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Developmental Biology

फ्लो साइटोमेट्री द्वारा माउस ऊतक से बर्स्ट-फॉर्मिंग यूनिट और कॉलोनी बनाने वाली यूनिट एरिथ्रोइड पूर्वजों की पहचान और अलगाव

Published: November 4, 2022 doi: 10.3791/64373
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Molecular, Cell and Cancer Biology, UMASS Chan Medical School

Summary

यहां, हम ताजा माउस अस्थि मज्जा और प्लीहा से सीधे प्रारंभिक विस्फोट बनाने वाली इकाई एरिथ्रोइड (बीएफयू-ई) और कॉलोनी बनाने वाली इकाई एरिथ्रोइड (सीएफयू-ई) पूर्वजों के संभावित अलगाव के लिए एक नवीन प्रवाह साइटोमेट्रिक विधि का वर्णन करते हैं। एकल-कोशिका ट्रांसक्रिप्टोमिक डेटा के आधार पर विकसित यह प्रोटोकॉल, उच्च शुद्धता वाले सभी ऊतक के एरिथ्रोइड पूर्वजों को अलग करने वाला पहला है।

Abstract

प्रारंभिक एरिथ्रोइड पूर्वजों को मूल रूप से विट्रो में उनकी कॉलोनी बनाने की क्षमता द्वारा परिभाषित किया गया था और बीएफयू-ई और सीएफयू-ई के रूप में जाना जाने वाला विस्फोट-निर्माण और कॉलोनी बनाने वाली "इकाइयों" में वर्गीकृत किया गया था। कुछ समय पहले तक, ताजा पृथक वयस्क माउस अस्थि मज्जा से शुद्ध बीएफयू-ई और सीएफयू-ई पूर्वजों के प्रत्यक्ष संभावित और पूर्ण अलगाव के तरीके उपलब्ध नहीं थे। इस अंतर को संबोधित करने के लिए, सेल सतह मार्करों के लिए जीन कोडिंग की अभिव्यक्ति के लिए माउस अस्थि मज्जा के एक एकल-सेल आरएनए-सेक (एससीआरएनएसेक) डेटासेट का विश्लेषण किया गया था। इस विश्लेषण को सेल भाग्य परख के साथ जोड़ा गया था, जिससे एक नए प्रवाह साइटोमेट्रिक दृष्टिकोण के विकास की अनुमति मिली जो माउस अस्थि मज्जा या प्लीहा में बीएफयू-ई और सीएफयू-ई पूर्वजों के पूर्ण और शुद्ध उपसमुच्चय की पहचान और अलगाव की अनुमति देता है। यह दृष्टिकोण अन्य पूर्वज उप-समूहों की भी पहचान करता है, जिसमें बेसोफिल / मस्तूल सेल और मेगाकैरियोसाइटिक क्षमता के लिए समृद्ध उपसमुच्चय शामिल हैं। विधि में किट और सीडी 55 पर निर्देशित एंटीबॉडी के साथ ताजा अस्थि मज्जा या प्लीहा कोशिकाओं को लेबल करना शामिल है। पूर्वज जो इन दोनों मार्करों को व्यक्त करते हैं, उन्हें तब पांच प्रमुख आबादी में विभाजित किया जाता है। जनसंख्या 1 (पी 1 या सीएफयू-ई, किट + सीडी 55 + सीडी 49 एफमेड / कम सीडी 105मेड / उच्च सीडी 71मेड / उच्च) में सभी सीएफयू-ई पूर्वज शामिल हैं और इसे आगे पी 1-लो (सीडी 71मेड सीडी 150उच्च) और पी 1-हाय (सीडी 71उच्च सीडी 150कम) में विभाजित किया जा सकता है, जो क्रमशः प्रारंभिक और देर से सीएफयू-ई के अनुरूप है; जनसंख्या 2 (पी 2 या बीएफयू-ई, किट + सीडी 55 + सीडी 49 एफमेड / कम सीडी 105मेड / उच्च सीडी 71कम सीडी 150उच्च) में सभी बीएफयू-ई पूर्वज शामिल हैं; जनसंख्या पी 3 (पी 3, किट + सीडी 55 + सीडी 49 एफमेड / उच्च सीडी 105मेड / कम सीडी 150कम सीडी 41कम) बेसोफिल / मास्ट सेल पूर्वजों के लिए समृद्ध है; जनसंख्या 4 (पी 4, किट + सीडी 55 + सीडी 49 एफमेड / उच्च सीडी 105मेड / कम सीडी 150उच्च सीडी 41 +) मेगाकैरियोसाइटिक पूर्वजों के लिए समृद्ध है; और जनसंख्या 5 (पी 5, किट + सीडी 55 + सीडी 49 एफमेड / उच्च सीडी 105मेड / कम सीडी 150उच्च सीडी 41-) में एरिथ्रोइड, बेसोफिल / मास्ट सेल, और मेगाकैरियोसाइटिक क्षमता (ईबीएमपी) और एरिथ्रोइड / मेगाकैरियोसाइटिक / बेसोफिल-पक्षपाती मल्टीपोटेंशियल पूर्वजों (एमपीपी) के साथ पूर्वज शामिल हैं। यह नया दृष्टिकोण एरिथ्रोइड और अन्य हेमटोपोइएटिक पूर्वजों का विश्लेषण करते समय अधिक सटीकता की अनुमति देता है और प्रत्येक प्रवाह साइटोमेट्रिक रूप से परिभाषित आबादी के लिए ट्रांसस्क्रिप्टम जानकारी के संदर्भ की भी अनुमति देता है।

Introduction

एरिथ्रोपोएसिस को दो प्रमुख चरणों में विभाजित किया जा सकता है: प्रारंभिक एरिथ्रोपोएसिस और एरिथ्रोइड टर्मिनल भेदभाव (चित्रा 1)1,2,3। प्रारंभिक एरिथ्रोपोएसिस में, हेमटोपोइएटिक स्टेम कोशिकाएं एरिथ्रोइड वंश के लिए प्रतिबद्ध होती हैं और प्रारंभिक एरिथ्रोइड पूर्वजों को जन्म देती हैं, जिन्हें पहली बार 1970 के दशक में अर्ध-ठोस माध्यम 4,5,6,7,8,9 में उनकी कॉलोनी बनाने की क्षमता के आधार पर पहचाना गया था . मोटे तौर पर, एरिथ्रोइड पूर्वजों को दो श्रेणियों में विभाजित किया जाता है: पहले पूर्वज जो प्रत्येक "फट" (छोटे एरिथ्रोइड सेल क्लस्टर का एक बड़ा समुच्चय) को जन्म देते हैं, जिन्हें "बर्स्ट-फॉर्मिंग यूनिट एरिथ्रोइड" या बीएफयू-ई 4,5,6 कहा जाता है; और उनकी संतान, जो प्रत्येक एक एकल, छोटे एरिथ्रोइड सेल क्लस्टर या कॉलोनी का निर्माण करती है, जिसे "कॉलोनी बनाने वाली इकाई एरिथ्रोइड" या सीएफयू-ई 7,8,9 नाम दिया जाता है। BFU-e और CFU-e अभी तक टर्मिनल एरिथ्रोइड जीन व्यक्त नहीं करते हैं और रूपात्मक रूप से पहचानने योग्य नहीं हैं। कई स्व-नवीकरण या विस्तार कोशिका विभाजनों के बाद, सीएफयू-ई एक ट्रांसक्रिप्शनल स्विच से गुजरता है जिसमें ग्लोबिन जैसे एरिथ्रोइड जीन प्रेरित होते हैं, जिससे एरिथ्रोइड टर्मिनल भेदभाव (ईटीडी) 1,10 में संक्रमण होता है। ईटीडी के दौरान, एरिथ्रोब्लास्ट रेटिकुलोसाइट्स बनाने के लिए एन्यूक्लिएटिंग से पहले तीन से पांच परिपक्वता कोशिका विभाजन से गुजरते हैं, जो लाल कोशिकाओं में परिपक्व होते हैं।

