Summary
Para a observação de distúrbios do ducto biliar neonatal murino, um ducto biliar intacto e uma preparação eficiente são necessários. Portanto, uma nova abordagem para isolar todo o sistema do ducto biliar extra-hepático em neonatos murinos foi desenvolvida com sucesso, mantendo a integridade do ducto biliar.
Abstract
A dissecção dos ductos biliares neonatais murinos tem sido descrita como difícil. O principal objetivo do procedimento cirúrgico padrão descrito é o isolamento do ducto biliar extra-hepático (EBD) em neonatos de camundongos sem danificar o ducto biliar durante a preparação. Devido à sua preparação excepcionalmente próxima em comparação com a linhagem celular de colangiócitos e a colheita de todo o sistema de ducto biliar extra-hepático (EBDS), a abordagem descrita é extremamente útil na pesquisa de modelos animais de distúrbios do ducto biliar recém-nascido, como a atresia biliar. Após a eutanásia, a cavidade peritoneal foi acessada e o sistema de ductos biliares, duodeno e fígado foram extraídos com a única ressecção em bloco (EbR). A amostra extraída é colocada em um tapete de espuma, e a EBD é dissecada de células contaminantes atraumaticamente sem o toque necessário. A dissecação de toda a EBDS é uma vantagem significativa deste método. Deve-se ter cuidado devido ao pequeno tamanho e quantidade de tecido do ducto biliar. Usando a técnica descrita, não há danos aos colangiócitos. Além disso, a pureza da técnica é reprodutível (n = 10). Portanto, amostras comparáveis de forma ideal podem ser colhidas. Além disso, nenhum tecido do ducto biliar é prejudicado, porque qualquer contato com o sistema do ducto biliar pode ser evitado durante a preparação, deixando o fluido biliar dentro da vesícula biliar. Mais importante ainda, durante a realização da vesícula biliar final e da dissecção do ducto biliar, microinstrumentos atrauratos foram usados apenas ligeiramente laterais do ducto biliar sem apertá-lo. Esta é a chave para uma amostra limpa e intacta, e essencial para uma investigação histológica mais aprofundada ou o isolamento de colangiócitos. Para resumir, a técnica de dissecção inovadora descrita permite que operadores especialmente inexperientes com o equipamento necessário isolem a EBDS da forma mais limpa possível.
Introduction
A gênese e a progressão de colangiopatias como atresia biliar, colangite esclerosante primária (colangite esclerosante) e colangite biliar primária (CBP) são desconhecidas ou incompletas 1,2. A compreensão limitada da origem e progressão dessas doenças leva a uma escassez de opções terapêuticas3. O obstáculo mais difícil no estudo dos distúrbios do ducto biliar neonatal é obter uma compreensão molecular da fisiopatologia. Uma das chaves essenciais para uma melhor compreensão da patologia molecular é a melhor observação possível do tecido afetado. Para evitar a redução da comparabilidade e discrepâncias entre as pesquisas, como a observação da potencial etiologia viral da atresia biliar4, surge a necessidade do melhor preparo possível e do compartilhamento das técnicas de dissecção realizadas. Uma preparação pura do tecido alvo é necessária para investigações microscópicas posteriores ou culturas organoides de células e 3D reprodutoras. No entanto, em distúrbios neonatais murinos, as amostras de tecido são raras e só ocorrem em pequena quantidade devido ao tamanho muito pequeno. Em relação aos distúrbios do ducto biliar, dificuldades no preparo limpo dos ductos biliares em neonatos murinos têm sido descritas5. Devido ao estágio neonatal de desenvolvimento, a diferenciação tecidual não é excessivamente avançada, o que complica o preparo e aumenta a dificuldade em comparação com o preparo de amostras adultas. Portanto, o grupo de trabalho operacional investigou uma nova estratégia para preparar a EBDS em um modelo de camundongo neonatal. No presente estudo, a técnica permite uma dissecção eficiente de cada amostra.
