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Biology

아데노바이러스 매개 형질도입을 이용한 천연 방광 요로상피에서의 형질전환 유전자의 발현

Published: October 6, 2022 doi: 10.3791/64584
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Renal-Electrolyte Division, Department of Medicine, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

다량의 재조합 아데노바이러스의 생성에 대한 방법이 기재되어 있으며, 이는 이식유전자의 발현 또는 내인성 유전자 산물의 하향조절을 허용하는 천연 설치류 요로상피를 형질도입하는 데 사용될 수 있습니다.

Abstract

고저항 장벽을 형성하는 것 외에도 신장 골반, 요관, 방광 및 근위 요도를 둘러싸고 있는 요로상피는 환경에 대한 정보를 감지하고 기저 조직으로 전달하여 배뇨 기능과 행동을 촉진하는 것으로 가정됩니다. 요로상피장벽 또는 감각/변환기 기능의 파괴는 질병을 유발할 수 있습니다. 이러한 복잡한 사건을 연구하는 것은 요로상피에서 유전자와 단백질 발현을 변화시키는 간단한 전략이 없기 때문에 방해를 받습니다. 연구자가 다량의 고역가 아데노바이러스를 생성할 수 있도록 하는 방법이 여기에 설명되어 있으며, 이를 사용하여 설치류 요로상피를 고효율로 비교적 간단한 방식으로 형질도입할 수 있습니다. cDNA와 작은 간섭 RNA는 모두 아데노바이러스 형질도입을 사용하여 발현될 수 있으며, 요로상피 기능에 대한 이식유전자 발현의 영향은 12시간에서 며칠 후에 평가할 수 있습니다. 이러한 방법은 마우스 또는 쥐 동물 모델을 사용한 정상 및 비정상 요로상피 생물학 연구에 광범위하게 적용할 수 있습니다.

Introduction

요로상피(urothelium)는 신장 골반, 요관, 방광, 근위 요도를 둘러싸고 있는 특수 상피이다1. 그것은 3 개의 지층으로 구성되어 있습니다 : 고도로 분화되고 분극화 된 종종 이중 핵 우산 세포의 층으로, 정점 표면은 소변으로 목욕됩니다. 이들의 급성 손실에 반응하여 표재성 우산 세포를 발생시킬 수 있는 이핵-전이-증폭 세포의 집단을 갖는 중간 세포층; 및 기저 세포의 단일 층, 그 하위 집합은 만성 손상에 대한 반응으로 요로 상피 전체를 재생할 수 있는 줄기 세포로 기능합니다. 우산 세포는 주로 고내성 요로상피 장벽을 형성하는 역할을 하며, 그 구성 요소에는 물과 용질에 대한 투과성이 낮은 정점막(콜레스테롤과 세레브로사이드가 풍부함)과 고저항 정점 접합 복합체(밀착 접합부, 부착 접합부, 데스모솜 및 관련 악토미오신 고리로 구성됨)가 포함됩니다.1 . 우산 세포의 정점 표면과 접합 링은 모두 방광 충전 중에 확장되고 1,2,3,4,5를 배뇨한 후 빠르게 미리 채워진 상태로 돌아갑니다. 장벽 기능에서의 역할 외에도 요로피는 세포외 환경의 변화(예: 스트레칭)를 감지하고 매개체(ATP, 아데노신 및 아세틸콜린 포함)의 방출을 통해 이 정보를 전달하여 이 정보를 비뇨상피하 구심성 신경 과정을 포함한 기저 조직으로 전달할 수 있는 감각 및 변환기 기능을 가지고 있다는 가설이 있습니다 6,7,8 . 이 역할에 대한 최근의 증거는 Piezo1과 Piezo2 모두의 요로상피 발현이 결여된 마우스에서 발견되며, 이는 변경된 배뇨 기능을 초래합니다9. 또한, 우산 세포층에서 밀착 접합 기공 형성 단백질인 CLDN2를 과발현하는 쥐는 간질성 방광염 환자에서 볼 수 있는 것과 유사한 염증과 통증을 일으킨다10. 요로상피관/변환기/장벽 기능의 파괴가 여러 방광 장애에 기여할 수 있다는 가설이 있습니다 6,11.

정상 및 질병 상태에서 요로상피의 생물학에 대한 더 나은 이해는 연구자가 내인성 유전자 발현을 쉽게 하향 조절하거나 천연 조직에서 이식유전자의 발현을 허용할 수 있는 도구의 가용성에 달려 있습니다. 유전자 발현을 하향 조절하는 한 가지 접근법은 조건부 요로상피 녹아웃 마우스를 생성하는 것이지만, 이 접근법은 플록스 대립유전자가 있는 마우스의 가용성에 따라 달라지며 노동 집약적이며 완료하는 데 수개월에서 수년이 걸릴 수 있습니다12. 당연히 연구자들은 요로상피를 형질주입하거나 형질도입하는 기술을 개발했으며, 이는 더 짧은 시간 규모로 결과를 가져올 수 있습니다. 형질감염을 위해 공개된 방법은 양이온성 지질13, 안티센스 포스포로티오화 올리고데옥시뉴클레오티드 14, 또는 HIV TAT 단백질 침투 11-mer 펩티드15에 테더링된 안티센스 핵산의 사용을 포함한다. 그러나 이 프로토콜의 초점은 광범위한 세포에 대한 유전자 전달에 효율적인 잘 연구된 방법론인 아데노비랄 매개 형질도입의 사용에 있으며, 수많은 임상 시험에서 테스트되었으며, 가장 최근에는 COVID-19 캡시드 단백질을 암호화하는 cDNA를 COVID-19 백신의 한 변종 수혜자에게 전달하는 데 사용되었습니다16, 17. 아데노바이러스 수명 주기, 아데노바이러스 벡터 및 아데노바이러스의 임상적 적용에 대한 보다 자세한 설명은 독자가 참조17을 참조하도록 지시합니다.

요로상피를 형질도입하기 위한 아데노바이러스 사용의 중요한 이정표는 Ramesh et al. N-도데실-β-D-말토사이드(DDM)를 포함한 세제로 짧은 전처리가 β-갈락토시다아제를 암호화하는 아데노바이러스에 의한 요로상피의 형질도입을 극적으로 향상시켰습니다18. 이 원리 증명 연구를 지침으로 사용하여 요로상피의 아데노비랄 매개 형질도입은 이제 Rab-family GTPases, 구아닌-뉴클레오티드 교환 인자, 미오신 운동 단편, 기공 형성 밀착 접합 관련 클라우딘 및 ADAM17 10,19,20,21,22 . 동일한 접근법이 작은 간섭 RNA(siRNA)를 발현하도록 조정되었으며, 그 효과는 이식유전자22의 siRNA 내성 변이체를 공동 발현함으로써 구출되었습니다. 여기에 설명된 프로토콜에는 이러한 기술에 대한 요구 사항인 고농축 아데노바이러스를 대량으로 생성하는 일반적인 방법과 요로상피에서 이식유전자를 고효율로 발현하기 위한 Ramesh et al.18의 방법의 적응이 포함됩니다.