टर्मिनल भेदभाव के दौरान एरिथ्रोब्लास्ट्स को मूल रूप से उनकी आकृति विज्ञान के आधार पर प्रोएरिथ्रोब्लास्ट्स, बेसोफिलिक, पॉलीक्रोमैटिक और ऑर्थोक्रोमैटिक में वर्गीकृत किया गया था। फ्लो साइटोमेट्री के आगमन ने सेल आकार (फॉरवर्ड स्कैटर, एफएससी द्वारा मापा गया) और दो सेल सतह मार्करों, सीडी 71 और टेर 119 11,12,13 (चित्रा 1) के आधार पर उनकी संभावित छंटाई और अलगाव की अनुमति दी। इस और इसी तरह के प्रवाह साइटोमेट्रिक दृष्टिकोण14 ने ईटीडी के आणविक और सेलुलर पहलुओं की जांच में क्रांति ला दी है, जिससे विवो और इन विट्रो10,15,16,17,18,19,20 में एरिथ्रोब्लास्ट्स के विकास चरण-विशिष्ट विश्लेषण की अनुमति मिलती है। CD71/Ter119 दृष्टिकोण अब एरिथ्रोइड अग्रदूतों के विश्लेषण में नियमित रूप से उपयोग किया जाता है।

हाल तक, माउस ऊतक से सीएफयू-ई और बीएफयू-ई के प्रत्यक्ष, उच्च शुद्धता वाले संभावित अलगाव के लिए एक समान, सुलभ प्रवाह साइटोमेट्रिक दृष्टिकोण जांचकर्ताओं से दूर रहा है। इसके बजाय, जांचकर्ताओं ने प्रवाह साइटोमेट्रिक रणनीतियों का उपयोग किया है जो इन पूर्वजों के केवल एक अंश को अलग करते हैं, अक्सर गैर-एरिथ्रोइड कोशिकाओं की उपस्थिति में जो एक ही प्रवाह साइटोमेट्रिक उपसमुच्चय21 के भीतर सह-शुद्ध होते हैं। नतीजतन, बीएफयू-ई और सीएफयू-ई की जांच इन विट्रो भेदभाव प्रणालियों तक सीमित थी जो पहले के अस्थि मज्जा पूर्वजों से बीएफयू-ई और सीएफयू-ई को प्राप्त और बढ़ाते हैं। फिर प्रवाह साइटोमेट्रिक रणनीतियों को लागू करना संभव है जो इन एरिथ्रोइड पूर्वज-समृद्ध संस्कृतियों में सीएफयू-ई को बीएफयू-ई से अलग करते हैं। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण भ्रूण सीएफयू-ई और बीएफयू-ई का उपयोग करता है, जो मध्य गर्भधारण 10,24,25 में माउस भ्रूण के यकृत के टेर119-नकारात्मक अंश में अत्यधिक समृद्ध होते हैं। हालांकि, इनमें से कोई भी दृष्टिकोण विवो में अपनी शारीरिक स्थिति में वयस्क बीएफयू-ई और सीएफयू-ई की जांच की अनुमति नहीं देता है। चुनौती की भयावहता की सराहना की जा सकती है जब याद किया जा सकता है कि, कॉलोनी गठन परख के आधार पर, ये कोशिकाएं वयस्क अस्थि मज्जामें क्रमशः केवल 0.025% और 0.3% की आवृत्ति पर मौजूद हैं।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल ताजा काटे गए किट + माउस अस्थि मज्जा कोशिकाओं के एकल-कोशिका ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण के आधार पर एक नया प्रवाह साइटोमेट्रिक दृष्टिकोण है (किट अस्थि मज्जा के सभी शुरुआती पूर्वज आबादी द्वारा व्यक्त किया जाता है)1। हमारे दृष्टिकोण में कुछ सेल सतह मार्कर शामिल हैं जो पहले से ही Pronk et al.21,26 द्वारा उपयोग में थे। एकल-सेल ट्रांसस्क्रिप्टम का उपयोग सेल सतह मार्करों के संयोजन को निर्धारित करने के लिए किया गया था जो एरिथ्रोइड और अन्य प्रारंभिक हेमटोपोइएटिक पूर्वजों की पहचान करते हैं (चित्रा 2)। विशेष रूप से, वंश-नकारात्मक (लिन-) किट + कोशिकाओं के सीडी 55+ अंश को पांच आबादी में विभाजित किया जा सकता है, जिनमें से तीन एरिथ्रोइड प्रक्षेपवक्र (चित्रा 2) के सन्निहित खंड उत्पन्न करते हैं। इन आबादी में से प्रत्येक की ट्रांसक्रिप्टोमिक पहचान की पुष्टि छंटाई द्वारा की गई थी, इसके बाद एससीआरएनएसेक और क्रमबद्ध एकल-कोशिका ट्रांसस्क्रिप्टम के प्रक्षेपण को मूल ट्रांसक्रिप्टोमिक मानचित्र पर वापस लाया गया (पांच आबादी में से प्रत्येक में जीन अभिव्यक्ति और पूरे अस्थि-मज्जा डेटासेट को https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html में खोजा जा सकता है)1 . प्रत्येक आबादी की सेल भाग्य क्षमता की पुष्टि पारंपरिक कॉलोनी गठन परख (चित्रा 2) का उपयोग करके की गई थी, साथ ही साथ एक उपन्यास उच्च-थ्रूपुट एकल-सेल भाग्य परख 1,27 भी थी। इन विश्लेषणों से पता चलता है कि नए प्रवाह साइटोमेट्रिक दृष्टिकोण के परिणामस्वरूप ताजा वयस्क अस्थि मज्जा और प्लीहा के सभी बीएफयू-ई और सीएफयू-ई पूर्वजों का उच्च शुद्धता अलगाव होता है। विशेष रूप से, जनसंख्या 1 (पी 1) में केवल सीएफयू-ई और कोई अन्य हेमटोपोइएटिक पूर्वज नहीं होते हैं, और जनसंख्या 2 (पी 2) में अस्थि मज्जा के सभी बीएफयू-ई पूर्वज और सीएफयू-ई की एक छोटी संख्या होती है लेकिन कोई अन्य पूर्वज नहींहोता है। नीचे दिए गए विस्तृत प्रोटोकॉल को चूहों में एक उदाहरण प्रयोग के साथ चित्रित किया गया है जिन्हें या तो खारा या एरिथ्रोपोएसिस-उत्तेजक हार्मोन एरिथ्रोपोइटिन (ईपीओ) के साथ इंजेक्ट किया गया था।

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Protocol

सभी प्रयोग पशु प्रोटोकॉल ए -1586 और मैसाचुसेट्स चान मेडिकल स्कूल संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित 202200017 के अनुसार आयोजित किए गए थे।

नोट: दो प्रोटोकॉल यहां विस्तृत हैं: पहला, प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण (खंड 1), इसके बाद प्रवाह साइटोमेट्रिक सॉर्टिंग (खंड 2) के लिए प्रोटोकॉल समायोजन। नीचे दिया गया प्रोटोकॉल 10 चैनलों के साथ एक प्रवाह साइटोमीटर / सॉर्टर का उपयोग करता है। एक उदाहरण सेटअप तालिका 1 में प्रदान किया गया है, जिसे चरण 1.14.5 में संदर्भित किया गया है। केवल नौ चैनलों के साथ इस प्रोटोकॉल को चलाना भी संभव है; तालिका 2 में किंवदंती देखें।

1. फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण

  1. वयस्क (>6 सप्ताह) बाल्ब / सी या सी 57 बीएल 6 चूहों को आपके संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित एक उपयुक्त विधि का उपयोग करके इच्छामृत्यु करें (उदाहरण के लिए, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद सीओ2 साँस लेना)। प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए, एक माउस से अस्थि मज्जा (बीएम) पर्याप्त होगा। छंटाई के लिए, चूहों की संख्या डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों पर निर्भर करती है। प्रत्येक जनसंख्या के लिए सेल उपज नीचे दी गई है (चरण 2.3.3)।
  2. ऊतक की फसल:
    1. बर्फ पर 3 एमएल ठंडा (4 डिग्री सेल्सियस) धुंधला बफर ("एसबी 5": फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस), 0.2% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए), 0.08% ग्लूकोज, 5 एमएम ईडीटीए) युक्त 5 एमएल फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) ट्यूब तैयार करें। काटे गए ऊतकों को रखने के लिए इसका उपयोग करें।
    2. प्रत्येक माउस से विच्छेदित प्रत्येक ऊतक के लिए अलग-अलग ट्यूब तैयार करें। कई चूहों से ऊतकों को पूल न करें।
    3. फीमर और टिबिया दोनों की कटाई करें। एसबी 5 के साथ ट्यूब में रखने से पहले हड्डियों से सभी मांसपेशियों को हटा दें।
    4. पेट के बाईं ओर चीरा के माध्यम से तिल्ली को विच्छेदित करें।
  3. अस्थि मज्जा कोशिका निष्कर्षण:
    1. ताजा विच्छेदित फीमर और टिबियास को सीधे ठंडे धुंधला बफर (एसबी 5) में रखें और ट्यूबों को बर्फ पर रखें जब तक कि अस्थि मज्जा (बीएम) निकालने के लिए तैयार न हो। एक बाल्टी में बर्फ पर एक साफ निष्फल मोर्टार रखें। ट्यूब से एसबी 5 के साथ हड्डियों को मोर्टार में स्थानांतरित करें।
    2. विच्छेदन कैंची के साथ प्रत्येक हड्डी के सिरों के लगभग 1 मिमी को बंद करें ताकि हड्डी का छिद्र सिर्फ दिखाई दे।
    3. हड्डियों से मज्जा को बाहर निकालने और इसे मोर्टार में इकट्ठा करने के लिए एसबी 5 से भरी 26 जी सुई और 3 एमएल सिरिंज का उपयोग करें। हर बार ताजा बफर का उपयोग करके प्रक्रिया को 3-5 बार दोहराएं जब तक कि हड्डियां रंगहीन न दिखाई दें।
    4. फ्लश किए गए मज्जा को 100 सेमी जाल फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें और कोशिकाओं को बर्फ पर रखे 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में इकट्ठा करें।
    5. एसबी 5 के 5-10 एमएल में फ्लश की गई हड्डियों को कुचलने के लिए मोर्टार और मूसल का उपयोग करें। कुचल हड्डियों के मिश्रण को फ़िल्टर करें और चरण 1.3.4 में एकत्र की गई कोशिकाओं के साथ 100 μm सेल छन्नी और पूल के माध्यम से बफर करें।
  4. तिल्ली कोशिका निष्कर्षण:
    1. बर्फ पर रखी एक खाली 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब पर 100 μm जाल फ़िल्टर सेट करें। जाल फिल्टर पर एक एकल तिल्ली रखें।
    2. यह सुनिश्चित करने के लिए प्लीहा में एसबी 5 का 0.5-1 एमएल जोड़ें कि यह सूख न जाए।
    3. 3 एमएल या 5 एमएल सिरिंज प्लंजर के रबर साइड का उपयोग करके, जाल के माध्यम से प्लीहा को मैश करें। एक समय में अधिक एसबी 5, 5 एमएल जोड़ें, और तब तक मैश करना जारी रखें जब तक कि सभी कोशिकाएं ट्यूब में एकत्र न हो जाएं।
  5. इस बिंदु से, अस्थि मज्जा और स्प्लेनिक कोशिकाओं को उसी तरह से इलाज किया जाता है।
  6. कोशिकाओं को 900 x g, 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए घुमाएं। वैक्यूम एस्पिरेशन सेटअप का उपयोग करके सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेटेड करें।
  7. एकल-सेल निलंबन बनाने के लिए, एसबी 5 के 2 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और एक बड़े छिद्र टिप के साथ पी 1000 का उपयोग करके 50 बार ऊपर और नीचे पाइप करें ( सामग्री की तालिका देखें)। नाजुक कोशिकाओं को नुकसान को रोकने में मदद करने के लिए इनमें व्यापक टिप ओपनिंग हैं।
  8. कोशिकाओं की गणना करने के लिए, 20 बार ऊपर और नीचे पाइप करके पुन: निलंबित करें। एसबी 5 में 1: 100 के अनुपात में कोशिकाओं को पतला करें। पतला कोशिकाओं के 10 μL को ट्रिपैन ब्लू के 10 μL के साथ मिलाएं और हेमोसाइटोमीटर और / या सेल काउंटर पर गिनती करें।
  9. कोशिकाओं को 900 x g, 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए घुमाएं। सुपरनैटेंट को एस्पिरेट करें और एसबी 5 में 33 x 106 जीवित कोशिकाओं / एमएल पर कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
  10. तालिका 3 में प्रत्येक एंटीबॉडी के बराबर मात्रा को मिलाकर लिन-एफआईटीसी कॉकटेल तैयार करें।
  11. एकल रंग नियंत्रण और "फ्लोरेसेंस माइनस वन" (एफएमओ) नियंत्रण के लिए कोशिकाओं को तैयार करें। चरण 1.14 (प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए नमूने) और / या चरण 2.1 (प्रवाह साइटोमेट्रिक सॉर्टिंग) में नमूना कोशिकाओं की तैयारी और धुंधलापन के समानांतर चरण 1.11-1.12 करें।