O sistema de ducto biliar é colocado intraperitonealmente no abdômen superior direito, surgindo do fígado. A vesícula biliar está localizada abaixo da superfície visceral do lobo direito do fígado. O ducto biliar, juntamente com a veia porta e a artéria hepática, está incorporado no ligamento hepatoduodenal. Ele une o fígado e o duodeno diretamente e drena o líquido biliar para o duodeno6. Anatomicamente, o ducto biliar é dividido nos ductos hepáticos direito e esquerdo, no ducto hepático comum, no ducto cístico e no ducto colédoco, que é formado pela confluência do ducto cístico e do ducto hepático comum7. Este eventualmente esvazia o líquido biliar e a saliva do ducto pancreático para o duodeno através da Ampola de Vater.
Os colangiócitos revestem o ducto biliar intra e extra-hepaticamente, habitando-se em um complicado nicho anatômico onde auxiliam na produção biliar e na homeostase8. O fluido biliar passa essas células epiteliais especializadas em altas concentrações diariamente. Em particular, a manutenção do guarda-chuva HCO3- é muito importante para a proteção contra a toxicidade dos ácidos biliares9. Os colangiócitos são a primeira linha de defesa no sistema hepatobiliar contra, por exemplo, microrganismos luminais10. A eficácia de defesa dos colangiócitos contra agressões tóxicas pode ser enfraquecida pela predisposição genética. Uma sobrecarga tóxica causa danos e destruição e, portanto, pode levar a colangiopatias. Além disso, o ducto biliar em desenvolvimento não é completamente capaz de todos os mecanismos de autoproteção, levando a uma maior suscetibilidade a toxinas ambientais nos ductos biliares neonatais11.
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Protocol
Após a aprovação ética (N045/2021), foram observados neonatos de camundongos C57BL/6 machos e fêmeas até os 9 dias de idade. Os animais nasceram e foram fornecidos para fins experimentais pela instalação animal do Centro Médico Universitário de Hamburgo-Eppendorf, Hamburgo, Alemanha. Os neonatos foram alojados em uma gaiola junto com seus animais pais. As condições ambientais foram controladas em temperatura (20-24 °C), ciclo claro-escuro de 12:12 h e umidade relativa do ar de 40%-70%.
1. Preparação experimental
- Prepare o equipamento necessário para a operação cirúrgica, incluindo tesoura, pinça, etc. (ver Tabela de Materiais).
- Coloque os instrumentos desinfetados e autoclavados em uma superfície estéril ao lado da mesa de operação.
- Eutanasiar um rato neonatal de idade P9 rapidamente por decapitação com uma tesoura cirúrgica. Coloque o corpo do rato neonatal eutanasiado em um campo de operação estéril. Dissecar os EBDSs em neonatos de camundongos de 9 dias de idade (etapa 5).
NOTA: O procedimento de dissecação descrito dá a qualquer cientista as ferramentas adequadas para remover o EBDS de camundongos neonatais e mais velhos. Quanto mais velho o mouse, mais fácil a preparação.
2. Acesso à cavidade peritoneal
- Segure a pele acima da localização da bexiga urinária com fórceps. Incida um orifício de 2 mm de diâmetro na pele usando uma tesoura, sem danificar o peritônio e as estruturas subjacentes. Expanda o corte até o local da decapitação, seguindo a linha axilar frontal esquerda. Remova a pele do lado esquerdo para o direito com a pinça atraumática.
- Segure o peritônio ao redor do baço. Levante-o suavemente até que o peritônio se assemelhe a uma estrutura semelhante a uma tenda e corte um orifício de 1 mm de diâmetro no centro. Espere a "tenda peritoneal" se encher de ar. Use uma ampliação microscópica de 10x para esta e as etapas a seguir.
- Corte o peritônio em uma janela emoldurada pelas costelas inferiores, ambas as regiões abdominais laterais e a área da bexiga inferior para garantir o acesso total ao fígado, sistema de ductos biliares, estômago, intestino delgado e cólon.
NOTA: Para melhorar o acesso ao fígado, uma incisão adicional pode ser realizada, removendo as três costelas mais baixas, deixando intactas as estruturas do processo xifoide, ligamento falciforme, fígado e ducto biliar. A visão do fígado é fácil de obter.
