres på grunn av mindre volum per brønn.
  8. La sfæroidene legge seg i bunnen av platen, ved å la platen vippe i en 45° vinkel i 5 minutter.
  9. Fjern SWB, og la CS-ene ligge i 200 μL av SWB (bruk referansebrønnen til å estimere det minimale volumet på 200 μL).
  10. Tilsett 200 μL av SWB med de primære antistoffene 2x konsentrert (f.eks. ɑ-aktinin [1:200] og troponin T [1:200]) og inkuber over natten ved 4 ° C mens du gynger / rister (40 rpm på en horisontal rister).
  11. Neste dag, legg til 1 ml av SWB til hver brønn.
  12. La sfæroidene legge seg i bunnen av platen ved å la platen stå i en 45° vinkel i 5 minutter.
  13. Fjern SWB, og la 200 μL ligge i platen. Tilsett 1 ml SWB og vask i 2 timer med langsom gynging/risting.
  14. Gjenta trinn 9.12 og 9.13 to ganger til.
  15. La CS-ene sette seg i bunnen av platen ved å la platen vippes 45° i 5 minutter. Fjern SWB, og la 200 μL i hver brønn
  16. Tilsett 200 μL av SWB med sekundære antistoffer, konjugerte antistoffer og fargestoffer 2x konsentrert (f.eks. DAPI [1 μg / ml], mus-AF488 [1:500], kanin-AF568 [1:500]), og inkuber over natten ved 4 ° C i mørket, mens du sakte gynger / rister.
  17. Neste dag gjentar du trinn 9.12 og 9.13 to ganger til.
  18. Overfør CS forsiktig til et 1,5 ml rør og sentrifugering ved 70 x g i 3 minutter.
  19. Fjern så mye av SWB som mulig ved å pipettere uten å forstyrre CS-ene.
  20. Tilsett innebyggingsløsningen (ES; minst 50 μL, ved RT) ved hjelp av en 200 μL-spiss med enden avskåret og resuspender forsiktig for å forhindre bobledannelse og inkuber ved RT i 20 minutter.
  21. I mellomtiden lager du en firkantet beholder på et lysbilde med enten neglelakk eller silikonforseglingsmiddel.
  22. Klipp av enden av en 200 μL-spiss og overfør CS-ene i ES til midten av den firkantede beholderen.
  23. Legg en firkantet dekkseddel på toppen. For å redusere luftbobler, plasser den ene siden av dekselet først, senk deretter dekselet sakte fra den ene siden til den andre til den til det ikke er fanget luft under overflaten, og slipp deretter dekselet.
  24. Trykk forsiktig på alle kanter av dekselet for å forsegle det til neglelakk eller silikonforseglingsmiddel.
  25. La lysbildet stå over natten på RT. Dagen etter er lysbildet klart for avbildning.
    MERK: Optisk clearing av ES kan forårsake mindre vevskrymping. Dette kan imidlertid ikke påvirke den generelle morfologien til kreftskolene. Her kan fargeprosedyren settes på pause ved å oppbevare lysbildene ved 4 °C (i minst 1 uke) eller ved -20 °C (i minst 6 måneder).

Representative Results

Protokollen vist i figur 1A beskriver genereringen av CSs fra tidligere utvidede hiPSC-CMs. CS-ene får en 3D-struktur etter dag 1 etter såing i rundbunnsplater med ultralavt feste og kan dyrkes i opptil 6 uker (figur 1B). Som vurdert ved immunfluorescensfarging, uttrykte flertallet av cellene i 3 uker gamle CSs sarkomerproteiner som α-aktinin og troponin T og viste regelmessig sarkomerorganisasjon (figur 1C). For kvantifisering av α-aktinin-positive celler ble det utført flowcytometrianalyse. I samsvar med immunfluorescensresultatene viste flowcytometridata sammenlignbare høye nivåer av α-aktinin både på dag 0 (76,9 % ± 16,6 %) og 3 uker gammel CS (71,1 % ± 22,7 %) (figur 1D), noe som indikerer en konstant og svært ren cellulær sammensetning under dyrking. Det var økt ekspresjon av hjertegenene for knutepunkter (GJA1, JPH2 og PKP2), desmosomer (DES) og mitokondrier (ATP5A) i hisc-CM-deriverte sfæroider (dag 42) versus hiPSC-CM dyrket i 2D i 90 dager (figur 1E). Ekspresjonen av disse genene er et kjennetegn på celle-celle-interaksjon og modning30.

