Summary
Organoid-fibroblast-samkulturer ger en modell för att studera in vivo-stamcellsnischen. Här beskrivs ett protokoll för esofageal organoid-fibroblast samkulturer. Dessutom används helmonteringsavbildning för att visualisera fibroblast-organoidinteraktionen.
Abstract
Epitelstam- och stamceller bidrar till bildandet och underhållet av epitelbarriären under hela livet. De flesta stam- och stamcellspopulationer är undangömda på anatomiskt distinkta platser, vilket möjliggör exklusiva interaktioner med nischsignaler som upprätthåller stamhet. Medan utvecklingen av epiteliala organoidkulturer ger ett kraftfullt verktyg för att förstå stam- och stamcellernas roll i homeostas och sjukdom, är interaktionen inom nischmiljön i stort sett frånvarande, vilket hindrar identifieringen av faktorer som påverkar stamcellsbeteende. Fibroblaster spelar en nyckelroll för att styra epitelstammen och stamfaderns öde. Här presenteras ett omfattande organoid-fibroblast samodlingsprotokoll som möjliggör avgränsning av fibroblastsubpopulationer i esofageal stamcellsförnyelse och differentiering. I detta protokoll beskrivs en metod för att isolera både epitelceller och fibroblaster parallellt från matstrupen. Distinkta fluorescensaktiverade cellsorteringsstrategier för att isolera både matstrupen stamceller såväl som fibroblastsubpopulationerna från antingen transgena reporter eller vildtypsmöss beskrivs. Detta protokoll ger ett mångsidigt tillvägagångssätt som kan anpassas för att tillgodose isoleringen av specifika fibroblastsubpopulationer. Etablering och passage av esofageal epitelial organoid monokultur ingår i detta protokoll, vilket möjliggör en direkt jämförelse med samodlingssystemet. Dessutom beskrivs en 3D-röjningsmetod som möjliggör detaljerad bildanalys av epitelial-fibroblastinteraktioner. Sammantaget beskriver detta protokoll en jämförande och relativt hög genomströmningsmetod för att identifiera och förstå esofageala stamcellsnischkomponenter in vitro.
Introduction
Organoider används som 3D in vitro-analyser för att karakterisera stam- och stamceller, samt för att förstå signalsignalerna härledda från de cellulära komponenterna i stamcellsnischen 1,2,3,4. Musesofageala organoider beskrevs först 2014 och flera artiklar har identifierat tillväxtfaktorer, som R-Spondin (RSPO), NOGGIN och epidermal tillväxtfaktor (EGF), som behövs för att upprätthålla och passera esofageala organoider 5,6,7, och hävdar att liknande signalsignaler krävs för in vivo förnyelse av stamceller. Tillväxtfaktorer tillsätts emellertid vanligen i icke-fysiologiska koncentrationer, vilket resulterar i organoida tillväxtförhållanden som inte nödvändigtvis återspeglar signalmiljön in vivo.
Fibroblaster är heterogena stromacellspopulationer som stöder stamcellsegenskaper i många stamcellsnischer8. Genom att kombinera epiteliala stamceller och fibroblaster i samma organoidkultur möjliggörs organoidbildning i reducerade koncentrationer av exogent kompletterade tillväxtfaktorer. Organoida samodlingssystem från tarm- och leverepitel beskrivs, men ett protokoll för att upprätta esofageala organoid-fibroblast-samkulturer är fortfarande enastående 9,10,11.
I detta protokoll beskrivs två fluorescensaktiverade cellsorteringsstrategier (FACS) för fibroblaster från matstrupen, med användning av antingen transgena PdgfrαH2BeGFP-möss 12 eller vildtypsmöss med klassisk antikroppsfärgning. Olika subpopulationer av fibroblaster kan isoleras med hjälp av valda cellytmarkörer, vilket ger protokollet flexibilitet. Dessutom används en 3D-fluorescensavbildningsteknik som bevarar organoidmorfologi för att karakterisera fibroblast-organoidinteraktioner. Organoidröjning ger en snabb metod för att öka ljuspenetrationsdjupet i organoiderna, vilket förbättrar visualiseringen av organoid-fibroblastanslutningar och möjliggör rekapitulation av organoidstrukturen i sin helhet. Detta protokoll kombinerar esofageal organoid samkultur med en hel monteringsbildningsstrategi, vilket möjliggör funktionell karakterisering av fibroblast-organoidinteraktionen.