3. Exame da vesícula biliar e ductos biliares
NOTA: Certifique-se de manter a amostra molhada regularmente durante todas as etapas a seguir.
- Puxe cuidadosamente o processo xifoide em uma posição cranioventral para examinar a vesícula biliar.
NOTA: A tensão no ligamento falciforme aumenta com este movimento, e a vesícula biliar anexada torna-se visível.- Realize apenas um leve puxão para evitar o rompimento incontrolável do ligamento falciforme, o que poderia levar ao rompimento da vesícula biliar do sistema de ductos biliares. Solte a tração do processo xifoide antes da próxima etapa.
- Puxe suavemente o duodeno para baixo para liberar o sistema de ducto biliar.
NOTA: À medida que a tensão no ligamento hepatoduodenal aumenta, o tecido do ducto biliar torna-se visível.
4. En-bloc-ressecção
- Realize a mobilização em bloco inferior seguindo as etapas abaixo.
- Identifique a papila duodenal, que conecta o sistema de ducto biliar ao duodeno.
- Corte o duodeno a cerca de 2 cm do lado direito lateral da papila.
- Corte a área pilórica. Certifique-se de que o conteúdo do estômago esteja presente na área pilórica entre o local de corte e a papila duodenal.
NOTA: Este é um passo importante para posterior segurança da orientação para a localização correta das partes duodenais orais e aborais.
- Realizar a mobilização superior em bloco.
- Puxe suavemente o processo xifoide e tenha acesso ao ligamento falciforme.
- Realizar um corte de 1 cm de comprimento através do ligamento falciforme, o mais próximo possível do processo xifoide, entre a vesícula biliar e o processo xifoide. Certifique-se de não danificar a vesícula biliar.
- Corte as seguintes estruturas de conexão entre o fígado e o tórax: esôfago, veia cava inferior, aorta torácica, todos os ligamentos que cercam a área nua do fígado e todas as conexões de tecido dorsalmente remanescentes.
NOTA: A amostra em bloco é completamente dissecada. Ele contém o fígado, o sistema do ducto biliar e o corpo duodenal, que está conectado com a região pilórica do estômago.
5. Vesícula biliar final e dissecção do ducto biliar
- Realize a preparação bruta seguindo os passos abaixo.
- Coloque a amostra em bloco em uma almofada de espuma geralmente usada para desidratação. Use uma ampliação microscópica de 20x e duas pinças atraumáticas microcirúrgicas com um tamanho máximo da ponta de 6 mm para esta e as etapas seguintes.
- Monte a amostra na almofada de espuma. Reorganize a amostra na posição anatômica correta. Achatar a parte oral e aboral do duodeno, realizando um movimento suave.
- Inicie o movimento na papila duodenal e continue até as arestas de corte usando pinça atraumática. Alise o conteúdo polpudo branco do estômago, que só ocorrerá na parte oral do duodeno. Certifique-se de identificar a parte oral e a parte aboral do duodeno para descartar a provável rotação do ducto biliar.
- Corte grandes restos de tecido hepático para iniciar a dissecção do ducto biliar.
- Execute o isolamento final.
- Pressione suavemente o tecido hepático restante nos poros do tapete de espuma. Certifique-se de que os movimentos de raspagem começam a partir do sistema de ductos biliares e levam aos limites do fígado.
- Transfira a amostra para uma posição mais limpa no tapete de espuma após alguns movimentos de raspagem em várias direções. Use a vantagem de menos tecido hepático espremido em segundo plano para otimizar a visão para a melhor diferenciação possível entre EBDS e células indesejadas. Raspe o tecido hepático do ducto biliar até que nada, ou o mínimo possível, do tecido hepático permaneça.
- Processe o ligamento hepatoduodenal até que a EBDS isolada permaneça. Remova os vasos sanguíneos intraligamentares, como a artéria hepática, a veia porta e pequenos remanescentes. Remova este filamento delicado, com um puxão suave e alto cuidado, para o lado lateral esquerdo. Esta etapa de dissecção pode já ter começado involuntariamente ou parcialmente concluída durante a remoção prévia do tecido hepático, o que no final leva ao mesmo resultado.
