Analisi di pesticidi organoclorurati in un campione di terreno mediante un approccio QuEChERS modificato utilizzando formiato di ammonio

La necessità di aumentare la produzione alimentare ha portato all'uso intensivo e diffuso di pesticidi in tutto il mondo negli ultimi decenni. I pesticidi vengono applicati alle colture per proteggerle dai parassiti e aumentare i raccolti, ma i loro residui di solito finiscono nell'ambiente del suolo, specialmente nelle aree agricole¹. Inoltre, alcuni pesticidi, come i pesticidi organoclorurati (OCP), hanno una struttura molto stabile, quindi i loro residui non si decompongono facilmente e persistono nel terreno per lungo tempo². Generalmente, il suolo ha un'elevata capacità di accumulare residui di pesticidi, soprattutto quando ha un alto contenuto di sostanza organica³. Di conseguenza, il suolo è uno dei compartimenti ambientali più contaminati dai residui di pesticidi. Ad esempio, uno degli studi completi finora condotti ha rilevato che l'83% dei 317 terreni agricoli provenienti da tutta l'Unione europea era contaminato da uno o più residui di pesticidi⁴.

L'inquinamento del suolo da residui di antiparassitari può influire sulle specie non bersaglio, sulla funzione del suolo e sulla salute dei consumatori lungo tutta la catena alimentare a causa dell'elevata tossicità dei residui ^5,6. Di conseguenza, la valutazione dei residui di antiparassitari nel suolo è essenziale per valutare i loro potenziali effetti negativi sull'ambiente e sulla salute umana, in particolare nei paesi in via di sviluppo a causa della mancanza di norme rigorose sull'uso dei pesticidi⁷. Ciò rende l'analisi multiresiduo dei pesticidi sempre più importante. Tuttavia, l'analisi rapida e accurata dei residui di pesticidi nel suolo è una sfida difficile a causa del gran numero di sostanze interferenti, nonché del basso livello di concentrazione e delle diverse proprietà fisico-chimiche di questi analiti⁴.

Di tutti i metodi di analisi dei residui di pesticidi, il metodo QuEChERS è diventato l'opzione più rapida, più semplice, più economica, più efficace, più robusta e più sicura⁸. Il metodo QuEChERS prevede due passaggi. Nella prima fase, viene eseguita un'estrazione su microscala basata sulla suddivisione tramite salatura tra uno strato acquoso e uno acetonitrile. Nella seconda fase viene effettuato un processo di pulizia che utilizza un'estrazione dispersiva in fase solida (dSPE); questa tecnica utilizza piccole quantità di diverse combinazioni di assorbenti porosi per rimuovere i componenti che interferiscono con la matrice e supera gli svantaggi della^{SPE 9} convenzionale. Quindi, il QuEChERS è un approccio ecologico con pochi solventi / sostanze chimiche che vanno sprecati che fornisce risultati molto accurati e riduce al minimo le potenziali fonti di errori casuali e sistematici. Infatti, è stato applicato con successo per l'analisi di routine ad alta produttività di centinaia di pesticidi, con forte applicabilità in quasi tutti i tipi di campioni ambientali, agroalimentari e biologici ^8,10. Questo lavoro mira ad applicare e convalidare una nuova modifica del metodo QuEChERS che è stato precedentemente sviluppato e accoppiato a GC-MS per analizzare gli OCP nel suolo agricolo.

1. Preparazione delle soluzioni madre

NOTA: Si consiglia di indossare guanti in nitrile, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza durante l'intero protocollo.

1. Preparare una soluzione madre in acetone a 400 mg/L da una miscela commerciale di OCP (vedere Tabella dei materiali) a 2.000 mg/L in esano:toluene (1:1) in un matraccio tarato da 25 ml. Nella tabella 1 sono riportati tutti gli OCP selezionati.
2. Preparare le successive soluzioni madre in acetone a concentrazioni di 50 mg/L, 1 mg/L e 0,08 mg/L in matraccio tarato da 10 mL e conservarle in flaconcini di vetro ambrato a -18 °C.
   NOTA: Le stesse soluzioni possono essere utilizzate durante tutto il lavoro, ma è importante conservarle in queste condizioni subito dopo ogni utilizzo.
3. Preparare le soluzioni madre in acetone a concentrazioni di 20 mg/L e 0,4 mg/L da uno standard commerciale di 4,4'-DDE-d8 a 100 mg/L in acetone in matraccio tarato da 10 mL e conservare in flaconcini di vetro ambrato a -18 °C. Utilizzare 4,4'-DDE-d8 come standard interno (IS).