Protocol
Djurförsök för denna studie godkändes av Stockholms Norra djurförsöksetiska nämnd (etiskt tillstånd nr 14051-2019). Djur hölls i patogenfria förhållanden enligt rekommendationerna från Federation of European Laboratory Animal Science Association.
1. Förberedelse
- Tina de enzymatiska stamlösningarna som används för dissociation (se materialtabell) på is. Tina en alikvot av basalmembranmatrisen (GFR) med reducerad (GFR) temperatur vid 4 °C.
- Förbered odlingsmediet. Använd det medium som beskrivs i tabell 1 för organoidkulturer och samkulturer och bereda det innan protokollet påbörjas.
2. Dissektion och separation av matstrupen epitel och stroma
OBS: Se till att alla instrument som används för dissektion och vävnadsbehandling är sterila. Förbered 2 ml dissociationslösning (se materialtabell) i Hanks balanserade saltlösning (HBSS) per tre matstrupar.
- Använd en valfri musstam, till exempel C57BL / 6J-möss. Esofagusutveckling hos möss avslutas efter postnatal dag (p) 70, så det rekommenderas att använda möss som är äldre än p7013. Använd fyra eller fem möss eftersom de ger tillräckligt med material för att etablera 8-10 organoida samkulturer.
OBS: Organoidbildande effektivitet minskar med mössens ålder. Om specifika fibroblastsubpopulationer är av intresse är det möjligt att det låga fibroblastutbytet begränsar antalet organoida samkulturer som kan fastställas. - Använd genetiskt modifierade (t.ex. PdgfrαH2BeGFP) eller vildtypsmöss (WT) för isolering av fibroblastpopulationer. När du använder WT-möss, utför antikroppsfärgning för att isolera specifika fibroblastsubpopulationer från stroma via FACS.
- Avliva mössen genom CO 2-kvävning. Dissekera matstrupen med pincett och dissektion sax. För att avlägsna hela matstrupen, skära den distala änden av matstrupen direkt ovanför magen och den proximala änden i början av luftstrupen. Sänk ner matstrupen i PBS och lägg den på is.
- Ta mekaniskt bort muscularis externa med hjälp av ett dissektionsmikroskop (totalt förstoringsområde 8x-40x) och pincett. Håll den distala änden av den dissekerade matstrupen med ett par pincett och använd de andra pincetterna för att ta tag i och dra muskeln från den distala till den proximala änden av den dissekerade matstrupen. Ta bort och kassera muskelskiktet.
- Öppna matstrupen i längdriktningen. Detta fungerar bäst med mikrodissektion fjädersax med en kulspets för att förhindra vävnadsskador. Håll ena änden av matstrupen för att sätta in fjädersaxens boll i matstrupen i matstrupen och skära upp matstrupen medan du håller fast vid änden.
- Placera matstrupen i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör eller en 24-brunnsplatta. Inkubera den öppnade matstrupen i 0,5 mg/ml termolysin i HBSS vid 37 °C på en vippskakare i 15 minuter. Sänk ner matstrupen helt i termolysinlösning.
OBS: Volymen av termolysinlösning som används beror på brunnen eller rörstorleken. Flera matstrupar kan placeras och nedsänkas i samma brunn eller rör. - Ta ut matstrupen från termolysinlösningen. Använd ett dissektionsmikroskop för att noggrant separera matstrupen epitel från stroma. Använd fina pincett, ta tag i både epitelsidan och stromasidan av vävnaden och dra dem långsamt isär för att separera de två skikten.
