Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Erytrocytsedimenteringshastighet: En fysikdriven karakterisering i ett medicinskt sammanhang

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/64502
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,3
1Experimental Physics, Saarland University, 2Department of Physics and Materials Science, University of Luxembourg, 3Theoretical Medicine and Biosciences, Saarland University

Summary

Erytrocytsedimenteringshastighet (ESR) är en fysisk parameter som ofta används vid rutinmässiga hälsokontroller och medicinsk diagnos. En teoretisk modell som gör det möjligt att extrahera fysiskt meningsfulla parametrar från hela sedimentationskurvan, baserad på modern kolloidal kunskap, har nyligen utvecklats. Här presenterar vi ett protokoll för att automatiskt samla in ESR över tid och extrahera parametrarna för den senaste modellen från denna automatiserade datainsamling. Dessa förfinade parametrar kommer sannolikt också att förbättra det medicinska vittnesmålet.

Abstract

Erytrocyt (eller röda blodkroppar) sedimenteringshastighet (ESR) är en fysisk härledd parameter av blod som ofta används vid rutinmässiga hälsokontroller och medicinsk diagnos. Till exempel, vid inflammation, observeras en högre ESR på grund av den associerade ökningen av fibrinogen och andra plasmaproteiner. Man trodde att denna ökning berodde på bildandet av större aggregat av röda blodkroppar (RBC) orsakade av ökningen av fibrinogen. Faktum är att fibrinogen är en agentfrämjande aggregering av röda blodkroppar och i Stokes-regimen antas observeras i blodstörre aggregatsediment snabbare. Alla modeller av ESR-mätningar baserade på denna hypotes kräver dock ytterligare specifika fysiska antaganden, som inte krävs i något annat system. Dessutom har moderna studier inom kolloidala suspensioner visat att attraktiva partiklar bildar perkolerande aggregat (dvs. aggregat så breda som behållaren). Sedimenteringen av dessa kolloider följer sedan en så kallad "kolloidal gelkollaps". Nyligen har det visat sig att RBC faktiskt följer samma beteende. Denna hypotes gör det också möjligt att effektivt och analytiskt modellera sedimenteringskurvan för röda blodkroppar, från vilken robusta och fysiskt meningsfulla deskriptorer kan extraheras. Detta manuskript beskriver hur man utför en sådan analys och diskuterar fördelarna med detta tillvägagångssätt.

Introduction

Erytrocytsedimenteringshastigheten (ESR) är ett medicinskt kliniskt verktyg in vitro, formellt introducerat i evidensbaserad medicin under det tjugonde århundradet 1,2,3,4. Det används för närvarande över hela världen som ett ospecifikt inflammatoriskt test, eller för att övervaka utvecklingen av vissa specifika tillstånd 5,6,7,8. Detta beror främst på en ökning av fibrinogenkoncentrationen, men även i andra plasmakomponenter såsom IgM 1,9,10,11. Enligt det nuvarande Westergren-standardprotokollet rapporteras ESR-värden som mätning av det cellfria plasmaskiktet vid en given tidpunkt (30 min eller 1 h) efter att ha lämnat ett vertikalt rör med en typisk storlek på 20 cm vertikalt i vila12. Denna mätmetod har dock kritiserats eftersom kvalitativt olika steg i sedimenteringsprocessen har rapporterats, inklusive en fördröjning innan maximal sedimenteringshastighet13 uppnås. Denna fördröjning varar mer än 1 h i ungefär hälften av friska prover14. Hastigheten under denna fas följer en annan skalning än under den andra, snabbare fasen av sedimenteringen15. Genom att begränsa avläsningen till den genomsnittliga sedimenteringshastigheten under den första timmen jämförs sedan en annan blandning av olika blodegenskaper mellan olika individer.

Dessutom har det nyligen visat sig att de vanliga teoretiska övervägandena bakom detta protokoll var felaktiga16,17,18. Vid fysiologisk hematokrit (över cirka 25%) sedimenterar röda blodkroppar (RBC) inte som separata aggregat, utan snarare som ett kontinuerligt, så kallat perkolerande nätverk av RBC 17,18, som lyder en annan uppsättning fysiska ekvationer än den vanligtvis nämnda Stokes sedimentation 16,17. Det har visat sig att betraktandet av en fysisk beskrivning baserad på de tidsupplösta mätningarna av sedimentationen (hela kurvan) var mer robust i vissa nya medicinska sammanhang19,20. Dessutom kan dessa mätningar användas för att belysa de fysiska mekanismerna som förändrar ESR i patologier där cellformer förändras19,20. Dessutom kan en långsam ESR ha en användbar medicinsk tolkning, vilket indikeras i mätningarna av en kohort av patienter med neuroacanthocytossyndrom19,20. Denna artikel granskar hur man praktiskt implementerar mätningen av fysiskt meningsfulla parametrar, baserat på hela ESR-kinetiken. Mer exakt extraherar metoden som presenteras här den maximala sedimenteringshastigheten Um, vars värde kan korrigeras för att överväga effekten av hematokriten hos givaren16,17. Denna parameter är mer exakt och därmed mer tillförlitlig än den traditionella mätningen16,17,19,20.

