Summary
바로 사용할 수있는 냉동 뉴런은 시냅스 기능을 평가하기위한 강력한 도구입니다. 여기에서는 96웰 플레이트를 사용하여 냉동 재고에서 쉽게 추출한 저밀도 1차 배양을 소개합니다.
Abstract
신경 세포 배양은 시냅스 기능 및 약물 스크리닝을 평가하는 데 유용한 시스템입니다. 특히, 일차 해마 뉴런의 저밀도 배양은 개별 뉴런 또는 세포 내 구성 요소의 연구를 가능하게합니다. 우리는 저밀도 1차 해마 배양을 사용하여 면역세포화학, 신경 극성, 시냅스 형태 및 발달 변화에 의해 뉴런 내에서 세포내 단백질 국소화를 보여주었습니다. 최근에, 바로 사용할 수있는 뉴런의 냉동 주식이 상업적으로 이용 가능하게되었다. 이러한 얼어 붙은 뉴런은 동물 실험을 준비하는 데 필요한 시간을 줄이고 사용되는 동물 수를 줄이는 데 기여합니다. 여기에서는 96웰 플레이트를 이용한 재현 가능한 저밀도 1차 배양 방법을 소개합니다. 우리는 쥐 배아 해마에서 상업적으로 이용 가능한 냉동 뉴런 재고를 사용했습니다. 뉴런은 특정 시점에서 신경교 세포의 성장을 감소시킴으로써 배지 변화 없이 장기간 안정적으로 배양될 수 있습니다. 저밀도 배양을 사용하는 이 고처리량 분석은 시냅스 가소성에 대한 재현 가능한 이미징 기반 평가를 가능하게 합니다.
Introduction
학습과 기억에 관여하는 시냅스 기능을 평가할 수 있는 시험관 내 실험 시스템의 개발이 중요합니다. 신경 세포 배양은 시험관 내에서 시냅스 기능을 평가하는 데 유용한 시스템입니다. 신경 세포 배양 기술은 1980 년대에 처음 사용되었으며, 1990 년대에는 단백질 성분의 세포 내 국소화, 단백질 트래피킹, 신경 극성, 척추 형태, 시냅스 발달 및 가소성 측면에서 개별 뉴런의 연구를 위해 1 차 해마 뉴런의 저밀도 배양이 개발되었습니다 1,2,3 . 그러나이 기술에는 동물 짝짓기, 배아 해부, 배양 용기 준비, 일주일에 한 번 배지 변경으로 3 주 동안 세포 배양 등 많은 단계가 있습니다. 또한 고급 기술이 필요합니다3.
우리는 쥐 배아 9,10에서 해리 된 해마 뉴런의 냉동 주식을 개발했습니다. 뉴런의 동결된 주식은 바로 사용할 수 있으며, 세포(11,12)를 배양하기 위한 진보된 기술이 필요하지 않다. 즉, 냉동 된 주식에서 뉴런을 배양하는 것은 실험자의 기술에 의존하지 않습니다. 동물 실험(예: 동물 실험 허가, 시간 제한 임신 동물 배치, 쥐 배아 해부)의 필요성을 제거하여 사용되는 동물의 수를 줄입니다. 최근에, 고품질의 즉시 사용할 수있는 냉동 뉴런 주식이 상업적으로 이용 가능하게되었습니다. 여기에서, 배아일(E) 18랫트 해마13,14,15로부터 시판되는 동결 주식을 사용하였다. 동결된 주식에서 뉴런을 배양하는 것은 신경교 조절 배지 또는 신경교 세포와의 공동 배양을 필요로 하지 않습니다. 추가 혈청이 없는 통상적인 1차 배양 배지를 사용하여 세포를 배양할 수 있습니다. 따라서 재현 가능한 데이터를 얻을 수 있습니다. 또한, 신경교 세포의 성장이 감소하기 때문에 세포 파종 후 3주 동안 배지 교환이 필요하지 않습니다(그림 1).
