Summary
Xenopus tropicalis es un modelo ideal para la investigación regenerativa ya que muchos de sus órganos poseen una notable capacidad regenerativa. Aquí, presentamos un método para construir un modelo de lesión cardíaca en X. tropicalis a través de la resección del ápice.
Abstract
Se sabe que en los mamíferos adultos, el corazón ha perdido su capacidad regenerativa, haciendo de la insuficiencia cardíaca una de las principales causas de muerte en todo el mundo. Investigaciones anteriores han demostrado la capacidad regenerativa del corazón del adulto Xenopus tropicalis, un anfibio anuro con un genoma diploide y una estrecha relación evolutiva con los mamíferos. Además, los estudios han demostrado que después de la resección del ápice ventricular, el corazón puede regenerarse sin cicatrización en X. tropicalis. En consecuencia, estos resultados previos sugieren que X. tropicalis es un modelo de vertebrados alternativo apropiado para el estudio de la regeneración cardíaca adulta. Aquí se presenta un modelo quirúrgico de regeneración cardíaca en el adulto X. tropicalis. Brevemente, las ranas fueron anestesiadas y fijadas; Luego, se realizó una pequeña incisión con tijeras de iridectomía, penetrando en la piel y el pericardio. Se aplicó una presión suave al ventrículo, y el ápice del ventrículo se cortó con tijeras. La lesión cardíaca y la regeneración se confirmaron por histología a los 7-30 días después de la resección (DPR). Este protocolo estableció un modelo de resección apical en adultos de X. tropicalis, que puede emplearse para dilucidar los mecanismos de regeneración cardíaca adulta.
Introduction
La insuficiencia cardíaca ha sido una de las principales causas de mortalidad en todo el mundo en los últimos años. Desde el año 2000, el número de muertes debidas a insuficiencia cardíaca ha ido aumentando con el tiempo. Más de 9 millones de personas murieron de miocardiopatía en 2019, lo que representó el 16% del número total de mortalidades a nivel mundial1. Debido a la pérdida de la capacidad regenerativa del corazón en mamíferos adultos, en algunos casos, no hay suficientes cardiomiocitos para mantener las funciones de contracción en el corazón, lo que afecta la función cardíaca y contribuye a la remodelación ventricular anormal y la insuficiencia cardíaca 2,3,4. De hecho, en los mamíferos, el corazón tiene la capacidad regenerativa más pobre en comparación con los otros órganos, como el hígado, los pulmones, los intestinos, la vejiga, los huesos y la piel. A medida que el envejecimiento de la población mundial se convierte en una megatendencia global, los desafíos que enfrentamos con las enfermedades cardíacas se intensificarán5.
Dilucidar los mecanismos de regeneración cardíaca puede tener implicaciones significativas para las terapias para la cardiopatía isquémica. Los informes han revelado que los corazones de ratones neonatos tienen una capacidad regenerativa después de la resección del ápice6. Sin embargo, esta capacidad regenerativa se pierde a los 7 días de edad7. Los estudios han demostrado que los corazones de los mamíferos adultos son incapaces de regenerarse porque su capacidad de proliferación de cardiomiocitos ha disminuido 8,9. Sin embargo, los corazones de los vertebrados inferiores poseen una poderosa capacidad regenerativa después de una lesión. Por ejemplo, el pez cebra 10, X. tropicalis11, Xenopus laevis12, tritón 13 y axolotl14 son capaces de regenerarse completamente después de la resección del ápice. Además, las otras partes de los cuerpos de algunos vertebrados inferiores también pueden sufrir una regeneración completa, como las extremidades de los tritones y las colas, lentes y brazos de las ranas tropicalescon garras 4,15,16.
El establecimiento de modelos de lesión cardíaca es el primer paso para dilucidar los mecanismos subyacentes a la regeneración cardíaca y tiene gran importancia en la investigación regenerativa. Los investigadores han desarrollado varios métodos para construir modelos de lesión cardíaca, incluyendo apuñalamiento, contuso, ablación genética, criolesión e infarto 5,6.