Dessutom, i viss grundläggande forskning, istället för att övervaka inflammationstillståndet hos en given patient, är det intressant att utesluta effekten av hematokrit på ESR 21,22,23, eller att undersöka rollen av RBC i en modifierad ESR 19,20,24,25 mellan olika givare. Det kan vara användbart att jämföra prover som inte är direkt fullständiga blodprover från patienter. Därför kan resuspendering av röda blodkroppar med en kontrollerad hematokrit i autolog plasma, eller i ett plasmasubstituent, användas som det första steget i ESR-mätningen. Exempelvis ger lösningar av Dextran 70 kDa med en koncentration på 55 mg/ml i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) ett sedimentationsintervall inom kontrollområdet för friska celler19. Detta manuskript visar också hur sådana steg bör genomföras, och att den presenterade analysen också är relevant i dessa fall.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Blodprovsinsamling och experiment godkändes av "Ärztekammer des Saarlandes", etik votum 51/18, och utfördes efter att informerat samtycke erhölls enligt Helsingforsdeklarationen. Standardmätningar bör utföras med etylendiamintetraättiksyra (EDTA)-antikoagulerat blod (standard EDTA-koncentration på 1,6 mg/ml blod, europeisk norm NF EN ISO 6710), i Westergren-rör. Volymen som krävs för att fylla Westergren-röret beror på tillverkaren (eftersom nedre delar ibland innehåller en bredare behållare); Volymen bör vara ca 1 ml fullblod och 800 μL för rören som anges i materialtabellen. Metoden som beskrivs nedan är dock giltig oavsett den specifika suspensionen och behållarformen, så länge hematokriten hos de undersökta proverna är högre än 25%16. Volymer, behållare, suspenderingsmedium och tillsatser bör därför väljas i enlighet med de specifika målen för den utförda forskningen.

1. Experiment och mätningar

OBS: Anteckna provets sedimenteringshastighet varje minut.

  1. Provberedning (om så krävs): Om en kontrollhematokrit eller suspenderande vätska krävs, börja med att tvätta cellerna och förbereda proverna (som ett exempel visar vi hur man förbereder prover med olika fibrinogennivåer genom att blanda autologt serum och plasma). Serum kan faktiskt approximeras som fibrinogenfri plasma26,27 och kan användas för att minska aggregeringen av röda blodkroppar, under annars fysiologiska förhållanden. För att bereda flera prover, samla blodet i standard EDTA-rör på 9 ml och serumet i standardserumrör (med kiseldioxidpärlor som koagulationsaktivatorer) på 9 ml.
    1. Centrifugera blodproverna (dvs. 9 ml standard EDTA- och serumrör i det valda exemplet) vid 3 000 x g i minst 7 minuter för optimal komprimering av de packade erytrocyterna. Byt ut supernatanten mot PBS eller önskad suspenderande vätska, om en tillräcklig mängd finns tillgänglig. Om det helt enkelt krävs för att kontrollera hematokriten i autolog plasma, fortsätt direkt till steg 1.1.3. Annars blanda försiktigt efter att supernatanten har inkluderats för tvätt.
    2. Upprepa tre gånger. Utför den sista tvätten med önskad suspenderingsvätska i alla fall.
      1. Bered i det valda exemplet blandningar av autolog plasma och serum med bestämda proportioner (t.ex. 25 %/75 %, 50 %/50 % eller 75 %/25 % plasma-serumvolymfraktion). Till exempel, vid framställning av 2,5 ml av 25% / 75% plasma-serumblandningen, tillsätt 0,625 ml plasma till 1,875 ml serum.
    3. Extrahera den önskade volymen packade celler och suspendera den i önskad vätska. Bearbeta de packade cellerna som en högviskös vätska (med standardpipettering och/eller omvänd pipettering eller en deplacementpipett28). I det valda exemplet, för ett 4 ml prov vid en hematokrit på 45%, suspendera 1,8 ml packade celler inom 2,2 ml av plasma-serumblandningen.
  2. Om provets hematokrit inte kontrolleras, bestäm det genom höghastighetsmikrocentrifugering (andra standardmetoder är också lämpliga).
    1. Extrahera den erforderliga mängden prov för hematokritbestämning: fyll mikrohematokritkapillärerna genom att nedsänka dess nedre spets i vätskan. Stoppa den genom att täcka den övre öppningen när den erforderliga mängden prov stiger i röret genom kapillärsugning.
    2. Försegla kapillärerna med tätningsvax. Placera dem i mikrohematokritcentrifugen och kör den vid 15 000 x g (12 000 rpm) i 5 minuter eller enligt tillverkarens instruktioner.
    3. Läs hematokritnivån på kapillären och skriv ner den som referens.
  3. Sätt upp en kamera för att registrera provernas sedimentering. Undvik att minnet överbelastas eller batteriet töms genom att strömförsörja enheten från elnätet och spara bilderna direkt på en dator eller extern hårddisk.
    1. Ställ in en stadig kamera framför hållaren där ESR-rören kommer att lämnas i vila. Använd en vit, upplyst bakgrund (vita pappersark i bakgrunden fungerar perfekt).
    2. Använd tomma Westergrenrör, gärna utan markeringar, ställ in kamerans fokus och synfält för att få högsta upplösning där proverna ska placeras. Se helst till att bildernas gränser är inriktade i vertikal och horisontell riktning.
    3. Ta en bild av ett skalat rör för att extrahera pixelupplösningen. Användning av RGB-bilder rekommenderas.
    4. Ställ in ljuset och exponeringstiden för kameran så att den har en vit bakgrund, men ingen mättnad. Exemplet i figur 1 har tagits med en Canon EOS M50, med en exponeringstid på 1/15s, en bländare på F8.0, volfram vitbalans, i enkelbildsläge med manuell fokusering och en ISO-hastighet på 1 000.
  4. Förbered och placera ESR-rören.
    1. Fyll Westergrentubens bottenbehållare med den volym som motsvarar tillverkarens anvisningar. Sätt i Westergren-röret i bottenbehållaren enligt tillverkarens anvisningar.
    2. Så snart det första röret är klart, placera det i hållaren och starta kamerainspelningen. Att spela in en bild varje minut ger vanligtvis en bra upplösning av ESR-kinetikkurvan.
    3. Förbered och placera nästa prover. Se till att inte stå framför något prov när en bild tas.
    4. Låt mätningarna pågå i minst 2 timmar för att jämföra med standardmätningarna vid 30 min, 1 och 2 timmar. Det är emellertid också bättre att se mättnaden och arresteringen av sedimenteringen. För friska prover, eller vid inflammation, är registreringen av proverna över natten, mellan 12 och 24 timmar, mer än tillräcklig eftersom krökningen av de snabbaste proverna är synlig inom 3 h13,19. Om ett tillstånd minskar sedimentationshastigheten, vilket en minskning av fibrinogenkoncentrationen gör (dvs. i det valda exemplet hög serumvolymfraktion), kan registreringar på 50 timmar eller mer krävas för att få den mest exakta informationen16,19.