Deretter ble de funksjonelle egenskapene til CSs, nemlig slaghastighet og Ca2+ håndtering, vurdert på forskjellige tidspunkter (figur 2). Kalsiumforbigående parametere som stigningstid, topptid, henfallstid og kalsiumforbigående varighet (CTD90) ble evaluert som angitt i figur 2A,B. Prosentandelen av å slå CSs er lik i de første 3 ukene etter generasjonen, men falt betydelig i uke 6 (Wk6) CSs (figur 2C). Slagfrekvensen ble betydelig redusert ved Wk3 sammenlignet med Wk1, og i likhet med prosentandelen av å slå CS, falt dramatisk på Wk6 (figur 2D). Ved Wk6 ble CS-forverring observert, noe som kan forklare nedgangen i både slagfrekvensen og antall slag-CS. Måling av kalsiumforbigående parametere indikerte en signifikant høyere toppverdi ved Wk2 (figur 2E), mens stigningstid, henfallstid og CTD90 var signifikant økt ved Wk3 sammenlignet med Wk1 (figur 2F-H ). Samlet viser disse resultatene at hiPSC-CM-avledede sfæroider er funksjonelt optimale rundt uke 2 og 3 etter generasjon.

Figur 3 viser effekten av sfæroidstørrelse på slaghastighet og kalsiumhåndtering. CS ble generert ved såing 2,5 x 10 4, 5 x 10 4, 10 x 10 4 og 20 x 10 4 hiPSC-CM i en brønn med en 96-brønns plate for totalt 24 CS / brønner per tilstand (figur 3A). Som forventet økte sfæroidstørrelsen etter hvert som antall celler som ble brukt, økte fra 178 ± 36 μm til 351 ± 65 μm (figur 3A, høyre panel). Ca2+ transienter ble målt i 3 uker gamle CS ved de fire forskjellige såtetthetene (figur 3B). Målinger av å slå CS-er indikerte at bare ca. 50 % av de mindre størrelse-CS-ene (2,5K- og 5K-CS-er) slo, mens prosentandelen av større CS-er (10K- og 20K-CS-er) var signifikant høyere (ca. 85 %) (figur 3C). En lignende slagfrekvens (ca. 28 bpm) ble vist av 5K-, 10K- og 20K-CS-er, som var betydelig høyere sammenlignet med 2,5K-CS (figur 3D). Toppverdiene for kalsiumbilder var like under alle testede forhold (figur 3E), men stigningstid (figur 3F), henfallstid (figur 3G) og CTD90 (figur 3H) ble signifikant økt i større størrelse-CS (10K- og 20K-CS) sammenlignet med de mindre (2,5K- og 5K-CS). Samlet sett viser disse resultatene at hiPSC-CM-avledede sfæroider er optimale for kalsiumhåndteringsscreening når en såtetthet mellom 10K- og 20K hiPSC-CMs/brønn brukes.

Deretter evaluerte vi virkningen av kryopreservering på CSs levedyktighet og funksjon. Før analyse ble tinte kreftskoler opprettholdt i dyrkning i 1 uke (figur 4A). Som vist ved levedyktighetstester for både flowcytometri (figur 4B) og Calcein-AM (figur 4C), påvirket ikke kryopreservering cellenes levedyktighet i CSene. I tillegg viste tinte CSs lignende ekspresjonsnivåer av sarkomeriske proteiner sammenlignet med de ferske aldersmatchede CS-ene (figur 4D). Disse dataene indikerer at CSs effektivt kan kryopreserveres for påfølgende hjertefunksjonsanalyse og høy gjennomstrømningsscreening.

