Dotto biliare extraepatico e dissezione della cistifellea nei neonati di topo di nove giorni

La genesi e la progressione delle colangiopatie come l'atresia biliare, la colangite sclerosante primitiva (PSC) e la colangite biliare primitiva (PBC) sono sconosciute o incomplete ^1,2. La limitata comprensione dell'origine e della progressione di tali malattie porta ad una scarsità di opzioni terapeutiche³. L'ostacolo più difficile nello studio dei disturbi del dotto biliare neonatale è acquisire una comprensione molecolare della fisiopatologia. Una delle chiavi essenziali per una migliore comprensione della patologia molecolare è la migliore osservazione possibile del tessuto interessato. Per evitare una ridotta comparabilità e discrepanze tra le ricerche, come l'osservazione della potenziale eziologia virale dell'atresia biliare⁴, sorge la necessità della migliore preparazione e condivisione possibile delle tecniche di dissezione eseguite. Una preparazione pura del tessuto bersaglio è necessaria per successive indagini microscopiche o colture di cellule di riproduzione e organoidi 3D. Tuttavia, nei disturbi neonatali murini, i campioni di tessuto sono rari e si verificano solo in una piccola quantità a causa delle dimensioni molto ridotte. Per quanto riguarda i disturbi del dotto biliare, sono state descritte difficoltà in una preparazione pulita dei dotti biliari nei neonati murini⁵. A causa della fase neonatale dello sviluppo, la differenziazione tissutale non è eccessivamente avanzata, il che complica la preparazione e aumenta la difficoltà rispetto alla preparazione di campioni adulti. Pertanto, il gruppo di lavoro operativo ha studiato una nuova strategia per preparare l'EBDS in un modello murino neonatale. Nel presente studio, la tecnica consente una dissezione efficiente di ciascun campione.

Il sistema del dotto biliare è posizionato per via intraperitoneale nell'addome superiore destro, derivante dal fegato. La cistifellea si trova sotto la superficie viscerale del lobo destro del fegato. Il dotto biliare, insieme alla vena porta e all'arteria epatica, è incorporato nel legamento epatoduodenale. Si unisce direttamente al fegato e al duodeno e drena il fluido biliare nel duodeno⁶. Anatomicamente, il dotto biliare è diviso nei dotti epatici destro e sinistro, nel dotto epatico comune, nel dotto cistico e nel dotto choledochus, che è formato dalla confluenza del dotto cistico e del dotto epatico comune⁷. Questo alla fine svuota il fluido biliare e la saliva dal dotto pancreatico nel duodeno attraverso l'Ampulla di Vater.

I colangiociti rivestono il dotto biliare intra ed extraepaticamente, dimorando in una nicchia anatomica complicata dove aiutano nella produzione di bile e nell'omeostasi⁸. Il fluido biliare passa queste cellule epiteliali specializzate in alte concentrazioni ogni giorno. In particolare, il mantenimento dell'ombrello HCO3- è molto importante per la protezione contro la tossicità degli acidi biliari⁹. I colangiociti sono la prima linea di difesa nel sistema epatobiliare contro, ad esempio, i microrganismi luminali¹⁰. L'efficacia di difesa dei colangiociti contro gli assalti tossici può essere indebolita dalla predisposizione genetica. Un sovraccarico tossico provoca danni e distruzione e può quindi portare a colangiopatie. Inoltre, il dotto biliare in via di sviluppo non è completamente capace di tutti i meccanismi di autoprotezione, portando ad una maggiore suscettibilità alle tossine ambientali nei dotti biliari neonatali¹¹.

A seguito dell'approvazione etica (N045/2021), sono stati osservati topi maschi e femmine di topi C57BL/6 neonati fino a 9 giorni di età. Gli animali sono nati e forniti a scopo sperimentale dalla struttura per animali del Centro medico universitario di Amburgo-Eppendorf, Amburgo, Germania. I neonati erano alloggiati in una gabbia insieme ai loro animali genitori. Le condizioni ambientali sono state controllate in temperatura (20-24 °C), 12:12 h ciclo luce-buio e umidità relativa del 40%-70%.

1. Preparazione sperimentale

1. Preparare l'attrezzatura necessaria per l'operazione chirurgica, comprese forbici, pinze, ecc. (vedi Tabella dei materiali).
2. Posizionare gli strumenti disinfettati e autoclavati su una superficie sterile accanto al tavolo operatorio.
3. Eutanasia un topo neonatale di età P9 rapidamente per decapitazione con una forbice operativa. Posizionare il corpo del topo neonatale eutanasia su un campo operatorio sterile. Sezionare gli EBDS in neonati di topo di 9 giorni (fase 5).
   NOTA: La procedura di dissezione descritta fornisce a qualsiasi scienziato gli strumenti adeguati per rimuovere l'EBDS da topi neonatali e anziani. Più vecchio è il mouse, più facile è la preparazione.