2. Bildanalys

OBS: När bilderna har spelats in, extrahera ESR-kurvan. Ett exempel på Matlab-kod tillhandahålls som kompletterande fil 1 (MatlabCodeImageAnalysisSampled.m).

  1. Välj eller identifiera ett område av intresse (ROI) där endast ett rör är synligt, varvid den nedre gränsen är belägen under det lägsta läget för det erytrocytcellfria plasmagränssnittet men inom provet (se figur 1A, B). Om det behövs roterar du bilden så att den lodräta riktningen justeras längs bildens första komponent.
  2. Konvertera avkastningen på RGB-bilden till en gråskalebild eller matris Gr. Vanligtvis är det mycket effektivt att kombinera trefärgskanalerna (röd [R], grön [G] och blå [B]) som Gr = 2 * R - B - G med en tydlig bakgrund (se figur 1C och MatlabCodeImageAnalysisSampled.m-linjerna 121-128).
  3. Binarize bilden. För ett felfritt prov ger användning av Otsu-tröskeln29 vanligtvis ett konsekvent resultat (se figur 1D och rad 133 i MatlabCodeImageAnalysisSampled.m). För prover med hög hematokrit eller med viss hemolys kan det vara bättre att justera det manuellt eller använda en annan automatisk metod (som görs i raderna 129-131 i MatlabCodeImageAnalysisSampled.m), beroende på den exakta kontrasten som erhålls mellan de olika faserna inuti röret.
  4. Hämta medelvärdet av pixelvärdena (eller elementen) för Gr längs den vågräta riktningen. Det här steget minimerar bruset och beräknar effektivt de möjliga oregelbundenheterna i gränssnittet (se bild 1E och MatlabCodeImageAnalysisSampled.m rad 137).
  5. Innan du beräknar variationerna, jämna ut kurvan med ett glidande medelvärde, särskilt om rören innehåller några horisontella markeringar (se figur 1F). För de angivna exemplen användes ett rörligt fönster på ~2,5 mm (50 pixlar) för den här processen (se rad 138 i MatlabCodeImageAnalysisSampled.m). Identifiera sedan gränssnittspositionen som den punkt med störst intensitetsvariation (se figur 1G).
  6. Upprepa för varje bild och varje prov. För varje prov, spara positionerna för gränssnittet längs tiden i ett lämpligt format för att passa den fysiska modellen med lämplig programvara.

3. Anpassning av den fysiska modellen

  1. Med hjälp av någon lämpligt passande programvara, som känner till hematokriten och den initiala höjden på blodkolonnen h 0, hitta värdena för fördröjningstiden t0, den dimensionslösa tiden γ och den slutliga packade volymfraktionen Φmav erytrocyterna som minimerar summan av kvadrerade restavvikelser för den fysiska modellen17. En Matlab-kod (ShapeAnalyzerIntegrated.m) tillhandahålls som kompletterande fil 2 som ett exempel på hur du utför en sådan passning. Se Kompletterande fil 2 för ytterligare instruktioner. Som beskrivits någon annanstans16,17, erytrocyter vid fysiologiskt hematokritsediment som en mjuk partikelgel, där de viktiga fysikaliska parametrarna är skillnaden i densitet mellan plasma och RBC hos givaren Δρ, RBC-karakteristikdiametern rRBC, plasmaviskositeten vid rumstemperatur η och donatorns hematokrit Φ . Med hjälp av dessa parametrar, och förutsatt att gravitationsspänningen är den huvudsakliga drivprocessen för plasman att strömma uppåt genom det porösa nätverket som bildas av erytrocyterna efter en fördröjningstid t0, får man den tidsmässiga utvecklingen16,17:
    Equation 1
    med Equation 2, Equation 3, och Equation 4 är den genomsnittliga skivradien för en erytrocyt. Ett exempel på en Matlab-kod som utför detta tillhandahålls som en bilaga (ShapeAnalyzerIntegrated.m passar funktionen definierad i SedimFit.m [kompletterande fil 3]). Alternativt kan G/γ också användas direkt som en passningsparameter med enheter på 1/t.
  2. När den kvantitativa kurvan har extraherats från bilden, spara de fysiska parametrarna i provet. Traditionella ESR-värden vid 30 min, 1 h eller 2 h kan fortfarande extraheras från kurvan för referens (se ShapeAnalyzerIntegrated.m raderna 123-132).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ett exempel på en korrekt förvärvad bildsekvens tillhandahålls som kompletterande film 1 (film1.avi). En serie karakteristiska passformer av modellen visas för olika förhållanden i figur 2. Fibrinogenkoncentrationen bestämdes utifrån fibrinogenkoncentrationen i plasma Fib0, förutsatt att serumet inte har något fibrinogen alls. Därför är Fib = C Fib0, där C är plasmavolymfraktionen i plasma-serumblandningen. I tidigare studier16 bestämdes Fib0 med standardmetoder i laboratoriet för klinisk kemi vid Saarlands universitetssjukhus (Homburg, Tyskland). Om det är nödvändigt att mäta en sådan mängd oberoende av varandra, innefattar en lämplig metod för att bestämma fibrinogenkoncentrationen (halv)automatiserade kulkoagulometrar, vilket också kan kräva att ett citrat-antikoagulerat blodprov erhålls från givaren30. ESR-kurvorna från de studier som genererade dessa kurvor kunde utrustas med en Pearson-koefficient R 2 [0,974, 0,9996], med ett genomsnitt på 0,996 och en standardavvikelse på 0,004 (endast en kurva av 35 gav en R2Equation 11-< 0,99). De parametrar som slutligen extraheras är den slutliga hematokriten i RBC-fasen Φm, fördröjningstiden t0-som krävs för att gelén ska spricka och börja kollapsa - och den maximala momentana hastigheten Equation 6, uppnådd i början av kollapsen. Den dimensionslösa parametern γ är associerad med inversen av porområdet i komprimeringsnätverket av RBC (uttryckt i multiplar av partikelradie), Δρ är skillnaden i densitet mellan givarens plasma och RBC, a är RBC-karakteristikdiametern, η är plasmaviskositeten vid rumstemperatur och Φ är givarens hematokrit. Passningen utförs faktiskt genom att fixera Δρ,a,η och Φ och sedan bestämma de bästa γ, Φm och t0. Hematokriten bör bestämmas oberoende via en annan standardmetod, medan den andra kan fixeras till standardvärden (ΔρEquation 10080 kg / m3 31,32, ηEquation 100 1,5 mPa s 33 och aEquation 1004 μm). Varje avvikelse från de andra parametrarna skulle helt enkelt ändra det fastställda värdet för γ med en motsvarande faktor, men skulle inte ändra den slutliga bestämningen av Um, som då är en robust parameter i detta avseende.

Samlingar av parametervärden som samlats in i tidigare grundläggande studier, som visar parametrarnas trender som en funktion av hematokrit- och fibrinogennivåerna, visas i figur 3 och figur 4.

Figure 1
Figur 1: Bildbehandling . (A) Idealisk vy av flera prover, med relevanta avkastningar, markerade för ett prov. (B) Zooma på vald ROI. (C) Omvandling av den färgade avkastningen till grånivå. (D) Binariserad bild erhållen med Otsu-tröskeln. (E) Den binära bildens horisontella genomsnittliga intensitet som en funktion av höjden (enligt den vanliga konventionen i bildbehandling anses ursprunget vara överst i bilden; se även steg 2.4 i protokollet.) (F) Utjämnad intensitet genom att utföra ett glidande medelvärde på ett vertikalt område med 50 pixlar (se även steg 2.5 i protokollet). (G) Variationer av den utjämnade intensiteten längs den vertikala riktningen. Positionen för det absoluta maximala värdet tas som gränssnittets position (se även steg 2.5 i protokollet). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Karakteristiska passningar. (A) Kurvor och passformer erhållna för en frisk givare, med olika justerade hematokriter. Kurvorna är anpassade från en tidigare studie17. (B) Kurvor och passningar som erhållits för en frisk givare, med olika fibrinogenkoncentrationer. Olika fibrinogenkoncentrationer erhölls genom att blanda autolog plasma och serum i olika proportioner. Kurvorna och data är från en tidigare studie16. Felstaplar (hämtas från pixelupplösning eller passningsstatistik) är mindre än symbolstorleken. Siffrorna har tryckts om med tillstånd från Dasanna et al.16 (18 prover från fyra oberoende blodteckningar) och Darras et al.17 (16 prover från sju oberoende blodteckningar). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Karakteristiska värden för de extraherade parametrarna för olika hematokriter . (A) Variation av den extraherade maximala sedimentationshastigheten Umsom en funktion av provhematokriten Φ. Cirklar är individuella mätningar; Olika färger är relaterade till olika friska givare. Den kontinuerliga röda linjen är den trend som förutsägs av modellen, erhållen med medelvärdena Φm och γ. Det korrigerade värdet på Umför en hematokrit av Φ = 0,45 visas också, både som trianglar för enskilda värden och som en rak linje för modellens förutsagda konstant. Detta korrigerade värde har beräknats enligt modellen som Equation 10. b) Värden som erhållits för parametern γ. (C) Värden erhållna för parametern Φm. d) Värden som erhållits för parametern t0. Felstaplar för enskilda data som hämtas från anpassningsstatistik är mindre än symbolstorleken. Denna siffra har anpassats med tillstånd från Darras et al.17. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Karakteristiska värden för de extraherade parametrarna för olika fibrinogenkoncentrationer . (A) Variation av den extraherade maximala sedimentationshastigheten Umsom en funktion av provets fibrinogenkoncentration. Olika färger är relaterade till olika friska givare. (B) Värden som erhållits för parametern γ. (C) Värden erhållna för parametern Φm. d) Värden som erhållits för parametern t0. Felstaplar för enskilda data som hämtas från anpassningsstatistik är mindre än symbolstorleken. Denna siffra har återtryckts med tillstånd från Dasanna et al.16. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Kompletterande film 1: Exempel på en korrekt förvärvad bildsekvens. Olika provtyper visas i dessa bilder från två olika givare (samma blodgrupp). Från vänster till höger, alla prover med dubbletter: helblod från givare 1, suspension av röda blodkroppar från givare 1 i Dextran 70 kDa (55 mg/ml PBS) med kontrollerad hematokrit vid 45 %, fullblod från givare 2, suspension av röda blodkroppar från givare 2 i Dextran (45 % hematokrit), suspension av röda blodkroppar från givare 1 i plasma från givare 2 (45 % hematokrit), och suspension av röda blodkroppar från donator 2 i plasma från donator 1 (45 % hematokrit). Proverna har ett brett spektrum av sedimenteringshastigheter, och suspensionerna i Dextran visar också viss hemolys. Den tillhandahållna koden MatlabCodeImageAnalysisSampled.m analyserar dock effektivt dem alla. Klicka här för att ladda ner den här filmen.

Kompletterande fil 1: MatlabCodeImageAnalysisSampled.m. Huvudkod som används för bildanalysen (steg 2 i protokollet). För att köra koden på en viss enhet bör rad 8 ändras. Den ska innehålla sökvägen till mappen som innehåller bilderna på Westergrenrören som ska analyseras och slutar med prefixet på bilderna, om sådana finns. En uppsättning komprimerade bilder är tillgängliga för öppen nedladdning på Zenodo (DOI: 10.5281/zenodo.7290177). Koden, och i synnerhet egenskaperna hos varje prov (definierat i raderna 14-61), har redan anpassats för att analysera dessa bilder. För den här bilduppsättningen användes prefixet "IMG_". Därför bör strängraden 8 sluta med '\IMG_' (eller '/IMG_' på Linux-system). Den sista delen av koden (raderna 166-179) plottar också automatiskt de extraherade sedimenteringskurvorna för varje prov. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil 2: ShapeAnalyzerIntegrated.m. Huvudkod som används för att passa den fysiska modellen (steg 3 i protokollet). För att köra den här koden, kopiera och klistra in den i mappen som innehåller utdatatextfilerna från MatlabCodeImageAnalysisSampled.m, tillsammans med SedimFit.m. Namnen på filerna som ska analyseras (utan .txt förlängning) ska listas i rad 9. Den ursprungliga hematokriten och rörets höjd bör också finnas i linjerna 12 respektive 15. Denna kod är redan förberedd för att analysera kurvorna extraherade från open access-bilderna på Zenodo (DOI: 10.5281/zenodo.7290177). När de ovan nämnda radkoderna har ändrats klickar du bara på knappen "Kör" i Matlab Editor-verktygsfältet. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil 3: SedimFit.m. Fysisk modell justerad av ShapeAnalyzerIntegrated.m. Denna fil är en Matlab-funktion som definierar de funktioner som är anpassade till experimentkurvorna för att extrahera de fysiska parametrarna. Den ska finnas i samma mapp som ShapeAnalyzerIntegrated.m när analysen körs. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

För att det automatiserade protokollet ska fungera effektivt är det viktigt att ha en tydlig bakgrund och korrekt belysning. En mörk bakgrund kan förhindra förekomsten av en effektiv binariseringströskel. För prover med viss hemolys, som vanligtvis uppträder (ökar) över tid, är det viktigt att först verifiera att den valda binariseringströskeln är relevant för både den första och slutliga bilden.