Til slutt ble slagaktiviteten og Ca2+-håndteringen målt i både ferske og kryopreserverte CS (figur 5). Prosentandelen av å slå CSs ble målt på forskjellige tidspunkter etter tining, henholdsvis på 2, 5 og 7 dager. Mens de fleste av de ferske CS-ene viste slagaktivitet over tid, var det klart at de kryopreserverte CS-ene trengte opptil 1 uke med dyrking for å gjenopprette slagaktiviteten (figur 5B). Det var ingen signifikant endring i slagfrekvensen for tinte CSs versus fresh; Det ble imidlertid ikke observert spontan slagaktivitet hos noen frosne CS (figur 5C). Selv om toppverdiene var signifikant redusert i fryst/tint CS sammenlignet med ferske (figur 5D), ble det ikke observert signifikante endringer i stigningstid, henfallstid og CTD90 for frosne/tinte CS sammenlignet med ferske (figur 5E-G). Disse dataene indikerer at det etter tining er viktig å la kreftskolene komme seg i inkubatoren i minst 1 uke før man måler slagaktivitet og Ca2+ forbigående.

Samlet sett viser disse resultatene at kryopreservering av hiPSC-CM-avledede sfæroider bevarer kardiomyocyttens levedyktighet, sarkomerstrukturen og deres funksjonelle egenskaper som spontan slående aktivitet og kalsiumhåndtering. Dermed representerer hiPSC-CM-avledede sfæroider en egnet modell for nøyaktig å rekapitulere hjertets elektrofysiologi in vitro.