    1. बर्फ पर एफएसीएस ट्यूब में सेल निलंबन के 50 μL (1.6 x 106 कोशिकाओं) को स्थानांतरित करके एक बिना दाग वाले सेल नियंत्रण के लिए कोशिकाओं को तैयार करें। बर्फ पर एफएसीएस ट्यूब में सेल निलंबन के 50 μL (1.6 x10 6 कोशिकाओं) को स्थानांतरित करके प्रत्येक एकल रंग नियंत्रण (11 ट्यूब) के लिए कोशिकाओं को तैयार करें।
    2. बर्फ पर एक अलग एफएसीएस ट्यूब में सेल निलंबन के 300 μL (10 x 106 कोशिकाओं) को स्थानांतरित करके निम्नलिखित रंगों (किट, CD41, CD150, CD49f [चार ट्यूब]) के लिए एफएमओ नियंत्रण तैयार करें।
    3. कोशिकाओं को 900 x g, 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए घुमाएं और सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें।
  12. एफएमओ और एकल रंग नियंत्रण के एंटीबॉडी धुंधलापन
    1. एफएसीएस ट्यूबों में 33 x 106 कोशिकाओं / एमएल (300 μL की कुल मात्रा में) पर एफएमओ को दाग दें। प्रत्येक नियंत्रण के लिए, एफएमओ के नाम एंटीबॉडी को छोड़कर सभी एंटीबॉडी जोड़ें। उदाहरण के लिए, किट एफएमओ के लिए, किट एंटीबॉडी को छोड़ दें। प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए, तालिका 2 में कमजोर पड़ने और अंतिम एकाग्रता का उपयोग करें।
    2. एफएसीएस ट्यूबों में 20 x 106 कोशिकाओं / एमएल (50 μL की कुल मात्रा में) पर एकल रंग नियंत्रण दागें; प्रत्येक नियंत्रण के लिए, तालिका 2 में सूचीबद्ध एकाग्रता पर एक एकल एंटीबॉडी जोड़ें।
    3. वोर्टेक्स प्रत्येक नियंत्रण ट्यूब 3,000 आरपीएम (प्रति मिनट रोटेशन) पर 2-3 सेकंड के लिए होती है, और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट होती है, अंधेरे में 2.5 घंटे तक रॉकिंग करती है, प्रकाश से सुरक्षित होती है। ट्यूब की लंबाई के समानांतर घूर्णन की धुरी के साथ ट्यूबों को रॉक करें, क्षैतिज से लगभग 10 ° और 60 ° कोण के बीच, ताकि सामग्री टोपी को न छुए।
    4. एसबी 5 के साथ कोशिकाओं को धोएं: एसबी 5 के साथ सेल निलंबन की मात्रा 4 एमएल तक बनाएं। कोशिकाओं को 900 x g, 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए घुमाएं, और सुपरनैटेंट को एस्पिरेट करें।
  13. सेल पुन: निलंबन:
    1. एसबी 5 के 300 μL में बिना दाग वाले और सभी एकल रंग नियंत्रणों (DAPI नियंत्रण को छोड़कर) को फिर से निलंबित करें और एक नए FACS ट्यूब में 40 μm फ़िल्टर जाल के माध्यम से फ़िल्टर करें।
    2. एसबी 5 में 1: 10,000 पर डीएपीआई स्टॉक (100% इथेनॉल में 1 मिलीग्राम / एमएल) को पतला करके डीएपीआई / एसबी 5 समाधान बनाएं।
    3. एसबी 5 के 1.8 एमएल में एफएमओ को फिर से निलंबित करें और एक नए एफएसीएस ट्यूब में 40 μm फ़िल्टर जाल के माध्यम से फ़िल्टर करें
    4. एसबी 5 के 300 μL में DAPI एकल रंग नियंत्रण को पुन: निलंबित करें और एक नए 4 mL FACS ट्यूब में 40 μm फ़िल्टर जाल के माध्यम से फ़िल्टर करें।
  14. नमूना तैयारी: यदि कोशिकाओं को प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए तैयार किया जा रहा है, तो चरण 1.14 पर जाएं। सॉर्टिंग के लिए कोशिकाओं को तैयार करते समय, चरण 2.1 पर जाएं।
  15. एफएसीएस ट्यूबों में 300 μL (10 x 106 कोशिकाओं) की कुल मात्रा में 33 x 106 सेल / एमएल पर प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण नमूने दागें:
    1. एंटीबॉडी मास्टर मिश्रण तैयार करें। प्रति नमूने 300 μL के साथ, नमूनों की संख्या से मास्टर मिश्रण की मात्रा निर्धारित करें। एसबी 5 में संकेतित कमजोर पड़ने पर तालिका 2 में सूचीबद्ध सभी एंटीबॉडी को पतला करके मास्टर मिश्रण बनाएं। मास्टर मिश्रण में खरगोश आईजीजी एक एफसी ब्लॉक के रूप में कार्य करता है।
    2. वोर्टेक्स प्रत्येक ट्यूब 3,000 आरपीएम पर 2-3 सेकंड के लिए, और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करता है, अंधेरे में 2.5 घंटे तक हिलता है, प्रकाश से सुरक्षित होता है।
    3. एसबी 5 के साथ कोशिकाओं को धोएं: एसबी 5 के साथ सेल निलंबन की मात्रा 4 एमएल तक बनाएं। कोशिकाओं को 900 x g, 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए घुमाएं, और सुपरनैटेंट को एस्पिरेट करें।
    4. चरण 1.12.5.2 में तैयार किए गए DAPI/SB5 के 1.8 mL में प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए नमूने पुन: निलंबित करें और एक FACS ट्यूब में 40 μm फ़िल्टर जाल के माध्यम से फ़िल्टर करें।
    5. तालिका 2 और व्यवहार्यता डाई DAPI में एंटीबॉडी संयुग्म को समायोजित करने के लिए 10 चैनलों के साथ साइटोमीटर पर नमूनों का विश्लेषण करें। तालिका 1 में एक उदाहरण चैनल सेटअप प्रदान किया गया है। केवल नौ चैनलों का उपयोग करना भी संभव है; तालिका 2 किंवदंती देखें।
    6. प्रवाह साइटोमेट्री डेटा के विश्लेषण के दौरान, चरण 2.4 में विस्तृत एकल रंग नियंत्रण और एफएमओ नियंत्रण की मदद से मानक वर्णक्रमीय मुआवजा दृष्टिकोण का उपयोग करें।