La criolesión, el infarto de miocardio (IM) y la resección del ápice son ampliamente utilizados para inducir lesión cardíaca, y el tipo de lesión puede tener efectos sustanciales en la siguiente regeneración de cardiomiocitos6. Dependiendo de la técnica quirúrgica, la respuesta del corazón a la regeneración puede variar. La criolesión causa la muerte celular masiva y produce cicatrices fibróticas en los corazones del pez cebra17, creando así un modelo que se asemeja al infarto de mamíferos. La resección apical se realiza cortando una parte de los tejidos ventriculares, lo que se ha hecho en el pez cebra10 y X. tropicalis11, sin causar cicatrices permanentes. Este estudio realizó la resección apical, que es una operación más simple y requiere menos instrumentos quirúrgicos que la criolesión. Utilizando el análisis de rastreo de linaje, un estudio previo demostró que la regeneración cardíaca está relacionada con la proliferación de cardiomiocitos que preexisten en los corazones del ratón6 y el pez cebra18, pero no existen informes para los anfibios. Por lo tanto, el modelo de resección del ápice en X. tropicalis juega un papel importante en la elucidación de los mecanismos subyacentes a las respuestas regenerativas.
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Protocol
Todos los protocolos experimentales relacionados con X. tropicalis fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Jinan.
1. Cirugía
- Preparación preoperatoria: Mantenga listas tijeras oftálmicas, fórceps oftálmicos, pinzas con aguja, bolas absorbentes, papel de filtro y suturas/agujas quirúrgicas para la resección del ápice en los corazones de X. tropicalis. Consulte la Tabla de materiales para obtener información detallada. Antes de su uso, esterilice todos los instrumentos quirúrgicos en autoclave y prepare una cantidad adecuada de hielo para su uso futuro.
- Anestesiar un adulto de X. tropicalis con tricaína colocándolo en 500 ml de solución de tricaína (1 mg/ml) a temperatura ambiente durante 4 min19, y luego colóquelo sobre una superficie de hielo en la mesa de operaciones para asegurarse de que la rana no se despierte durante el proceso operativo.
PRECAUCIÓN: Todo el procedimiento requiere 5-10 min; el tiempo de anestesia no debe ser demasiado largo, de lo contrario el X. tropicalis puede no ser capaz de despertarse después de la operación. - Toracotomía
- Coloque el abdomen anestesiado de X. tropicalis hacia arriba, y cubra el abdomen de la rana con una gasa preempapada en agua destilada para evitar el secado de la piel del animal durante la operación.
- Presione suavemente el pecho con fórceps, encuentre el centro del pecho paralelo a la extremidad anterior inferior, levante la piel con tijeras oftálmicas y haga suavemente una pequeña incisión de ~ 1 cm. Usando tijeras oftálmicas, levante la capa muscular debajo de la piel y cree una herida en el músculo central del pecho. Como el corazón está ubicado en la posición superior del sitio de la herida, presione suavemente el tórax con los fórceps oftálmicos para exprimir el corazón de la herida.
PRECAUCIÓN: Como la piel de X. tropicalis puede producir péptidos antimicrobianos, no es necesario emplear procedimientos de desinfección convencionales en el sitio quirúrgico de X. tropicalis. Cualquier desinfectante dañará la piel del X. tropicalis.
- Resección del ápice ventricular
- Sujete suavemente el pericardio con fórceps y rompa suavemente con tijeras oftálmicas cerca del ápice del corazón. Espere a que el pericardio se desprenda debido al bombeo sanguíneo sistólico (Figura 1A, B).
- Sostenga la punta del corazón con fórceps en la mano no dominante y levante el corazón ligeramente de acuerdo con el ritmo de contracción cardíaca. Cuando el corazón se contrae para recircular la sangre a través de los vasos sanguíneos, corte rápidamente el ápice del corazón (~ 14% del ventrículo) (Figura 1C).
- Para asegurar que la cantidad de resección del ápice sea aproximadamente el 14% de todo el corazón, analice el peso del corazón (HW) y el área de superficie con o sin resección20. Coloque el corazón en el pecho usando fórceps y una bola absorbente.
NOTA: No presione el corazón directamente con los fórceps; de lo contrario, se perforarán otras partes del corazón.