Figure 1
Figur 1 Generering av hjertesfæroider. (A) Skjematisk fremstilling av Wnt-basert rettet hjertedifferensiering, den påfølgende utvidelsen av hiPSC-CM og generering av CS. Laget med biorender.com. (B) Bright-field bilder på ulike tidspunkter av CS dyrking. Skala bar, 200 μm. Wk representerer uke. (C) Representative immunfluorescensbilder for hjertesarkomeriske proteiner α-aktinin og troponin T i 3 uker gamle CS. Immunfluorescens: Hoechst (blå), α-aktinin (grønn) og troponin T (rød). Skala bar, 200 μm. Det innzoomede sammenslåtte bildet til høyre viser sarkomerorganisasjonen. Skalastang, 50 μm. (D) Flowcytometrikvantifisering av α-aktininpositive celler før (dag 0) og 3 uker etter dannelse av CS. (n = 14-23 per tilstand. (E) RT-qPCR utført på hiPSC-CMs dyrket i 90 dager (2D) og sfæroidprøver dyrket i 42 dager for å etablere ekspresjonsnivåer av forskjellige hjertegener relatert til cellekryss, mellomliggende filamenter og mitokondrier. (n = 1-3 partier). Data representeres som gjennomsnitt ± SD. NS (ikke-signifikant) beregnet ved en uparet t-test. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Slagfrekvens og kalsiumhåndtering i kreftskolene ved ulike uker etter generering. (A) Eksempler på kalsiumtransiente parametere beregnet av Vala sciences analysealgoritme i Cyteseer Software. (B) Representative kalsiumforbigående spor og time-lapse-bilder av kreftskolene på forskjellige tidspunkter (uker) etter generering. Skala bar, 200 μm. (C) Kvantifisering av spontan slagaktivitet uttrykkes som prosentandelen av å slå CSs. (D) Slår frekvensen av CSs i løpet av dyrkingstiden. (E-H) Kvantifisering av kalsiumtransientene som viser toppverdi, stigningstid, henfallstid og CTD90. Data som vises er gjennomsnittlige ± SD. Biologiske replikater = tre, tekniske replikater = henholdsvis 38, 50, 66 og 7. *p < 0,05, ****p < 0,001; enveis ANOVA etterfulgt av Tukeys post hoc multiple-comparisons test. Forkortelser; CTD = kalsium forbigående varighet, Wk = uke, CSs = humane hjertesfæroider. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Slaghastighet og kalsiumhåndtering i CSs generert ved bruk av forskjellige cellesåtettheter. (A) Bright-field imaging (venstre) og størrelsesmålinger (høyre) av CSs generert ved hjelp av forskjellige antall hiPSC-CMs. Skalastang, 200 μm. (B) Representative kalsiumtransiente spor og time-lapse-bilder av 2.5K-20K-CSene. (C,D) Slo prosent og slo rate på 2.5K-20K-CSs. (E-H) Toppverdi, stigningstid, forfallstid og CTD90 i 2.5K-20K-CS. Data er gjennomsnittlige ± SD. Biologiske replikater = tre, tekniske replikater = 28-39. *p < 0,05, ****p < 0,001; enveis ANOVA etterfulgt av Tukeys post hoc multiple-comparisons test. Forkortelser: CTD = kalsium forbigående varighet, Wk = uke, k = x 1000 celler, CSs = hjerte sfæroider. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4. Effekt av kryopreservering på hjertesfæroiders levedyktighet og struktur. (A) Skjematisk fremstilling av CS-generering, påfølgende biobanking og tining. (B) Levedyktighetstest av flowcytometriceller i både ferske og kryopreserverte CSer. Som en positiv kontroll ble det brukt en behandling med 10% Triton-X-løsning i 5 minutter. (n = 4 per betingelse). Data er representert som gjennomsnitt ± SD. ** **p < 0,001; enveis ANOVA etterfulgt av Tukeys post hoc multiple-comparisons test. (C) Calcein-AM celle levedyktighet test i fersk versus tint CSs etter 7 dager med dyrking (n = 15-17 per tilstand, ** **p < 0,001, ved paret t-test; skala bar, 200 μm). (D) Representativ lysfelt (venstre) og immunfluorescensfarging for α-aktinin og troponin T-uttrykk i friske og tinte CSs. Immunfluorescens: Hoechst (blå), α-aktinin (grønn) og troponin T (rød). De sammenslåtte bildene til høyre viser sarkomerstriper i CS-ene. Skala bar, 50 μm. Forkortelser: X = valgfri tinedag, PI = propidiumjodid, Cal-AM = calcein-AM, EthD-I = Ethidium homodimer I. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Kalsiumtransienter i fersk versus tint CS. (A) Representative kalsiumforbigående spor og time-lapse-bilder av kreftskolene før kryopreservering og 1 uke etter tining. (B) Slagprosent av ferske og frosne/tinte hjertesfæroider. Barer representerer individuelle eksperimenter. (C) Slagfrekvens av ferske og frosne/tinte hjertesfæroider. (VG Nett) Kvantifisering av kalsiumforbigående parametere: toppverdi, stigningstid, henfallstid og CTD90. Data er gjennomsnittlige ± SD. *p < 0,05, ****p < 0,001; enveis ANOVA etterfulgt av Tukeys post hoc multiple-comparisons test. Forkortelser; CTD = kalsium forbigående varighet, CSs = hjerte sfæroider. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfigur 1: Representative gatingstrategier for flowcytometrianalyse. (A) Representativ gatingstrategi for α-aktinin-positive hiPSC-CMs i en ren populasjon versus negativ kontroll og isotypekontroll. Antall α-aktininpositive analyserte celler er 25 x 105. Forkortelser; SSC = sidespredning, PI+ = propidiumjodid positiv. (B) Representativ gatingstrategi for levedyktighetsanalysen i både fersk, tint, positiv kontroll (Triton-X) og negativ kontroll (ufarget). Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Oppdagelsen av legemidler i hjertet hindres av en avhengighet av ikke-menneskelige dyre- og cellemodeller med utilstrekkelig gjennomstrømning og fysiologisk troskap til å utføre avlesninger nøyaktig. hiPSC-CM-biologi kombinert med HT-instrumentering og fysiologiske prober har potensial til å gjeninnføre menneskelige modeller i de tidligste stadiene av hjertesykdomsmodellering og narkotikaoppdagelse. Vi utviklet en 3D-metode for generering av hjertevev som produserer høykvalitets og funksjonelle CS-er for en optimal plattform for modellering av hjertesykdom og screening av legemidler. I tillegg gir kombinasjonen av sfæroidteknologien i 3D-bioreaktorsystemer for industriell EV-produksjon et nødvendig skritt mot klinisk oversettelse av EV-basert terapi. Metoden beskrevet her er avhengig av flere avgjørende faktorer og er en variant av eksisterende protokoller 9,10,28,29. Disse metodene inkluderer: 1) generering av 3D-vevskonstruksjoner, 2) det optimale cellenummeret og timingen før screeningen, 3) forbedring av følsomhet og høy gjennomstrømningskapasitet for instrumenter, og 4) å kunne fryse sfæroidene før noen funksjonell analyse. I motsetning til tidligere beskrevne protokoller, beskriver den foreslåtte protokollen genereringen av opptil 1,500 sfæroider per dag og egnetheten for HTS. Konvensjonell analyse av hundre forbindelser over 6 x 0,5 loggdoser for 10 replikater ved bruk av eksisterende 96-brønns kalsiumavbildningssystemer eller 24-brønns multiplekset konstruert hjertevev krever omtrent 500 millioner til 3 milliarder hiPSC-CMs31,32. Den foreslåtte applikasjonen gjør hjertescreening mindre kostbar og tidseffektiv sammenlignet med de konvensjonelle systemene, siden 96-brønnplatene bare krevde 10% av såtettheten sammenlignet med den beskrevne metoden. Dessuten, sammenlignet med tidligere protokoller, for eksempel hengende dråpe-metoden, muliggjør generering av sfæroider ved selvaggregering i ultra-lave festeplater høy kvalitet automatisert avbildning av enkeltmikrovev33.