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Protocol

BSL2 인증이 필요한 아데노바이러스 생성과 관련된 실험은 피츠버그 대학교 환경 보건 및 안전 사무소와 기관 생물 안전 위원회의 승인을 받아 수행되었습니다. 아데노바이러스 형질도입(ABSL2 인증 필요)을 포함한 모든 동물 실험은 실험실 동물의 인도적 관리 및 사용에 관한 공중 보건 서비스 정책 및 동물 복지법의 관련 지침/규정에 따라 피츠버그 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받아 수행되었습니다. 재조합 바이러스와 관련된 모든 절차에는 장갑, 보안경 및 적절한 의복을 착용합니다. 액체 또는 고체 폐기물은 아래에 설명된 대로 처리해야 합니다. 형질도입 후 동물의 침구와 그로 인한 동물 사체는 생물학적 위험 물질로 취급하고 제도적 정책에 따라 폐기해야 합니다.

1. 고역가 아데노바이러스 스톡의 제조

참고: 설치류 방광의 효과적인 형질도입은 정제 및 농축된 바이러스 스톡(일반적으로 μL당 1 x 107 내지 1 x 108 감염성 바이러스 입자(IVP))의 사용에 달려 있습니다. 프로토콜의 이 부분은 기존 바이러스 제제에서 고역가 아데노바이러스 스톡을 생성하는 데 중점을 둡니다. 모든 단계는 멸균 시약과 도구를 사용하여 세포 배양 후드에서 수행해야 합니다. 오늘날 사용되는 아데노바이러스 균주는 복제 결함이 있지만 대부분의 기관에서는 아데노바이러스 및 재조합 DNA를 사용하기 위해 승인이 필요합니다. 여기에는 종종 세포 배양실을 아데노바이러스를 생산하고 증폭하기 위한 BSL2 승인 시설로 지정하는 것이 포함됩니다. 몇 가지 일반적인 고려 사항에는 바이러스 생산 및 정제의 모든 단계에서 마스크, 보안경, 장갑 및 적절한 의복 사용이 포함됩니다. 원심분리를 수행할 때 원심분리기 튜브에 꼭 맞는 캡이 없는 경우 안전 캡을 사용하는 것이 좋습니다. 오염 가능성이 있는 원심분리기 안전 캡, 병 및 로터를 포함한 모든 비일회용 재료는 항바이러스 용액( 재료 표 참조)으로 처리한 다음 물 또는 70% 에탄올로 헹굽니다. 액체 폐기물은 표백제를 최종 농도 10%(v/v)로 첨가하여 처리됩니다. 이러한 액체 폐기물의 처리는 제도적 정책에 달려 있습니다. 고형 폐기물은 일반적으로 생물학적 유해 폐기물로 처리됩니다.

  1. HEK293T 세포 배양
    1. HEK293T 세포의 냉동 바이알을 37°C의 수조에서 해동하고 5mL 피펫을 사용하여 세포를 직경 15cm 세포 배양 접시에 옮깁니다. 25mL 피펫을 사용하여 10%(v/v) 소 태아 혈청과 페니실린/스트렙토마이신 항생제(DMEM-FBS-PS)가 포함된 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) 20mL를 접시에 천천히 추가합니다. 세포가 80%-90% 합류점(~2 x 107 세포)에 도달할 때까지 5%(v/v)CO2로 가스가 공급된 37°C 세포 배양 배양기에서 세포를 배양합니다.
    2. 진공 공급원에 부착된 유리 피펫을 이용하여, 배지를 흡인하고, 20 mL의 멸균 PBS (2.7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4, 136.9 mM NaCl, 및 8.9 mMNa2HPO4)를 25 mL 피펫을 사용하여 접시에 옮겨 세포를 헹구었다. 폐한 PBS를 흡인한 다음 5mL 피펫을 사용하여 3mL의 따뜻한(37°C) 프로테이나제 용액(재료 표 참조)을 접시에 옮기고 세포가 분리될 때까지(~3-4분) 세포 배양 배양기에서 접시를 배양합니다.
      알림: 효과적인 단백질 분해는 접시를 천천히 앞뒤로 기울여 접시의 모든 부분에서 움직이는 유체로 세포가 방출되는 것을 찾는 것으로 가장 잘 평가할 수 있습니다. HEK293T 세포는 연장된 프로테이나제 치료에 민감하며 프로테이나제 용액에 몇 분 이상 방치하면 죽습니다.
    3. 10mL 피펫을 사용하여 7mL의 DMEM-FBS-PS를 분리된 세포의 접시에 옮긴 다음 동일한 피펫을 사용하여 세포와 배지를 흡인합니다. 현탁 세포를 50mL 원뿔형 튜브로 옮긴 다음, 현탁액을 200 x g 의 저속 임상 원심분리기에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다. 진공 소스에 부착된 유리 피펫을 사용하여 상층액을 흡인합니다. 25mL 피펫을 사용하여 15mL의 DMEM-FBS-PS에 세포 펠릿을 재현탁합니다.
    4. 19mL의 DMEM-FBS-PS가 들어 있는 15cm 접시 각각에 1mL의 세포 현탁액을 추가합니다.
    5. 조직 배양 인큐베이터에서 세포가 85%-90% 합류(~3-4일)에 도달할 때까지 성장시킵니다.
  2. 희석 된 바이러스 용액을 준비하십시오
    1. FBS 또는 항생제가 없는 45mL의 DMEM으로 채워진 50mL 원뿔형 튜브에 기존 바이러스 스톡(5-10IVP/세포)의 ~1.5 x 10 9에서 3 x 109 IVP를 추가합니다.
      참고: 더 낮은 농도의 바이러스(1-5 IVP/세포)를 사용할 수 있습니다. 그러나 바이러스 생산이 계속되는 데는 더 오래 걸릴 것입니다.
  3. 배양 된 세포를 바이러스로 감염시킵니다.
    1. 진공 소스에 부착된 유리 피펫을 사용하여 1.1.5단계에서 거의 합류한 셀에서 배지를 흡인합니다.
    2. 25mL 피펫을 사용하여 3.0mL의 희석된 바이러스 용액(1.2.1단계에서 준비됨)을 각 세포 배양 접시에 옮깁니다. 그런 다음 10mL 피펫을 사용하여 7.0mL의 DMEM 배지(FBS 또는 항생제 부족)를 각 접시에 추가합니다. 세포 배양 인큐베이터에서 60분 동안 배양한 다음 20%(v/v) FBS 및 2x PS를 포함하는 DMEM 10mL를 각 접시에 추가합니다.
      참고: 15개 접시 중 하나를 대조군(바이러스가 추가되지 않음)으로 사용하면 다음 단계에서 감염된 세포에서 바이러스 유발 세포 반올림 및 사멸을 더 쉽게 식별할 수 있습니다.
    3. 세포 배양 인큐베이터에서 세포를 2-4일 동안 배양하여 대부분이 반올림되기 시작하고 세포의 >60%가 분리될 때까지 배양합니다.
      참고: 더 낮은 역가의 바이러스를 사용하는 경우 세포 사멸이 발생하는 데 최대 일주일이 걸릴 수 있습니다. 세포 사멸이 일주일 이내에 발생하지 않으면 더 높은 역가의 바이러스를 사용하여 과정을 반복해야 할 것입니다.
  4. 세포 용해물에서 바이러스 복구
    1. 세포 스크레이퍼를 사용하여 각 접시의 바닥을 긁어 부착 된 세포를 배지로 방출합니다.
    2. 25mL 피펫을 사용하여 각 세포 배양 접시에서 배지, 세포 및 세포 파편을 수집하고 50mL 원뿔형 세포 배양 튜브에 풀링합니다.
      참고: 자원을 절약하기 위해 두 접시의 배지를 하나의 50mL 튜브로 결합할 수 있습니다.
    3. 저속 테이블탑 원심분리기를 이용한 원심분리에 의해 세포 물질을 펠렛화: 3,000 x g에서 실온에서 5분. 진공 장치에 부착된 유리 피펫을 사용하여 상층액을 흡인합니다.
    4. 분쇄와 결합된 10mL 피펫을 사용하여 생성된 모든 펠릿화된 물질을 10mM EDTA(Tris-EDTA 용액)를 포함하는 멸균 여과된 100mM Tris-HCl pH 7.4의 총 7mL에 통합합니다. 풀링된 물질을 멸균된 15mL 세포 배양 원뿔형 튜브로 옮기고 얼음 위에 놓습니다.
      참고: 이 시점에서 바이러스 전처리는 -80°C에서 무기한 동결될 수 있습니다.
  5. 세포 용해물 준비
    1. 3 번의 동결 해동 사이클을 수행하여 나머지 세포를 파괴하여 형성된 바이러스 입자를 추가로 유리시킵니다. 튜브를 액체 질소(~1.4.4초)에 담가 30단계에서 풀링된 재료를 동결합니다. 튜브를 37°C 인큐베이터에 넣어 샘플을 빠르게 해동합니다. 샘플을 15초 동안 소용돌이친 다음 급속 냉동 및 해동 절차를 추가로 2회 반복합니다.
      알림: 바이러스 용액은 수조에서 37°C로 빠르게 해동할 수 있지만 온도 변화로 인해 튜브가 깨져 바이러스 용액이 수조로 방출될 수 있으므로 주의해야 합니다. 이러한 일이 발생하지 않도록 바이러스 상청액이 들어 있는 튜브를 더 큰 튜브에 넣은 다음 수조에 넣습니다.
    2. 10mL 피펫을 사용하여 3회 동결 해동된 세포 물질을 초고속 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 4°C 초고속 원심분리기에서 30분 동안 튜브의 재료를 원심분리하여 ~18,500 x g로 합니다.
    3. 10mL 피펫으로 ~7mL의 바이러스가 풍부한 상층액을 회수하고 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 다음 단계까지 샘플을 얼음 위에 보관하십시오.
      참고: 이 시점에서 정제되지 않은 바이러스 상청액의 부분 표본을 새로운 바이러스 제제(또는 백업)를 시작하기 위한 프리앰블로 유지하는 것을 고려하십시오. 이 분취량을 -80 °C에서 보관하십시오.
  6. 밀도 구배 원심분리를 사용하여 바이러스를 분리하고 정제합니다.
    1. 12mL PET 얇은 벽의 투명한 초원심분리기 튜브( 재료 표 참조) 또는 이와 동등한 곳에서 CsCl의 불연속 구배를 준비합니다. 18G 바늘이 장착된 3mL 주사기를 사용하여 2.5mL의 1.4g/mL CsCl 용액을 튜브 바닥에 조심스럽게 주입한 다음 새 주사기/바늘을 사용하여 2.5mL의 1.25g/mL CsCl 용액을 겹칩니다.
      알림: 기존 레이어 위에 직접 용액을 떨어뜨리면 심각하고 원치 않는 혼합이 발생합니다. 대신 바늘의 비스듬한 부분을 튜브 가장자리에 대고 주사기 플런저를 아주 천천히 눌러 용액이 튜브를 채울 때 바늘의 위치를 높입니다.
    2. 7mL 주사기를 사용하여 유사한 방식으로 구배 위에 ~10mL의 바이러스 상청액을 로드합니다. 바이러스 상청액과 튜브 상단 사이에 2-3mm 이상의 공간이 있는 경우 2-3mm의 공간만 남을 때까지 추가 Tris-EDTA 용액을 추가하여 튜브를 채웁니다.
    3. CsCl 층을 포함하지만 바이러스 상청액을 Tris-EDTA 용액으로 대체하여 유사하게 준비된 균형 튜브를 만듭니다.
      알림: 두 튜브는 초원심분리기에서 잠재적으로 위험한 불균형 부하 상황을 방지하기 위해 동일한 무게(및 유사한 밀도)를 가져야 합니다.
  7. rate-zonal 초원심분리를 사용하여 바이러스를 분리합니다.
    1. 1.6.2-1.6.3단계에서 형성된 그래디언트를 SW41 로터 또는 이와 동등한 것의 버킷에 로드합니다. 버킷 캡을 조이고 로터를 초원심분리기(4°C로 예냉)에 넣고 ~150,000 x g에서 1시간 동안 원심분리합니다.
    2. 원심분리하는 동안 아래 단계 1.9.1에 설명된 컬럼을 평형화합니다.
  8. 분리된 바이러스 입자 회수
    1. 원심분리 단계가 끝나면 로터에서 버킷을 조심스럽게 분리하고 세포 배양 후드에서 버킷 캡을 제거한 다음 튜브를 제거하고 랙에 놓습니다.
    2. 1.25g/mL와 1.4g/mL CsCl 용액 사이의 계면에 떠 있는 바이러스 입자가 풍부한 줄무늬 물질을 수집합니다. 세포 배양 접시의 아래쪽 절반에 그래디언트가 들어 있는 튜브를 잡고(엎질러진 물질을 걸러낼 수 있음) 3mL 주사기에 부착된 1인치 18G 바늘을 사용하여 줄무늬 바이러스 바로 아래에 있는 튜브에 조심스럽게 구멍을 뚫습니다. 일반적으로 ~1mL로 회수되는 바이러스를 천천히 흡인합니다.
    3. 튜브에서 바늘을 제거하면 그래디언트에 남아 있는 물질이 튜브에서 세포 배양 접시의 아래쪽 절반으로 흘러 들어갑니다(모든 액체는 유해 폐기물로 처리해야 함).
    4. 주사기의 바이러스 용액을 얼음 위의 멸균 미세 원심 분리기 튜브로 옮깁니다.
      알림: 이 단계에서 바이러스를 복구할 때 바늘이 바이러스가 풍부한 밴드 몇 mm 아래에 바늘이 열리도록 바늘의 내강이 위쪽을 향하도록 바늘을 배치합니다. 때때로 줄무늬 바이러스보다 2-3mm 위에서 관찰되는 부적절하게 조립된 바이러스의 얇은 띠에 의한 오염을 피하십시오( 그림 1A의 가는 검은색 화살표 참조).
  9. 겔 여과에 의해 샘플에서 CsCl을 제거합니다.
    1. PD-10 컬럼(Sephadex G-25M으로 사전 포장)을 지지대에 고정하고 10%(v/v) 글리세롤을 함유한 0.2μm 멸균 여과 PBS 50mL로 평형을 맞춥니다.
      참고: 초기 평형 단계는 완료하는 데 2-3시간이 걸리며 제조업체가 컬럼을 안정화하는 데 사용하는 방부제가 완전히 세척되도록 하는 데 필요합니다.
    2. 세척 용액이 프릿(컬럼 배지 상단의 흰색 물질로 된 보호 디스크) 아래로 물러나도록 한 다음 1.8단계에서 수집한 정제된 바이러스 용액을 컬럼 상단으로 조심스럽게 옮깁니다. 바이러스가 풍부한 용액이 프릿 아래로 물러나도록 한 다음 PBS-글리세롤로 컬럼을 채우기 시작합니다.
      참고: 프릿의 한 가지 기능은 컬럼이 마르는 것을 방지하는 것입니다. 그 결과, 더 많은 용리액이 컬럼에 추가되기 전에 짧은 지연이 허용됩니다.
    3. 12개의 멸균 미세원심분리기 튜브에 분획당 0.5mL씩 용리액을 수집합니다.
  10. 바이러스 수율을 결정하십시오.
    1. 분광광도법을 사용하여 피크 바이러스 분획을 측정합니다. PBS에서 각 분획의 1:100 희석액을 준비하고, 1:100 희석 완충액을 블랭크로 사용하여 분광광도계에서OD260 을 측정한다. 바이러스 입자는 분획 6 부근에서 시작하여 공극 부피에서 용리되어야 합니다. 가장 높은 OD260 판독값을 포함하는 분획을 풀링합니다.
    2. 풀링된 바이러스 분획을 1:100으로 희석하고 OD260을 다시 측정합니다. 다음 공식을 사용하여 바이러스 입자의 최종 농도와 풀링된 분획의 IVP 수를 계산합니다: mL당 바이러스 입자 = OD260 × 100(희석 계수를 보정함) ×10 12. 일반적으로 바이러스 입자의 1%가 IVP인 것으로 추정됩니다: IVP/mL = OD 260 × 100 × 10 10 또는 IVP/μL = OD260 × 100 ×10 7.
  11. 풀링된 바이러스 분획(5 x 107 내지 1 x 108 IVP 함유)을 멸균 미세원심분리기 튜브 또는 극저온 난실에 분취합니다. 샘플을 -80°C에서 보관합니다.

2. 설치류 방광의 형질 도입

참고: 이 기술을 처음 접하는 경우 한 번에 형질도입되는 동물의 수를 2-4개로 제한하는 것이 좋습니다. 이것은 특히 2.2 단계에서 세제를 처리한 다음 2.3 단계에서 바이러스 배양 동안 각 동물의 시작 시간을 엇갈리게 하여 달성할 수 있습니다. 숙련된 조사관은 한 번에 최대 6마리의 동물을 형질도입할 수 있습니다.

  1. 방광 카테터 삽입
    1. 노즈 콘이 부착된 기화기를 사용하여 암컷 C57Bl/6J 마우스(일반적으로 8-10주령, ~20-25g) 또는 암컷 Sprague Dawley 쥐(일반적으로 2-3개월령, ~250g)를 마취합니다. 기화기를 보정하여 마우스의 경우 3.0%(v/v) 이소플루란, 97%(v/v) O 2 또는 쥐의 경우 4.0%(v/v) 이소플루란, 96%(v/v) O2 를 생성합니다. 동물이 발가락 꼬집음에 반응하지 않는지 확인하여 동물이 마취되었는지 확인합니다(일반적으로 1-2분 후).
    2. 동물을 가열 된 패드에 올려 놓아 동물의 체온을 유지하십시오. 형질도입 프로토콜 전반에 걸쳐 동물을 모니터링하여 동물이 마취되고 이 절차 동안 통증을 경험하지 않는지 확인합니다.
    3. 이소플루란을 생쥐의 경우 1.5%(v/v), 쥐의 경우 2.0%(v/v)로 줄이고 프로토콜 기간 동안 동물을 마취 상태로 유지합니다.
    4. 방광으로 공기가 유입되는 것을 방지하려면 IV 카테터의 플라스틱 카테터 부분( 재료 표 참조) 및 관련 허브를 이송 피펫을 사용하여 멸균 PBS로 채웁니다.
    5. 앙와위 자세로 외부 비도를 70 % 알코올로 닦고 멸균 카테터를 외부 비도, 요도, 방광에 삽입합니다.
      1. 이 작업을 수행하려면 미세한 집게를 사용하여 외부 비도를 형성하는 조직을 부드럽게 잡고 동물에서 멀리 수직으로 확장하십시오. 다른 손을 사용하여 카테터를 약 3-4mm 수직으로 요도 비도 (질 입구 바로 위의 살덩어리)에 조심스럽게 삽입하십시오. 그런 다음 요도가 구부러져 외부 비도에 삽입 된 카테터를 동물의 꼬리쪽으로 낮추면 치골 아래를 통과하는 요도 부분으로의 진입이 쉬워지고 궁극적으로 방광으로 쉽게 들어갈 수 있습니다
        . 알림: 특히 마우스의 경우 카테터가 너무 길 수 있으며 1.0-1.1cm 이상을 동물에 삽입해서는 안 됩니다. 그렇지 않으면 방광 점막이 손상됩니다. 이를 방지하려면 카테터를 끝 아래 ~1cm에 표시한 다음 이 표시 이상으로 카테터를 삽입하지 마십시오.
    6. 방광의 소변이 새어 나오도록하십시오. Credé의 조작을 수행하여 잔류 소변을 제거하십시오 : 마사지하고 하복부의 방광 범프를 부드럽게 누릅니다.
  2. 요로상피를 세제 용액으로 처리하여 형질도입을 수용하도록 합니다.
    1. PBS로 채워진 멸균된 1mL 주사기를 카테터 허브에 부착하여 마우스 또는 래트 방광을 세척합니다. 멸균 PBS 100μL를 마우스 방광에 주입합니다(또는 쥐 방광의 경우 450μL). 카테터 피팅에서 주사기를 분리하고 PBS 배수를 허용합니다. 필요한 경우 Crede의 조작을 수행하여 과도한 방광액을 제거하십시오.
    2. 멸균된 1mL 주사기를 사용하여 0.1%(w/v) N-도데실-β-D-말토사이드(DDM)(PBS에 용해되고 0.2μm 필터 멸균됨) 100μL를 마우스 방광에 주입합니다. 주사기를 제자리에 두고 DDM을 10분 동안 방광에 유지합니다. 쥐에서 DDM의 부피는 450 μL로 증가합니다.
    3. 주사기를 분리하고 배출되도록 하여 방광에서 DDM을 제거합니다. 필요한 경우 Crede의 기동을 수행하십시오.
  3. 방광에 바이러스를 도입하십시오.
    1. 멸균된 1mL 주사기를 카테터 허브에 부착하고 마우스의 경우 멸균 PBS 100μL, 쥐의 경우 450μL로 희석한 아데노바이러스(단계 1에서 제조)의 0.5 x 107 에서 1 x 108IVP 를 방광에 주입합니다. 바이러스 용액이 빠져 나가는 것을 방지하기 위해 주사기를 카테터에 부착 된 상태로 두십시오.
    2. 30분 후 주사기를 분리하고 바이러스 용액이 방광을 일회용 패드로 배출하도록 합니다. 흡수성 물티슈로 잔류 바이러스 용액을 닦아내고 패드를 버리고 생물학적 유해 폐기물로 닦아냅니다.
      참고: 글리세롤은 세포 독성이 있습니다. 따라서 마우스에 주입된 바이러스 용액의 최대 부피는 5μL로 제한됩니다(PBS 100μL로 희석하면 최종 글리세롤 농도가 ~0.5%[v/v]가 됨). 또한, 주입된 IVP의 수를 증가시키고 바이러스 배양을 45분으로 연장함으로써 형질도입 효율을 향상시킬 수 있습니다.
    3. 선택적 단계: 방광은 위의 단계 2.2.1에 설명된 대로 PBS로 헹굴 수 있습니다. 그러나 이 작업은 필요하지 않습니다.
  4. 동물이 회복되도록하십시오.
    1. 이소플루란의 흐름을 중단하고 특히 동물이 집단 수용된 경우 새장으로 되돌리기 전에 동물이 회복되고 완전히 움직일 수 있도록 합니다.
      참고: 바이러스 형질도입 자체는 관찰 가능한 하부 요로 증상이나 통증을 유발하지 않기 때문에 일반적으로 수술 후 치료가 필요하지 않습니다. 그러나 암호화된 이식유전자가 독성이 있는 경우 기관에서 요구하는 대로 시술 후 진통제 또는 항생제가 필요할 수 있습니다.
  5. mRNA in situ hybridization, western blot 또는 immunofluorescence 9,10,23과 같은 방법을 사용하여 처리 후 12-72시간 후에 이식유전자 발현의 효과를 분석합니다(대표적인 결과 참조).

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Representative Results

바이러스 준비
밀도 구배 원심분리에 의한 바이러스 정제의 예가 도 1A에 제시되어 있다. 로드된 세포 물질과 1.25g/mL CsCl 층의 계면에서 발견되는 연한 분홍색 띠는 주로 파괴된 세포와 그 파편으로 구성됩니다( 그림 1A의 자홍색 화살표 참조). 그것은 프로토콜의 1.5 단계에서 이월되는 소량의 배양 배지에서 분홍빛이 도는 색을 띤다. 유백색 띠로 나타나는 관심 바이러스 입자는 1.25g/mL CsCl 및 1.40g/mL CsCl 용액의 계면에서 발견됩니다( 그림 1A의 노란색 화살표 참조). 농축된 바이러스 입자 위로 2-3mm 위에 떠 있는 물질 띠를 관찰할 수도 있습니다( 그림 1A의 가는 검은색 화살표 참조). 조립되지 않은 바이러스와 파편으로 구성되고 IVP가 거의 포함되어 있지 않으므로 바이러스 샘플을 수집할 때 피해야 합니다.

PD10 컬럼을 이용한 바이러스 및 완충액 교환의 추가 정제는 도 1B에 도시되어 있고, 용출 후 생성된 분획의 OD260 판독값은 도 1C에 도시되어 있다. 이 컬럼의 공극 부피는 약 3mL이므로 바이러스는 분획 6에서 나타나기 시작하고 분획 9에서 최고조에 달합니다. 이 실험에서, 분획 6-9를 풀링하였다. 분획 6과 7은 바이러스 입자가 상대적으로 적지만 회수하기에 충분한 바이러스를 함유하고 있으며 매우 높은 역가 분획을 보다 합리적인 농도로 희석하는 역할을 합니다. 분획 10-12는 분획 11에서OD260의 증가가 제2 오염 피크의 존재 가능성을 나타내는 것으로서 포함되지 않았으며, 이는 이들 제제에서 가변적으로 관찰된다. 풀링된 분획은 일반적으로 1 x 107 내지 1 x 108 IVP/μL를 가지며, 예상 수율은 1 x 10 10 내지 2 x10 11 총 IVP 정도이다. 이것은 수백 번의 형질 도입을 수행하기에 충분한 양의 바이러스입니다. 플라크 분석법이나 형광 단백질을 발현하는 세포의 콜로니를 계수하여 바이러스의 역가를 계산할 수 있지만22, 대부분의 경우 1% 규칙으로 충분하다. 이 규칙은 샘플의 OD260을 측정하여 추정한 정제된 바이러스 입자의 1%가 IVP임을 나타냅니다. -80 °C에서 보관된 바이러스의 분취량은 2-5년의 저장 수명을 가지지만 감염성은 장기적으로 감소합니다. 해동된 바이러스 분취량은 감염성의 현저한 손실 없이 -80°C에서 1회 재냉동될 수 있습니다. 그러나 반복적인 해동 및 동결은 바이러스 감염에 부정적인 영향을 미칩니다.

방광 형질 도입
형질도입의 영향을 평가할 때 중요한 첫 번째 단계는 형질도입 유전자 발현을 확인하는 것입니다. 이는 mRNA(예: RNAScope)를 검출하는 도구, 웨스턴 블롯 분석 또는 면역형광사용을 포함한 여러 기술을 사용하여 평가할 수 있습니다 9,10,23. 그림 2는 V5-에피토프 태그가 부착된 인간 성장 호르몬(V5-hGH)23을 암호화하는 아데노바이러스로 형질도입된 마우스 요로상피의 예입니다. 이 단백질은 원반형/방추형 소포로 포장되어 있으며 방광을 채우는 동안 엑소사이토화될 수 있다19,23. 요로상피 용해물의 웨스턴 블롯 분석은 형질도입된 방광의 요로상피에서 V5-hGH 발현을 나타내었지만 형질도입되지 않은 방광에서는 발현되지 않았습니다(그림 2A). 발현은 또한 면역형광법에 의해 확인되었으며, 이 경우 hGH 또는 V5 에피토프 태그를 인식하는 항체를 사용하였다 (형질도입되지 않은 방광에는 신호가 결여됨, 나타내지 않음) (도 2B).

추가의 예는 CLDN2를 코딩하는 바이러스, 기공 형성 밀착 접합 관련 단백질24,25로 쥐 방광을 형질도입하는 것입니다. CLDN2는 양이온(K+ 포함)의 세포주위 플럭스를 증가시키며, CLDN2의 과발현은 염증과 내장 통증을 유발한다10. 웨스턴 블롯 분석은 Cldn2를 인코딩하는 아데노바이러스로 형질도입된 쥐 방광에서 CLND2의 발현을 확인했지만, 대조군 GFP-코딩 바이러스로 형질도입된 방광에서는 확인되지 않았습니다(그림 2C). 일반적으로 GFP는 세포에서 발현될 때 독성이 있는 것으로 간주되지 않으므로 유용한 대조군으로 작용합니다. GFP를 사용하면 조사자가 형질도입이 효과가 있는지 확인할 수도 있습니다. 면역형광 분석은 Cldn2 cDNA를 코딩하는 바이러스로 형질도입된 요로상피 우산 세포에서 외인성 CLDN2 발현을 추가로 확인했습니다(그림 2D의 빨간색 신호). 또한, 내인성 CLDN2 (도시되지 않음)와 유사하게, 발현된 CLDN2는 TJP1-표지된 밀착 접합부뿐만 아니라 우산 세포의 기저외측 표면에 국한된다(CLDN2는 도 2E에서 녹색으로 표지됨)10. CLDN2 발현의 경우, 형질도입 후 1일 후에 가장 높았지만, 그 후 후행되었고, 15일 후에는 거의 검출되지 않았다.

두 번째 고려 사항은 어떤 세포 유형이 아데노바이러스 형질도입에 의해 표적이 될 것인가 하는 것입니다. 쥐에서는 우산 세포층(19)을 대부분 형질도입하는 것이 가능하지만, 마우스에서는 중간 및 기저 세포층의 형질도입이 가변적일 수 있지만, 요로상피의 모든 층은 형질도입될 수 있다. 중요한 것은 방광벽 전체에서 요로상피만 형질도입되고 주입된 아데노바이러스의 표적이 되는 다른 조직은 없다는 것입니다(그림 3).

형질도입된 세포의 분석은 단일 세포 수준에서 수행할 수 있지만 전체 방광 표현형을 탐색할 때는 대부분의 요로상피 세포를 형질도입해야 합니다. 따라서, 형질도입의 효율(즉, 형질도입되는 요로상피 세포의 어떤 부분)을 정의하는 것이 중요하다. 예를 들어, Cldn2-발현 아데노바이러스의 경우, 우산 세포의 >95%가 형질도입되었다( 도 2D 참조). 추가의 예는 도 3에 도시된 이미지 필드이며, 여기서 형질도입된 우산 세포의 수(이 경우,Ca2+ 센서 GCAMP5G를 발현)를 계수하면, 95%에 근접하는 효율을 나타낸다. 그러나 형질도입 효율에 대한 정확하고 편향되지 않은 추정치를 달성하기 위해 방광벽 전체에서 채취한 무작위 필드의 세포를 검사해야 합니다.

Figure 1
그림 1: 아데노바이러스의 정제. (A) 감염된 HEK293T 세포에 의해 생성된 아데노바이러스 입자는 1.4g/mL CsCl의 층, 1.25g/mL CsCl의 층, 및 Tris-EDTA 용액에 희석된 샘플(S) 층으로 구성된 불연속 CsCl 구배에서 원심분리에 의해 정제되었습니다. 세포 물질(분홍색 화살표)은 S/1.25 계면에 축적되는 반면, 정제된 아데노바이러스는 1.25/1.4 계면(노란색 화살표)에 떠 있습니다. 부적절하게 조립 된 바이러스의 작은 띠가 후자 위에 떠 있습니다 (얇은 검은 색 화살표). (B) 구배의 아데노바이러스가 풍부한 밴드를 바늘을 사용하여 회수하고 10.0%(v/v) 글리세롤을 함유한 PBS로 평형화된 G25 세파덱스로 채워진 PD10 컬럼을 사용하여 겔 여과에 의해 아데노바이러스에서 CsCl을 제거합니다. Sephadex의 표면은 다공성 플라스틱 프릿으로 보호됩니다. (C) 분획 0.5 mL를 PD10 컬럼으로부터 수집하였다. 분획의OD260을 분광광도계로 측정하고 값을 플로팅하였다. 바이러스가 풍부한 분획은 공극 부피에서 용리되며, 이는 분획 6에서 시작하여 분획 9까지 확장됩니다. 이 대표적인 실험에 대한 합동 분수는 파란색으로 음영 처리됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: V5-hGH 또는 CLDN2를 암호화하는 아데노바이러스를 사용한 설치류 방광 요로상피의 형질도입. (A) 마우스 요로상피를 형질도입되지 않은 채로 두거나(UT) V5 에피토프 태그가 부착된 인간 성장 호르몬(hGH)을 암호화하는 아데노바이러스로 형질도입되었습니다. 24시간 후, 방광을 회수하고, 요로상피 용해물을 제조하고, 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 실시하고, hGH에 대한 항체로 프로빙한 웨스턴 블롯을 이용하여 V5-hGH 발현을 확인하였다. (B) hGH(녹색) 또는 V5 에피토프(빨간색) 및 형광단 태그가 부착된 2차 항체에 대한 항체를 사용하여 절편 및 염색된 마우스 요로상피에서 V5-hGH의 검출. 면역형광은 공초점 현미경을 사용하여 캡처되었습니다. 샘플을 TO-PRO3로 대조염색하여 핵을 표지했습니다. (C-F) 랫트 요로피를 대조군으로서 래트 CLDN2 (일반명 클라우딘-2) 또는 GFP (일반명 녹색 형광 단백질)를 코딩하는 바이러스로 형질도입하였다. (c) 다시 CLDN2 항체를 이용한 웨스턴 블랏팅에 의한 외인성 CLDN2의 검출. 내인성 CLDN2는 낮은 수준으로 발현되며 이 실험에서는 검출되지 않습니다. (D) 우산 세포층의 형질도입은 면역형광 및 공초점 현미경에 의해 밝혀진다. 세포의 경계는 피질 액틴 세포 골격을 표시하는 FITC-팔로이딘으로 조직을 공동 염색하여 드러납니다. (E) 전체 장착 또는 단면 요로상피의 면역형광 및 공초점 현미경에 의한 외인성 CLDN2 및 TJP1(일반명 ZO1)의 검출. 작은 흰색 화살표는 단단한 접합부의 위치를 나타내고 작은 자홍색 화살촉은 세포질에서 CLDN2의 세포 내 축적 위치를 표시합니다. 이들은 이전에 골지체와 관련된 CLDN210으로 밝혀졌습니다. (F) 형질도입 후, 동물을 감염 후 표시된 날에 안락사시켰다. 외인성 CLDN2 발현은 웨스턴 블랏팅을 사용하여 검출하였다. GFP를 발현하는 동물은 1일 후에 안락사시켰다. 그림 2C-E의 데이터는 Montalbetti et al.10에서 수정되었으며 미국 생리학회의 허가를 받아 복제되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 아데노바이러스 형질도입의 효율. 마우스 방광 요로상피는 칼슘 센서 GCaMP5G를 코딩하는 아데노바이러스로 형질도입되었다. 상부 패널은 GCaMP5G에 대한 염색을 보여줍니다(녹색 형광 단백질에 대한 항체를 사용하여 검출됨; GFP, 녹색), 중간 패널은 DAPI 염색 핵(파란색)과 로다민-팔로이딘 표지 액틴(빨간색)의 분포를 보여주고, 하단 패널은 세 가지 신호의 병합입니다. 하단 패널의 흰색 화살촉은 형질도입되지 않은 희귀한 우산 세포입니다. 이 이미지에서 우산 세포의 형질 도입의 전체 효율은 ~ 95 %입니다. 요로상피만 형질도입된다는 점에 유의하십시오. 박스형 영역은 오른쪽 패널에서 확대됩니다. 상자 1의 영역은 주로 형질도입된 우산 세포를 포함합니다. 상자 2의 영역은 우산 세포의 효율적인 형질도입을 보여주지만 기본 세포층의 덜 효율적인 형질도입을 보여주는 요로상피입니다. LP = 고유판; ME = externa 근섬유; Se = 장막; Ut = 요로상피. 이미지는 컨포칼 현미경을 사용하여 획득했습니다( 재료 표 참조). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

Ramesh et al. 방광암 치료에 아데노바이러스 형질도입을 사용하기 위한 전략 개발에 초점을 맞추었지만 18, 보다 최근의 보고서에서는 정상적인 요로상피 생물학/생리학 및 병태생리학을 연구하는 데 이러한 기술의 유용성을 입증했습니다 10,18,19,20,21 . 이 접근법의 중요한 특징은 다음과 같다 : (i) 설치류 방광벽 전체에서, 요로 상피 만이 형질 도입된다10,19,20,21,22. 쥐의 경우, 형질 도입은 대부분 우산 세포층으로 제한되는 반면, 마우스에서는 요로 상피 전체를 표적으로 삼을 수 있습니다. (ii) 이 접근법은 단백질 또는 siRNA를 발현하는 데 사용할 수 있습니다 10,19,20,21,22; (iii) 형질도입 효율은 70%-95%에 도달할 수 있습니다(예: 그림 3 참조)18,20; (iv) 형질도입 1일 후, 요로상피의 미세구조, 조직의 완전성, 고내성 장벽의 존재(경상피 저항성 측정으로 평가) 및 요로상피 분화 마커의 발현은 "정상"입니다10,19. 지금까지 언급 된 유일한 형태 학적 효과는 우산 세포 직경의 감소입니다 (위에서 볼 때). 그러나 3-4 일 후에 정상 크기로 되돌아갑니다10,19; (v) 요로상피는 최대 3개의 상이한 아데노바이러스로 동시에 형질도입될 수 있다18; (vi) 이식유전자 발현은 단백질 발현량에 영향을 미치는 IVP의 수를 적정하거나, 동물을 희생하기 전에 배양 시간을 연장 또는 단축하거나, tet-조절 시스템(tet-off)과 같은 다른 프로모터를 사용하여 변경할 수 있습니다19. 후자의 경우, transactivator/tet-repressor를 코딩하는 바이러스를 공동 발현한 다음 동물의 식단에서 독시사이클린의 농도를 변경하여 이식유전자의 발현을 조절할 수 있습니다.

전체 프로토콜은 비교적 간단하지만 이러한 실험을 수행할 때 고려해야 할 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 그 중 하나는 합리적인 순도의 고역가 바이러스 재고를 사용할 수 있다는 것입니다. 아데노바이러스는 상업적 공급업체, 기관 바이러스 생산 코어, 다른 연구자로부터 얻거나 사내에서 생산할 수 있습니다. 후자의 경우, Bert Vogelstein 실험실 AdEasy 시스템은 Addgene에서 구입할 수 있고, 이 접근법을 사용하여 생성된 아데노바이러스는 요로상피도입에서 잘 작동하기 때문에 권장된다4. 이 기술을 사용하면 pAdEasy-1 패키징 플라스미드(삽입물이 바이러스 유전자 E1 및 E3을 대체함), pAdEasier-1 박테리아 세포(바이러스 생산에 필요한 아데노바이러스 유전자를 암호화함) 및 HEK293T 세포(필요한 바이러스 E1 단백질을 발현함)에서 복제 결함 아데노바이러스의 생산을 사용하여 8Kb만큼 큰 cDNA를 암호화하는 아데노바이러스를 생성할 수 있습니다. 그러나, pAdEasy-1 패키징 플라스미드를 pAdEasy-2 패키징 플라스미드로 치환하면 패키징 크기가 추가로 2.7 kB 증가하지만, E1 및 E34 이외에 초기 유전자 E4가 결핍된 바이러스로서 다른 세포주(E1-형질전환된 인간 배아 망막 911 세포)를 사용할 필요가 있다. siRNA의 발현은 Kasahara et al.26에 상세히 기술되어 있는 pAdloss를 포함하는 몇몇 시스템을 사용하여 달성될 수 있다. 바이러스가 풍부한 세포 배양 배지를 사용하여 요로피를 형질도입하는 것이 가능할 수 있지만 이 방법은 신뢰할 수 없습니다. 대신, 대규모 바이러스 증폭, CsCl 그래디언트 정제, 겔 여과가 다량의 고역가 바이러스를 생성하는 가장 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다. -80°C에서 바이러스의 상대적 안정성과 상대적으로 많은 수율의 바이러스는 많은 실험에서 사용할 수 있는 일관된 바이러스 재고를 확보하는 이상적인 방법입니다.

이 프로토콜의 추가 중요한 단계에는 변환 프로토콜과 관련된 단계가 포함됩니다. 여기에는 세척제 및 희석제로 PBS(2가 양이온 없음)의 사용과 DDM 세제의 사용이 포함됩니다. 접합 복합체가 적절한 기능을 위해Ca2+에 의존하기 때문에, PBS는 접합 관련 장벽을 파괴함으로써 바이러스 진입을 촉진할 가능성이 있다. DDM도 중요합니다. Ramesh et al.이 보고한 바와 같이, 아데노바이러스 형질도입의 효율은 세제 처리가 없을 때 매우 낮다18. 그러나 세제의 작용 방식은 명확하지 않습니다. DDM을 사용한 10분 배양이 이상적이지만 5분으로 단축할 수 있습니다. 그러나 세제가 기저 조직에 예기치 않은 손상을 줄 수 있으므로 배양을 10분 이상 연장하지 않는 것이 좋습니다. 사용되는 바이러스의 양은 중요한 매개변수이며, 일반적으로 농도가 높을수록 더 많은 양의 이식유전자 발현과 더 높은 형질도입 효율이 발생합니다. 그러나 발현, 효율성 및 표현형의 최상의 조합을 제공하는 최적의 바이러스 농도는 경험적으로 결정되어야 합니다. 시작 농도로서 동물 당 5.0 x 106에서 2.0 x 107 IVP의 범위가 권장됩니다. 발현되는 단백질에 따라 70%-95% 범위 10,19,20,21,22의 효율이 발생합니다. 그러나, 일부 우성-음성 GTPase 구축물은 덜 효율적이며(30%-50%) 단일-세포 분석 접근법 4,20을 필요로 한다. 이러한 효율성의 차이는 형질도입 유전자의 회전율, 독성, 또는 형질도입에 사용되는 바이러스의 순도 및 수율을 반영할 수 있습니다. 후자는 플라크 분석을 수행하여 배제할 수 있습니다. 매우 중요하지는 않지만 바이러스가 방광에 남아 있는 시간은 바이러스가 CXADR 수용체에 부착될 수 있을 만큼 충분히 길어야 합니다. 30분 미만의 시간은 형질도입의 효율을 낮출 수 있는 반면, 배양 기간을 45분으로 연장하면 효율성을 높일 수 있습니다. 그러나 이것은 이식유전자에 의존적일 수 있습니다. 이 프로토콜의 마지막 중요한 단계는 표현형을 평가하기 전에 동물을 얼마나 오래 보관할 것인지 결정하는 것입니다. 이식유전자는1-2일 후에 가장 높은 발현을 나타내지만, 그 이후에는 발현이 감소할 수 있다. siRNA의 경우 단백질 자체의 회전율에 따라 달라집니다. 예를 들어, Rab-family GTPase인 Rab11a의 발현을 표적으로 하는 siRNA를 발현할 때, 효율적인 하향조절은 형질도입 후 72시간 후에야 관찰된다23. 따라서 수명이 긴 단백질(반감기가 일 단위로 측정됨)은 이 접근법을 사용하는 데 적합한 표적이 아닐 수 있습니다.

조사관은 또한 이 접근 방식과 관련된 주의 사항을 알고 있어야 합니다. 첫째, 그 유용성은 남성 설치류가 음경을 통해 카테터를 삽입하는 데 어려움이 있기 때문에 암컷 설치류로 제한될 수 있습니다. 그러나, 방광측정법을 시행할 때 사용하는 제제와 유사하게 방광의 돔에 카테터를 삽입하여 남성에서 이 프로토콜을 수행하는 것이 기술적으로 가능할 수 있다9. 이렇게 하면 세제나 바이러스를 도입하고 필요에 따라 세척을 수행할 수 있습니다. 두 번째 주의 사항은 단백질의 과발현이 세포 경로와 자원을 고갈시켜 단백질 응집, 세포 스트레스 경로의 활성화 및 사망과 같은 사건으로 이어질 수 있다는 것입니다27. 따라서, 일반적으로 세포 스트레스 및 세포 사멸의 마커를 사용하여 평가된 바와 같이 이식유전자 발현을 비독성 수준으로 제한하는 것이 현명합니다(물론 그것이 이식유전자 발현의 의도가 아닌 한). 세 번째 주의할 점은 일부 환경에서는 장기간의 아데노바이러스 발현이 면역 반응을 유발할 수 있다는 것이다28. 요로상피의 아데노바이러스 형질도입 자체가 면역 반응을 자극한다는 증거는 없지만10, 이는 이식유전자 의존적이며, 위에서 언급한 바와 같이 CLDN2 과발현은 방광염을 유발한다.

