Test di screening ad alto contenuto per l'identificazione di composti modificanti la citotossicità cellulare anticorpo-dipendenti

L'immunoterapia con anticorpi antitumorali, inibitori del checkpoint immunitario o cellule T (CAR-T) che esprimono il recettore dell'antigene chimerico rappresenta un potente approccio al trattamento del cancro ^1,2,3. Trastuzumab è un anticorpo monoclonale umanizzato anti-HER-2 (recettore 2 del fattore di crescita epidermico umano) utilizzato per il trattamento del carcinoma mammario HER-2 positivo allo stadio iniziale o metastatico, nonché del carcinoma gastrico metastatico HER-2 positivo ^4,5,6. Agisce principalmente inibendo l'effetto stimolante della proliferazione del fattore di crescita epidermico⁴. È stato riportato, tuttavia, che trastuzumab innesca efficacemente la morte delle cellule tumorali anche se le cellule tumorali hanno perso la loro reattività alla stimolazione di HER-2⁷. Questo effetto paradossale dell'anticorpo è dovuto alla citotossicità cellulo-mediata anticorpo-dipendente (ADCC)⁷. L'ADCC può essere mediato da cellule natural killer (NK), granulociti e macrofagi noti collettivamente come cellule effettrici di ADCC ^8,9. Se un anticorpo, come trastuzumab, si lega alle cellule tumorali, allora queste cellule effettrici usano i loro recettori Fc per legare la regione costante (Fc) dell'anticorpo. L'anticorpo collega le cellule tumorali e le cellule effettrici portatrici del recettore Fc, innescando il rilascio dei loro mediatori citotossici¹⁰. Le cellule natural killer rilasciano il carico citotossico dei loro granuli contenenti perforina per generare pori nella membrana cellulare bersaglio e granzima (innescando le vie di segnalazione della morte cellulare) nella sinapsi immunitaria che porta all'apoptosi delle cellule tumorali (vedi Figura 1).

Figura 1: Interazioni effettore e cellula bersaglio nell'ADCC. Il recettore Fcγ della superficie cellulare della cellula effettrice NK riconosce la regione Fc dell'anticorpo anti-HER2 trastuzumab specifico per la molecola HER2 espressa sulla superficie della cellula tumorale. Pertanto, la cosiddetta sinapsi immunologica si stabilisce tra le due cellule, inducendo l'esocitosi diretta dei granuli citotossici della cellula effettrice. Le molecole di perforina e granzima rilasciate alla fine provocano l'apoptosi della cellula bersaglio. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Diversi saggi sono stati precedentemente sviluppati per quantificare la citotossicità, incluso l'ADCC. Il gold standard è il metodo di rilascio del cromo radioattivo, in cui le cellule bersaglio sono etichettate con isotopo radioattivo ⁵¹Cr e l'ADCC è quantificato misurando la radioattività dal surnatante delle cellule bersaglio lisate¹¹. A causa degli ovvi problemi dovuti alla manipolazione, allo stoccaggio e allo smaltimento strettamente regolamentati di farmaci e rifiuti radioattivi, questo metodo è diventato sempre meno popolare tra gli scienziati della vita. Inoltre, non è nemmeno suscettibile di applicazioni ad alta produttività. La misurazione dell'attività degli enzimi (ad esempio, lattato-deidrogenasi) rilasciati dalle cellule bersaglio uccise può fornire un'alternativa non radioattiva al test ⁵¹Cr¹². Questi test, tuttavia, non riescono a distinguere tra morte delle cellule bersaglio e cellule effettrici. L'Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) si è dimostrato adatto per la quantificazione dell'ADCC¹³, ma l'apparecchiatura ECIS non è disponibile nella maggior parte dei laboratori e la tecnica non è compatibile con applicazioni/screening ad alto rendimento. Le cellule marcate con fluorescenza rappresentano un'alternativa popolare in molti saggi di biologia cellulare e sono spesso utilizzate nella citometria a flusso o nelle applicazioni basate su lettori di piastre^14,15,16. Tuttavia, questi test spesso contengono fasi di lavaggio o sono altrimenti incompatibili con applicazioni ad alta produttività (ad esempio, tecniche basate sulla citometria a flusso). Alcuni test di citotossicità popolari, che in teoria dovrebbero essere adatti per la quantificazione dell'ADCC, non riescono a determinare in modo affidabile l'efficienza dell'ADCC¹³. Recentemente, con la diffusione della microscopia confocale fluorescente, i saggi basati su immagini e ad alto contenuto stanno diventando sempre più popolari in vari settori delle scienze della vita¹⁷. Da un lato, le apparecchiature di imaging cellulare sono ora piuttosto onnipresenti, mentre, d'altra parte, i parametri morfologici virtualmente infiniti possono essere raccolti dalle immagini acquisite. Pertanto, abbiamo deciso di sviluppare un test ADCC compatibile con lo screening ad alto contenuto e di dimostrare la sua idoneità per lo screening delle librerie composte.