NOTA: Os vasos sanguíneos estão emergindo como um filamento branco e muito delicado aproximadamente 3-5 mm por via oral da papila duodenal e se juntam ao ligamento hepatoduodenal do lado lateral esquerdo, acumulando-se com o ducto biliar até a tríade glissoniana. Com a conclusão desta etapa, a amostra final é completamente isolada. Se houver necessidade de registro, as imagens podem ser capturadas após a organização das estruturas do ducto biliar em sua posição anatômica (Figura 1). Recomenda-se fazer as últimas etapas de preparação em um tapete de espuma porque a amostra não grudará tanto na superfície do campo de operação. Se os poros estiverem molhados, o ducto biliar levita ou flutua. Ao mover a amostra, ela não grudará tão firmemente quanto com a preparação no pano de operação, resultando em nenhum rasgo ao mover a amostra.
6. Preparação para a análise histológica
- Colocar a amostra isolada numa solução tamponada, num meio especial ou em fixadores contendo formalina (ver Tabela de Materiais) o mais rapidamente possível após a dissecção.
- Escolha uma solução de armazenamento adequada, dependendo das etapas de processamento planejadas adicionais.
CUIDADO: Use fixadores contendo formalina apenas sob uma saída de ar devido à toxicidade aguda, corrosividade e diversos riscos para a saúde.
NOTA: No estudo apresentado, as amostras de EBDS foram inseridas em paraformaldeído, desidratadas e embutidas em parafina. Eles foram armazenados à temperatura ambiente e resfriados antes da secção. Em um armário de aquecimento, fatias de 2 μm foram mantidas durante a noite e coradas usando hematoxilina convencional e eosina4 (ver Tabela de Materiais).
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Representative Results
A Figura 1A mostra a EBDS de um neonato murino, que foi dissecado com a técnica descrita. Microscopicamente, nenhum outro tecido hepático é visível. O tecido hepático foi removido durante as etapas finais de isolamento do protocolo e pode ser facilmente distinguido do tecido do ducto biliar em relação à cor e consistência. A Figura 1B mostra a amostra isolada em comparação com uma escala milimétrica. O comprimento da EBD (medido da vesícula biliar à papila duodenal) é inferior a 10 mm. O diâmetro do muito delicado Ductus choledochus variou de 0,05-0,2 mm. A Figura 2 mostra a coloração hematoxilina-eosina de uma seção longitudinal da EBDS com lúmen aberto. Os colangiócitos podem ser identificados em torno do lúmen como uma monocamada e tingidos mais escuros. A microscopia foi realizada com ampliação de 20x. Os números mostram que o uso do protocolo de dissecção descrito permite ao operador dissecar microscopicamente a EBDS perto das margens do duto, mesmo em camundongos neonatais. As amostras foram coletadas de neonatos murinos de 9 dias de idade.
Figura 1: Dissecção da EBDS . (A) Amostra final de EBDS de um neonato murino. (1) Vesícula biliar, (2) Ductus cysticus, (3) Ductus hepaticus dexter, (4) Ductus hepaticus sinistro, (5) Ductus hepaticus communis, (6) Ductus choledochus, (7) Duodenum. Barra de escala = 500 μm. (B) Dimensão do tamanho da EBDS dissecada em comparação com uma escala milimétrica. Barra de escala = 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Seção longitudinal da EBDS. A coloração de hematoxilina-eosina mostra EBDS contendo um lúmen aberto. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 1 Suplementar: Desenvolvimento do peso dos neonatos C57BL/6 até o nono dia de vida. Os neonatos foram pesados até duas vezes ao dia. Os dados fornecidos mostram o peso dos animais controle (n = 5). Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Este artigo relatou e discutiu a criação e validação de uma nova abordagem cirúrgica para a remoção da EBDS de camundongos neonatais eutanasiados. Os achados microscópicos e histológicos revelam que a abordagem detecta rapidamente as EBDs e as disseca perto das margens do ducto, mesmo em camundongos neonatais. Apenas instrumentos cirúrgicos e um microscópio com ampliação de 20x são necessários para o protocolo descrito. Além disso, a abordagem permite o isolamento de toda a EBDS. A técnica é altamente eficiente, direta e simples de replicar.