현재 연구자들은 형질전환 또는 조건부 요로상피 녹아웃 마우스의 사용, 형질주입 시약의 사용 또는 아데노바이러스 형질도입의 사용을 포함하여 요로상피에서 유전자 및 단백질 발현을 조절하는 데 사용할 수 있는 다양한 방법을 가지고 있습니다. 이 프로토콜의 주제인 후자의 방법은 비교적 쉽고 효율적이며 재현 가능합니다. 바이러스 스톡을 생성하는 데 필요한 세포 배양 시약의 초기 비용 외에, 매우 많은 양의 바이러스가 생성되어(수백 개의 형질도입을 수행하기에 충분함) 동물당 상대적으로 낮은 비용을 초래합니다. 아데노바이러스 형질도입은 요로상피 생물학을 연구하는 데 이용될 수 있습니다. 예를 들어, 엑소사이토시스 및 엔도사이토시스(endocytosis)에서 Rho-family 및 Rab-family GTPases, 구아닌-뉴클레오티드 교환 인자, 미오신 운동 단편 및 ADAM17의 중요성을 정의하기 위해 아데노바이러스 형질도입이 사용되었고, 아데노바이러스 형질도입은 최근 요로상피 기계 형질도입9을 연구하기 위해 사용되었다 . 마찬가지로, 아데노바이러스 형질도입은 인간 질병을 탐색하고 치료할 때 관련될 수 있습니다. 예를 들어, Ramesh et al. 초기에 제안된 아데노바이러스 형질도입은 종양 세포를 표적화하는 유용한 방법일 수 있다18. 그들의 연구는 원리 증명 접근법에 더 가깝지만 암세포에서 독소의 발현이나 면역 체계가 인식할 수 있는 에피토프의 발현이 유용한 전략이 될 것이라고 상상할 수 있습니다. 아데노바이러스 형질도입은 또한 유전자 산물의 과발현 또는 과소발현이 질병을 유발하는 질병을 이해하는 데 유용할 수 있습니다. 한 예로서, 간질성 방광염 환자의 방광으로부터의 생검에서는 CLDN2 발현이 90배 증가하였다29. 흥미롭게도, 아데노바이러스 형질도입을 이용한 CLDN2 과발현은 쥐에서 이 질환의 많은 증상을 재현한다10. 따라서 CLDN2는 이 장애가 있는 환자의 치료에서 하나의 표적이 될 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

이 작업은 P30DK079307(MGD에게), NIH 보조금 R01DK119183(GA 및 MDC에), NIH 보조금 R01DK129473(GA에), 미국 비뇨기과 협회 경력 개발 상 및 Winters Foundation 보조금(NM)을 통한 파일럿 프로젝트 상, 피츠버그 신장 연구 센터(P30DK079307)의 세포 생리학 및 모델 유기체 신장 이미징 코어, 그리고 S10OD028596(G.A.에게)에 의해, 이 원고에 제시된 이미지 중 일부를 캡처하는 데 사용되는 컨포칼 시스템의 구매 자금을 지원했습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL pipette Corning Costar (Millipore Sigma) CLS4488 sterile, serological pipette, individually wrapped
12 mL ultracentrifuge tube ThermoFisher 06-752 PET thinwall ultracentrifuge tube
15 mL conical centrifuge tube Falcon (Corning) 352097 sterile
18 G needle BD  305196 18 G x 1.5 in needle
20 mL pipette Corning Costar (Millipore Sigma) CLS4489 sterile, serological pipette, individually wrapped
50 mL conical centrifuge tube Falcon (Corning) 352098 sterile
5 mL pipette Corning Costar (Millipore Sigma) CLS4487 sterile, serological pipette, individually wrapped
Cavicide Henry Schein 6400012 Anti-viral solution
Cell culture dish - 15 cm Falcon (Corning) 353025 sterile, tissue-culture treated  (150 mm x 25 mm dish)
Cell scraper Sarstedt 893.1832 handle length 24 cm, blade length 1.7 cm
CsCl Millipore Sigma C-4306 Molecular Biology grade ≥ 98%
DMEM culture medium (high glucose) Gibco (ThermoFisher) 11965092 with 4.5 g/L glucose + L-glutamine + phenol red
EDTA Millipore Sigma EDS Bioiultra grade ≥ 99%
Fetal bovine serum  Hyclone (Cytiva) SH30070.03 defined serum
Glass pipette Fisher Scientific 13-678-20A 5.75 in glass pipette, autoclaved
Glycerol Millipore Sigma G-5516 Molecular Biology grade ≥ 99%
HEK293 cells ATCC CRL-3216 HEK293T cells are a variant of HEK293 cells that express the SV40 large T-antigen
Isoflurane Covetrus 29405
IV catheter - mouse Smith Medical Jelco 3063 24 G x 3/4 in Safety IV catheter  radiopaque
IV catheter - rat Smith Medical Jelco 3060 22 G x 1 in Safety IV catheter radiopaque
KCl Millipore Sigma P-9541 Molecular Biology grade ≥ 99%
KH2PO4 Millipore Sigma P5655 Cell culture grade  ≥ 99%
Na2HPO4•7 H2O Millipore Sigma 431478  ≥ 99.99%
NaCl Millipore Sigma S3014 Molecular Biology grade ≥ 99%
N-dodecyl-β-D-maltoside  Millipore Sigma D4641  ≥ 98%
Nose cone for multiple animals custom designed commercial options include one from Parkland Scientific (RES3200)
PD-10 column  GE Healthcare 17-085-01 Prepacked columns filled ith Sephadex G-25M
Penicillin/streptomycin antibiotic (100x) Gibco (ThermoFisher) 15070063 100x concentrated solution
Spectrophotometer Eppendorf  BioPhotometer
Stand and clamp Fisher Scientific 14-679Q and 05-769-8FQ available from numerous suppliers
Sterile filter unit Fisher Scientific (Nalgene) 09-740-65B 0.2 µm rapid-flow filter unit (150 mL)
Sterile filter unit 0.2 µm (syringe) Fisher Scientific  SLGV004SL Millipore Sigma Milex 0.22 µm filter unit that attaches to syringe
Super speed centrifuge Eppendorf  5810R with Eppendorf F34-6-38 fixed angle rotor (12,000 rpm)
Syringe (1 mL) BD  309628 1-mL syringe Luer-lok tip - sterile
Syringe (3 mL) BD  309656 3-mL syringe slip tip - sterile
Table-top centrifuge (low speed) Eppendorf  5702 with swinging bucket rotor
Transfer pipettes Fisher Scientific 13-711-9AM polyethylene 3.4 mL transfer pipette
Tris-base Millipore Sigma 648310-M Molecular Biology grade 
TrypLE select protease solution Gibco (ThermoFisher) 12604013 TrypLE express enzyme (1x), no phenol red
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima L-80 XP with Beckman SW41 rotor (41,000 rpm)
Vaporizer  General Anesthetic Services, Inc. Tec 3 Isoflurane vaporizer
Vortex Mixer VWR 10153-838 analog vortex mixer

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References

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생물학 문제 188
아데노바이러스 매개 형질도입을 이용한 천연 방광 요로상피에서의 형질전환 유전자의 발현
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Ruiz, W. G., Clayton, D. R., Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction. J. Vis. Exp. (188), e64584, doi:10.3791/64584 (2022).

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