Denne lille 3D-modellen etterligner den biologiske og fysiologiske fenotypen til det kardiovaskulære miljøet in vivo . Som tidligere vist øker kalsiumtransienter dramatisk i 3D-hjertevevskonstruksjoner sammenlignet med 2D monolagscellekulturer34.

Deretter fant vi ut at såtetthet og riktig dyrkingstid også er kritiske faktorer for en vellykket CS-screening. Tetthetene på 10K-20K hiPSC-CM per sfæroid og screening mellom uke 2-3 etter generasjon var optimale, mens for små eller for gamle sfæroider viser forstyrret kalsiumhåndtering (figur 2 og figur 3). Derfor er det viktig å opprettholde såtettheten så konsistent som mulig, siden størrelsen påvirker de funksjonelle parametrene. Selv om denne optiske metoden gir gode resultater for levende 3D-kulturer som et helt vev, er det utfordrende å skaffe data i større sfæroider på (sub-) cellulært nivå uten å stole på tidkrevende histologimetoder. Nylig har flere tilnærminger blitt publisert som brukte "optisk clearing", som muliggjør oppkjøp av hele 3D-sfæroider med mulighet for enkeltcellekvantifisering av markører. Her tilpasset vi en 3-dagers protokoll fra CS-høsting til bildeanalyse, som er optimalisert for 3D-avbildning ved hjelp av konfokalmikroskopi29 (figur 1C og figur 4D).