När det gäller binariseringsprocessen för bilden är valet av ROI och binariseringströskel det mest känsliga steget. Det kan vara användbart att manuellt testa olika tröskelvärden på tre olika bilder (i början, mitten och slutet av sedimenteringsprocessen) för att säkerställa att valet av tröskelvärde verkligen ger relevant binarisering för hela processen. Om provet upplever stark hemolys kan det vara nödvändigt att begränsa analysen av provet till början av processen, när ett tydligt gränssnitt fortfarande kan observeras. Som för alla ESR-mätningar är det också viktigt att undvika att det finns bubblor i röret. Men om några små bubblor observeras högst upp i röret kan en ROI som börjar under bubblorna och precis ovanpå det ursprungliga gränssnittet fortfarande ge den relevanta mätningen. I det här fallet är det dock viktigt att inkludera lite bakgrundsutrymme till höger och vänster om röret så att Otsu-tröskeln kan bestämmas samtidigt som man alltid överväger en betydande mängd pixlar med bakgrundsgrånivån.

Metoden, som med alla ESR-mätningar, bygger på antagandet att ett tydligt gränssnitt mellan packade erytrocyter och cellfri plasma kan ses. Om provet upplever någon signifikant mängd hemolys, eller om provets hematokrit är för utspädd (under 25%17), kommer ett sådant gränssnitt inte att observeras längre. En ESR-mätning under dessa förhållanden är då omöjlig att utföra.

Som tidigare nämnts säkerställer denna metod att tillhandahålla den relevanta hastigheten för gelkollapsen Um, vilken kan korrigeras enligt patientens initiala hematokrit17. Figur 3A, tillsammans med de råa mätningarna av Um, visar också de korrigerade värdena för en normaliserad hematokrit av Φ 0 = 0,45. Det kan ses att korrigeringen tar bort det totala beroendet av Φ0, liksom det mesta av dataspridningen. Att bestämma Umbaserat direkt på den relevanta fysiska modellen innebär också att tekniken är mer objektiv än en godtycklig kurvutjämning, med godtyckliga val av utjämningsparametrar. Bland annat har denna metod visat sig vara mer robust i medicinska sammanhang där onormalt låga ESR-värden observeras19,20.

Ett annat inneboende intresse med denna mätning är att den ger mer robusta och fysiskt tolkningsbara data. Till exempel, i fallet med en sänkt ESR, gör det det möjligt att skilja om fördröjningstiden t0 för kollapsen förlängs, om nätverket av RBC är ovanligt oordnat genom γ, eller om den slutliga komprimeringen Φm av cellerna på något sätt hindras16,19,20.

Intressant nog är mätningen av den maximala sedimenteringshastigheten också mer robust och känslig för fibrinogennivåer, vilket redan belysts i tidigare studier13,14,15. Detta är en viktig funktion, eftersom ESR ofta används för att övervaka inflammation, vilket är förknippat med förhöjda nivåer av fibrinogen. Denna känslighet härrör i huvudsak från avkoppling Um från tidpunkten för gelkollaps, som är känd för att ha en viktig slumpmässig komponent34,35,36. Mer exakt, som framgår av figur 4D16, för högre koncentrationer av fibrinogen har den inneboende slumpmässiga variationen av fördröjningstiden (där mätningar över 150 mg/ml är mellan 12 min och 30 min, även bland en enda givare) samma storleksordning som dess underliggande beroende av denna parameter (mellan 150 mg/dl och 300 mg/dl; den genomsnittliga trenden för mätningarna minskar endast från 0,45 timmar till 0,4 timmar [ dvs 27 min till 24 min]). Eftersom denna fördröjningstid faktiskt ingår i den traditionella höjdmätningen vid 30 min eller 1 h (varaktigheter som denna fördröjningstid ibland kan nå eller överskrida), ger extraktion av den maximala hastigheten Um (som presenterar en systematisk och signifikant trend för varje givare) sedan en mer robust och meningsfull parameter 13,14,15,34,35, 36.