Qui, presentiamo un test ADCC basato su immagini e dimostriamo come questo test può essere utilizzato per lo screening ad alto contenuto (HCS) per identificare i composti modulanti ADCC. Il modello si basa sulle cellule bersaglio del carcinoma mammario JIMT-1, sulle cellule effettrici CD16.176V.NK-92 e sull'anticorpo monoclonale umanizzato anti-HER2 trastuzumab. Con questo metodo, è possibile identificare farmaci che possono migliorare l'azione di uccisione del tumore delle cellule NK o ottenere informazioni sul meccanismo dell'ADCC mediato dalle cellule NK identificando piccole molecole che interferiscono con l'ADCC. Suggeriamo che gli scienziati della vita che mirano a quantificare la citotossicità cellulo-mediata con particolare riguardo all'ADCC possono trarre beneficio dall'uso di questo test sia per la scienza della scoperta che per lo sviluppo di farmaci. Questo test può essere un'alternativa se un laboratorio ha accesso e una certa esperienza nell'imaging fluorescente e nell'analisi quantitativa delle immagini.

NOTA: i passaggi chiave del flusso di lavoro del test sono presentati nella Figura 2.

Figura 2: Flusso di lavoro della schermata ADCC. Le cellule bersaglio JIMT-1-EGFP seminate in 96 piastre HCS sono trattate con farmaci della libreria composta. A loro volta, vengono aggiunte cellule NK (effettrici) non colorate e trastuzumab e la piastra viene ripresa a 0 timepoint e dopo 3 ore di incubazione. La valutazione dell'ADCC si basa sulla variazione del numero di cellule bersaglio vitali (aderenti alla superficie). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

1. Rivestimento della piastra HCS

1. Rivestire le piastre di screening ad alto contenuto (HSC) a 96 pozzetti con terreno JIMT-1 da 50 μL/pozzetto (terreno DMEM/F-12 integrato con siero bovino fetale al 20% (FBS), insulina 0,3 U/mL (100 UI/ml, Humulin R e 1% penicillina-streptomicina).
2. Posizionare la piastra in un incubatore di CO₂ per 1 ora.
   NOTA: Il rivestimento è fondamentale per attaccare le celle JIMT-1 alla superficie di vetro della piastra.

2. Semina di cellule JIMT-1 Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP)

NOTA: Le cellule JIMT-1 che esprimono EGFP sono state generate nel nostro precedente lavoro¹⁸ e le cellule sono state coltivate in flaconi di coltura tissutale T25 in terreni JIMT-1 (vedere la composizione nel passaggio 1.1).

1. Lavare le cellule con 2 ml di PBS sterile.
2. Aggiungere 1 mL di tripsina-EDTA al matraccio e rimetterlo in un incubatore di CO₂ per 10 minuti.
3. Dopo l'incubazione, toccare il pallone per verificare se le cellule JIMT-1 sono staccate.
4. Interrompere la digestione con 2 mL di mezzi JIMT-1 e raccogliere la sospensione cellulare in un tubo da 15 ml.
5. Contare le cellule con 0,4% di blu tripano (80 μL del colorante + 20 μL della sospensione cellulare) in una camera Bürker e regolare il numero di cellule a 133.000 cellule / ml.
6. Aspirare il mezzo di rivestimento dalla piastra a 96 pozzetti (passo 1.2).
7. Pipettare 75 μL della sospensione cellulare su ciascun pozzetto delle piastre HCS (vedere Tabella dei materiali).
8. Consentire alle cellule di attaccarsi durante un'incubazione notturna a 37 °C in un incubatore a CO₂ .

3. Pretrattamento delle cellule JIMT-1 EGFP con la libreria di composti

1. Aspirare il mezzo dalle cellule JIMT-1 e aggiungere 50 μL/pozzetto di terreno JIMT-1 fresco ai pozzetti. Trasferire la piastra al laboratorio di screening ad alta produttività.
   NOTA: L'utilizzo di un robot per la gestione dei liquidi rende l'aggiunta di librerie di composti più efficiente e riproducibile.
2. Trasferire i composti in esame dalla piastra di libreria del composto alla piastra di analisi con uno strumento a perno calibrato su un volume di 25 nL. Esegui questa operazione quattro volte. Quattro cicli di trasferimento danno un volume finale di 100 nL (e una concentrazione finale di 20 μM).
3. Tra un passaggio e l'altro, lavare lo strumento perno, prima con il 50% di DMSO e poi con il 70% di etanolo.
4. Incubare le piastre per 1 ora in un incubatore a CO₂ a 37 °C.

4. Avvio del test ADCC aggiungendo le cellule effettrici

NOTA: Le cellule CD16.176V.NK92 (di seguito denominate cellule NK92) sono state coltivate in α-MEM integrate con 20% FBS, 1% MEM-NEAA, 1% Na-piruvato, 1% glutammina, 1% penicillina-streptomicina e 100 UI/mL IL-2.

1. Contare le cellule NK92 con blu tripano (80 μL del colorante + 20 μL della sospensione cellulare). Regolare il numero di celle a 400.000 celle/ml.
2. Centrifugare 4 mL della sospensione cellulare a 150 x g per 3 minuti a temperatura ambiente.
3. Preparare il mezzo ADCC aggiungendo 20 μg/mL di anticorpo anti-HER2 (trastuzumab) al mezzo JIMT-1.
4. Risospendere il pellet della cella NK in 5 mL di terreno ADCC.
5. Pipettare 20.000 cellule NK in 50 μL di terreno ADCC fino alle cellule JIMT-1 target. Il volume finale è di 100 μL e la concentrazione finale di trastuzumab è di 10 μg/ml.
6. Posizionare la piastra di analisi nell'apparecchiatura di analisi ad alto contenuto con un incubatore incorporato impostato a 37 °C.

5. Imaging

NOTA: Le lastre devono essere visualizzate in due punti temporali, in primo luogo, immediatamente dopo l'aggiunta delle cellule effettrici alle cellule bersaglio e in secondo luogo, a 3 ore dopo l'aggiunta di cellule NK. Per l'imaging, è possibile utilizzare l'analizzatore ad alto contenuto e il suo software o alternative adeguate (vedi Tabella dei materiali).

1. Selezionare Tipo di piastra (96-well cell carrier ultra) dall'elenco delle piastre.
2. Selezionare l'autofocus a due picchi se il test viene eseguito in lastre.
3. Usa l'obiettivo 10x in modalità non confocale.
4. Selezionare Binning 2 per raddoppiare il rapporto segnale/rumore.
5. Immagini in campo chiaro a 650-760 nm e immagini fluorescenti delle celle JIMT-1 trasdotte da EGFP a lunghezze d'onda di 488 nm (eccitazione) e 500-550 nm (emissione).
6. Selezionare il numero di campi e il numero di punti temporali per l'imaging.

6. Analisi delle immagini

NOTA: Per analizzare l'efficienza dell'ADCC, vengono contate le cellule JIMT-1 vitali. Le cellule bersaglio uccise dall'ADCC si staccano dalla superficie e si allontanano dal piano focale del microscopio. Pertanto, la differenza tra il numero di cellule vitali all'inizio e alla fine della reazione ADCC corrisponde alle cellule bersaglio eliminate dall'ADCC. Per mostrare come costruire la sequenza di valutazione, nel video viene mostrato un pozzetto ADCC di controllo.

1. Utilizzare il modulo Trova celle per rilevare le regioni dell'immagine corrispondenti alle celle.
   NOTA: Ogni cellula viene rilevata come una regione dell'immagine con un'intensità di fluorescenza superiore rispetto all'ambiente circostante.
2. Selezionare le celle utilizzando l'algoritmo M integrato con un diametro minimo di 80 μm.
3. Impostate Sensibilità di divisione, che suddivide un oggetto di grandi dimensioni in oggetti più piccoli, su 0.5.
4. Imposta la soglia comune (il livello più basso di intensità dei pixel) su 0.
5. Escludere il rilevamento dell'area di fondo con alta intensità di fluorescenza EGFP in due fasi.
   1. Innanzitutto, utilizzare la funzione Calcola proprietà intensità per determinare l'intensità di fluorescenza EGFP nella regione Celle selezionata in precedenza.
   2. Impostare la soglia di intensità minima e massima utilizzando l'opzione Seleziona popolazione .

Per dimostrare come funziona il test nella vita reale, abbiamo creato una libreria di test di 16 composti selezionati casualmente dagli scaffali di laboratorio (Figura 3). Inoltre, il DMSO è stato incluso anche come controllo negativo e tre composti inibitori della polimerizzazione dei microtubuli (colchicina, vincristina e podofillotossina) come controlli positivi. Ci si aspettava che questi ultimi inibissero l'ADCC interferendo con la migrazione delle cellule NK verso le cellule tumorali e la degranulazione delle cellule NK. Tutti i composti di prova e il DMSO sono stati posizionati sulla piastra della libreria di prova in quadruplicati e il DMSO è stato aggiunto anche alla prima e all'ultima colonna della piastra (Figura 3).

Figura 3: La libreria di composti utilizzata per testare il test HCS ADCC . (A) Viene mostrata la mappa delle lastre della libreria di composti. Ogni composto è presente sulla piastra della libreria in quadruplicati. DMSO è stato aggiunto come controllo negativo alla prima e all'ultima colonna della piastra. I pozzetti contenenti DMSO e i tre inibitori dell'assemblaggio dei microtubuli (colchicina, vincristina e podofillotossina) sono evidenziati a colori. (B) Sono presentati i nomi, le posizioni delle piastre e i nomi abbreviati dei composti in esame. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Utilizzando la nostra libreria di test, abbiamo eseguito il test e valutato i risultati come descritto nel protocollo. Poiché le cellule JIMT-1 esprimono EGFP, possono essere facilmente distinte dalle cellule effettrici che non sono fluorescenti. Il test si basa sulla rilevazione del cambiamento nel numero di cellule bersaglio aderenti alla superficie (vitali). Nelle nostre condizioni di analisi, le cellule NK hanno causato circa il 50% di morte cellulare JIMT-1 (+gruppo NK), mentre nessuno dei composti in esame ha causato alcuna tossicità in assenza di cellule NK (gruppo -NK) (Figura 4). Le condizioni del test sono state precedentemente ottimizzate per raggiungere questo livello medio di citotossicità18, supponendo che ciò avrebbe permesso l'identificazione sia dell'attivatore dell'ADCC che dei composti inibitori. Gli inibitori dell'assemblaggio dei microtubuli di controllo positivo si sono presentati come "colpi" in tutte le posizioni quadruplicate come previsto, indicando l'elevata affidabilità del test (Figura 4).

Figura 4: Test di una libreria di composti nel modello ADCC. (A) Le immagini delle reazioni ADCC sono state prese 3 ore dopo la co-incubazione delle cellule NK e delle cellule JIMT-1 in presenza di DMSO con l'obiettivo 10x dell'imager HCS. (La barra della scala è 200 μm.) Una parte dell'immagine è ingrandita, mostrando le cellule NK effettrici non colorate e le cellule JIMT-1 bersaglio trasdotte da EGFP. (L'ingrandimento dell'immagine originale è 4x, la barra della scala è 50 μm.) (B) Il test ADCC è stato eseguito con linea cellulare di carcinoma mammario JIMT-1 trasdotta da EGFP e linea cellulare CD16.176 V.NK-92. Il rapporto effettore/target (E:T) applicato era 2:1. Nel caso del gruppo -NK, le cellule EGFP JIMT-1 sono state incubate senza cellule NK e anticorpo anti-HER2, mentre nel gruppo +NK (ADCC) 10 μg/mL di trastuzumab sono stati aggiunti alle co-colture di cellule JIMT-1 e NK. Il numero di cellule vitali JIMT-1-EGFP è stato rilevato utilizzando apparecchiature di analisi ad alto contenuto immediatamente dopo l'aggiunta di cellule NK e dopo 3 ore di incubazione. La vitalità delle cellule bersaglio nel gruppo +NK era del 50% di quella nel gruppo -NK. La linea tratteggiata rossa mostra il valore soglia, che rappresenta i campioni con una vitalità del ≥70% rispetto alla media delle uccisioni di controllo DMSO (n = 20). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Gli autori non segnalano alcun conflitto di interessi.