Til slutt, med økningen i 3D-hjertevevsapplikasjoner og kommersielle applikasjoner, øker etterspørselen etter langtidslagring og pasientspesifikk biobanking fra ulike givere. Kryopreservering er en effektiv strategi for å generere HTS-plater fra flere partier over tid. Frysing av hiPSC-CM er beskrevet tidligere og er ikke forskjellig sammenlignet med andre dyrkede celletyper 10,35,36. Nylig har tilnærminger for frysing av plater med 2D-celler blitt beskrevet37. Her fant vi at PSC-kryopreserveringssettet er den mest optimale tilstanden sammenlignet med tre andre (data ikke vist) og brukte dette mediet for effektiv frysing av sfæroider. Etter kryopreservering forblir levedyktigheten høy (figur 4B,C), men CSs elektrofysiologiske egenskaper påvirkes og en periode med inkubasjon etter tining er nødvendig. 1 uke etter tining viste kreftskolene spontan slagaktivitet og kalsiumhåndtering. Det er imidlertid beskrevet at ferske og gjenvunnede hiPSC-CM ikke alltid viser identiske molekylære og fysiologiske egenskaper38. Denne begrensningen må vurderes når kryopreserverte hiPSC-CMs brukes til å vurdere legemiddelinduserte hjerteavlesninger. Videre, selv om vi effektivt modulerer antall celler per sfæroid og den optimale timingen av kalsiumforbigående avbildning, kan hjertesfæroidene forbedres ved å blande hiPSC-avledede kardiomyocyttceller med endotelceller, fibroblaster, celle-cellekryss og ekstracellulære matriser, som kitosan, kollagen IV, fibronektin, matrigel eller laminin, som etterligner in vivo hjertemiljøet39, 40. Samlet sett foreslår vi en trinnvis protokoll for effektivt å generere CSs som er egnet for nedstrøms applikasjoner som sykdomsmodellering og HT-medikamentscreening.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi ønsker å anerkjenne VALA-vitenskap for programvarepakken Cyteseer og optimalisering av den automatiserte 3D-kalsiumanalysen. Vi ønsker å anerkjenne tilskuddsstøtte fra PLN-stiftelsen (RM). P.A.D. og F.S. støttes av CUREPLaN Leducq. J.P.G.S. støttes av H2020-EVICARE (#725229) fra Det europeiske forskningsrådet (ERC). J.W.B. støttes av UMC Utrecht Clinical Fellowship, Netherlands Heart Institute Fellowship og CVON-Dosis stipend for unge talenter; Netherlands Heart Foundation (CVON-Dosis 2014-40). N.C. støttes av gravitasjonsprogrammet "Materials Driven Regeneration" av den nederlandske organisasjonen for vitenskapelig forskning (RegmedXB #024.003.013), og Marie Skłodowska-Curie Actions (Grant agreement RESCUE #801540). VS-P. støttes av Alliance Fund (UMCU, UU, TU/e). A.v.M. er støttet av det EU-finansierte prosjektet BRAVE (H2020, ID:874827)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 wells suspenion plate  Corning  3738
96 wells Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate Corning CLS3474-24EA
Albumax Thermo Fisher Scientific 11020021
Anti-α-Actinin (Sarcomeric) antibody Sigma-Aldrich A7811 Dilution: 1:200
Anti-Cardiac Troponin T antibody (ab45932) Abcam ab45932 Dilution: 1:200
Ascorbic acid  Sigma-Aldrich A8960
B-27 supplement  Thermo Fisher Scientific 17504-044
Biotin Sigma-Aldrich B4639
Bovine serum albumin fraction V (BSA) Roche 10735086001
Cal-520, AM  Abcam ab171868
Confocal microscope Leica  DMi8 
Confocal microscope software  Leica  Las X
Conical tubes 15 mL Greiner Bio-One 5618-8271
Creatine monohydrate  Sigma-Aldrich C3630
DAPI  Thermo Fisher Scientific D3571 Concentration: 1 µg/mL
DMEM no glucose  Thermo Fisher Scientific 11966025
EDTA Thermo Fisher Scientific 15575020
Fructose  Sigma-Aldrich 76050771.05
Glucose Sigma-Aldrich G7021
Glycerol Boom 76050771.05
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 Invitrogen A11029 Dilution: 1:500
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568 Invitrogen A11011 Dilution: 1:500
Horizontal shaker IKA 4003000
Human induced pluripotent stem cell lines (Stanford Cardiovascular Institute (S-CVI) Biobank) CVI-273 (control 1)
Human induced pluripotent stem cell lines Germany  141 (control 2) 144 (control 3)
Hydrochloric acid (HCl)  Ajax Firechem 265.2.5L-PL 10 M stock solution, corrosive
Isotype control, FITC mouse IgM κ isotype BD 556652
KnockOut Serum Replacement  Thermo Fisher Scientific 10828 Protect from light
L-carnitine Sigma-Aldrich C0283
Myocyte calcium and contractility system Leica  Thunder, DMi8
Non essential amino acids (NEAA) Thermo Fisher Scientific 11140
Paraformaldehyde solution 4% in 1x PBS, pH 7.0–7.6 Santa Cruz SC281692 Hazardous
PBS, pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010023
Penicillin/streptomycin  Thermo Fisher Scientific 15140
PES Membrane Vacuum Filter system Corning  431097
PI/RNase Staining Solution Invitrogen F10797 Dilution: 1:1000
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443
PSC Cryopreservation Kit Thermo Fisher Scientific A2644601
RevitaCell Thermo Fisher Scientific A2644501
RPMI 1640 medium  Thermo Fisher Scientific 11875
Silicone Elastomer Kit SYLGARD 184
Sodium dodecyl sulfate solution (10%) Sigma-Aldrich 71736
Sodium L-Lactate Sigma-Aldrich 71718
Taurine Sigma-Aldrich T0625
Tris Fisher  Scientific  11486631
Triton X-100 Merck X100-1L Hazardous
Trypan blue solution, 0.4% Thermo Fisher Scientific 15250061
TrypLE Select Enzyme (10x) Thermo Fisher Scientific A1217701
Tween-20  Sigma-Aldrich P1379
Urea  Sigma-Aldrich 51456
Vitamin B12 Sigma-Aldrich V6629
Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor) Tocris  1254 Protect from light