수지상 가시는 대부분의 흥분성 시냅스의 시냅스 후 구획입니다. 그들은 수용체 단백질, 시냅스 후 스캐폴드 단백질 및 액틴 세포골격 단백질을 포함합니다. 우리는 액틴 결합 단백질 drebrin 5,6,7,16,17,18에 초점을 맞추 었습니다. 드레브린은 성숙한 뉴런19의 척추 머리에 축적되며, 우리는 드레브린을 시냅스 상태 15,17,20,21,22,23의 마커로 보고했습니다. 드레브린을 판독값으로 사용하여 고함량 분석을 수행함으로써 최근 N-메틸-D-아스파르트산형 글루타메이트 수용체(NMDAR)10에 대한 펜시클리딘 유사체의 억제 효과와 시냅스 상태에 대한 천연 화합물 및 생약물의 NMDAR 의존적 효과15를 보고했습니다.
여기에서는 저밀도에서 뉴런의 동결 주식을 배양하는 방법을 자세히 설명합니다. 또한 96웰 플레이트를 사용한 시냅스 상태의 drebrin 이미징 기반 평가를 보여줍니다.
Protocol
1. 플레이트 코팅
- 96웰 마이크로플레이트를 폴리-L-라이신(1mg/mL, 0.1M 붕산염 완충액[pH: 8.5]에 희석; 100μL/웰)으로 코팅하고 37°C에서 밤새 배양합니다.
알림: 사용해야 하는 우물만 코팅하십시오. 여기에서 수행 된 실험에서는 중간 60 웰이 사용됩니다. 붕산염 완충액은 멸균된 물에서 50mM 붕산 및 12mM 붕산염을 혼합함으로써 제조된다. - 멸균 된 물 (250 μL / 웰)로 플레이트를 두 번 씻으십시오.
- 보충제가 없는 신선한 배양 배지(250μL/웰)로 플레이트를 한 번 세척합니다.
- 깨끗한 벤치에서 접시를 20 분 동안 건조시킵니다.
- 플레이트를 알루미늄 호일로 싸서 사용할 때까지 4 ° C에서 보관하십시오 (1 개월 동안 유효).
2. 세포 파종
- 코팅된 플레이트에 배양 배지 50μL/웰을 추가하고 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 30분에서 1시간 동안 보관합니다. 주변 웰을 멸균수(200μL/웰)로 채웁니다.
알림: 배양 배지는 50x B-27, 400x Glutamax 및 100 U/mL의 페니실린/스트렙토마이신을 신경기저 배지에 첨가하여 준비됩니다(자세한 내용은 재료 표 참조). - 액체 질소 탱크에서 뉴런 저온을 제거합니다. 여기에 사용된 뉴런은 DMSO-동결보존된 뉴런(11)이었다.
- 극저온을 37°C 열 블록에 최대 3분 동안 담그고 내용물을 부분적으로 해동합니다. 저온을 너무 오랫동안 예열하지 마십시오. 내용물이 해동되는 즉시 50mL 튜브로 옮깁니다.
- 넓은 기공 팁이 있는 1mL 피펫을 사용하여 뉴런 극저온 내용물을 멸균된 50mL 튜브에 적하(50μL/s)로 천천히 옮깁니다.
- 빈 극저온을 1mL의 배양 배지(실온; RT)를 참조하십시오. 이 배양액 1mL를 극저온 적가(50μL/s)에서 세포 현탁액이 들어 있는 50mL 튜브로 옮깁니다.
- 9mL의 배양 배지(RT)를 50mL 튜브에 적하(0.5mL/s)하고 부피를 11mL로 구성합니다. 피펫팅을 반복하지 말고 세포 현탁액을 천천히 혼합하십시오.
- 세포 번호를 세십시오 (세포 카운터 또는 혈구계 사용).
- 모든 세포 현탁액을 저장소로 옮기고 넓은 기공 팁(1.0 x 104 cells/well)이 있는 다채널 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 96웰 플레이트에 분주합니다. 배양 배지 증발을 줄이려면 주변 웰을 멸균 된 물로 채 웁니다 (단계 2.1).
참고: 이 연구는 배지 교환 없이 3주 배양에 대해 배양 배지 증발이 작다는 것을 확인합니다. 배지의 감소율은 3.6 % (n = 120 웰)입니다. 따라서 삼투압 변화는 3 주 잠복기 동안 과감하지 않습니다. - 뉴런을 37°C, 5%CO2 배양기에서 1-2시간 동안 인큐베이션한다.
- 배양 배지를 웰당 예열된 배양 배지(37°C) 100μL로 교체하고 37°C, 5%CO2 인큐베이터에 다시 넣습니다(배양 중 배지 변경이 필요하지 않음).
3. 아라-C 치료
- 시험관 내 4일(DIV)에 시토신 β-D-아라비노-푸라노사이드(Ara-C)를 웰당 최종 농도 0.2μM로 첨가하여 신경교 세포의 성장을 감소시킵니다.
4. 약물 치료
- 시험관 내 21 일에 세포를 관심 약물로 치료하십시오.
- 약물 치료 동안 플레이트의 온도를 37°C로 유지하십시오.
- 양성 대조군의 경우, 고정 전에 10분 동안 세포를 100μM 글루타메이트(최종 농도는 웰당)로 처리합니다.
5. 고정
- 고정을 위해 0.1M 인산염 완충액(100μL/웰)에 4% 파라포름알데히드를 사용하십시오.
- ~20분 고정 후 인산염 완충 식염수(PBS; 250μL/웰)로 웰을 각각 5분 동안 2회 세척합니다.
6. 면역세포화학
- 세포를 PBS(250μL/웰)로 1회 5분 동안 세척합니다.
- PBS에서 0.1% 트리톤 X-100(100μL/웰)으로 세포를 5분 동안 투과시킵니다.
- 세포를 PBS(250μL/웰)로 각각 5분 동안 3회 세척합니다.
- 차단을 위해 PBS (PBSA; 100 μL / 웰)에서 3 % 소 혈청 알부민을 RT에서 1 시간 동안 사용하십시오.
- 항-드레브린(1:1) 및 항미세소관 관련 단백질 2(MAP2)(1:000) 항체(60μL/웰)와 함께 세포를 4°C에서 밤새 배양합니다.
- 세포를 PBS(250μL/웰)로 각각 5분 동안 4회 세척합니다.
- 적절한 2차 항체와 4',6-디아미디노-2-페닐인돌, 디하이드로클로라이드(DAPI; 1:1000)를 PBSA(60μL/웰) 중 RT에서 2시간 동안 배양합니다.
- 세포를 PBS(250μL/웰)로 각각 5분 동안 4회 세척합니다.
- 세포를 0.1% 아지드화나트륨(150μL/웰)이 포함된 PBS에 보관합니다.
7. 이미지 획득 및 분석
- 이미지를 획득하려면 적절한 현미경을 사용하십시오.
- 뉴런의 세포체를 식별하려면 MAP2 양성 및 DAPI 양성 영역을 모두 사용하십시오.
- 뉴런의 수상 돌기를 식별하려면 세포체없이 MAP2 양성 신호를 사용하십시오.
- 드레브린 클러스터를 식별하려면 MAP2 양성 수상 돌기를 따라 드레브린 양성 신호를 사용하십시오.
Representative Results
프로토콜에 따라 뉴런을 96웰 플레이트에서 21일 동안 배양한 다음 글루타메이트로 처리했습니다(그림 1). 뉴런은 3주 동안 배양액을 교환하지 않고 정상적으로 발달했습니다(그림 2). 세포를 여러 농도의 글루타메이트(멸균수에 희석한 1μM, 3μM, 10μM, 30μM, 100μM)로 10분 동안 처리하고 고정했습니다. 면역세포화학을 수행하고, sCMOS 카메라가 있는 자동 형광 현미경을 사용하여 드레브린 및 MAP2의 형광 이미지를 획득하였다. 그림 3에서 볼 수 있듯이 드레브린 양성 수지상 가시는 MAP2 양성 수상 돌기를 따라 명확하게 관찰됩니다. 글루타메이트 자극은 NMDAR를 통해Ca 2+ 유입을 유도하여 수지상 가시에서 드레브린 탈출을 유발하여 드레브린 클러스터 밀도를 감소시키는 것으로 나타났습니다 5,17. 따라서, 우리는 글루타메이트 자극10에 대한 drebrin 클러스터 밀도의 용량 의존적 감소를 관찰했다 (그림 4). 그림 5에서 볼 수 있듯이이 방법은 drebrin이 시냅스 상태의 마커로 사용되는 경우 재현성이 높습니다.
그림 1: 방법의 구성표. 뉴런을 96웰 플레이트에서 21일 동안 배양한 후 글루타메이트로 처리하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 96웰 플레이트를 사용한 배양된 뉴런의 명시야 이미지. 위상차 이미지는 공초점 정량 이미지 세포분석기를 사용하여 각 발달 단계(DIV 1, 7, 14, 21)에서 획득하였다. 스케일 바: 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 면역염색된 배양된 뉴런의 대표 이미지. (왼쪽) 드레브린(녹색)과 MAP2(빨간색)의 병합된 형광 이미지. 드레브린 및 MAP2의 각 형광 이미지는 각각 중간 및 우측 패널에 나타났다. 흰색 사각형은 아래 확대된 영역을 나타냅니다. 스케일 바; 상단 패널: 50 μm, 하단 패널: 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 정규화된 드레브린 클러스터 밀도의 글루타메이트 의존적 용량-반응 변화. (A) 0 μM, 10 μM 및 100 μM 글루타메이트로 처리된 웰에서 드레브린(녹색) 및 MAP2(적색)를 사용하여 면역염색된 대표적인 형광 이미지(왼쪽에서 오른쪽으로). 스케일 바: 50 μm. (B) 드레브린 클러스터 밀도는 대조군(0 μM)의 평균에 의해 정규화되었다. 0 μM, N = 58 웰; 1 μM, N = 46; 3 μM, N = 54; 10 μM, N = 45; 30 μM, N = 54; 100 μM, N = 55, 다른 로트를 사용한 13 개의 실험에서. ** P < 분산 분석 후 Dunnett의 다중 비교 테스트에 의한 대조군 (0 μM) 대비 0.01입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 드레브린 클러스터 밀도의 글루타메이트 의존적 용량-반응 변화. 서로 다른 로트를 사용한 6개의 실험에서 얻은 원시 데이터입니다. N = 각 농도에 대해 4웰(0μM, 3μM, 10μM, 30μM 및 100μM). 값은 평균± SEM으로 표현됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : 전기 생리 학적 실험에 뉴런의 동결 된 주식의 적용. (A) 미세 전극 어레이 (MEA) 플레이트를 사용한 전기 생리 학적 실험을위한 프로토콜. 코팅: 세포를 플레이팅하기 하루 전에, 각각의 48-웰 MEA 플레이트를 폴리에틸렌이민(PEI: 0.1%) 용액으로 미리 코팅하고, 37°C에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, MEA 플레이트를 멸균된 물로 3x 세척하고, 1시간 동안 건조시켰다. 이어서, MEA 플레이트를 4°C에서 밤새 유지하였다. 고밀도 배양: 뉴런의 50,000개 세포/웰을 48웰 MEA 플레이트에 플레이팅했습니다. 세포 파종 단계는 전술한 프로토콜의 섹션 2에 기재된 바와 같이 수행하였다. 라미닌 (20 μg / mL) 첨가 배양 배지 (신경 기저 배지에 2 v / v % B-27, 2.5 mM 글루타맥스 및 100 μg / mL의 페니실린 / 스트렙토 마이신 추가)를 사용하여 뉴런을 플레이트화했습니다. 그 후, 뉴런을 배양액에서 37°C, 5%CO2에서 배양하였다. 배지는 DIV 1에서 DIV 3까지의 배양 배지와 완전히 교환되었습니다. Ara-C를 DIV 4 (최종 0.2 μM)에서 첨가하였다. DIV 5 이후부터 일주일에 2 번, 배지의 50 %가 배양 배지로 변경되었습니다. MEA 플레이트의 각 웰 상의 뉴런의 활성을 MEA 시스템으로 기록하였다. (B) 자발적인 뉴런 활성은 DIV 21에서 12.5kHz/채널의 샘플링 속도로 MEA 시스템을 사용하여 5%CO2 분위기 하에 37°C에서 획득하였다. 웰 내의 16개 채널 중 4개 채널의 녹음이 표시됩니다. 모든 녹음에 버터워스 대역 통과 필터(200-3,000Hz)가 적용되었습니다. 화살촉은 동기화된 버스트 발사 타이밍을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이 방법에서 중요한 단계는 세포 현탁액을 해동하는 것입니다. 너무 따뜻해지기 전에 세포 현탁액을 옮기는 것이 매우 중요합니다. 그러나 삼투압의 급격한 변화를 피하려면 세포 현탁액을 한 번에 많은 양의 배지로 옮기지 마십시오. 배양 배지를 적가하는 것도 삼투압의 갑작스러운 변화를 방지하는 데 중요합니다.
뉴런은 24웰 플레이트, 8웰 챔버, 60mm 접시 또는 MED 프로브와 같은 다른 배양 용기에서 배양할 수 있습니다. 그러나 이러한 경우 최종 농도와 Ara-C 첨가시기를 조정해야합니다. 또한 뉴런의 밀도는 다양한 유형의 실험에서 최적화되어야합니다. 예를 들어, 전기생리학적 실험을 위해서는 고밀도 배양이 필요하며, 이 경우 일주일에 두 번 배지 교환이 필요합니다(그림 6). 따라서 저밀도 배양은 고밀도 배양보다 더 적은 단계가 필요합니다.
저밀도 신경 배양에는 종종 고급 기술이 필요합니다. 그러나 바로 사용할 수 있는 냉동 재고를 사용하면 이 문제가 해결됩니다. 설명 된 방법은 실험자의 기술에 의존하지 않습니다. 냉동 주식의 품질은 안정적이며 액체 질소에 보관하고 최대 4 년 동안 온도 변화를 피하는 한 안정적으로 배양 할 수 있습니다.
배지 교환 없이 3주 동안 세포를 배양하면 상당한 삼투압 변화 또는 배양 배지 증발이 있는지에 대한 질문이 제기됩니다. 그러나 배양액 증발량이 적은 것을 확인했습니다 (환원율 3.6 %). 시냅스 단백질의 국소화와 뉴런의 형태는 3 주 후에 정상으로 보입니다. 따라서, 배지 교환 없이 3주간 배양은 배양된 뉴런의 상태에 영향을 미치는 큰 삼투압 변화를 일으키지 않는다. Ara-C 처리 후 플레이트를 인큐베이터에 보관하는 것도 증발을 최소화하는 중요한 포인트입니다.
동결된 스톡 뉴런의 사용에 관한 제한은 없다. 그러나 저밀도 배양 방법에는 몇 가지 한계가 있습니다. 저밀도 배양이 뉴런의 형태학적 관찰, 시냅스 기능 평가 및 GFP 형질감염에 적용될 수 있음을 확인했습니다. 그러나 우리는 살아있는 세포 이미징을 조사하지 않았습니다. 또한, 위에서 언급했듯이, 전기 생리학을 수행하기 위해서는 고밀도 배양이 필요합니다.
시냅스 성숙은 일반적으로3주 7주가 소요되며, 배양된 뉴런이 끝까지 적절한 시냅스를 가지고 있는지 확인할 수 없습니다. 3 주 후에 시냅스 성숙이 좋지 않으면 다시 배양해야합니다. 실험을 시작하기 전에 뉴런의 품질을 알면이 3 주를 절약 할 수 있습니다. 따라서 실험을 효율적으로 수행하기 위해서는 사전에 뉴런의 품질을 확인하는 것이 가장 좋다. 냉동 된 주식은 사전에 뉴런의 품질을 확인하는 것을 가능하게합니다. 냉동 재고의 각 배치는 한 깔짚의 쥐에서 생성되며 품질 검사를 위해 각 배치의 재고 중 하나를 사용할 수 있습니다. Drebrin은 뉴런의 품질 검사를위한 좋은 마커입니다. 설명 된 바와 같이, 드레 브린은 성숙한 뉴런의 척추 머리에 축적되어 시냅스 자극에 반응합니다. 따라서 우리는 drebrin을 마커로 사용하여 냉동 주식의 뉴런의 품질을 확인할 수 있습니다.
이 방법은 시냅스 상태에 대한 약물의 효과를 평가하는 데 적용될 수 있습니다. 수지상 등뼈로부터의 드레 브린 탈출은 시냅스 가소성22의 초기 단계에서 발생합니다. 따라서 약물 치료에 의해 유도 된 드레 브린 클러스터 감소의 검출은 약물이 시냅스를 자극하고 시냅스 가소성을 유발한다는 것을 보여줍니다. 또한, 환원이 NMDAR 의존적인지 여부를 확인하기 위해, 2- 아미노 -5- 포스 포노 발레르 산 (APV, NMDAR 길항제)을 사용한 실험이 유용하다. 드레브린을 마커로 사용하면 NMDAR 의존성조차도 명확하게 결정됩니다10,15. 설명된 방법은 약물 스크리닝, 안전성 약리학적 연구 및 시냅스 기능 평가에 유용합니다.
Disclosures
Tomoaki Shirao는 AlzMed, Inc.의 CEO입니다. 이 연구는 AlzMed, Inc. ( "시냅스 기능의 고 처리량 분석"이라는 제목의 프로젝트를 위해 NK에 500,000 JPY)의 자금 지원을 받았습니다.
Acknowledgments
실험에 도움을 주신 카미야마 카즈미와 카와다 마나미에게 감사드립니다. 이 작업은 JSPS KAKENHI (N.K.에 대한 보조금 번호 19K08010)와 일본 의료 연구 개발기구 (AMED) (보조금 번호 JP19bk0104077 및 JP22bm0804024에서 T.S.)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well plate | Zeon Corporation | Gifted | |
| 96 well plate | greiner | 655986 | |
| Anti-drebrin antibody (M2F6) | MBL | D029-3 | Mouse monoclonal (dilution 1:1) |
| Anti-MAP2 antibody | Millipore | AB5622 | Rabbit (dilution 1:1000) |
| Anti-mouse Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A11031 | Dilution 1: 500 |
| Anti-rabbit Alexa Fluor | Thermo Fisher Scientific | A11008 | Dilution 1: 500 |
| B-27 | Gibco | 17504-044 | 2 v/v% for MEA plates; 50x for normal plates |
| Borax | Sigma | B-9876 | Final concentration 12 mM |
| Boric acid | WAKO | 021-02195 | Final concentration 50 mM |
| Bovine serum albumin | Millipore | 12659-100G | Final concentration: 3% in PBS |
| Confocal quantitative image cytometer CellVoyager CQ1 |
YOKOGAWA | Phase contrast images | |
| Cytosine β-D-arabino-furanoside (Ara-C) | Sigma | C-6645 | Diluted in dH2O (final concentration: 0.2 µM) |
| DAPI | FUJIFILM | 340-07971 | Dilution 1:1000 |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 2.5 mM for MEA plates; 400x for normal plates |
| In Cell Analyzer 2200 | Cytiva | Fluorescence images | |
| Laminin | Sigma | 114956-81-9 | Final concentration: 20 µg/mL |
| Maestro | Axion Biosystems | MEA recordings | |
| MEA plate | Axion Biosystems | M768-tMEA-48W | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| Paraformaldehyde | nacalai tesque | 26126-25 | Final concentration: 4% in PBS |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100 U/mL for normal plates |
| Penicillin/Streptomycin | nacalai tesque | 26253-84 | 100 µg/mL for MEA plates |
| polyethyleimine | Sigma | 9002-98-6 | Final concentration: 0.1% |
| Poly-L-lysine | Sigma | P2636 | Diluted in the borate buffer (final concentration: 1 mg/mL) |
| SKY Neuron | AlzMed , Inc. | ARH001 | 1.0 x 106 cells/tube |
| Sodium azide | FUJIFILM | 195-11092 | 0.1% |
| SodiumL(+)-Glutamate monohydrate | WAKO | 194-02032 | Diluted in dH2O (final concentrations: 1 µM, 3 µM, 10 µM, 30 µM, 100 µM) |
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