2. प्रवाह साइटोमेट्रिक सॉर्टिंग के लिए प्रोटोकॉल समायोजन

  1. लिन की तैयारी-
    1. 10 चूहों से एक ही ऊतक (या तो बीएम या प्लीहा) से निकाले गए सभी कोशिकाओं को 50 एमएल ट्यूब में पूल करें। एक बड़े छिद्र टिप के साथ पी 1000 का उपयोग करके प्रत्येक पूल किए गए नमूने को पुन: निलंबित करें।
    2. कोशिकाओं को 900 x g, 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए घुमाएं और सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें।
    3. गैर-समृद्ध कोशिकाओं का उपयोग करके अनुभाग 1 में वर्णित एकल रंग और एफएमओ नियंत्रण तैयार करें।
    4. लिन-कोशिकाओं के चुंबकीय मोती संवर्धन का उपयोग करके छंटाई के लिए लिन-कोशिकाओं को समृद्ध करें:
    5. कोशिकाओं को एसबी 5 के साथ 1 x 108 कोशिकाओं / एमएल पर पुन: निलंबित करें और उन्हें 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। तालिका 4 में सूचीबद्ध सामान्य चूहे सीरम और बायोटिनिलेटेड एंटीबॉडी जोड़ें और 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रॉकिंग के साथ इनक्यूबेट करें।
    6. कोशिकाओं को 900 x g, 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए घुमाएं और सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें। ठंडे एसबी 5 के 15 एमएल में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
    7. कोशिकाओं को 900 x g, 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए घुमाएं और सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें। ठंडे एसबी 5 में कोशिकाओं को 1 x 108 कोशिकाओं / एमएल पर पुन: निलंबित करें और उन्हें बर्फ पर रखें।
    8. वोर्टेक्स 5-10 सेकंड के लिए 3,000 आरपीएम पर चुंबकीय नैनोबीड्स। प्रत्येक 10 एमएल कोशिकाओं के लिए 1 एमएल चुंबकीय नैनोबीड्स लें।
    9. नैनोबीड्स को 5 एमएल एफएसीएस ट्यूब में धो लें। एसबी 5 के साथ मात्रा को 4 एमएल तक बनाएं, 900 x g पर स्पिन करें, 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर घुमाएं, और सुपरनैटेंट को एस्पिरेट करें।
    10. नैनोबीड्स को एसबी 5 के 500 μL में पुन: निलंबित करें और चरण 2.1.7 में तैयार कोशिकाओं के साथ मिलाएं। 15 मिनट के लिए रॉकिंग के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    11. कोशिकाओं को 900 x g, 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए घुमाएं और सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें। एसबी 5 के साथ 1 x 108 कोशिकाओं / एमएल पर कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
    12. ट्यूब को 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर चुंबक पर रखें।
    13. ध्यान से सुपरनैटेंट को एक नई 15 एमएल ट्यूब में डालें।
    14. चरण 2.1.13 से सतह पर तैरने वाले ट्यूब को 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर चुंबक पर रखें। ध्यान से सुपरनैटेंट को एक नई 15 एमएल ट्यूब में डालें।
    15. चरण 2.1.14 में सतह पर सतह पर तैरने वाले से कोशिकाओं को 900 x g, 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए घुमाएं, और सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें।
    16. एसबी 5 के 1 एमएल में लिन-समृद्ध कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
    17. एसबी 5 में 1:100 पर कोशिकाओं के 10 μL को पतला करें। पतला कोशिकाओं के 10 μL को ट्रिपैन ब्लू के 10 μL के साथ मिलाएं और हेमोसाइटोमीटर और / या सेल काउंटर पर गिनती करें।
    18. चरण 2.1.17 में सेल गणना के आधार पर, लिन-समृद्ध कोशिकाओं को 33 x 106 कोशिकाओं / एमएल पर पुन: निलंबित करें।
  2. समृद्ध कोशिकाओं का धुंधलापन:
    1. तालिका 2 में सूचीबद्ध सभी एंटीबॉडी को जोड़कर एफएसीएस ट्यूबों में 33 x 106 कोशिकाओं / एमएल पर समृद्ध सेल नमूनों को दाग दें। वोर्टेक्स प्रत्येक ट्यूब 3,000 आरपीएम पर 2-3 सेकंड के लिए, और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करता है, अंधेरे में 2.5 घंटे तक हिलता है, प्रकाश से सुरक्षित होता है।
    2. एसबी 5 के साथ कोशिकाओं को धोएं: एसबी 5 के साथ एफएसीएस ट्यूबों की मात्रा को 4 एमएल तक बनाएं। कोशिकाओं को 900 x g, 4 ° C पर 10 मिनट के लिए घुमाएं, और सुपरनैटेंट को हटा दें।
    3. चरण 1.12.5.2 में तैयार किए गए DAPI/SB5 के 4-6 mL में प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए नमूने पुन: निलंबित करें और एक नए 4 mL FACS ट्यूब में 40 μm फ़िल्टर जाल के माध्यम से फ़िल्टर करें।
  3. नमूना सॉर्टिंग:
    1. सीएफयू-ई उपज को अधिकतम करने के लिए एक बड़े नलिका और कम दबाव के साथ नमूनों को क्रमबद्ध करें क्योंकि सीएफयू-ई कोशिकाएं उच्च दबाव में आसानी से क्षतिग्रस्त हो जाती हैं। इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले प्रवाह साइटोमीटर के लिए, 14 पीएसआई और 100 μm नोजल या 130 μm नोजल के साथ 12 psi का उपयोग करें। नीचे दिए गए चरण 2.4 के तहत वर्णित सॉर्टिंग गेट सेट करें।
    2. संग्रह बफर तैयार करें: पीबीएस में 20% भ्रूण गोजातीय सीरम जोड़ें।
    3. क्रमबद्ध आबादी की शुद्धता की जांच करने के लिए, चरण 1.12.5.2 में वर्णित DAPI वाले बफर में प्रत्येक क्रमबद्ध आबादी से एक छोटा एलिकोट फिर से चलाएं।
      नोट: आमतौर पर, कुल 10 चूहों (लगभग 1 x 109 कोशिकाओं) से बीएम लगभग 70% की व्यवहार्यता के साथ पी 1-हाय, पी 1-लो और पी 2 आबादी में से प्रत्येक के लिए कम से कम 50,000-100,000 कोशिकाओं का उत्पादन करता है।
  4. विश्लेषण या सॉर्टिंग गेट स्थापित करने के लिए चित्रा 3 में दिखाए गए गेटिंग रणनीति का उपयोग करें।
    1. आकार के आधार पर मलबे को हटाने के लिए फॉरवर्ड-स्कैटर (FSC) पैरामीटर का उपयोग करें। सेल समुच्चय को बाहर करने और एकल कोशिकाओं का चयन करने के लिए एफएससी-ऊंचाई बनाम एफएससी-क्षेत्र हिस्टोग्राम का उपयोग करें; साइड-स्कैटर (एसएससी)-ऊंचाई बनाम एसएससी-क्षेत्र हिस्टोग्राम के साथ दोहराएं।
    2. डीएनए डाई डीएपीआई के लिए सकारात्मक कोशिकाओं को बाहर निकालकर मृत कोशिकाओं को बाहर करें, जिसके लिए व्यवहार्य कोशिकाएं अभेद्य हैं।
    3. Lin-Ter119-Kit+ कक्षों का चयन करें, और इनमें से, CD55 को व्यक्त करने वाली उप-जनसंख्या का चयन करें.
    4. CD49f और CD105 की अभिव्यक्ति के आधार पर लिन-टेर119-किट+CD55+ कोशिकाओं को दो प्रमुख आबादी, P6 और P7 में विभाजित करें।
    5. सीडी 150 और सीडी 41 की अभिव्यक्ति के आधार पर, पी 6 को पी 3 (बेसोफिल या मस्तूल सेल पूर्वजों), पी 4 (मेगाकैरियोसाइटिक पूर्वजों), और पी 5 (ईबीएमपी और एरिथ्रोइड-पक्षपाती एमपीपी) में विभाजित करें।
    6. CD150 और CD71 की अभिव्यक्ति के आधार पर, P7 को P2 (BFU-e), प्रारंभिक CFU-e (P1-low), और देर से CFU-e (P1-hi) में विभाजित करें।

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Representative Results

प्रोटोकॉल ताजा काटी गई अस्थि मज्जा और प्लीहा कोशिकाओं में बीएफयू-एस और सीएफयू-एस की पहचान करने के लिए एक प्रवाह साइटोमेट्रिक दृष्टिकोण का वर्णन करता है। यह चूहों से ताजा बीएम और प्लीहा की कटाई और तुरंत ऊतक को बर्फ पर रखने के साथ शुरू होता है। सेल व्यवहार्यता को संरक्षित करने के लिए ठंड में सभी प्रक्रियाएं आयोजित की जाती हैं। कोशिकाओं को "वंश" एंटीबॉडी कॉकटेल के साथ लेबल किया जाता है जो विभेदित रक्त वंशों के मार्करों को व्यक्त करने वाली सभी कोशिकाओं के बहिष्करण की अनुमति देता है (एफआईटीसी-लिन कॉकटेल, तालिका 3, प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के मामले में; या चुंबकीय मोती संवर्धन, तालिका 4, वंश-नकारात्मक कोशिकाओं के लिए)। कोशिकाओं को मार्करों के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ भी लेबल किया जाता है जो हमें वंश-नकारात्मक कोशिका अंश के भीतर कई प्रारंभिक पूर्वज आबादी को अलग करने की अनुमति देता है। लेबलिंग के बाद या तो प्रवाह साइटोमेट्रिक सॉर्टिंग या विश्लेषण होता है। प्रवाह साइटोमेट्रिक सॉर्टिंग का दृष्टिकोण प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के समान है, लेकिन बड़ी संख्या में कोशिकाओं को छांटने के समय और व्यय को कम करने के लिए लिन-सेल अंश के लिए चुंबकीय-मोती संवर्धन से पहले है। पूर्वजों को सॉर्ट करते समय, बीएम को कई चूहों से पूल किया जाता है, डाउनस्ट्रीम आवेदन के आधार पर संख्या। आमतौर पर, कुल 10 चूहों (लगभग 1 x 109 कोशिकाओं) से बीएम लगभग 70% की व्यवहार्यता के साथ प्रत्येक पी 1-हाय, पी 1-लो और पी 2 आबादी के लिए कम से कम 50,000-100,000 कोशिकाओं का उत्पादन करता है।