2. Raccolta dei campioni

1. Raccogliere circa 0,5 kg dello strato superiore di 10 cm di un terreno agricolo in un contenitore di vetro. Il suolo oggetto di questo studio è stato raccolto in una zona agricola tradizionale di colture di patate.
   NOTA: è stato effettuato un campionamento superficiale con una spatola. Tuttavia, la profondità del suolo potrebbe influenzare le sue caratteristiche fisico-chimiche. Pertanto, se il contenuto di carbonio organico varia con la profondità, è necessario prelevare campioni a profondità diverse.
2. Portare il campione di terreno in laboratorio, setacciarlo con un setaccio di 1 mm di diametro e conservarlo fino all'analisi a 4 °C in un contenitore di vetro ambrato.
   NOTA: Lo stesso campione di terreno può essere utilizzato durante tutto il lavoro, ma è importante conservarlo in queste condizioni subito dopo ogni utilizzo.

3. Preparazione del campione tramite il metodo QuEChERS modificato utilizzando formiato di ammonio

Nota : la Figura 1 mostra una rappresentazione schematica del metodo QuEChERS modificato.

1. Pesare 10 g del campione di terreno in una provetta da centrifuga da 50 mL e aggiungere 50 μL della soluzione IS a 20 mg/L per ottenere 100 μg/kg. Ai fini del recupero, aggiungere anche le soluzioni di pesticidi preparate nella fase 1.2 per ottenere 10 μg/kg, 50 μg/kg e 200 μg/kg (n = 3 ciascuna).
2. Agitare il tubo usando un vortice per 30 s per integrare meglio il picco nel campione.
3. Aggiungere 10 ml di acqua. Agitare il tubo con uno shaker automatico a 10 x g per 5 minuti.
4. Aggiungere 10 ml di acetonitrile. Agitare nuovamente il tubo a 10 x g per 5 minuti.
5. Aggiungere 5 g di formiato di ammonio (vedi tabella dei materiali), agitare vigorosamente il tubo per 1 minuto a mano e centrifugare a 1.800 x g per 5 minuti.
6. Trasferire 1 mL di estratto di acetonitrile in una provetta da centrifuga da 2 mL contenente 150 mg di_{MgSO 4} anidro, 50 mg di ammina primaria-secondaria (PSA) e 50 mg di ottadecilsilano (C₁₈) (vedere Tabella dei materiali) per scopi di pulizia mediante estrazione in fase dispersiva-solida (d-SPE)⁸, vortice per 30 s e centrifugare a 1.800 x g per 5 minuti.
7. Trasferire 200 μL dell'estratto in un flaconcino di autocampionatore opportunamente etichettato con un inserto fuso da 300 μL ed eseguire un'analisi strumentale utilizzando un sistema GC-MS (fase 4).
   NOTA: la calibrazione abbinata alla matrice viene eseguita seguendo gli stessi passaggi di cui si utilizzavano in precedenza estratti in bianco, ma 5 mL del surnatante vengono puliti in provette da 15 mL nella fase d-SPE (fase 3.6) e le soluzioni spike e IS non vengono aggiunte fino al punto 3.7. Aggiungere le soluzioni standard di taratura nei flaconcini dell'autocampionatore per ottenere 5 μg/kg, 10 μg/kg, 50 μg/kg, 100 μg/kg, 200 μg/kg e 400 μg/kg, evaporare fino all'essiccazione e aggiungere 200 μL degli estratti della matrice.