Dessutom kan parametern Um effektivt korrigeras för den initiala hematokriten, enligt det praktiska resultatet Equation 11 som beskrivits tidigare17. När man kombinerar data för alla friska donatorer i en tidigare studie17 erhålls värden på γ = 0,50 ± 0,06 och Φ m = 0,86 ± 0,04, vilket fint återger trenden för Um som en funktion av donatorhematokriten Φ , som visas i figur 3. I praktiska fall kan det dock vara strängare att korrigera ESR med de γ- och Φm-värdensom erhållits för en specifik givare, eftersom fibrinogennivåerna också kan förändras avsevärt mellan givare och ha en betydande inverkan på dessa parametrar (figur 4).

Med tanke på de punkter som diskuteras och inkluderar dem i rutinmässiga medicinska procedurer kommer ESR: s noggrannhet och mångsidighet som ett kliniskt in vitro-verktyg att förbättras ytterligare.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att förklara relevanta för innehållet i denna artikel.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av forskningsenheten FOR 2688 - Wa1336/12 från den tyska forskningsstiftelsen och av Marie Skłodowska-Curie-bidragsavtalet nr 860436-BEVIS. T. J. och C. W. erkänner finansiering från French German University (DFH/UFA). A. D. erkänner finansiering från Young Investigator Grant vid Saarland University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anticoagulant (EDTA or Heparin) tube (for blood sample) SARSTEDT 267001 or 265 Anticoagulated blood sample to characterize
Camera EOS M50 Canon Kit EF-M18-150 IS STM Any camera should work, provided that sector alimentation, connection to computer for automated shooting and adapted objective are available
Centrifuge HERMLE 302.00 V03 - Z 36 HK Requirements: at least 3000 x g ofr 7 min.
Micro-centrifuge MLW TH21 or any other way to determine the hematocrit
Micro-hematocrit capilaries Fisher scientific 11884040 or other capillaries/containers for hematocrit determination
Phosphate Buffered Saline (PBS) ThermoFisher 10010023 1x PBS, pH 7.4, 298 Osm
Pipettes (e.g. positive displacement pipette) Gilson FD10006 Pipette required to manipulate blood and/or packed cells.Other models are of course suitable, but be careful to treat blood and pakced cells as highly viscous fluids.
Wax sealing plate Hirschmann 9120101 Sealing wax for the micro-hematocrit capillaries
Westergren tubes Praxindo A9244560 Any other standard Wetsergren tube should work too
White background with illumination / / White sheet(s) of paper behind the samples, with usual room light is perfcetly sufficient.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bedell, S. E., Bush, B. T. Erythrocyte sedimentation rate. From folklore to facts. The American Journal of Medicine. 78, 1001-1009 (1985).
  2. Grzybowski, A., Sak, J. Edmund Biernacki (1866-1911): Discoverer of the erythrocyte sedimentation rate. On the 100th anniversary of his death. Clinics in Dermatology. 29 (6), 697-703 (2011).
  3. Kushner, I., Mackiewicz, A. The Acute Phase Response: An Overview. Acute Phase Proteins. , CRC Press. (1993).
  4. Tishkowski, K., Gupta, V. Erythrocyte Sedimentation Rate. StatPearls Publishing. , Treasure Island, FL. (2022).
  5. Menees, S. B., Powell, C., Kurlander, J., Goel, A., Chey, W. D. A meta-analysis of the utility of C-reactive protein, erythrocyte sedimentation rate, fecal calprotectin, and fecal lactoferrin to exclude inflammatory bowel disease in adults with IBS. The Americal Journal of Gastroenterology. 110 (3), 444-454 (2015).
  6. Brigden, M. L. Clinical utility of the erythrocyte sedimentation rate. Americal Family Physician. 60 (5), 1443-1450 (1999).
  7. Liu, S., et al. Preliminary case-control study to evaluate diagnostic values of C-reactive protein and erythrocyte sedimentation rate in differentiating active Crohn's disease from intestinal lymphoma, intestinal tuberculosis and Behcet's syndrome. The American Journal of the Medical Sciences. 346 (6), 467-472 (2013).
  8. Greidanus, N. V., et al. Use of erythrocyte sedimentation rate and C-reactive protein level to diagnose infection before revision total knee arthroplasty: A prospective evaluation. The Journal of Bone and Joint Surgery. 89 (7), 1409-1416 (2007).
  9. Flormann, D., Kuder, E., Lipp, P., Wagner, C., Kaestner, L. Is there a role of C-reactive protein in red blood cell aggregation. International Journal of Laboratory Hematology. 37 (4), 474-482 (2015).
  10. Brust, M., et al. The plasma protein fibrinogen stabilizes clusters of red blood cells in microcapillary flows. Scientific Reports. 4, 4348 (2014).
  11. Gray, S. J., Mitchell, E. B., Dick, G. F. Effect of purified protein fractions on sedimentation rate of erythrocytes. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 51 (3), 403-404 (1942).
  12. Kratz, A., et al. ICSH recommendations for modified and alternate methods measuring the erythrocyte sedimentation rate. International Journal of Laboratory Hematology. 39 (5), 448-457 (2017).
  13. Hung, W. T., Collings, A. F., Low, J. Erythrocyte sedimentation rate studies in whole human blood. Physics in Medicine and Biology. 39 (11), 1855-1873 (1994).
  14. Woodland, N. B., Cordatos, K., Hung, W. T., Reuben, A., Holley, L. Erythrocyte sedimentation in columns and the significance of ESR. Biorheology. 33 (6), 477-488 (1996).
  15. Holley, L., Woodland, N., Hung, W. T., Cordatos, K., Reuben, A. Influence of fibrinogen and haematocrit on erythrocyte sedimentation kinetics. Biorheology. 36 (4), 287-297 (1999).
  16. Dasanna, A. K., et al. Erythrocyte sedimentation: Effect of aggregation energy on gel structure during collapse. Physical Review. E. 105 (2-1), 024610 (2022).
  17. Darras, A., et al. Erythrocyte sedimentation: collapse of a high-volume-fraction soft-particle gel. Physical Review Letters. 128 (8), 088101 (2022).
  18. Darras, A., et al. Imaging erythrocyte sedimentation in whole blood. Frontiers in Physiology. 12, 729191 (2022).
  19. Darras, A., et al. Acanthocyte sedimentation rate as a diagnostic biomarker for neuroacanthocytosis syndromes: Experimental evidence and physical justification. Cells. 10 (4), 788 (2021).
  20. Rabe, A., et al. The erythrocyte sedimentation rate and its relation to cell shape and rigidity of red blood cells from chorea-acanthocytosis patients in an off-label treatment with dasatinib. Biomolecules. 11 (5), 727 (2021).
  21. Giavarina, D., Capuzzo, S., Pizzolato, U., Soffiati, G. Length of erythrocyte sedimentation rate (ESR) adjusted for the hematocrit: reference values for the TEST 1 method. Clinical Laboratory. 52 (5-6), 241-245 (2006).
  22. Bull, B. S. Is a standard ESR possible. Laboratory Medicine. 6 (11), 31-39 (1975).
  23. Bull, B. S., Brecher, G. An evaluation of the relative merits of the Wintrobe and Westergren sedimentation methods, including hematocrit correction. American Journal of Clinical Pathology. 62 (4), 502-510 (1974).
  24. Reinhart, W. H., Singh, A., Straub, P. W. Red blood cell aggregation and sedimentation: the role of the cell shape. British Journal of Haematology. 73 (4), 551-556 (1989).
  25. Jan, K., Usami, S., Smith, J. A. Influence of oxygen tension and hematocrit reading on ESRs of sickle cells: Role of RBC aggregation. Archives of Internal Medicine. 141 (13), 1815-1818 (1981).
  26. Issaq, H. J., Xiao, Z., Veenstra, T. D. Serum and plasma proteomics. Chemical Reviews. 107 (8), 3601-3620 (2007).
  27. Yu, Z., et al. Differences between human plasma and serum metabolite profiles. PLoS One. 6 (7), 21230 (2011).
  28. Proper Pipetting Techniques - DE. , Available from: https://www.thermofisher.com/de/de/home/life-science/lab-plasticware-supplies/lab-plasticware-supplies-learning-center/lab-plasticware-supplies-resource-library/fundamentals-of-pipetting/proper-pipetting-techniques.html (2023).
  29. Otsu, N. A threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Transaction on Systems, Man, and Cybernetics. 9 (1), 62-66 (1979).
  30. Solomon, C., et al. A comparison of fibrinogen measurement methods with fibrin clot elasticity assessed by thromboelastometry, before and after administration of fibrinogen concentrate in cardiac surgery patients. Transfusion. 51 (8), 1695-1706 (2011).
  31. Norouzi, N., Bhakta, H. C., Grover, W. H. Sorting cells by their density. PLoS One. 12 (7), 0180520 (2017).
  32. Trudnowski, R. J., Rico, R. C. Specific gravity of blood and plasma at 4 and 37 degrees C. Clinical Chemistry. 20 (5), 615-616 (1974).
  33. Késmárky, G., Kenyeres, P., Rábai, M., Tóth, K. Plasma viscosity: A forgotten variable. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 39 (1-4), 243-246 (2008).
  34. Teece, L. J., et al. Gels under stress: The origins of delayed collapse. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 458, 126-133 (2014).
  35. Lindström, S. B., Kodger, T. E., Sprakel, J., Weitz, D. A. Structures, stresses, and fluctuations in the delayed failure of colloidal gels. Soft Matter. 8 (13), 3657-3664 (2012).
  36. Bartlett, P., Teece, L. J., Faers, M. A. Sudden collapse of a colloidal gel. Physical Review. E, Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 85, 021404 (2012).

Tags

Medicin utgåva 193
Erytrocytsedimenteringshastighet: En fysikdriven karakterisering i ett medicinskt sammanhang
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Darras, A., John, T., Wagner, C.,… More

Darras, A., John, T., Wagner, C., Kaestner, L. Erythrocyte Sedimentation Rate: A Physics-Driven Characterization in a Medical Context. J. Vis. Exp. (193), e64502, doi:10.3791/64502 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter