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Research Article
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Il presente protocollo descrive un metodo per la validazione dei test comportamentali e la previsione bioinformatica dell'efficacia terapeutica di Zadi-5, una medicina tradizionale mongola, nella depressione.
Zadi-5 è una medicina tradizionale mongola ampiamente utilizzata per il trattamento della depressione e dei sintomi di irritazione. Sebbene gli effetti terapeutici di Zadi-5 contro la depressione siano stati indicati in studi clinici precedentemente riportati, l'identità e l'impatto dei composti farmaceutici attivi presenti nel farmaco non sono stati completamente chiariti. Questo studio ha utilizzato la farmacologia di rete per prevedere la composizione del farmaco e identificare i composti terapeuticamente attivi nelle pillole Zadi-5. Qui, abbiamo stabilito un modello di ratto di stress lieve cronico imprevisto (CUMS) e condotto un test in campo aperto (OFT), un'analisi del labirinto d'acqua di Morris (MWM) e un test di consumo di saccarosio (SCT) per indagare la potenziale efficacia terapeutica di Zadi-5 nella depressione. Questo studio mirava a dimostrare gli effetti terapeutici di Zadi-5 per la depressione e a prevedere il percorso critico dell'azione di Zadi-5 contro il disturbo. I punteggi verticali e orizzontali (OFT), SCT e il numero di attraversamento delle zone dei gruppi fluoxetina (controllo positivo) e Zadi-5 erano significativamente più alti (P < 0,05) rispetto a quelli dei ratti del gruppo CUMS senza trattamento. Secondo i risultati dell'analisi farmacologica di rete, la via PI3K-AKT è risultata essenziale per l'effetto antidepressivo di Zadi-5.
La depressione, nota anche come disturbo depressivo maggiore (MDD), è una grave malattia neuropsichiatrica responsabile di crescenti oneri medici ed economici per la società. A causa della complessità, della morbilità e dei tassi di mortalità associati, è stata condotta una quantità significativa di ricerche per trovare rimedi per il disturbo 1,2. Secondo un'indagine sulla salute mentale dell'Organizzazione Mondiale della Sanità, circa 350 milioni di persone soffrono attualmente di depressione e dei sintomi associati in tutto il mondo. Si prevede che la depressione supererà il cancro e le malattie cardiovascolari come principale causa di carico di malattia a livello globale entro il 2030. Pertanto, la prevenzione e il trattamento della depressione diventeranno una priorità globale nel prossimo futuro3. La patogenesi della MDD non è stata ancora chiarita. Tuttavia, è comunemente attribuito ai seguenti fattori: predisposizione genetica, disfunzione dell'asse ipotalamo-ipofisi-surrene, riduzione della secrezione di neurotrasmettitori, neuroinfiammazione indotta da disregolazione neuroimmune, apoptosi cellulare e ridotta proliferazione cellulare 4,5.
Tra questi fattori, la neuroinfiammazione indotta dalla disregolazione neuroimmune e l'alterata secrezione di fattori neurotrofici hanno ricevuto particolare attenzione per il loro ruolo nello sviluppo della depressione e di molte altre malattie psichiatriche6. Nell'ultimo decennio, gli studiosi hanno dimostrato che l'ippocampo è il sito dominante per le funzioni nervose rigenerative ed è coinvolto nella regolazione delle emozioni e della cognizione. A questo proposito, i neuroni dell'ippocampo sono riconosciuti come nuovi bersagli terapeutici per i farmaci antidepressivi in fase di sviluppo 7,8. Inoltre, è stato anche segnalato che l'ippocampo è coinvolto nella memoria a breve e lungo termine nell'apprendimento e nel consolidamento dei ricordi. In particolare, la carenza di neuroni piramidali nella regione CA1 dell'ippocampo causa amnesia retrograda e anterograda9. Una tipica strategia terapeutica antidepressiva mira a migliorare la proliferazione cellulare e la neurogenesi nel giro dentato dell'ippocampo. I composti naturali derivati da prodotti e le piccole molecole sintetizzate sulla base di tecniche di chimica farmaceutica sono considerate le fonti primarie di agenti terapeutici innovativi per varie condizioni neuropsichiatriche.
Le medicine tradizionali mongole, che hanno una lunga storia e un sistema medico teorico ben supportato, discendono dai nomadi dell'altopiano mongolo Questi farmaci mostrano effetti multi-target e multi-pathway a causa dei vari componenti medicinali che agiscono di concerto per generare funzioni sinergiche. Zadi-5 è una formulazione ben consolidata tra questi farmaci ed è stata registrata per la prima volta in "Clinical Experience of Dr. Gao Shi", scritto da un eccezionale clinico mongolo chiamato Dr. Gao Shi (1804-1876). È stata pratica clinica per molto tempo in Mongolia usare queste pillole per trattare i sintomi di angoscia, palpitazioni, irritazione e dolore lancinantecardiaco 10,11. Inoltre, Zadi-5 ha dimostrato effetti nell'alleviare la depressione post-ictus nei pazienti affetti12. La recente ricerca sperimentale sul CUMS ha rivelato che la formulazione Zadi-5 allevia la depressione regolando i neurotrasmettitori centrali13; infatti, con Zadi-5, sono stati rilevati livelli aumentati di fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF) e del recettore tirosin-chinasico B (TrkB) e correlati con un miglioramento dell'apprendimento e della memoria in un modello di ratto di depressione14. Tuttavia, l'esatto meccanismo d'azione di Zadi-5 per tale alleviamento della depressione non è stato chiarito.
Questo studio mirava a dimostrare gli effetti terapeutici di Zadi-5 contro la depressione nei ratti utilizzando un test comportamentale e identificare i componenti di Zadi-5 utilizzando la farmacologia dei sistemi di medicina tradizionale cinese (TCMSP) e Swiss Target Prediction per prevedere i potenziali meccanismi alla base dell'efficacia di Zadi-5, una medicina tradizionale mongola, nel trattamento della depressione.
Tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati dall'Ethics of Animal Experiment Care Committee dell'Università di Medicina della Mongolia Interna e hanno seguito le linee guida del National Institutes of Health sulla cura e l'etica degli animali. I ratti maschi di Sprague Dawley (SD) di 8 settimane di età (200 g ± 20 g) sono stati alloggiati in una stanza con temperatura controllata (22 °C ± 2 °C) e umidità (55% ± 15%) in un ciclo di luce/buio regolato di 12 ore/12 ore per 1 settimana. Vedere la Figura 1 per il flusso di lavoro dell'analisi farmacologica di rete.
1. Test comportamentale nei ratti
× 100% (1)2. Predizione farmacologica di rete
3. Analisi statistica
Test comportamentali negli animali
Risultati dei test comportamentali nel modello di depressione del ratto indotto da CUMS
Non sono state riscontrate differenze significative tra i gruppi testati per il punteggio OFT, il consumo di saccarosio e l'analisi MWM prima della stimolazione CUMS. Dopo aver stabilito il modello CUMS, i punteggi verticali e orizzontali del gruppo MOD erano inferiori a quelli del gruppo CON (P < 0,05). Rispetto al gruppo MOD, i punteggi verticali e orizzontali dei gruppi POS e Zadi-5 erano significativamente più alti (P < 0,05) (Figure 2A,B).
Il giorno 0, i gruppi testati non hanno mostrato differenze significative nel consumo di saccarosio (%). Il consumo di saccarosio (%) dei gruppi Zadi-5 e POS è stato superiore a quello del gruppo MOD il giorno 28 (Figura 2C).
Rispetto al gruppo CON, la latenza del gruppo MOD per trovare la piattaforma nel MWM è stata significativamente più alta (P < 0,01). La latenza nel gruppo POS è risultata nettamente inferiore rispetto al gruppo MOD. Le latenze dei ratti nel gruppo Zadi-5 erano inferiori rispetto al gruppo MOD, ma non in misura significativa. Per quanto riguarda il conteggio degli attraversamenti di zona, il gruppo MOD ha mostrato meno attraversamenti rispetto al gruppo CON. I gruppi POS e Zadi-5 hanno mostrato più incroci rispetto al gruppo MOD (Figura 2D,E).
Predizione della farmacologia di rete
C'erano 134 componenti attivi in Zadi-5 e 220 candidati proteici bersaglio sono stati recuperati per questi componenti. Inoltre, sono stati previsti 1.000 bersagli proteici correlati alla depressione. Secondo l'analisi del diagramma di Venn, 86 bersagli sovrapposti sono stati identificati come bersagli critici legati alla depressione di Zadi-5 (Figura 3). Sulla base di questi risultati, sono stati costruiti "Zadi-5 bersagli erbe-ingredienti-malattia" e un'analisi di rete PPI dei candidati bersaglio (Figura 4A, B, Figura 5 e Tabella 2). La via PI3K-AKT ha mostrato bordi relativamente irregolari, indicando che questa via è essenziale per l'effetto antidepressivo di Zadi-5. Secondo l'analisi della via KEGG, la via di segnalazione PI3K-AKT si è classificata al settimo posto (Figura 6) ed è stata associata a molte vie di segnalazione. Di conseguenza, è stato considerato relativamente più importante rispetto alle altre vie di arricchimento (Figura 7A-C e Figura 8).
Figura 1: Flusso di lavoro dell'analisi farmacologica di rete per la validazione in vivo . Abbreviazioni: PPI = interazione proteina-proteina; KEGG = Enciclopedia dei geni e dei genomi di Kyoto; GO = Ontologia genica; OFT = prova in campo aperto; MWM = Labirinto d'acqua di Morris; SCT = test di consumo di saccarosio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Effetti di Zadi-5 sul modello di depressione del ratto indotto da CUMS. (A) Punteggi verticali OFT. (B) Punteggi orizzontali OFT. (C) Livello di consumo di saccarosio (%) il giorno 0 e il giorno 28. (D) Tempo di latenza per il test MWM. (E) Numeri di attraversamento della zona per la prova MWM. ##P < 0,01 indica che il gruppo CUMS MOD ha mostrato differenze significative rispetto al gruppo CON. *P < 0,05 indica che il gruppo POS e il gruppo Zadi-5 hanno mostrato differenze significative rispetto al gruppo MOD. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Diagramma di Venn dei bersagli proteici di Zadi-5 e delle proteine associate alla depressione. Il cerchio rosso rappresenta i bersagli dei componenti attivi di Zadi-5, mentre il cerchio blu rappresenta le proteine associate alla depressione. L'intersezione dei due colori rappresenta le proteine sovrapposte che possono essere identificate come i bersagli terapeutici per l'alleviamento della depressione da parte di Zadi-5. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Costruzione della "Zadi-5 herbs-ingredients-disease targets network". I parallelogrammi rossi rappresentano Zadi-5 e le sue erbe, mentre i cerchi rosa, arancioni, gialli, verdi e viola rappresentano i componenti di ciascuna erba. I diamanti blu rappresentano le proteine associate alla depressione, che è l'esagono verde. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: PPI dei bersagli proteici sovrapposti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Il grafico a bolle per i primi 20 termini arricchiti con KEGG basato su 86 target proteici sovrapposti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: I principali risultati bioinformatici per i componenti Zadi-5 e i bersagli proteici associati alla depressione. (A) Le prime 20 funzioni molecolari sovrapposte GO termini di Zadi-5 e depressione. (B) I primi 20 componenti cellulari sovrapposti GO termini di Zadi-5 e depressione. (C) I primi 20 processi biologici sovrapposti GO termini di Zadi-5 e depressione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: La rete di arricchimento della via di segnalazione degli ingredienti Zadi-5-PI3K-AKT per il trattamento della depressione. Il cerchio rappresenta gli ingredienti di Zadi-5, gli esagoni indicano ogni farmaco di Zadi-5 e i diamanti verdi rappresentano i bersagli arricchiti della via di segnalazione PI3K-AKT. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Sequenza e metodi di applicazione degli stimoli di stress per l'induzione di CUMS in soggetti di ratto. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 2: I codici ID utilizzati nella Figura 2. Abbreviazioni: MF = Myristica Fragrans Inula IH = Innula helenium L.; FC = Fructus Choerospondiatis; AL = Aucklandia lappa Decne.; PL = Piper Longum L. Clicca qui per scaricare questa tabella.
File supplementare 1: Immagini di screenshot del protocollo farmacologico di rete. Fare clic qui per scaricare il file.
File supplementare 2: Zadi-5 componenti-proteine-rete di depressione. Fare clic qui per scaricare il file.
File supplementare 3: Tipo di rete. Fare clic qui per scaricare il file.
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Il presente protocollo descrive un metodo per la validazione dei test comportamentali e la previsione bioinformatica dell'efficacia terapeutica di Zadi-5, una medicina tradizionale mongola, nella depressione.
Siamo grati per la strumentazione e il laboratorio forniti dalla facoltà di medicina mongola dell'Università di Medicina della Mongolia Interna, in Cina. Questo studio è stato sostenuto dalla National Natural Sciences Foundation of China (81760762) e dal Science and Technology Plan Project della Commissione sanitaria della Mongolia Interna, Cina (202201300).
| Software | Cytoscape& | nbsp; versione 3.7.0 | |
| Fluoxetina | Lilly Suzhou Pharmaceutical Co., Ltd | J20160029 | |
| Morris sistema di analisi video del percorso del labirinto d'acqua | Tai Meng Tech Co., Ltd | WMT-200 | |
| Sprague Dawley ratti | Beijing Biotechnology Co., Ltd, Cina | SCXK (JING) 2016-0002 | |
| Tai | Meng Tech Co., Ltd | Centro di preparazione farmaceutica della pillolaZH-ZFT | |
| Zadi-5 | dell'ospedale mongolo internazionale, Mongolia interna, | Cina M1301006 |