- Suturar la piel con una sutura de hilo quirúrgico no absorbente no sedoso 4-0 (Figura 1D). Tenga cuidado de evitar la sutura en la capa muscular para prevenir la mortalidad postoperatoria. Espere a que la herida de la piel sane naturalmente dentro de 1 semana después de la cirugía.
- En el grupo de operación simulada, realizar la toracotomía, abrir el pericardio y suturar, sin realizar la resección del ápice.
2. Recuperación quirúrgica
- Coloque el postoperatorio X. tropicalis con su abdomen hacia arriba en una placa de Petri que contenga una pequeña cantidad de agua desionizada (no inunde completamente al animal). Espere a que el X. tropicalis se despierte dentro de ~ 10 minutos.
- Al recuperar la conciencia, observe la movilidad y la actividad del animal, así como la sutura de la herida durante la actividad. Transfiera las ranas que han recuperado su equilibrio a un recipiente lleno de agua pura para el cultivo. Reemplace el agua con agua pura todos los días para evitar la infección de la herida.
NOTA: Con estas medidas, la tasa de supervivencia podría alcanzar ~90%. Un tiempo prolongado de anestesia y sangrado excesivo durante la cirugía conducen a la muerte, que generalmente ocurre el día de la cirugía.
3. Detección de la condición de reparación después de una lesión cardíaca
- Recolectar los corazones de X. tropicalis en múltiples puntos de tiempo después de la cirugía.
- Después de anestesiar el X. tropicalis con tricaína, abra el abdomen y use fórceps para extirpar los otros órganos y tejidos internos para encontrar la ubicación del corazón.
NOTA: Debido a la resección del ápice, es probable que el corazón se desarrolle junto con otros tejidos y órganos durante el proceso de reparación. A veces, se adhiere a la pared muscular y no es fácil de separar, por lo que debe manipularse con cuidado durante la recolección. - Después de encontrar el corazón, use fórceps para arrancar suavemente los otros órganos del corazón. Despegue suavemente los otros tejidos que rodean el corazón para exponer el corazón. Use fórceps para levantar suavemente el corazón y córtelo con tijeras. Coloque el corazón inmediatamente en PBS para eliminar cualquier resto de sangre y fotografíelo con un estereoscopio para su documentación (Figura 2).
- Después de anestesiar el X. tropicalis con tricaína, abra el abdomen y use fórceps para extirpar los otros órganos y tejidos internos para encontrar la ubicación del corazón.
- Deshidratación de gradiente
- Seque los corazones con papel de filtro para secar el exceso de residuos de PBS y colóquelos en una placa de cultivo celular de 24 pocillos. Use 1-2 ml de paraformaldehído al 4% para reparar los tejidos del corazón durante la noche. Al día siguiente, realice la deshidratación de etanol. Primero, use etanol al 70% durante la noche, seguido de etanol al 80%, etanol al 90% y etanol al 100% para la deshidratación del gradiente (1 h cada vez). Repita el uso de etanol 100% tres veces.
- Incrustación de parafina
- Tratar el tejido cardíaco deshidratado con xileno durante 6-8 min. Colocar el tejido tratado con xileno en un recipiente de vidrio lleno de cera de parafina a 65 °C durante 2-3 h.
NOTA: Es esencial evitar las burbujas de aire, ya que afectan a la sección durante el proceso de incrustación.
- Tratar el tejido cardíaco deshidratado con xileno durante 6-8 min. Colocar el tejido tratado con xileno en un recipiente de vidrio lleno de cera de parafina a 65 °C durante 2-3 h.
- Congelar el tejido incrustado a -20 °C durante 1 h y seccionarlo.
- Después de seccionar el corazón, realice las técnicas estándar de hematoxilina y eosina (H&E) y tinción tricrómica de Masson en las secciones11.
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Representative Results
Los corazones se recolectaron a 0 dpr, 7 dpr, 14 dpr y 30 dpr. El análisis morfológico reveló que el coágulo de sangre causado por la lesión cardíaca desapareció a 30 dpr (Figura 2). Al mismo tiempo, la apariencia de los corazones a 30 dpr en el grupo de resección fue similar a la de los corazones en el grupo de operación simulada; no había heridas evidentes (Figura 2). Después de la resección apical, se formó un coágulo de sangre y selló la herida en el ventrículo, como se observa en H&E (Figura 3) y la tinción tricrómica de Masson (Figura 4). Dentro de 14 dpr, el coágulo desapareció gradualmente y fue reemplazado por fibrina (Figura 4). De 14 dpr a 30 dpr, el miocardio reemplazó gradualmente la fibrina y reparó el ápice del ventrículo dañado (Figura 4). El análisis histológico no mostró diferencias entre el corazón simulado y resecado a 30 dpr (Figura 3 y Figura 4). Este análisis morfológico e histológico reveló que el adulto X. tropicalis podría reparar y regenerar el ápice ventricular lesionado en 30 dpr.
Figura 1: Procedimiento quirúrgico . (A) Imagen representativa de un corazón expuesto cubierto por el pericardio. (B) Imagen representativa de un corazón en la fase sistólica, durante la cual el pericardio fue despegado; La línea discontinua indica el sitio de la resección apical del corazón. (C) Imagen representativa de la resección del ápice del corazón. (D) Imagen representativa de la sutura cutánea después de la cirugía. Barras de escala = 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Análisis morfológico de corazones de X. tropicalis de 0 dpr a 30 dpr. (A) Imágenes representativas de corazones de los grupos de resección simulada (izquierda) y apical (derecha) a 0 dpr, con el ápice del corazón significativamente ausente en el grupo de resección. (B,C) Imágenes representativas de corazones del grupo simulado (izquierda) versus grupos de resección (derecha) a 7-14 dpr, con muchos coágulos de sangre apareciendo en los corazones del grupo de resección a 7 dpr. A 14 dpr, se observa una regeneración significativa en el sitio de resección apical, pero los bordes del ápice del corazón no son uniformes. (D) Imagen representativa de corazones de la farsa (izquierda) versus grupos de resección (derecha) a 30 dpr; El ápice del corazón resecado se ha regenerado casi por completo. Barras de escala = 1 mm. Abreviatura: dpr = días después de la resección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Análisis histológico de corazones de Xenopus tropicalis de 0 dpr a 30 dpr. Imágenes representativas de tinción de H&E usando corazones de los grupos simulados y de resección a 0 dpr a 30 dpr. (A) Imagen representativa de la tinción de H&E usando corazones del grupo simulado, con líneas discontinuas que indican los planos de amputación aproximados. (B) Imagen representativa de la tinción H&E usando corazones del grupo de resección a 0 dpr. (C-E) Imágenes representativas de tinción de H&E usando corazones del grupo de resección a 7-30 dpr, con grandes cantidades de glóbulos rojos acumulados dentro de la herida a 7 dpr (flechas). Una masa de fibrina ha aparecido en el sitio de resección a 14 dpr (puntas de flecha). Los corazones se han regenerado completamente sin cicatrices a 30 dpr. Barra de escala = 500 μm. Abreviatura: dpr = días después de la resección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Análisis de fibrosis miocárdica de corazones X. tropicalis de 0 dpr a 30 dpr. Imágenes representativas de la tinción de corazones de Masson de los grupos simulados y de resección de 0 dpr a 30 dpr. (A) Imagen representativa de la mancha de corazones de Masson del grupo simulado, con líneas discontinuas que indican los planos de amputación aproximados. (B) Imagen representativa de la tinción de corazones de Masson del grupo de resección a 0 dpr. (C-E) Imágenes representativas de la tinción de Masson de corazones del grupo de resección a 7-30 dpr, con grandes cantidades de glóbulos rojos acumulados dentro de la herida a 7 dpr (flechas). Una masa de fibrina ha aparecido en el sitio de resección a 14 dpr (puntas de flecha). Los corazones se han regenerado completamente sin cicatrices a 30 dpr. Barra de escala = 500 μm. Abreviatura: dpr = días después de la resección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La resección apical, que implica la amputación quirúrgica del ápice del corazón, ha sido descrita en peces cebra y ratones 6,18; sin embargo, esto no ha sido descrito en X. tropicalis. Este informe describe un modelo creíble de lesión cardíaca y demuestra que el corazón de X. tropicalis adulto puede regenerarse completamente después de la resección apical sin dejar cicatrices. Sin embargo, es necesario mejorar algunas deficiencias y prestar atención a ciertos detalles.