Para o estudo de doenças do ducto biliar, como atresia biliar, PSC e PBC, a extração mecânica de todo o sistema de ductos biliares é frequentemente necessária. Devido ao pequeno tamanho, especialmente em neonatos, é difícil dissecar, processar e analisar. O isolamento de células ductais extra-hepáticas de EBDs de camundongos recém-nascidos de 1 dia de idade já foi estabelecido, no entanto, o método tem sido descrito como difícil. Geralmente, indivíduos novos nesse procedimento têm dificuldades devido a desafios técnicos com as técnicas de dissecção, bem como a limpeza dos pequenos ductos biliares5. Portanto, o grupo de trabalho operacional investigou uma nova estratégia para preparar a EBDS em um modelo de camundongo neonatal. No presente estudo, a técnica permite uma dissecção eficiente de cada amostra. Os neonatos foram sacrificados aos 9 dias de idade e os ductos biliares foram colhidos conforme descrito no protocolo. Além disso, a técnica também foi aplicável em neonatos mais jovens. Alguns indivíduos morreram ou tiveram que ser sacrificados antes de chegar ao nono dia, incluindo neonatos com peso inferior a 2 g (Figura Suplementar 1). Os operadores devem considerar um tempo de operação mais longo devido ao estágio neonatal de desenvolvimento. A diferenciação tecidual não é excessivamente avançada, o que complica a preparação e aumenta a dificuldade em comparação com a preparação de amostras adultas.
Outro efeito colateral em relação à dificuldade de preparo é a alta possibilidade de células indesejadas na amostra, o que poderia levar à contaminação em culturas celulares. Em contraste, a nova técnica de dissecação permite que operadores inexperientes com o equipamento necessário para remover o EBDS o mais limpo possível. Como resultado, é ainda mais crítico usar a melhor abordagem viável para a dissecção da EBD em camundongos neonatais. Se utilizado como indicado no protocolo, o equipamento atrumático, acompanhado por um tapete de espuma, não irá, ou apenas muito ligeiramente, ferir o ducto biliar. A almofada de espuma irá combater suavemente os movimentos do operador enquanto disseca o tecido indesejado, contendo células como hepatócitos e fibroblastos da EBD sem prejudicá-lo. Na verdade, até mesmo a bile pode ser preservada. Além disso, o protocolo descreve o acesso seguro ao sistema de ducto biliar devido ao progresso cauteloso camada por camada. Como resultado, anormalidades congênitas e aderências peritoneais serão visíveis antes que qualquer tecido seja danificado.
Um dos principais princípios cirúrgicos durante a operação com o objetivo de remoção (por exemplo, ressecção tumoral ou colecistectomia em indivíduos vivos) é poupar o máximo de tecido saudável possível. A aplicabilidade desse princípio precisa ser solicitada para a execução do preparo cirúrgico em camundongos eutanasiados. Para a dissecção da EBD, optou-se por não poupar o tecido hepático, mas sim realizar um EbR do EBDS, fígado e corpo duodenal, o que se mostrou uma grande vantagem técnica e menos difícil do que a remoção exclusiva da EBD da cavidade abdominal. Após o EbR, a amostra em bloco foi transferida para um tapete de espuma para movimentação do tecido hepático e restos contaminantes.
O uso de técnicas cirúrgicas alternativas para remover o sistema completo do ducto biliar extra-hepático não pode ser considerado para a preparação de camundongos após a eutanásia. A razão para isso é a sequência de movimentos de operação; A preparação de cima para baixo, como o nome indica, começa no topo (neste caso, a vesícula biliar) e progride para a junção do duodeno e do Ductus choledochus. Para começar, remova a vesícula biliar do tecido hepático, depois o ducto cístico e, por último, o hepático comum e o ducto colédoco até a junção do duodeno e do ducto colédoco. Essa técnica de isolamento utilizada no intraoperatório no abdômen de camundongos neonatais resultou em lesão do ducto biliar ou enrolamento do ducto biliar isolado. O enrolamento foi causado como resultado do aperto ser muito solto. É extremamente difícil localizar o ducto biliar após o enrolamento. Tentando evitar o enrolamento em novas dissecções, o ducto biliar ou o ligamento falciforme ligado foi apertado com mais firmeza, o que interrompe o enrolamento indesejado, mas pode resultar em danos celulares com maus resultados no exame histológico subsequente. Para a dissecção da vesícula biliar única, recomenda-se a dissecção de cima para baixo.
Em uma técnica alternativa, a preparação de baixo para cima é feita na ordem oposta. A preparação começa na junção do duodeno e do Ductus choledochus. Em segundo lugar, o duodeno precisa ser puxado para baixo caudalmente usando pinça atraumática com a mão direita, causando um estiramento do ligamento hepatoduodenal e, assim, revelando o ducto biliar. Enquanto isso, use a pinça atraumática na mão esquerda para acessar a bursa omental e manter a tensão no ligamento hepatoduodenal. Começando com o duodeno, uma preparação precisa até a confluência do cístico e do ducto hepático comum é alcançável. No entanto, ao dissecar ainda mais o ducto cístico do fígado e a vesícula biliar, a tensão pode se acumular em um ponto, resultando no rompimento e enrolamento do ducto biliar. Os experimentos mostraram que a preparação de baixo para cima só é aconselhada para a dissecção do Ductus choledochus em camundongos recém-nascidos.
Para resumir, as preparações de cima para baixo e de baixo para cima demonstraram desvantagens significativas na preparação de camundongos recém-nascidos. Como resultado, o novo modelo foi desenvolvido para facilitar a dissecção da EBDS completa, o que permite identificar e transferir a localização do ducto biliar para contextos histológicos posteriormente examinados de forma confiável e eficiente.
Além das abordagens mecânica e cirúrgica, a digestão enzimática tornou-se mais relevante no processamento tecidual nas últimas décadas 5,12. Enzimas altamente purificadas fornecem uma alternativa precisa para atingir estruturas específicas sem prejudicar as células selecionadas para experimentos futuros.
O isolamento de colangiócitos extra-hepáticos e intra-hepáticos foi estabelecido com sucesso em camundongos e ratos 5,13,14,15,16. No entanto, ambas as técnicas permitem isolar células individuais quando um ducto biliar intacto é crítico para certas técnicas, em particular abordagens histológicas. Além disso, mesmo para abordagens de cultura celular, todos os estudos publicados exigem uma etapa de dissecção mecânica antes da digestão enzimática sem fornecer um protocolo detalhado passo a passo. A dissecção prévia resulta em uma redução da contaminação por cultura celular, comprovando que a técnica de dissecção será vantajosa para abordagens histológicas e experimentais diversas.
No início, a técnica pode exigir algum tempo para o treinamento. Praticar aumentará a velocidade e o resultado. Os operadores podem estar confiantes de que simplesmente seguir a abordagem passo a passo levará a uma reprodutibilidade fácil e isolamento preciso.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflito de interesses.