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Burridge, P. W., et al. Chemically defined and small molecule-based generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  2. Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
  3. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (27), 1848-1857 (2012).
  4. Paige, S. L., et al. Endogenous Wnt/beta-catenin signaling is required for cardiac differentiation in human embryonic stem cells. PLoS One. 5 (6), 11134 (2010).
  5. Gintant, G., et al. Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in preclinical cancer drug cardiotoxicity testing: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 125 (10), 75-92 (2019).
  6. Ahmed, R. E., et al. A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 19 (8), 178 (2020).
  7. Liu, C., et al. Generating 3D human cardiac constructs from pluripotent stem cells. EBioMedicine. 76, 103813 (2022).
  8. Musunuru, K., et al. Induced pluripotent stem cells for cardiovascular disease modeling and precision medicine: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation: Genomic and Precision Medicine. 11 (1), 000043 (2018).
  9. Buikema, J. W., et al. Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).
  10. Maas, R. G. C., et al. Massive expansion and cryopreservation of functional human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell STAR Protocols. 2 (1), 100334 (2021).
  11. Tremblay, C., et al. A new construction technique for tissue-engineered heart valves using the self-assembly method. Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (11), 905-915 (2014).
  12. Lewis-Israeli, Y. R., et al. Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease. Nature Communications. 12 (1), 5142 (2021).
  13. Goldfracht, I., et al. Engineered heart tissue models from hiPSC-derived cardiomyocytes and cardiac ECM for disease modeling and drug testing applications. Acta Biomaterialia. 1 (92), 145-159 (2019).
  14. Fleischer, S., et al. Comprehensive human stem cell differentiation in a 2D and 3D mode to cardiomyocytes for long-term cultivation and multiparametric monitoring on a multimodal microelectrode array setup. Biosensors and Bioelectronics. 126, 624-631 (2019).
  15. Branco, M. A., et al. Transcriptomic analysis of 3D cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells reveals faster cardiomyocyte maturation compared to 2D culture. Science Reports. 9 (1), 9229 (2019).
  16. Ergir, E., et al. Generation and maturation of human iPSC-derived cardiac organoids in long term culture. bioRxiv. , (2022).
  17. Lemoine, M. D., et al. Human iPSC-derived cardiomyocytes cultured in 3D engineered heart tissue show physiological upstroke velocity and sodium current density. Scienctific Reports. 7 (1), 5464 (2017).
  18. Kofron, C. M., et al. A predictive in vitro risk assessment platform for pro-arrhythmic toxicity using human 3D cardiac microtissues. Science Reports. 11 (1), 10228 (2021).
  19. Giacomelli, E., et al. Human-iPSC-derived cardiac stromal cells enhance maturation in 3D cardiac microtissues and reveal non-cardiomyocyte contributions to heart disease. Cell Stem Cell. 26 (6), 862-879 (2020).
  20. Richards, D. J., et al. Human cardiac organoids for the modelling of myocardial infarction and drug cardiotoxicity. Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 446-462 (2020).
  21. Tenreiro, M. F., et al. Next generation of heart regenerative therapies: progress and promise of cardiac tissue engineering. npj Regenerative Medicine. 6 (1), 30 (2021).
  22. Hansen, A., et al. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. Circulation Research. 107 (1), 35-44 (2010).
  23. McDermott-Roe, C., et al. Investigation of a dilated cardiomyopathy-associated variant in BAG3 using genome-edited iPSC-derived cardiomyocytes. Journal of Clinical Investigation Insight. 4 (22), 128799 (2019).
  24. National Library of Medicine (U.S.). Safety and efficacy of induced pluripotent stem cell-derived engineered human myocardium as biological ventricular assist tissue in terminal heart failure. National Library of Medicine. , Identifier NCT04396899 (2020).
  25. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  26. Oh, J. G., et al. Generation of ventricular-like HiPSC-derived cardiomyocytes and high-quality cell preparations for calcium handling characterization. Journal of Visualized Experiments. 155, 60135 (2020).
  27. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
  28. Feyen, D. A. M., et al. Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).
  29. van Ineveld, R. L., et al. Single-cell resolution three-dimensional imaging of intact organoids. Journal of Visualized Experiments. (160), e60709 (2020).
  30. Guo, Y., Pu, W. T. Cardiomyocyte maturation: New phase in development. Circulation Research. 126 (8), 1086-1106 (2020).
  31. Ding, B., et al. Three-dimensional renal organoids from whole kidney cells: Generation, optimization, and potential application in nephrotoxicology in vitro. Cell Transplantation. 29, 963689719897066 (2020).
  32. Denning, C., et al. Cardiomyocytes from human pluripotent stem cells: From laboratory curiosity to industrial biomedical platform. Biochimica Biophysica Acta. 1863, 1728-1748 (2016).
  33. Amaral, R. L. F., et al. Comparative analysis of 3D bladder tumor spheroids obtained by forced floating and hanging drop methods for drug screening. Frontiers in Physiology. 8, 605 (2017).
  34. Daily, N. J., et al. Improving cardiac action potential measurements: 2D and 3D cell culture. Journal of Bioengineering and Biomedical Science. 5 (3), 168 (2015).
  35. Preininger, M. K., et al. Cryopreservation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: Strategies, challenges, and future directions. Advances in Experimental Medicine and Biology. 951, 123-135 (2016).
  36. Kim, Y. Y., et al. Cryopreservation of human embryonic stem cells derived-cardiomyocytes induced by BMP2 in serum-free condition. Reproductive Science. 18 (3), 252-360 (2011).
  37. Daily, M. I., et al. Cryopreservation of primary cultures of mammalian somatic cells in 96-well plates benefits from control of ice nucleation. Cryobiology. 93, 62-69 (2020).
  38. Zhang, J. Z., et al. Effects of cryopreservation on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for assessing drug safety response profiles. Stem Cell Reports. 16 (1), 168-181 (2021).
  39. Yeh, H. -Y., et al. The calcium-dependent regulation of spheroid formation and cardiomyogenic differentiation for MSCs on chitosan membranes. Biomaterials. 33 (35), 8943-8954 (2012).
  40. Scalise, M., et al. From spheroids to organoids: The next generation of model systems of human cardiac regeneration in a dish. International Journal of Molecular Sciences. 22 (24), 13180 (2021).

Tags

Bioteknologi utgave 193
Generering, høy gjennomstrømningsscreening og biobanking av menneskeskapte pluripotente stamcelleavledede hjertesfæroider
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maas, R. G. C., Beekink, T.,… More

Maas, R. G. C., Beekink, T., Chirico, N., Snijders Blok, C. J. B., Dokter, I., Sampaio-Pinto, V., van Mil, A., Doevendans, P. A., Buikema, J. W., Sluijter, J. P. G., Stillitano, F. Generation, High-Throughput Screening, and Biobanking of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids. J. Vis. Exp. (193), e64365, doi:10.3791/64365 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter