Articolo metodologico

Dotto biliare extraepatico e dissezione della cistifellea nei neonati di topo di nove giorni

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DOI:

10.3791/64424

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23 agosto 2022

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1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, 2Research Laboratory for Pediatric Surgery, 3Research Animal Facility, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

In questo articolo

Sommario

Per l'osservazione dei disturbi del dotto biliare neonatale murino, sono necessari un dotto biliare intatto e una preparazione efficiente. Pertanto, è stato sviluppato con successo un nuovo approccio per isolare l'intero sistema dei dotti biliari extraepatici nei neonati murini mantenendo l'integrità del dotto biliare.

Abstract

La dissezione dei dotti biliari neonatali murini è stata descritta come difficile. L'obiettivo principale della procedura operativa standard descritta è l'isolamento del dotto biliare extraepatico (EBD) nei neonati di topo senza danneggiare il dotto biliare durante la preparazione. A causa della sua preparazione eccezionalmente stretta rispetto alla linea cellulare dei colangiociti e della raccolta dell'intero sistema dei dotti biliari extraepatici (EBDS), l'approccio descritto è estremamente utile nella ricerca di modelli animali di disturbi del dotto biliare neonatale, come l'atresia biliare. Dopo l'eutanasia, si è acceduto alla cavità peritoneale e il sistema del dotto biliare, il duodeno e il fegato sono stati estratti con l'esclusiva resezione in blocco (EbR). Il campione estratto viene posto su un tappetino di schiuma e l'EBD viene sezionato dalle cellule contaminanti in modo atraumatico senza il necessario contatto. La dissezione dell'intero EBDS è un vantaggio significativo di questo metodo. Bisogna fare attenzione a causa delle piccole dimensioni e della quantità di tessuto del dotto biliare. Usando la tecnica descritta, non vi è alcun danno ai colangiociti. Inoltre, la purezza della tecnica è riproducibile (n = 10). Pertanto, è possibile raccogliere campioni comparabili in modo ottimale. Inoltre, nessun tessuto del dotto biliare viene danneggiato, perché qualsiasi contatto con il sistema del dotto biliare può essere evitato durante la preparazione, lasciando il fluido biliare all'interno della cistifellea. Ancora più importante, durante l'esecuzione della dissezione finale della cistifellea e del dotto biliare, sono stati utilizzati microstrumenti atraumatici solo leggermente laterali del dotto biliare senza schiacciarlo. Questa è la chiave per un campione pulito e intatto, ed essenziale per ulteriori indagini istologiche o l'isolamento dei colangiociti. Per riassumere, l'innovativa tecnica di dissezione descritta consente agli operatori particolarmente inesperti con le attrezzature necessarie di isolare l'EBDS nel modo più pulito possibile.

Introduzione

La genesi e la progressione delle colangiopatie come l'atresia biliare, la colangite sclerosante primitiva (PSC) e la colangite biliare primitiva (PBC) sono sconosciute o incomplete 1,2. La limitata comprensione dell'origine e della progressione di tali malattie porta ad una scarsità di opzioni terapeutiche3. L'ostacolo più difficile nello studio dei disturbi del dotto biliare neonatale è acquisire una comprensione molecolare della fisiopatologia. Una delle chiavi essenziali per una migliore comprensione della patologia molecolare è la migliore osservazione possibile del tessuto interessato. Per evitare una ridotta comparabilità e discrepanze tra le ricerche, come l'osservazione della potenziale eziologia virale dell'atresia biliare4, sorge la necessità della migliore preparazione e condivisione possibile delle tecniche di dissezione eseguite. Una preparazione pura del tessuto bersaglio è necessaria per successive indagini microscopiche o colture di cellule di riproduzione e organoidi 3D. Tuttavia, nei disturbi neonatali murini, i campioni di tessuto sono rari e si verificano solo in una piccola quantità a causa delle dimensioni molto ridotte. Per quanto riguarda i disturbi del dotto biliare, sono state descritte difficoltà in una preparazione pulita dei dotti biliari nei neonati murini5. A causa della fase neonatale dello sviluppo, la differenziazione tissutale non è eccessivamente avanzata, il che complica la preparazione e aumenta la difficoltà rispetto alla preparazione di campioni adulti. Pertanto, il gruppo di lavoro operativo ha studiato una nuova strategia per preparare l'EBDS in un modello murino neonatale. Nel presente studio, la tecnica consente una dissezione efficiente di ciascun campione.