4. Analisi strumentale da parte di GC-MS

1. Eseguire le analisi GC-MS utilizzando un sistema GC-MS con un singolo spettrometro di massa a quadrupolo e un'interfaccia di ionizzazione elettronica (-70 eV) (vedi Tabella dei materiali).
2. Impostare la linea di trasferimento MS a 280 °C e la sorgente di ioni a 230 °C.
3. Utilizzare una colonna 5%-fenil-metilpolisilossano 30 m x 250 μm x 0,25 μm (vedi Tabella dei materiali) e He di purezza ultraelevata come gas di trasporto a una portata costante di 1,2 ml / min.
4. Mantenere il forno GC a 60 °C inizialmente per 2 minuti, quindi aumentare la temperatura a 160 °C a 25 °C/min e tenere premuto per 1 minuto. Quindi, aumentare la temperatura a 175 °C a 15 °C/min e tenere premuto per 3 minuti. Quindi, aumentare a 220 °C a 40 °C/min e tenere premuto per 3 min. Anche in questo caso, aumentare a 250 °C a 30 °C/min e tenere premuto per 2 minuti. Infine, portare la temperatura a 310 °C a 30 °C/min e tenere premuto per 2 minuti. Il tempo totale di analisi è di 22.125 min.
5. Condurre un autotune completo e un controllo dell'aria e dell'acqua del MS prima di ogni sequenza.
   1. Aprire il software di acquisizione MassHunter che controlla tutti i parametri del sistema GC-MS.
      NOTA: Il sistema di strumenti include il software di acquisizione MassHunter per impostazione predefinita.
   2. Apri l'opzione "Visualizza" sulla barra degli strumenti e fai clic su Controllo vuoto, fai clic su Sintonizzazione e fai clic su Autotune. L'autotune terminerà dopo pochi minuti.
   3. Apri l'opzione "Visualizza" e fai clic su Controllo strumento.
   4. Fare clic su Sì e salvare il nuovo file di melodia per l'autotune.
   5. Apri l'opzione "Visualizza" sulla barra degli strumenti e fai clic su Controllo vuoto, fai nuovamente clic su Sintonizza e fai clic su Controllo aria e acqua. Il controllo dell'aria e dell'acqua terminerà dopo pochi secondi.
   6. Apri l'opzione "Visualizza" e fai clic su Controllo strumento.
   7. Fare clic su Sì e salvare il nuovo file di melodia per il controllo dell'aria e dell'acqua.
6. Eseguire l'iniezione utilizzando un autocampionatore (vedere Tabella dei materiali) a 280 °C in modalità splitless, mantenendo il volume di iniezione 1,5 μL. Dopo 0,75 minuti dall'iniezione, aprire la divisione a una portata di 40 ml/min.
   NOTA: Tra un'iniezione e l'altra, la siringa da 10 μL deve essere lavata tre volte con acetato di etile e tre volte con cicloesano. Tutte le iniezioni sono in duplicato.
7. Analizzare gli analiti in modalità di monitoraggio ionico selezionato (SIM). Questa è la modalità standard utilizzata nei sistemi MS con un singolo quadrupolo.
   NOTA: la tabella 1 mostra i tempi di ritenzione (min) e i parametri di quantificazione basati sull'utilizzo di una quantificazione e due ioni di identificazione per gli OCP e l'IS. L'analisi quantitativa si basa sul rapporto tra l'area di picco dello ione di quantificazione e lo ione di IS.

5. Acquisizione dei dati

1. Aprire il software di acquisizione MassHunter che controlla tutti i parametri del sistema GC-MS.
2. Aprire l'opzione "Sequenza" sulla barra degli strumenti e modificare la sequenza, incluso il nome del campione, il numero della fiala, il numero di iniezioni, il metodo strumentale e il nome del file da generare. Aggiungere tutte le righe necessarie.
3. Fare clic su OK e salvare la nuova sequenza.
4. Apri nuovamente l'opzione "Sequenza" sulla barra degli strumenti e fai clic su Esegui sequenza nel menu a discesa. Si aprirà una nuova finestra per confermare il metodo di iniezione e la cartella in cui verranno salvati i campioni. Fare nuovamente clic su Run Sequence e inizierà l'iniezione.

La validazione completa del metodo analitico è stata eseguita in termini di linearità, effetti matriciali, recupero e ripetibilità.

Per la valutazione della linearità sono state utilizzate curve di calibrazione abbinate alla matrice con campioni bianchi a spillo a sei livelli di concentrazione (5 μg/kg, 10 μg/kg, 50 μg/kg, 100 μg/kg, 200 μg/kg e 400 μg/kg). I coefficienti di determinazione (R2) erano superiori o uguali a 0,99 per tutti gli OCP. Il livello minimo di taratura (LCL) è stato fissato a 5 μg/kg, che soddisfa il limite massimo consentito fissato a 10 μg/kg a fini di monitoraggio nelle applicazioni alimentari11.

La valutazione dell'effetto della matrice è stata effettuata confrontando le pendenze delle curve di calibrazione OCP in solvente puro e le curve di calibrazione abbinate alla matrice. L'effetto della matrice è stato calcolato utilizzando la seguente equazione12:

Effetto matrice (%) = (pendenza della curva di taratura abbinata alla matrice − pendenza della curva di taratura a base di solvente puro)/(pendenza della curva di taratura a base di solvente puro) × 100.

La figura 2 mostra le distribuzioni dell'effetto matrice per gli OCP studiati applicando un metodo QuEChERS modificato utilizzando formiato di ammonio ai campioni di terreno. Le percentuali positive dell'effetto della matrice corrispondono a un miglioramento del segnale, mentre le percentuali negative significano che c'è soppressione del segnale. In particolare, (1) valori compresi tra -20% e 20% corrispondono a un effetto matrice morbida; (2) valori compresi tra -20% e -50% o tra il 20% e il 50% corrispondono a un effetto matrice medio; (3) e valori superiori al 50% o inferiori a -50% significano che c'è un forte effetto matrice. Come osservato, un maggior numero di OCP ha subito effetti di matrice morbida o media, mentre un minor numero di OCP ha subito forti effetti di matrice.

Il recupero e la ripetibilità sono stati valutati mediante campioni in bianco con pesticidi a tre livelli di concentrazione (10 μg/kg, 50 μg/kg e 200 μg/kg). La figura 3 mostra i valori complessivi di recupero e i valori di deviazione standard relativa (RSD) per tutti i pesticidi e i livelli di picchiata (n = 9). Come si può osservare, la grande maggioranza degli OCP studiati presentava percentuali medie di recupero comprese tra il 70% e il 120%, con RSD inferiori al 20%, ad eccezione di eptacloro, endrin e β-endosulfan, che hanno dato recuperi medi leggermente più alti.

Figura 1: Rappresentazione del metodo QuEChERS modificato utilizzando formiato di ammonio per estrarre residui di pesticidi dal campione di terreno. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Distribuzione degli effetti della matrice rispetto ai tempi di ritenzione (min) per i 17 OCP. Un effetto matrice morbida corrisponde a valori compresi tra -20% e 20%; un effetto matrice medio corrisponde a valori compresi tra -20% e -50% o tra il 20% e il 50%; Un effetto matrice forte corrisponde a valori superiori al 50% o inferiori a -50%. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Recuperi medi per i 17 OCP dopo aver picchiato 10 μg/kg, 50 μg/kg e 200 μg/kg (n = 9) nel campione di terreno. Viene fornito il numero di analiti all'interno dell'intervallo di recupero accettabile (70%-120%) e RSD (<20%), insieme a quelli etichettati al di fuori di tale intervallo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Tabella 1: Tempi di ritenzione (min) e parametri di quantificazione per l'analisi GC-MS degli OCP. alfa-benzeneesacloruro (α-BHC); beta-benzeneesacloruro (β-BHC); lindano; delta-benzeneesacloruro (δ-BHC); eptacloro; aldrin; eptacloro epossido; α-endosulfan; 4,4'-diclorodifenildicloroetilene-d8 (4,4'-DDE-d8) (IS); 4,4'-diclorodifenildicloroetilene (4,4'-DDE); dieldrin; endrin; β-endosulfan; 4,4'-diclorodifenildicloroetano (4,4'-DDD); endosulfan solfato; 4,4'-diclorodifeniltricloroetano (4,4'-DDT); endrin chetone; metossicloro.

Non ho conflitti di interesse da rivelare.