2. Accesso alla cavità peritoneale

1. Afferrare la pelle sopra la posizione della vescica urinaria con una pinza. Incidere un foro di 2 mm di diametro nella pelle usando le forbici, senza danneggiare il peritoneo e le strutture sottostanti. Espandi il taglio fino alla posizione della decapitazione, seguendo la linea ascellare anteriore sinistra. Rimuovere la pelle dal lato sinistro a quello destro con la pinza atraumatica.
2. Afferrare il peritoneo che circonda la milza. Sollevalo delicatamente fino a quando il peritoneo assomiglia a una struttura simile a una tenda e taglia un foro di 1 mm di diametro al centro. Aspetta che la "tenda peritoneale" si riempia d'aria. Utilizzare un ingrandimento microscopico 10x per questo e i seguenti passaggi.
3. Tagliare il peritoneo in una finestra incorniciata dalle costole inferiori, entrambe le regioni addominali laterali e l'area della vescica inferiore per garantire il pieno accesso al fegato, al sistema dei dotti biliari, allo stomaco, all'intestino tenue e al colon.
   NOTA: Per migliorare l'accesso al fegato, è possibile eseguire un'incisione aggiuntiva, rimuovendo le tre costole più basse lasciando intatte il processo xifoideo, il legamento falciforme, il fegato e le strutture del dotto biliare. La vista del fegato è facile da ottenere.

3. Esame della cistifellea e dei dotti biliari

NOTA: assicurarsi di mantenere il campione bagnato regolarmente durante tutti i passaggi successivi.

1. Tirare con attenzione il processo xifoideo in posizione cranioventrale per esaminare la cistifellea.
   NOTA: La tensione sul legamento falciforme aumenta con questo movimento e la cistifellea attaccata diventa visibile.
   1. Eseguire solo una leggera trazione per evitare la lacerazione incontrollabile del legamento falciforme, che potrebbe portare alla rottura della cistifellea dal sistema dei dotti biliari. Rilasciare l'attrazione del processo xifoideo prima del passaggio successivo.
2. Tirare delicatamente verso il basso il duodeno per liberare il sistema del dotto biliare.
   NOTA: All'aumentare della tensione sul legamento epatoduodenale, il tessuto del dotto biliare diventa visibile.

4. Resezione in blocco

1. Eseguire la mobilitazione in blocco inferiore seguendo i passaggi seguenti.
   1. Identificare la papilla duodenale, che collega il sistema del dotto biliare al duodeno.
   2. Tagliare il duodeno a circa 2 cm dal lato laterale destro della papilla.
   3. Tagliare attraverso l'area pilorica. Assicurarsi che il contenuto dello stomaco sia presente nell'area pilorica tra la posizione di taglio e la papilla duodenale.
      NOTA: Questo è un passo importante per la successiva sicurezza dell'orientamento per la corretta posizione delle parti duodenali orali e aborali.
2. Eseguire la mobilitazione superiore in blocco.
   1. Tirare delicatamente il processo xifoideo e ottenere l'accesso al legamento falciforme.
   2. Eseguire un taglio lungo 1 cm attraverso il legamento falciforme, il più vicino possibile al processo xifoideo, tra la cistifellea e il processo xifoideo. Assicurarsi di non danneggiare la cistifellea.
   3. Tagliare attraverso le seguenti strutture di collegamento tra il fegato e il torace: esofago, vena cava inferiore, aorta toracica, tutti i legamenti che circondano l'area nuda del fegato e tutte le connessioni tissutali dorsalmente rimanenti.
      NOTA: il campione in blocco è completamente sezionato. Contiene il fegato, il sistema dei dotti biliari e il corpo duodenale, che è collegato con la regione pilorica dello stomaco.