Il sistema del dotto biliare è posizionato per via intraperitoneale nell'addome superiore destro, derivante dal fegato. La cistifellea si trova sotto la superficie viscerale del lobo destro del fegato. Il dotto biliare, insieme alla vena porta e all'arteria epatica, è incorporato nel legamento epatoduodenale. Si unisce direttamente al fegato e al duodeno e drena il fluido biliare nel duodeno6. Anatomicamente, il dotto biliare è diviso nei dotti epatici destro e sinistro, nel dotto epatico comune, nel dotto cistico e nel dotto choledochus, che è formato dalla confluenza del dotto cistico e del dotto epatico comune7. Questo alla fine svuota il fluido biliare e la saliva dal dotto pancreatico nel duodeno attraverso l'Ampulla di Vater.

I colangiociti rivestono il dotto biliare intra ed extraepaticamente, dimorando in una nicchia anatomica complicata dove aiutano nella produzione di bile e nell'omeostasi8. Il fluido biliare passa queste cellule epiteliali specializzate in alte concentrazioni ogni giorno. In particolare, il mantenimento dell'ombrello HCO3- è molto importante per la protezione contro la tossicità degli acidi biliari9. I colangiociti sono la prima linea di difesa nel sistema epatobiliare contro, ad esempio, i microrganismi luminali10. L'efficacia di difesa dei colangiociti contro gli assalti tossici può essere indebolita dalla predisposizione genetica. Un sovraccarico tossico provoca danni e distruzione e può quindi portare a colangiopatie. Inoltre, il dotto biliare in via di sviluppo non è completamente capace di tutti i meccanismi di autoprotezione, portando ad una maggiore suscettibilità alle tossine ambientali nei dotti biliari neonatali11.

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Protocollo

A seguito dell'approvazione etica (N045/2021), sono stati osservati topi maschi e femmine di topi C57BL/6 neonati fino a 9 giorni di età. Gli animali sono nati e forniti a scopo sperimentale dalla struttura per animali del Centro medico universitario di Amburgo-Eppendorf, Amburgo, Germania. I neonati erano alloggiati in una gabbia insieme ai loro animali genitori. Le condizioni ambientali sono state controllate in temperatura (20-24 °C), 12:12 h ciclo luce-buio e umidità relativa del 40%-70%.

1. Preparazione sperimentale

  1. Preparare l'attrezzatura necessaria per l'operazione chirurgica, comprese forbici, pinze, ecc. (vedi Tabella dei materiali).
  2. Posizionare gli strumenti disinfettati e autoclavati su una superficie sterile accanto al tavolo operatorio.
  3. Eutanasia un topo neonatale di età P9 rapidamente per decapitazione con una forbice operativa. Posizionare il corpo del topo neonatale eutanasia su un campo operatorio sterile. Sezionare gli EBDS in neonati di topo di 9 giorni (fase 5).
    NOTA: La procedura di dissezione descritta fornisce a qualsiasi scienziato gli strumenti adeguati per rimuovere l'EBDS da topi neonatali e anziani. Più vecchio è il mouse, più facile è la preparazione.

2. Accesso alla cavità peritoneale

  1. Afferrare la pelle sopra la posizione della vescica urinaria con una pinza. Incidere un foro di 2 mm di diametro nella pelle usando le forbici, senza danneggiare il peritoneo e le strutture sottostanti. Espandi il taglio fino alla posizione della decapitazione, seguendo la linea ascellare anteriore sinistra. Rimuovere la pelle dal lato sinistro a quello destro con la pinza atraumatica.
  2. Afferrare il peritoneo che circonda la milza. Sollevalo delicatamente fino a quando il peritoneo assomiglia a una struttura simile a una tenda e taglia un foro di 1 mm di diametro al centro. Aspetta che la "tenda peritoneale" si riempia d'aria. Utilizzare un ingrandimento microscopico 10x per questo e i seguenti passaggi.
  3. Tagliare il peritoneo in una finestra incorniciata dalle costole inferiori, entrambe le regioni addominali laterali e l'area della vescica inferiore per garantire il pieno accesso al fegato, al sistema dei dotti biliari, allo stomaco, all'intestino tenue e al colon.
    NOTA: Per migliorare l'accesso al fegato, è possibile eseguire un'incisione aggiuntiva, rimuovendo le tre costole più basse lasciando intatte il processo xifoideo, il legamento falciforme, il fegato e le strutture del dotto biliare. La vista del fegato è facile da ottenere.

3. Esame della cistifellea e dei dotti biliari

NOTA: assicurarsi di mantenere il campione bagnato regolarmente durante tutti i passaggi successivi.