इस प्रोटोकॉल द्वारा पहचाने गए तिल्ली- और बीएम-व्युत्पन्न आबादी के बीच महत्वपूर्ण अंतर प्लीहा-व्युत्पन्न कोशिकाओं में पी 6 आबादी और इसकी उप-आबादी, पी 4 / पी 5 / पी 3 की बहुत कम आवृत्ति है।

प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के एक उदाहरण के रूप में, चूहों में ईपीओ प्रशासन के प्रभाव की जांच की गई थी। ईपो ईपो रिसेप्टर (ईपीओआर) को बांधता है और सक्रिय करता है, जो हाइपोक्सिया जैसी तनाव स्थितियों के तहत बेसल और त्वरित एरिथ्रोपोइजिस दोनों के लिए आवश्यक है। हाइपोक्सिया रक्त ईपीओ स्तर28,18 में वृद्धि को उत्तेजित करता है, बदले में सीएफयू-ई 1,29 और एरिथ्रोइड अग्रदूतों के विस्तार को बढ़ावा देता है।

ईपीओ (0.25 यू / जी शरीर का वजन) या वाहन की एक समान मात्रा (खारा) को 3 दिनों के लिए हर 24 घंटे में एक बार चूहों में चमड़े के नीचे इंजेक्ट किया गया था। बीएम और प्लीहा को 72 घंटे पर काटा गया था। ईपो उत्तेजना ने बीएम और प्लीहा दोनों में प्रारंभिक और देर से सीएफयू-ई आबादी (पी 1-लो और पी 1-एचआई) का विस्तार किया (चित्रा 4 और चित्रा 5)।

Figure 1
चित्रा 1: निश्चित एरिथ्रोपोइजिस के दो प्रमुख चरण। एरिथ्रोपोइजिस को प्रारंभिक चरण में विभाजित किया जा सकता है, जहां पूर्वजों को उनकी कॉलोनी बनाने की क्षमता के आधार पर परिभाषित किया जाता है, और बाद के चरण को एरिथ्रोइड टर्मिनल भेदभाव (ईटीडी) के रूप में जाना जाता है, जहां एरिथ्रोब्लास्ट चरण को आकृति विज्ञान के आधार पर परिभाषित किया जाता है। फ्लो साइटोमेट्रिक तकनीकों ने एफएससी, टेर 119 और सीडी 71 का उपयोग करके विकास ता्मक रूप से विशिष्ट एरिथ्रोब्लास्ट चरणों के संभावित अलगाव की अनुमति दी है। इसके विपरीत, उच्च शुद्धता वाले ऊतक से सीधे बीएफयू-ई और सीएफयू-ई पूर्वजों को अलग करने के लिए एक समकक्ष विधि नहीं है। ध्यान दें कि बीएफयू-ई कॉलोनी का केवल एक अंश दिखाया गया है। स्केल बार सीएफयू-ई और बीएफयू-ई कॉलोनियों दोनों पर लागू होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: सीएफयू-ई और बीएफयू-ई को सीधे ऊतक से अलग करने के लिए एक नई प्रवाह साइटोमेट्रिक रणनीति। यह पांडुलिपि एससीआरएनएसेक डेटा के विश्लेषण के आधार पर पांच नए प्रवाह साइटोमेट्रिक आबादी, पी 1 से पी 5 की पहचान करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करती है। (ए) ताजा बाल्ब / सी वयस्क अस्थि मज्जा एकल-कोशिका प्रतिलेख का बल-निर्देशित ग्राफ प्रक्षेपण ("स्प्रिंग प्लॉट")। रंग ट्रांसक्रिप्टोमिक जानकारी और जनसंख्या-संतुलन विश्लेषण (पीबीए) एल्गोरिथ्म1 के आधार पर अनुमानित सेल भाग्य क्षमता को इंगित करते हैं। प्लॉट के क्षेत्र जो प्रवाह साइटोमेट्रिक आबादी पी 1 से पी 5 में से प्रत्येक के अनुरूप हैं, उन्हें इंगित किया गया है। चित्रित क्षेत्र मूल डेटा के हाथ से तैयार किए गए अनुमान हैं, जो तुसी एट अल.1 में पाए जा सकते हैं। पत्राचार की पुष्टि प्रत्येक क्रमबद्ध पी 1 से पी 5 आबादी1 के एससीआरएनएसेक द्वारा की गई थी। ई = एरिथ्रोइड; बीए = बेसोफिलिक या मस्तूल-सेल पूर्वज; मेग = मेगाकैरियोसाइटिक पूर्वज; लाइ = लिम्फोसाइटिक पूर्वज; डी = डेंड्राइटिक पूर्वज; एम = मोनोसाइटिक पूर्वज; जी = ग्रैनुलोसाइटिक पूर्वज। (बी) कॉलोनी गठन की परख, तुसी एट अल 1 से पुनर्निर्मित। पी 1 से पी 5 आबादी और सीडी 55 + कोशिकाओं को इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में क्रमबद्ध किया गया था, और प्रत्येक आबादी को संबंधित कॉलोनी गठन परख के लिए चढ़ाया गया था। संकेतित दिनों में एरिथ्रोइड कॉलोनियों को स्कोर किया गया था। यूएफ = यूनिफोकल; एमएफ = मल्टी-फोकल; सीएफयू-एमके = कॉलोनी बनाने वाली इकाई मेगाकैरियोसाइटिक; सीएफयू-जीएम = कॉलोनी बनाने वाली इकाई ग्रैनुलोसाइटिक / मोनोसाइटिक; सीएफयू-जीईएमएम = कॉलोनी बनाने वाली इकाई ग्रैनुलोसाइटिक, एरिथ्रोइड, मोनोसाइटिक, मेगाकैरियोसाइटिक। (सी) सेल सतह मार्कर जो पांच आबादी में से प्रत्येक को परिभाषित करते हैं, साथ ही साथ उनकी सेल भाग्य क्षमता भी। सेल भाग्य क्षमता ट्रांसक्रिप्टोमिक जानकारी और सेल भाग्य परख दोनों का परिणाम है, कॉलोनी गठन और एकल-सेल भाग्य परख 1,27। ध्यान दें, पी 1 आबादी को सीडी 71 मार्कर की अभिव्यक्ति के आधार पर पी 1-हाय और पी 1-लो 1 में विभाजितकिया गया था। तुसी एट अल.1 के आंकड़ों पर आधारित है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: फ्लो साइटोमेट्रिक गेटिंग रणनीति। आबादी पी 1 से पी 5 के लिए पूर्ण गेटिंग रणनीति। बाल्ब/सी माउस से ताजा काटी गई अस्थि मज्जा (बीएम) या प्लीहा (एसपी) को 0.9% बाँझ खारा के 100 μL के साथ इंजेक्ट किया जाता है, जो मलबे को छोड़कर, मुख्य आबादी के लिए सबसे पहले गेट किया जाता है; इसके बाद सिंगल्स का चयन किया जाता है, मृत कोशिकाओं को त्याग दिया जाता है, और उन कोशिकाओं पर गेटिंग की जाती है जो टेर 119-नकारात्मक, वंश-नकारात्मक और एक्सप्रेस किट हैं। Ter119-Lin-Kit+CD55+ को P6 और P7 में विभाजित करने के बाद जनसंख्या P1 से P5 में अंतिम उपखंड होता है (चित्र 2 भी देखें)। टेर 119 चैनल एक ही नमूने पर एरिथ्रोब्लास्ट्स के विश्लेषण की अनुमति देता है (टेर 119 / सीडी 71 दृष्टिकोण12 का उपयोग करके)। हालांकि, इस प्रोटोकॉल के लिए एक अलग टेर 119 चैनल आवश्यक नहीं है, और टेर 119 एंटीबॉडी को मास्टर मिश्रण से छोड़ा जा सकता है और इसके बजाय लिन-एफआईटीसी कॉकटेल के हिस्से के रूप में शामिल किया जा सकता है। टेर 119 सकारात्मक कोशिकाओं के लिए बहिष्करण चरण इस गेटिंग रणनीति में नहीं दिखाया गया है। संख्याएं दिखाए गए हिस्टोग्राम के भीतर प्रत्येक गेट के प्रतिशत हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: एपो उत्तेजना के बाद अस्थि मज्जा और तिल्ली प्रारंभिक एरिथ्रोइड पूर्वजों का विश्लेषण। ताजा काटी गई अस्थि मज्जा (बीएम) या प्लीहा (एसपी) के प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्रिक भूखंड। बाल्ब /सी चूहों को ईपो के 0.25 यू / जी शरीर के वजन के साथ या खारे की समान मात्रा के साथ चमड़े के नीचे इंजेक्ट किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: विवो में ईपो के लिए बीएम और प्लीहा पूर्वजों की प्रतिक्रिया। ताजा काटे गए (ए) अस्थि मज्जा और (बी) प्लीहा कोशिकाओं में ईपो इंजेक्शन के बाद आबादी पी 1 से पी 5 में पूर्ण सेल संख्या में परिवर्तन दिखाने वाले सारांश आंकड़े; * पी = 0.02। चित्र 4 में वर्णित प्रयोग। एन = प्रत्येक समूह में 4 चूहे। पूर्ण सेल संख्या की गणना करने के लिए, बीएम या प्लीहा ( चित्रा 4 से) में प्रत्येक आबादी में कोशिकाओं की आवृत्ति को प्रत्येक माउस से काटे गए बीएम या प्लीहा कोशिकाओं की कुल संख्या से गुणा किया गया था और ग्राम में माउस के वजन से विभाजित किया गया था। ध्यान दें, बीएम में केवल प्रारंभिक सीएफयू-ई सांख्यिकीय महत्व (पी = 0.02) तक पहुंच गया, संभवतः अपेक्षाकृत कम ईपीओ खुराक और प्रत्येक समूह में चूहों की एक छोटी संख्या का संयोजन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