Acknowledgments
Os autores reconhecem Johanna Hagens, Pauline Schuppert, Clara Philippi, PD Dr. med Christian Tomuschat, Svenja Warnke, PD Dra. Diana Lindner, Prof. Dr. Dirk Westermann, Miriam Tomczak, Nicole Lüder, Nadine Kurzawa, Dra. rer nat. Laia Pagerols Raluy, Birgit Appl e Magdalena Trochimiuk por suas contribuições. Hans Christian Schmidt foi apoiado financeiramente pela Else Kröner-Fresenius-Stiftung iPRIME Scholarship (2021_EKPK.10), UKE, Hamburgo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol | CHEMSOLUTE | 11365000 | used as a dehydrating agent |
| 30 G canula | B Braun/Sterican, Melsungen Germany | 4656300 | canula for hydration of the sample |
| Air vent | C + P Möbelsysteme GmbH & Co. KG, Breidenbach, Germany | Tec-Ononmic AZ 1200 | the use of an air vent helps to avoid inhalation of formalin-containing fixatives |
| Aqua ad injectabilia Braun | B Braun, Melsungen, Germany | 2351744 | saline; Container: Mini-Plasco connect, 20 x 10 mL, sterile |
| Bigger microsurgical Forceps | DIADUST von Aesculap, Trossingen Deutschland | FD253R | straight, 180 mm (7"), platform tip, round handle, width: 0,800 mm, diamond dust coated, non-sterile, reusable optional tool for observation and every step of preparation except very final preparation; Dividing skin of the peritoneum |
| Camera “SmartCAM 5” | Basler and Vision Engineering, Send, United Kingdom | EVC131A | optional Lynx Exo camera modul: sensortype: CMOS, resolution 2560 x 1920 pixels, sensor size: 1/2"; Used for videoproduction and technical evaluation |
| Dehydration machine/Citadel 2000 Tissue Processor | Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany | 12612613 | used for automatic dehydration, short program (approx. 4.8 h) |
| Dehydration sponge | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | TT56.1 | sponge for final dissection step, other sponges/foam pads with a minimum pore size of 60 pores per inch are also suitable, the use of two foam pads per embedding cassette is recomended to cover the sample from below and above to prevent sliding through the perforation of the embedding cassettes |
| Dulbecco´s Phosphat Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Doesn´t contain Calzium or Magnesium, 500 mL |
| Embedding cassettes | Engelbrecht GmbH, Edermünde, Germany | 17990 | |
| Eosin | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | 41-6660-00 | staining solution, ready to use |
| Fine Scissors CeramaCut | FST, Heidelberg Germany | 14959-09 | Tips: Sharp-Sharp, Alloy / Material: Ceramic Coated Stainless Steel, Serrated:, Yes; Feature: CeramaCut, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 22 mm, Length: 9 cm; Skin incision, incision of the peritoneal window |
| Graefe Forceps | FST, Heidelberg Germany | 11051-10 | Length: 10 cm, Tip Shape: curved, serrated, Tip width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 x 0.7 mm, Alloy /Material: Stainless Steel |
| Hematoxylin | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | 41-5130-00 | staining solution, ready to use |
| Highresolotion microscope | Vision Engineering, Send United Kingdom | EVO503 | Capable of enlargement up to 60x magnification, only 6x to 20x magnification were used |
| Microscope | Olympus Optical CO, Ltd., Hamburg, Germany | BX60F5 | |
| Microscope Cover Glases | Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany | 101244 | 60 mm broad, made of SCHOTT D 263 glass |
| Microscope Slides | R. Langenbrinck GmbH, Emmendingen, Germany | 03-0060 | |
| Microtome | Leica, Nußloch, Germany | SM2010R | Tool for sectioning (2 µm-slices) |
| Omnifix-F 1 mL syringe | B Braun, Melsungen, Germany | 9161406V | syringe without canula |
| Paraffin | Sakura Finetec, Torrance, USA | 4511 | Tissue-Tek Paraffin Wax Tek III, without DMSO |
| Paraffin embedding machine | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | TES 99 | The embedding machine used in this study contained the following three individual modules: TES 99.420, TES 99.250, TES 99.600. The sample should be embedded in Paraffin directly after the dehydration, no interim storage in a fridge should be performed due to possible shrinking and moisture in the fridge |
| Paraformaldehyde (PFA) | Morphisto | 1176201000 | Prepare 1 mL Aliquots in 2 mL Eppendorf conical Tubes for liver samples and 0.5 mL Aliquots in 1 mL Eppendorf conical Tubes for extrahepatic bile duct samples, 4% in PBS ph 7.4 |
| Small Microsurgical Forceps | EPM (Erich Pfitzer Medizintechnik), Bütthard, Bayern, Germany | (00)165 | Round handle, straight, 0.3 mm tip, tool for observation and every step of preparation, especially useful in final preparation |
| Stainless Steel Ruler | Agntho's AB, Lidingö, Sweden | 30085-15 | 150mm With Metric & Inch Graduations |
| Surgical Scissors – Sharp-blunt for decapitation | FST, Heidelberg Germany | 14001-14 | Device for decapitation |
| Warming cabinet | Haraeus, Hanau, Germany | T 6060 | the sliced samples should be kept in the warming cabinet to ensure the attachement of the sample on the microscope slides |
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