  1. Tirare con attenzione il processo xifoideo in posizione cranioventrale per esaminare la cistifellea.
    NOTA: La tensione sul legamento falciforme aumenta con questo movimento e la cistifellea attaccata diventa visibile.
    1. Eseguire solo una leggera trazione per evitare la lacerazione incontrollabile del legamento falciforme, che potrebbe portare alla rottura della cistifellea dal sistema dei dotti biliari. Rilasciare l'attrazione del processo xifoideo prima del passaggio successivo.
  2. Tirare delicatamente verso il basso il duodeno per liberare il sistema del dotto biliare.
    NOTA: All'aumentare della tensione sul legamento epatoduodenale, il tessuto del dotto biliare diventa visibile.

4. Resezione in blocco

  1. Eseguire la mobilitazione in blocco inferiore seguendo i passaggi seguenti.
    1. Identificare la papilla duodenale, che collega il sistema del dotto biliare al duodeno.
    2. Tagliare il duodeno a circa 2 cm dal lato laterale destro della papilla.
    3. Tagliare attraverso l'area pilorica. Assicurarsi che il contenuto dello stomaco sia presente nell'area pilorica tra la posizione di taglio e la papilla duodenale.
      NOTA: Questo è un passo importante per la successiva sicurezza dell'orientamento per la corretta posizione delle parti duodenali orali e aborali.
  2. Eseguire la mobilitazione superiore in blocco.
    1. Tirare delicatamente il processo xifoideo e ottenere l'accesso al legamento falciforme.
    2. Eseguire un taglio lungo 1 cm attraverso il legamento falciforme, il più vicino possibile al processo xifoideo, tra la cistifellea e il processo xifoideo. Assicurarsi di non danneggiare la cistifellea.
    3. Tagliare attraverso le seguenti strutture di collegamento tra il fegato e il torace: esofago, vena cava inferiore, aorta toracica, tutti i legamenti che circondano l'area nuda del fegato e tutte le connessioni tissutali dorsalmente rimanenti.
      NOTA: il campione in blocco è completamente sezionato. Contiene il fegato, il sistema dei dotti biliari e il corpo duodenale, che è collegato con la regione pilorica dello stomaco.

5. Dissezione finale della cistifellea e del dotto biliare

  1. Eseguire la preparazione grossolana seguendo i passaggi seguenti.
    1. Posizionare il campione in blocco su un tampone di schiuma solitamente utilizzato per la disidratazione. Utilizzare un ingrandimento microscopico 20x e due pinze atraumatiche microchirurgiche con una dimensione massima della punta di 6 mm per questo e i seguenti passaggi.
    2. Assemblare il campione sul tampone di schiuma. Riorganizzare il campione nella corretta posizione anatomica. Appiattire la parte orale e aborale del duodeno, eseguendo un movimento delicato.
    3. Inizia il movimento dalla papilla duodenale e continua verso i bordi taglienti usando una pinza atraumatica. Levigare il contenuto polposo bianco dello stomaco, che si verificherà solo nella parte orale del duodeno. Assicurarsi di identificare la parte orale e quella aborale del duodeno per escludere la probabile rotazione del dotto biliare.
    4. Tagliare via grandi resti di tessuto epatico per iniziare la dissezione del dotto biliare.
  2. Eseguire l'isolamento finale.
    1. Premere delicatamente il tessuto epatico rimanente nei pori del tappetino di schiuma. Assicurarsi che i movimenti di raschiatura inizino dal sistema del dotto biliare e portino ai confini del fegato.
    2. Trasferire il campione in una posizione più pulita sul tappetino di schiuma dopo alcuni movimenti di raschiatura in varie direzioni. Utilizzare il vantaggio di meno tessuto epatico schiacciato sullo sfondo per ottimizzare la vista per la migliore differenziazione possibile tra EBDS e cellule indesiderate. Raschiare il tessuto epatico dal dotto biliare fino a quando non rimane nulla, o il meno possibile, del tessuto epatico.
    3. Elaborare il legamento epatoduodenale fino a quando rimane l'EBDS isolato. Rimuovere i vasi sanguigni intralegamentosi come l'arteria epatica, la vena porta e piccoli resti. Rimuovere questo filamento delicato, con una leggera trazione e molta cura, sul lato laterale sinistro. Questa fase di dissezione potrebbe essere già iniziata involontariamente o parzialmente completata durante la precedente rimozione del tessuto epatico, che alla fine porta allo stesso risultato.
      NOTA: I vasi sanguigni stanno emergendo come un filamento bianco e molto delicato a circa 3-5 mm per via orale della papilla duodenale e si uniscono al legamento epatoduodenale dal lato laterale sinistro, accumulandosi con il dotto biliare alla triade glissoniana. Con il completamento di questo passaggio, il campione finale è completamente isolato. Se c'è bisogno di una registrazione, le immagini possono essere catturate dopo aver organizzato le strutture del dotto biliare nella loro posizione anatomica (Figura 1). Si consiglia di eseguire le ultime fasi di preparazione su un tappetino di schiuma perché il campione non si attaccherà tanto alla superficie del campo operativo. Se i pori sono bagnati, il dotto biliare levita o galleggia. Quando si sposta il campione, non si attaccherà saldamente come con la preparazione sul tessuto operatorio, con conseguente assenza di strappi durante lo spostamento del campione.