Aunque la resección apical puede establecer un modelo de lesión cardíaca, garantizar el mismo grado de escisión del corazón es un desafío debido a la diversidad de las ranas, que tienen diferentes tamaños cardíacos. Para garantizar que los corazones con ápices del mismo tamaño se resequen, es necesario seleccionar ranas del mismo tamaño, y el operador debe practicar extensamente antes del experimento.
En segundo lugar, la capacidad de localizar y exponer el corazón con precisión y rapidez es fundamental para el éxito del procedimiento, ya que el proceso de encontrar el corazón puede resultar en la punción de los vasos sanguíneos adyacentes y causar sangrado, lo que impide el progreso del procedimiento o incluso causa fracaso. La duración de la anestesia no debe ser demasiado corta ni demasiado larga. Si es demasiado corto, la rana puede despertarse antes de que se complete la operación, y si este proceso es demasiado largo, es probable que conduzca a la muerte de la rana. Como se mencionó en las secciones 2-5 del protocolo, la sutura debe hacerse con precaución. Para garantizar que la proporción de la cantidad de resección del ápice en comparación con todo el corazón sea aproximadamente la misma en todas las ranas, se analizan el peso del corazón (HW) y el área de superficie con o sin resección20, y una pequeña porción del ápice cardíaco se reseca para garantizar la exposición a la cámara6.
La criolesión, el IM y la resección apical son los tres métodos más utilizados para inducir lesión cardíaca en peces cebra y ratones 6,18,21. La limitación de este artículo es que solo se utilizó el tercer método, lo que significa que este trabajo no proporciona ninguna información sobre las diferentes respuestas regenerativas después de la lesión con los otros dos métodos6. La criolesión resulta en la muerte de un gran número de células en ~ 20% de la pared ventricular, similar a los infartos de mamíferos21. El IM, que también se llama oclusión de la arteria coronaria, tiene tasas de supervivencia más altas en X. tropicalis en comparación con la resección apical en ratones6, pero es más difícil de lograr en X. tropicalis porque los corazones de las ranas tropicales con garras son más pequeños que los de los ratones. El método de resección apical de X. tropicalis establecido en este estudio es más simple de realizar y tiene una alta tasa de supervivencia postoperatoria.
La resección apical desarrollada en este informe será un método significativo para investigar los mecanismos moleculares de regeneración en los corazones de X. tropicalis. Un estudio previo también demostró que Fosl1 es indispensable para la regeneración cardíaca en X. tropicalis después de la resección apical20. Este modelo de lesión cardíaca por resección apical en X. tropicalis se puede utilizar para aprender más sobre los mecanismos moleculares subyacentes a la regeneración cardíaca para promover el estudio de los genes y mecanismos moleculares relacionados con la regeneración cardíaca humana.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2016YFE0204700), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82070257, 81770240) y la Subvención de Investigación del Laboratorio Clave de Medicina Regenerativa, Ministerio de Educación, Universidad de Jinan (ZSYXM202004 y ZSYXM202104), China.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | GHTECH | 64-19-7-500ml | |
| Acid Alcohol Fast Differentiation Solution | Beyotime | C0163M | |
| Acid Fuchsin | aladdin | A104916 | |
| Alcohol Soluble Eosin Y Stainin Solution | Servicebio | G1001-500ML | |
| BioReagent | Beyotime | ST2600-100g | |
| Ethanol absolute | Guangzhou Chemical Reagent Factory | HB15-GR-0.5L | |
| Hematoxylin Stain Solution | Servicebio | G1004-500ML | |
| Neutral balsam | Solarbio | G8590 | |
| Operating Scissors | Prosperich | HC-JZ-YK-Z-10cm | |
| Paraffins | Leica | 39601095 | |
| Para-formaldehyde Fixative | Servicebio | G1101-500ML | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) powder | Servicebio | G0002-2L | |
| Phosphomolybdic acid hydrate | Macklin | P815551 | |
| Stereo microscope | Leica | ||
| surgical forceps | ChangZhou | zfq-11-btjw | |
| Surgical Suture | HUAYON | 18-5140 | |
| Tricaine | Macklin | ||
| Xylene | Guangzhou Chemical Reagent Factory | IC02-AR-0.5L |
References
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