डिटेक्टर सरणी PMT डाइक्रोइक दर्पण बैंडपास फ़िल्टर फ्लोरोफोरे का पता चला
ब्लू लेजर (488 एनएम) एक 685LP 695/40
B 505LP 530/30 लिन-एफआईटीसी (+Ter119-FITC)
C 488/10
वायलेट लेजर (405 एनएम) एक 760LP 800/80
B 630LP 660/20 CD150-BV650
C 595LP 605/20 CD41-BV605
D 475LP 525/20
E 450/50 CD49f-BV421
लाल लेजर (640 एनएम) एक 755LP 785/50 cKit-APC-Cy7
B 700 LP 720/30
C 675/14 CD55-AF 647
यूवी लेजर (355 एनएम) एक 505LP 525/20
B 420LP 450/50 DAPI
C 379/28 टेर119-बीयूवी 395
वाईजी लेजर (561 एनएम) एक 755LP 780/60 CD71-PE-Cy7
B 685LP 710/50
C 635LP 660/20
D 600LP 610/20
E 570LP 580/20 CD105-PE

तालिका 1: LSRII साइटोमीटर में चैनल लेआउट का उदाहरण। वर्णित प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी का पैनल और डेटा एकत्र करने के लिए एलएसआरआईआई प्रवाह साइटोमीटर में उनकी व्यवस्था।

अभिकर्मक या एंटीबॉडी संयुग्मी स्टॉक कॉन्क (mg/mL) कमजोर पड़ने का कारक सेल निलंबन में अंतिम शंख (μg/ mL) क्लोन
CD71 PE/Cy7 0.2 2000 0.1 RI7217
TER-119 BUV395 0.2 100 2 TER-119
CD55 (DAF) AF647 0.5 50 10 RIKO-3
CD105 पीई 0.2 50 4 एमजे 7/18
CD150 (SLAM) BV650 0.1 50 2 TC15-12F12.2
CD49f BV421 0.025 50 0.5 GoH3
CD41 BV605 0.2 100 2 MWReg30
CD117 (cKit) APC/Cy7 0.2 200 1 2B8
लिन कॉकटेल एफआईटीसी 0.08 (कॉकटेल में प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए) 83 1 (कॉकटेल में प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए)
खरगोश आईजीजी 10 50 200

तालिका 2: एंटीबॉडी मास्टर-मिक्स घटक। एंटीबॉडी मास्टर मिश्रण की संरचना। टेर 119 चैनल एक ही नमूने पर एरिथ्रोब्लास्ट्स के विश्लेषण की अनुमति देता है (टेर 119 / सीडी 71 दृष्टिकोण12 का उपयोग करके)। हालांकि, इस प्रोटोकॉल के लिए एक अलग टेर 119 चैनल आवश्यक नहीं है, और टेर 119 एंटीबॉडी को मास्टर मिश्रण से छोड़ा जा सकता है और इसके बजाय लिन-एफआईटीसी कॉकटेल के हिस्से के रूप में शामिल किया जा सकता है।

अभिकर्मक या एंटीबॉडी संयुग्मी स्टॉक कॉन्क (mg/mL) क्लोन
Ly-6G और Ly-6C एफआईटीसी 0.5 RB6-8C5
CD11b एफआईटीसी 0.5 M1/70
CD19 एफआईटीसी 0.5 1D3
CD4 एफआईटीसी 0.5 RM4-5
CD8a एफआईटीसी 0.5 53-6.7
F4/80 एफआईटीसी 0.5 BM8

तालिका 3: लिन कॉकटेल घटक। एंटीबॉडी मास्टर मिश्रण के हिस्से के रूप में उपयोग किए जाने वाले लिन कॉकटेल की संरचना ( तालिका 2 में मास्टर मिश्रण का विवरण देखें)।

अभिकर्मक या एंटीबॉडी संयुग्मी स्टॉक कॉन्क (mg/mL) कमजोर पड़ने का कारक सेल निलंबन में अंतिम शंख (μg/ mL) क्लोन
Ly-6G और Ly-6C बायोटिन 0.5 200 2.5 RB6-8C5
CD11b बायोटिन 0.5 200 2.5 M1/70
CD19 बायोटिन 0.5 200 2.5 1D3
CD4 बायोटिन 0.5 200 2.5 RM4-5
CD8a बायोटिन 0.5 200 2.5 53-6.7
F4/80 बायोटिन 0.5 200 2.5 BM8
TER-119 बायोटिन 0.5 200 2.5 TER-119
सामान्य चूहे सीरम 50