6. Preparazione per l'analisi istologica

  1. Mettere il campione isolato in una soluzione tamponata, in un mezzo speciale o in fissativi contenenti formalina (vedere Tabella dei materiali) il più presto possibile dopo la dissezione.
  2. Scegli una soluzione di archiviazione adatta in base alle ulteriori fasi di elaborazione pianificate.
    ATTENZIONE: Utilizzare fissativi contenenti formalina solo sotto una presa d'aria a causa di tossicità acuta, corrosività e diversi rischi per la salute.
    NOTA: Nello studio presentato, i campioni EBDS sono stati inseriti in paraformaldeide, disidratati e incorporati in paraffina. Sono stati conservati a temperatura ambiente e raffreddati prima del sezionamento. In un armadio riscaldante, fette di 2 μm sono state conservate durante la notte e colorate con ematossilina convenzionale ed eosina4 (vedi Tabella dei materiali).

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Risultati

La figura 1A mostra l'EBDS di un neonato murino, che è stato sezionato con la tecnica descritta. Microscopicamente, non è visibile altro tessuto epatico. Il tessuto epatico è stato rimosso durante le fasi finali di isolamento del protocollo e potrebbe essere facilmente distinto dal tessuto del dotto biliare per quanto riguarda il colore e la consistenza. La Figura 1B mostra il campione isolato rispetto a una scala millimetrica. La lunghezza dell'EBD (misurata da...

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Discussione

Questo articolo ha riportato e discusso la creazione e la convalida di un nuovo approccio chirurgico per la rimozione dell'EBDS dei topi neonatali eutanasiatici. I risultati microscopici e istologici rivelano che l'approccio rileva rapidamente le EBD e le seziona vicino ai margini del dotto, anche nei topi neonatali. Per il protocollo descritto sono necessari solo strumenti chirurgici e un microscopio con un ingrandimento 20x. Inoltre, l'approccio consente l'isolamento dell'intero EBDS. La tecnica è altamente efficiente,...