5. Dissezione finale della cistifellea e del dotto biliare

1. Eseguire la preparazione grossolana seguendo i passaggi seguenti.
   1. Posizionare il campione in blocco su un tampone di schiuma solitamente utilizzato per la disidratazione. Utilizzare un ingrandimento microscopico 20x e due pinze atraumatiche microchirurgiche con una dimensione massima della punta di 6 mm per questo e i seguenti passaggi.
   2. Assemblare il campione sul tampone di schiuma. Riorganizzare il campione nella corretta posizione anatomica. Appiattire la parte orale e aborale del duodeno, eseguendo un movimento delicato.
   3. Inizia il movimento dalla papilla duodenale e continua verso i bordi taglienti usando una pinza atraumatica. Levigare il contenuto polposo bianco dello stomaco, che si verificherà solo nella parte orale del duodeno. Assicurarsi di identificare la parte orale e quella aborale del duodeno per escludere la probabile rotazione del dotto biliare.
   4. Tagliare via grandi resti di tessuto epatico per iniziare la dissezione del dotto biliare.
2. Eseguire l'isolamento finale.
   1. Premere delicatamente il tessuto epatico rimanente nei pori del tappetino di schiuma. Assicurarsi che i movimenti di raschiatura inizino dal sistema del dotto biliare e portino ai confini del fegato.
   2. Trasferire il campione in una posizione più pulita sul tappetino di schiuma dopo alcuni movimenti di raschiatura in varie direzioni. Utilizzare il vantaggio di meno tessuto epatico schiacciato sullo sfondo per ottimizzare la vista per la migliore differenziazione possibile tra EBDS e cellule indesiderate. Raschiare il tessuto epatico dal dotto biliare fino a quando non rimane nulla, o il meno possibile, del tessuto epatico.
   3. Elaborare il legamento epatoduodenale fino a quando rimane l'EBDS isolato. Rimuovere i vasi sanguigni intralegamentosi come l'arteria epatica, la vena porta e piccoli resti. Rimuovere questo filamento delicato, con una leggera trazione e molta cura, sul lato laterale sinistro. Questa fase di dissezione potrebbe essere già iniziata involontariamente o parzialmente completata durante la precedente rimozione del tessuto epatico, che alla fine porta allo stesso risultato.
      NOTA: I vasi sanguigni stanno emergendo come un filamento bianco e molto delicato a circa 3-5 mm per via orale della papilla duodenale e si uniscono al legamento epatoduodenale dal lato laterale sinistro, accumulandosi con il dotto biliare alla triade glissoniana. Con il completamento di questo passaggio, il campione finale è completamente isolato. Se c'è bisogno di una registrazione, le immagini possono essere catturate dopo aver organizzato le strutture del dotto biliare nella loro posizione anatomica (Figura 1). Si consiglia di eseguire le ultime fasi di preparazione su un tappetino di schiuma perché il campione non si attaccherà tanto alla superficie del campo operativo. Se i pori sono bagnati, il dotto biliare levita o galleggia. Quando si sposta il campione, non si attaccherà saldamente come con la preparazione sul tessuto operatorio, con conseguente assenza di strappi durante lo spostamento del campione.

6. Preparazione per l'analisi istologica

1. Mettere il campione isolato in una soluzione tamponata, in un mezzo speciale o in fissativi contenenti formalina (vedere Tabella dei materiali) il più presto possibile dopo la dissezione.
2. Scegli una soluzione di archiviazione adatta in base alle ulteriori fasi di elaborazione pianificate.
   ATTENZIONE: Utilizzare fissativi contenenti formalina solo sotto una presa d'aria a causa di tossicità acuta, corrosività e diversi rischi per la salute.
   NOTA: Nello studio presentato, i campioni EBDS sono stati inseriti in paraformaldeide, disidratati e incorporati in paraffina. Sono stati conservati a temperatura ambiente e raffreddati prima del sezionamento. In un armadio riscaldante, fette di 2 μm sono state conservate durante la notte e colorate con ematossilina convenzionale ed eosina⁴ (vedi Tabella dei materiali).

La figura 1A mostra l'EBDS di un neonato murino, che è stato sezionato con la tecnica descritta. Microscopicamente, non è visibile altro tessuto epatico. Il tessuto epatico è stato rimosso durante le fasi finali di isolamento del protocollo e potrebbe essere facilmente distinto dal tessuto del dotto biliare per quanto riguarda il colore e la consistenza. La Figura 1B mostra il campione isolato rispetto a una scala millimetrica. La lunghezza dell'EBD (misurata dalla cistifellea alla papilla duodenale) è inferiore a 10 mm. Il diametro del delicatissimo Ductus choledochus variava da 0,05-0,2 mm. La figura 2 mostra la colorazione dell'ematossina-eosina di una sezione longitudinale dell'EBDS con un lume aperto. I colangiociti possono essere identificati che circondano il lume come un monostrato e tinto più scuro. La microscopia è stata eseguita utilizzando un ingrandimento 20x. Le figure mostrano che l'utilizzo del protocollo di dissezione descritto consente all'operatore di sezionare microscopicamente l'EBDS vicino ai margini del dotto, anche nei topi neonatali. I campioni sono stati prelevati da neonati murini di 9 giorni.

Figura 1: Dissezione EBDS . (A) Campione finale EBDS di un neonato murino. (1) Cistifellea, (2) Ductus cysticus, (3) Ductus hepaticus dexter, (4) Ductus hepaticus sinistro, (5) Ductus hepaticus communis, (6) Ductus choledochus, (7) Duodeno. Barra di scala = 500 μm. (B) Dimensioni dell'EBDS sezionato rispetto a una scala millimetrica. Barra della scala = 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Sezione longitudinale dell'EBDS. La colorazione dell'eossina-eosina mostra EBDS contenente un lume aperto. Barra di scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura supplementare 1: Sviluppo del peso di C57BL/6-neonati fino al nono giorno di vita. I neonati venivano pesati fino a due volte al giorno. I dati forniti mostrano il peso degli animali di controllo (n = 5). Clicca qui per scaricare questo file.

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.