तालिका 4: चुंबकीय-मोती संवर्धन के लिए एंटीबॉडी। कोशिका छंटाई से पहले बीएम या प्लीहा के लिन-अंश को समृद्ध करने के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी।

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Discussion

उच्च शुद्धता वाले ताजा ऊतक से सीधे बीएफयू-ई और सीएफयू-ई पूर्वजों को भावी प्रभाव से अलग करने की क्षमता पहले जांचकर्ताओं से दूर थी। हमारा नया दृष्टिकोण, जिसे scRNAseq और सेल भाग्य परख 1,27 का उपयोग करके मान्य किया गया है, अब ऐसा करने के लिए उपकरण प्रदान करता है।

सॉर्टिंग और विश्लेषणात्मक प्रोटोकॉल दोनों को सफलतापूर्वक निष्पादित करने के लिए कई प्रमुख बिंदु हैं। सबसे पहले, कम घनत्व वाली कोशिकाओं के नुकसान को रोकने के लिए कोशिकाओं को 900 x g पर काटने की आवश्यकता होती है। सीएफयू-ई चरण में कई कोशिकाएं बड़ी, कम घनत्व वाली कोशिकाएं होती हैं जो अन्यथा खो सकती हैं। दूसरा, सेल समुच्चय को तोड़ने और नाजुक पी 1 और पी 2 कोशिकाओं के नुकसान को रोकने में मदद करने के लिए ऊपर और नीचे पाइप करते समय बड़े छिद्र युक्तियों का उपयोग करना आवश्यक है। यह कदम महत्वपूर्ण है क्योंकि कई सीएफयू-ई पूर्वज एरिथ्रोब्लास्टिक-द्वीप मैक्रोफेज (ईबीआई) से जुड़े हैं और सफलतापूर्वक अलग नहीं होने पर खो जाएंगे। तीसरा, कोशिकाओं को धुंधला होने से पहले ईडीटीए युक्त बफर ("एसबी 5") के साथ इनक्यूबेट किया जाता है, जो ईबीआई को अलग करने में मदद करता है। चौथा, प्रवाह साइटोमेट्रिक डेटा अधिग्रहण के दौरान, अधिग्रहण की दर 7,000 घटनाओं / सेकंड या उपयोग किए जा रहे प्रवाह साइटोमीटर उपकरण के लिए अनुशंसित दर से अधिक नहीं होनी चाहिए।

पी 1 और पी 2 आबादी में क्रमशः अस्थि मज्जा में सभी सीएफयू-ई और बीएफयू-ई पूर्वज होते हैं, और इसमें कोई अन्य पूर्वज सेल प्रकार1 नहीं होता है। पी 1 आबादी को सीडी 71 1 की अभिव्यक्ति के आधार पर प्रारंभिक सीएफयू-ई (पी 1-लो) और लेट सीएफयू-ई (पी 1-एचआई) में विभाजित कियागया है। ये अत्यधिक शुद्ध प्रवाह साइटोमेट्रिक आबादी विवो में बीएफयू-ई और सीएफयू-ई पूर्वज आबादी की पूरी तस्वीर प्रदान करती है।

एक दोष यह है कि पी 2 आबादी में प्रारंभिक सीएफयू-ई पूर्वजों का एक छोटा सा अंश होता है। हालांकि, इसमें बीएम में सभी बीएफयू-ई कोशिकाएं होती हैं और कोई अन्य सेल प्रकार नहीं होता है। पी 1 आबादी में बीएम में सभी सीएफयू-ई होते हैं, पी 2 में मौजूद छोटे अंश के अलावा। पी 1 और पी 2 आबादी के विपरीत, पी 3 से पी 5 अत्यधिक समृद्ध हैं, लेकिन शुद्ध, पूर्वज आबादी नहीं हैं।

एरिथ्रोपोइजिस के माउस मॉडल के लिए इस प्रवाह साइटोमेट्रिक टूल को लागू करने से अब एरिथ्रोपोइजिस के लिए शारीरिक और पैथोलॉजिकल गड़बड़ी के दौरान सेलुलर और आणविक प्रतिक्रियाओं का निर्धारण करने की अनुमति मिलेगी। दिखाए गए उदाहरण में, चूहों को हार्मोन ईपो के साथ इंजेक्ट किया गया था। इस दृष्टिकोण का उपयोग आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों में किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, हीमोग्लोबिनोपैथी के माउस मॉडल में, विवो में उनके परिवर्तित एरिथ्रोइड पूर्वजों के अधिक सटीक आणविक विश्लेषण के लिए।

डेटा उपलब्धता:
चित्रा 4 और चित्रा 5 में प्रयोगों से जुड़े अतिरिक्त डेटा अनुरोध पर उपलब्ध हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

यह काम एनआईएच अनुदान R01DK130498, R01DK120639, और R01HL141402 द्वारा समर्थित है

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA, pH 8.0 Life Technologies 15575020
1000 µL large orifice tips USA sceintific 1011-9000
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD55 (DAF) Antibody BioLegend 131806
APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) Antibody BioLegend 105826
Biotin-CD11b BD Biosciences 557395 M1/70 (clone)
Biotin-CD19 BD Biosciences 553784 1D3 (clone)
Biotin-CD4 BD Biosciences BDB553045 RM4-5 (clone)
Biotin-CD8a BD Biosciences BDB553029 53-6.7 (clone)
Biotin-F4/80 Biolegend 123106 BM8 (clone)
Biotin-Ly-6G and Ly-6C BD Biosciences 553125 RB6-8C5 (clone)
Biotin-TER-119 BD Biosciences 553672 TER-119 (clone)
Bovine Serum Albumin Sigma aldritch A1470
Brilliant Violet 421 anti-human/mouse CD49f Antibody BioLegend 313624
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD41 Antibody BioLegend 133921
Brilliant Violet 650 anti-mouse CD150 (SLAM) Antibody BioLegend 115931
BUV395 Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells BD Biosciences 563827
ChromPure Rabbit IgG, whole molecule Jackson ImmunoResearch Laboratories 011-000-003
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Life Technologies D1306
Digital DIVA hardware and software for LSR II BD Biosciences
FITC anti-mouse F4/80 Antibody BioLegend 123108
FITC Rat Anti-CD11b BD Biosciences 557396
FITC Rat Anti-Mouse CD19 BD Biosciences 553785
FITC Rat Anti-Mouse CD4 BD Biosciences 553047
FITC Rat Anti-Mouse CD8a BD Biosciences 553031
FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G and LY-6C BD Biosciences 553127
FlowJo software  FlowJo version 10 Flow cytometer analysis software
LSR II digital multiparameter flow cytometer analyzer BD Biosciences Flow cytometer 
NewlineNY Stainless Steel Hand Masher & Bowl, Mortar and Pestle Set Amazon
Normal rat serum Stem Cell Technologies 13551
PE anti-mouse CD105 Antibody BioLegend 120408
PE/Cyanine7 anti-mouse CD71 Antibody BioLegend 113812
Phosphate Buffered Saline, 10x Solution Fisher scientific BP3994
Streptavidin Nanobeads BioLegend 480016 Magnetic beads

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References

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विकासात्मक जीवविज्ञान अंक 189 एरिथ्रोपोइजिस फ्लो साइटोमेट्री एफएसीएस सीएफयू-ई बीएफयू-ई एरिथ्रोइड पूर्वज
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Swaminathan, A., Hwang, Y., Winward, A., Socolovsky, M. Identification and Isolation of Burst-Forming Unit and Colony-Forming Unit Erythroid Progenitors from Mouse Tissue by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (189), e64373, doi:10.3791/64373 (2022).

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