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Dichiarazioni

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano Johanna Hagens, Pauline Schuppert, Clara Philippi, PD Dr. med Christian Tomuschat, Svenja Warnke, PD Dr. Diana Lindner, Prof. Dr. Dirk Westermann, Miriam Tomczak, Nicole Lüder, Nadine Kurzawa, Dr. rer nat. Laia Pagerols Raluy, Birgit Appl e Magdalena Trochimiuk per i loro contributi. Hans Christian Schmidt è stato sostenuto finanziariamente dalla borsa di studio Else Kröner-Fresenius-Stiftung iPRIME (2021_EKPK.10), UKE, Amburgo.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
2-propanoloCHEMSOLUTE11365000utilizzato come agente disidratante
30 G canulaB Braun/Sterican, Melsungen Germania4656300canula per l'idratazione del campione
Sfiato ariaC + P Mö belsysteme GmbH & Co. KG, Breidenbach, GermaniaTec-Ononmic AZ 1200l'uso di una presa d'aria aiuta ad evitare l'inalazione di fissativi contenenti formalina
Aqua ad injectabilia BraunB Braun, Melsungen, Germania2351744soluzione salina; Contenitore: Mini-Plasco connect, 20 x 10 mL, sterile
Pinza microchirurgica più grandeDIADUST von Aesculap, Trossingen DeutschlandFD253Rdiritta, 180 mm (7"), punta della piattaforma, impugnatura rotonda, larghezza: 0,800 mm, rivestita in polvere di diamante, non sterile, strumento opzionale riutilizzabile per l'osservazione e ogni fase della preparazione, ad eccezione della preparazione finale; Pelle divisoria del peritoneo
Camera " SmartCAM 5"  Basler and Vision Engineering, Send, Regno UnitoEVC131Amodulo opzionale della fotocamera Lynx Exo: tipo di sensore: CMOS, risoluzione 2560 x 1920 pixel, dimensione del sensore: 1/2"; Utilizzato per la produzione video e la valutazione tecnica
Macchina per la disidratazione/Elaboratore di tessuti Citadel 2000Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germania12612613utilizzato per la disidratazione automatica, programma breve (circa 4,8 ore)
Spugna per la disidratazione Carl Roth, Karlsruhe, GermaniaSpugna TT56.1per la fase finale di dissezione, sono adatte anche altre spugne/cuscinetti in schiuma con una dimensione minima dei pori di 60 pori per pollice, si consiglia l'uso di due cuscinetti in schiuma per cassetta di inclusione per coprire il campione dal basso e dall'alto per evitare che scivoli attraverso la perforazione delle cassette di inclusione
Dulbecco´ s Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Gibco14190-144 t contengono Salio o Magnesio, 500 mL
Cassette di inclusioneEngelbrecht GmbH, Edermü nde, Germania17990
EosinMEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germania41-6660-00soluzione colorante, pronta all'uso
Forbici fini CeramaCutFST, Heidelberg Germania14959-09Punte: affilate-affilate, lega / Materiale: acciaio inossidabile rivestito in ceramica, seghettato:, sì; Caratteristica: CeramaCut, Forma della punta: Dritta, Tagliente: 22 mm, Lunghezza: 9 cm; Incisione cutanea, incisione della finestra peritoneale
Graefe ForcipeFST, Heidelberg Germania11051-10Lunghezza: 10 cm, Forma della punta: curva, seghettata, Larghezza della punta: 0,8 mm, Dimensioni della punta: 0,8 x 0,7 mm, Lega /Materiale: Acciaio inossidabile
HematoxylinMEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germania41-5130-00soluzione colorante, pronta all'uso
Microscopio ad alta risoluzioneVision Engineering, Inviare Regno UnitoEVO503 In grado di ingrandire fino a 60x di ingrandimento, sono stati utilizzati solo da 6x a 20x di ingrandimento.
MicroscopioOlympus Optical CO, Ltd., Amburgo, GermaniaBX60F5
Copri microscopio VetriMarienfeld, Lauda-Kö nigshofen, Germania10124460 mm di larghezza, realizzato in vetro SCHOTT D 263
Vetrini per microscopioR. Langenbrinck GmbH, Emmendingen, Germania03-0060
MicrotomoLeica, Nuß loch, GermaniaSM2010RUtensile per sezionamento (2 µ fette m) 
Siringa Omnifix-F 1 mLB Braun, Melsungen, Germania9161406Vsiringa senza cannula
ParaffinaSakura Finetec, Torrance, USA4511Cera di paraffina Tissue-Tek Tek III, senza DMSO
Macchina per inclusione di paraffinaMEDITE Medical GmbH, Burgdorf, GermaniaTES 99La macchina per l'inclusione utilizzata in questo studio conteneva i seguenti tre moduli individuali: TES 99.420, TES 99.250, TES 99.600. Il campione deve essere incorporato nella paraffina subito dopo la disidratazione, non deve essere eseguita alcuna conservazione temporanea in frigorifero a causa del possibile restringimento e dell'umidità nel frigorifero
Paraformaldeide (PFA)Morphisto1176201000Preparare 1 mL di Aliquote in 2 mL di Provette coniche Eppendorf per campioni di fegato e 0,5 mL di Aliquote in 1 mL di Provette coniche Eppendorf per campioni di dotto biliare extraepatico, 4% in PBS ph 7,4 
Piccole pinze microchirurgiche EPM (Erich Pfitzer Medizintechnik), Bü tthard, Bayern, Germania(00)165Manico rotondo, dritto, punta da 0,3 mm, strumento per l'osservazione e ogni fase della preparazione, particolarmente utile nella preparazione finale
Righello in acciaio inossidabileAgntho's AB, Lidingö, Svezia30085-15150mm con sistema metrico e Forbici chirurgiche per graduazioni in pollici
– Sharp-blunt per la decapitazioneFST, Heidelberg Germania14001-14Dispositivo per la decapitazione
Armadio di riscaldamentoHaraeus, Hanau, GermaniaT 6060i campioni affettati devono essere conservati nell'armadio di riscaldamento per garantire l'attecchimento del campione sui vetrini del microscopio

Riferimenti

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