OBS: Stroma identifieras av sitt vita och ogenomskinliga utseende, i motsats till det transparenta epitelet. Stroma innehåller lamina propria och submukosal skikt. - Överför epitel- och stromaskiktet till två separata 1,5 ml mikrocentrifugrör med 200 μL dissociationslösning i HBSS. Lägg på is.
3. Isolering av esofageala stamceller
OBS: Isoleringen av esofageala stamceller (steg 2) och fibroblaster (steg 3) kan utföras samtidigt. Förbered ett 50 ml rör med 1% FBS i HBSS (1% FBS).
- Överför det separerade matstrupsepititelet från 1,5 ml mikrocentrifugröret (steg 2.8) till en ren petriskål och använd en skarp skalpell för att hacka. Samla upp malet vävnad från petriskålen med 200 μL dissociationslösning och överför den tillbaka till 1,5 ml mikrocentrifugrör.
OBS: Epitelet mals ordentligt när bitarna kan placeras tillbaka i 1,5 ml mikrocentrifugröret med en 200 μL pipettspets. - Tillsätt 800 μl färsk dissociationslösning till 1,5 ml mikrocentrifugröret till en total volym på 1 ml.
OBS: Det är viktigt att tillsätta en tillräcklig volym dissociationslösning. Per en till tre matstrupar rekommenderas 1 ml lösning. Skala upp när mer matstrupe bearbetas på en gång. - Placera röret med det malda epitelskiktet på en vipp-shaker vid 37 °C i 60 minuter. Pipettera lösningen upp och ner cirka 20 gånger med en 200 μL pipettspets var 15:e minut för att förbättra matsmältningen.
- Efter 60 minuter, pipettera upp och ner ytterligare 20 gånger med en 200 μL pipettspets. För lösningen genom en 40 μm cellsil till ett nytt 1,5 ml mikrocentrifugrör. Centrifugera vid 300 x g i 10 min vid 4 °C.
OBS: Våt cellsilen med 1% FBS innan du silar cellerna för att minimera cellernas vidhäftning till filtret. Epitelet kommer inte att smälta fullständigt, och bitar av vävnad kommer fortfarande att vara synliga. Längre inkubation kommer dock att minska cellöverlevnaden och inte resultera i ett högre utbyte av livskraftiga celler. - Kassera supernatanten genom att avlägsna överflödig vätska med en 1 ml pipett och suspendera pelleten igen i 1 ml 1% FBS. Centrifugera vid 300 x g i 10 min vid 4 °C.
- Under centrifugering bereds den konjugerade antikroppsblandningen för FACS av esofageala stamceller.
- Blanda 1 μL CD324-PE-Cy7 (ECADHERIN) och CD104-A647 (INTEGRIN-β4) i 200 μL 1% FBS per en miljon celler.
OBS: 1 μL antikropp (200 μL slutlig volym) är tillräcklig för en eller två matstrupar. Vid bearbetning av mer matstrupe på en gång, öka volymen av antikroppsfärgningslösningen.
- Återsuspendera pelleten i 200 μl antikroppsblandning och överför till ett flödescytometrirör. Efter tillsats av fluorescerande antikroppar, håll cellsuspensionerna i mörkret för att undvika blekning av signalen. Inkubera cellerna i 30 minuter vid 4 °C. Tillsätt 3 ml 1 % FBS och centrifugera vid 300 x g i 10 minuter vid 4 °C och suspendera sedan cellerna igen i minst 200 μl 1 % FBS.
OBS: 500 μL 1% FBS används för upp till fyra eller fem matstrupar. Öka volymen när mer matstrupe bearbetas på en gång, så att en FACS-flödeshastighet på 100-300 händelser / s kan uppnås. Fler händelser/ar kommer att minska sorteringseffektiviteten och en ökning av flödeshastigheten kommer att minska cellöverlevnaden. - Lägg till dödcellsfärgmarkör till en slutlig koncentration på 1:10 000, 5 minuter före FACS-sortering för att isolera levande celler. Sortera stamcellerna med hjälp av en FACS-maskin (se figur 1 för grindstrategi). Samla upp cellerna i 1,5 ml mikrocentrifugrör fyllda med 200 μl basiskt organoidmedium (tabell 1).
4. Isolering av fibroblaster från stromaskiktet
- Skär stomalskiktet i fina bitar i ett 1,5 ml rör innehållande 200 μL dissociationslösning (steg 2.8) med en dissektionssax. Vävnaden mals ordentligt när lösningen kan pipetteras upp och ner med en 200 μL pipettspets.
- Tillsätt 800 μl färsk dissociationslösning till 1,5 ml mikrocentrifugröret till en total volym på 1 ml.
OBS: Det är viktigt att tillsätta en tillräcklig volym dissociationslösning. Per en till tre matstrupar rekommenderas 1 ml lösning. Skala upp när mer matstrupe bearbetas på en gång. - Placera röret på en vipp-shaker vid 37 °C i 30 minuter. Efter 15 minuter pipetterar du lösningen upp och ner cirka 20 gånger med en 200 μL pipettspets för att förbättra matsmältningen.
- Efter 30 minuters enzymatisk nedbrytning, pipettera upp och ner ytterligare 20 gånger med en 200 μL pipettspets. Sila lösningen genom en 70 μm cellsil till ett nytt 1,5 ml mikrocentrifugrör. Centrifugera vid 300 x g i 10 min vid 4 °C.
OBS: Blöt cellsilen med 1% FBS innan du silar cellerna för att minimera cellernas vidhäftning till filtret. - Kassera supernatanten genom att avlägsna överflödig vätska med en 1 ml pipett och suspendera pelleten igen i 1 ml 1% FBS. Centrifugera vid 300 x g i 10 min vid 4 °C.
OBS: Vid användning av en genetiskt modifierad musstam som innehåller flourescerande märkta fibroblaster är antikroppsfärgningar valfria. Om antikroppsfärgning inte krävs, fortsätt med steg 3.7 och överför provet till ett flödescytometrirör.- Bered den konjugerade antikroppsblandningen under centrifugeringen för FACS-isolering av fibroblaster. Blanda 1 μL CD26-APC (DPP4) i 200 μL 1% FBS per en miljon celler.
OBS: 1 μL antikropp är tillräcklig för en eller två matstrupar. Vid bearbetning av mer matstrupe på en gång, öka volymen av antikroppsfärgningslösningen.
- Bered den konjugerade antikroppsblandningen under centrifugeringen för FACS-isolering av fibroblaster. Blanda 1 μL CD26-APC (DPP4) i 200 μL 1% FBS per en miljon celler.
- Återsuspendera pelleten i 200 μL konjugerad antikroppsblandning i 1% FBS och överför till ett flödescytometrirör. Inkubera cellerna i 30 minuter vid 4 °C.
- Tillsätt 3 ml 1% FBS och centrifugera vid 300 x g i 10 min vid 4 °C. Resuspendera cellerna i minst 200 μl 1% av FBS.
OBS: 500 μL 1% FBS används för upp till fyra eller fem matstrupar. Öka volymen när mer matstrupe bearbetas på en gång, så att en flödeshastighet på 100-300 händelser / s kan uppnås. Fler händelser/s kommer att minska sorteringseffektiviteten och öka flödeshastigheten kommer att minska cellöverlevnaden. Efter tillsats av fluorescerande antikroppar bör cellsuspensionerna hållas mörka för att undvika blekning av signalen. - Lägg till dödcellsfärgmarkör till en slutlig koncentration på 1:10 000, 5 minuter före FACS-sortering för att isolera levande celler. Sortera cellerna med hjälp av en FACS-maskin (se figur 1 för grindstrategi). Samla upp cellerna i 1,5 ml mikrocentrifugrör fyllda med 200 μl basiskt organoidmedium (tabell 1).
5. Etablering och odling av esofageala organoider
OBS: Förvärmd ERlåg (organoid samkultur), ENR (organoid) medium (se tabell 1 för beskrivning) och en 48-brunnsplatta vid 37 °C. Placera den tinade matrisen (beredd i steg 1) alikvot på is. Det rekommenderas att använda matrisen som tillhandahålls här (se materialförteckning) för musesofageal organoidodling, eftersom andra märken av matris negativt påverkar organoidbildningseffektiviteten.
- För organoid samkultur, blanda de sorterade epitelcellerna och fibroblasterna i förhållandet 1: 2 i ett rör. För varje matriskupol, använd 5 000 epitelceller och 10 000 fibroblaster. När du förbereder dig för fler kupoler, lägg till en multipel av 5 000 epitelceller och 10 000 fibroblaster till ett rör. För organoidkulturer utan fibroblaster, använd 5 000 epitelceller per matriskupol.
- Centrifugera blandcellspopulationen vid 300 x g i 5 minuter. Kassera supernatanten genom att försiktigt avlägsna den med en 200 μL pipett.
- Tvätta cellerna en gång genom att återsuspendera pelleten i kallt basiskt organoidmedium och centrifugera vid 300 x g i 5 minuter. Placera cellerna på is.
- Förbered en blandning bestående av 80% matris och 20% kallt basiskt organoidmedium. Placera allt på is när matrisen stelnar vid rumstemperatur (RT).
- Kassera supernatanten efter centrifugering genom att försiktigt avlägsna den med en 200 μl pipett. Återsuspendera cellerna i 10 μL matrisblandning/kupol och lägg tillbaka på is.
- Ta den förvärmda plattan med 48 brunnar från inkubatorn på 37 °C och gör en matriskupol per brunn med en 20 μl pipett. Varje kupol innehåller 10 μL 80% matris, 5 000 epitelceller och 10 000 fibroblaster. Överför plattan upp och ner till en inkubator och låt kupolerna stelna i ytterligare 20-30 minuter vid 37 °C.
OBS: En minskning av matriskupolvolymen och/eller en ökning av cellantalet kommer att påverka organoidbildningseffektiviteten. - Tillsätt 200 μLförvärmt ER-lågmedium (tabell 1) till matriskupolerna innehållande organoida samkulturer och ENR-medium (tabell 1) till respektive matriskupoler som endast innehåller epitelorganoider och placera plattan i inkubatorn.
- Odla organoiderna vid 37 °C och 5 %CO2. För de första 2 dagarna, komplettera mediet med 10 μM Rock-inhibitor (Y-27623). Berghämmare förhindrar stressinducerad celldöd och ökar chansen för en framgångsrik etablering av organoidkulturer.
- Uppdatera mediet var 2-3: e dag. Se till att mediet är varmt för att förhindra dissociation av den temperaturkänsliga matrisen.
- Utför analyser av experimentet 6 till 8 dagar efter plätering. Organoiderna kan hållas i kultur i upp till 14 dagar. Runt dag 14 observeras förlust av kupolintegritet.
6. Passaging av organoider
OBS: Passage av organoider odlade i samkultur resulterar i förlust av fibroblaster. Därför rekommenderas att använda ENR-medium för alla organoider när de passeras. Förvärm ENR, PBS och en platta med 48 brunnar vid 37 °C.
- Ta bort mediet och tvätta brunnen som innehåller matriskupolen med förvärmd PBS. Tillsätt 200 μL kall 0,25% trypsinlösning och pipettera upp och ner för att bryta matriskupolen.
OBS: Användning av kallt 0,25% trypsin rekommenderas, eftersom matrisen är temperaturkänslig och detta hjälper till att bryta ner matriskupolerna. - Inkubera organoiderna med trypsin vid 37 °C i ~20 minuter. Pipettera upp och ner efter 10 min för att öka dissociationen av organoiderna. Övervaka dissociationsprocessen med ett mikroskop var 5-10 min. Eftersom trypsin minskar cellviabiliteten kan detta hjälpa till att identifiera den ideala dissociationstiden.
- Efter 20 minuter pipetterar organoiderna upp och ner med en 200 μL pipett för att dissociera organoiderna. Samla cellerna i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör, tillsätt 1 ml basiskt organoidmedium och centrifugera vid 300 x g i 5 minuter vid RT.
- Valfritt: För att säkerställa bästa organoida tillväxtförhållanden och att nya organoider härrör från enskilda celler, sila cellerna genom en förfuktad 40 μm cellsil. Filtrering av cellsuspensionen resulterar i avlägsnande av organoidkärnor och cellklumpar som är svåra att dissociera.
- Förbered en matrisblandning bestående av 80% matris och 20% kallt basiskt organoidmedium. Placera allt på is, eftersom matrisen stelnar vid RT.
- Kassera supernatanten genom att försiktigt avlägsna den med en 200 μl pipett, suspendera cellerna igen i 10 μL matrisblandning/kupol och lägg tillbaka blandningen på is.
OBS: Organoider kan delas i förhållandet 1:5 till 1:10, beroende på kupoldensitet. Epitelceller kan också räknas och pläteras om vid 5 000 celler / kupol. - Ta den förvärmda plattan med 48 brunnar från inkubatorn på 37 °C och gör en kupol per brunn. Överför plattan upp och ner till en inkubator och låt kupolerna stelna i ytterligare 20-30 minuter vid 37 °C.
- Tillsätt 200 μL förvärmt ENR-medium till respektive organoidkupoler. Komplettera mediet med 10 μM Rock-inhibitor (Y-27623) under de första 2 dagarna.
- Uppdatera mediet var 2-3: e dag. Se till att mediet är varmt för att förhindra dissociation av den temperaturkänsliga matrisen.
7. Organoidbearbetning för färgning av hela berget
OBS: Belägg spetsarna och rören med 10% FBS i PBS före användning för att undvika att organoider fäster vid plast. För pipettspetsar räcker det att pipettera en eller två gånger upp och ner i 10% FBS/PBS-lösning innan du använder spetsen. För rör, fyll röret med 10% FBS / PBS och ta sedan bort lösningen.
- Ta bort organoidmediet och tillsätt 200 μL iskall PBS till matriskupolerna. Lägg plattan på is i 5-10 min.
- Pipettera upp och ner och överför lösningen till 0,6 ml mikrocentrifug icke-vidhäftande rör. Centrifugera kort i 30-60 s vid 100 x g för att låta organoiderna sätta sig i botten.
OBS: Överskott av pipettering och lång centrifugering bryter organoiderna och stör fibroblast-organoidinteraktionen. - Ta bort överflödig vätska och tillsätt iskall PBS. Centrifugera kort i 30-60 s vid 100 x g för att låta organoiderna sätta sig i botten.
- Ta bort överflödig vätska och fixera organoiden med 200 μL kall 4% formaldehyd i PBS-lösning i 30 minuter på is.
VARNING: Formaldehyd är giftigt och måste alltid användas i en kemisk dragskåp. Nitrilhandskar, skyddsglasögon och labbrockar måste alltid bäras. - Fixering av organoid får dem att sjunka, och centrifugering behövs inte längre. Låt organoiderna sjunka genom att placera röret upprätt och vänta 2-3 minuter, ta bort formaldehyden och tillsätt 500 μL kall PBS för att tvätta bort formaldehyden.
- Låt organoiderna sjunka, ta bort överflödigt PBS och tillsätt 500 μL färsk kall PBS. Låt organoiderna sjunka, ta bort överskottet av PBS och tillsätt 500 μL blockerande buffert (5% normalt åsneserum, 1% BSA och 0,5% Triton X-100 i PBS). Sätt röret på en vippskakare i 60 minuter vid rumstemperatur.
OBS: Blockering kan också göras över natten (O/N) vid 4 °C. - Låt organoiderna sjunka, avlägsna blockeringsbufferten och återsuspendera organoiderna i 200 μL blockerande buffert med primära antikroppar (se materialtabell). Förvara organoiderna på en vippskakare O/N vid 4 °C.
OBS: För att förbättra färgningen av kärnproteiner, lågt uttryckta proteiner eller antikroppar som visar ospecifik färgning kan inkubationstiden ökas i 1 eller 2 dagar vid 4 °C. Att placera organoiderna på en vippskakare är viktigt eftersom det förhindrar att organoider klumpar ihop sig och ökar färgningseffektiviteten. - Låt organoiderna sjunka, ta bort den primära antikroppsblandningen och tvätta organoiderna med 500 μL 0,02% Triton X-100 i PBS (0,02% Tx) i 60 minuter vid RT. Upprepa tre gånger.
OBS: När längre primär antikroppsinkubation behövs, lägg till ett tvättsteg med 0,02% Tx i PBS O / N vid 4 ° C. - Låt organoiderna sjunka, avlägsna tvättbufferten och tillsätt 200 μL fluorescenskonjugerad sekundär antikropp i blockerande buffert O/N vid 4 °C. Efter tillsats av fluorescerande sekundära antikroppar, håll organoiderna i mörkret för att undvika blekning av signalen.
- Låt organoiderna sjunka, ta bort den sekundära antikroppsblandningen och tvätta organoiderna med 500 μL 0,02% Tx i 60 minuter vid RT. Upprepa tre gånger.
- Motfärga organoiderna med 200 μL DAPI (0,25 μg/ml) lösning för nukleär färgning vid behov. Inkubera proverna i 60 minuter vid rumstemperatur på en vippskakare.
- Låt organoiderna sjunka, avlägsna DAPI-lösningen och tvätta organoiderna i 500 μL PBS i 15 minuter vid RT. Upprepa tre gånger.
- Låt organoiderna sjunka och ta bort all överskottsvätska. Tillsätt 10 μl clearinglösning till organoiderna och inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur.
OBS: Rensningslösningen är viskös, så skär av den yttre delen av en 20 μL pipettspets innan du pipetterar rensningslösningen. Mer rensningslösning kan läggas till om en större distans används för avbildning. Monteringslösning kan användas istället för rensningslösningen när organoiderna inte rensas. Rensningslösningen minskar bakgrunden vid avbildning och ökar bilddjupet. - Placera en 0,05 mm dubbelsidig klibbig 4-brunnsdistans på ett mikroskopglas. Tillsätt 10 μL rensningslösning med organoiderna i en brunn och placera en täckslip ovanpå distansen.
OBS: Organoider kan också monteras utan användning av en distans. Distansen håller organoidformen intakt och förhindrar att organoiderna plattas ut. - Håll bilden vid RT O / N för att rensa organoiderna. För långtidsförvaring, håll objektglasen vid 4 °C. Hämta bilder med hjälp av ett konfokalmikroskopisystem.
Representative Results
Matstrupen är uppdelad i olika lager: epitel, lamina propria, submucosa och muscularis externa (figur 1A). Fibroblaster finns i submucosa och lamina propria, kallad stroma. I detta protokoll avlägsnas muscularis externa mekaniskt (figur 1B), vilket inte leder till förlust av fibroblaster (PdgfrαH2BeGFP+) som bor i stroma (figur 1C). Före dissociation separeras epitelet från stroma vilket resulterar i två vävnadssegment (figur 1B). Separering av de två skikten ger möjlighet att öka dissociationstiden för det mer robusta epitelskiktet jämfört med det bräckliga stromaskiktet. På detta sätt etableras ett effektivt isoleringsprotokoll som ger både livskraftiga epiteliala stamceller såväl som stromala fibroblaster (figur 1B). Esofagus stamceller sorteras baserat på deras höga INTEGRIN-β4 och E-CADHERIN-uttryck (figur 1C, D).
Subpopulationer av fibroblaster kan isoleras med hjälp av distinkta markörer. I detta protokoll tillhandahålls en strategi för fibroblastisolering baserad på vanliga fibroblastmarkörer PDGFRα och DPP4 (CD26). Isolering av antingen PdgfrαH2BeGFP-rapportöruttrycket eller DPP4-antikroppen visar att cirka 50% av de isolerade cellerna är fibroblaster (figur 1E, F). Dessutom är 70% av PDGFRα+ fibroblasterna DPP4+, vilket indikerar att en i stort sett överlappande, men inte identisk, fibroblastpopulation erhålls. Efter isolering av både epitel- och stromacellspopulationer odlas esofageala stamceller antingen ensamma eller tillsammans med fibroblaster i en matriskupol. För att studera fibroblasternas bidrag till organoidbildning bibehålls samkulturen i ett tillväxtfaktorreducerat medium (figur 1G).
Esofagus stamceller bildar organoider i närvaro av EGF, NOGGIN och RSPO (ENR). Ta bort NOGGIN och minska mängden RSPO (25 ng/μl; ERlåg) är tillräcklig för att förhindra organoidbildning (figur 2A). Intressant är att tillsats av antingen DPP4 + eller PDGFRα + fibroblaster till matstrupen stamceller iER-lågmediet återställer organoidbildningsförmågan, vilket visar en stödjande funktion för båda fibroblastpopulationerna (figur 2A-D). Visualisering av PdgfrαH2BeGFP-transgenen visar att fibroblaster är i nära kontakt med epiteliala stamceller under organoidbildning (figur 2A). Vid dag 6 är PdgfrαH2BeGFP+ fibroblaster fortfarande rikligt närvarande i samkulturen. Fibroblaster finns i hela kupolen, nära och vidrör organoiderna (full pil), eller fäst vid organoiderna (pilspets; Figur 2D).
Färgning av hela berget visar en 3D-representation av fibroblasternas interaktion med organoiderna (figur 3). Även om det är möjligt att utföra hela monteringsprotokollet utan att använda en rensningslösning, minskar det transparens och laserpenetration av organoiden (figur 3B, z-vy). Vid montering av organoider hjälper distansen till att upprätthålla organoidmorfologi. Däremot plattar plätering av täckglaset direkt på organoiderna (utan distans) organoiderna och resulterar i förlust av organoidstruktur (figur 3A, B).
Både DPP4+ och PDGFRα+ fibroblasterna har visat sig vara lindade runt organoiderna (figur 3C, Video1 och Video 2). Differentiering av esofageala organoider kan bedömas med hjälp av olika markörer. Figur 4 visar att det medföljande färgningsprotokollet är lämpligt för lättare att färga keratiner (KRT14/13) samt mer svårfärgade transkriptionsfaktorer (TRP63/KLF4). Samodlingsprotokollet genererar organoider med ett liknande differentieringsmönster, vilket visas in vivo13,14 och ses i organoider odlade i ENR-medium. KRT14+ eller TRP63+ stamceller bildar det yttre skiktet och KRT13+ eller KLF4+ differentierade celler orienterar inåt.
Detta protokoll ger ett verktyg för att studera matstrupen stamcellsnisch in vitro och visualiserar interaktionen mellan organoider och fibroblaster. Genom att implementera ett protokoll för isolering av fibroblaster med antikroppar är metoden anpassningsbar och kan användas för att studera fibroblastsubpopulationer utan behov av transgena möss.
Figur 1: Isolering av stamceller och fibroblastsubpopulationer från matstrupen . (A) Schematisk översikt över de olika lagren i matstrupen. Stroma innehåller lamina propria och submucosa. (B) Schematisk översikt över isoleringsprotokollet. Muskeln (muscularis externa) avlägsnas mekaniskt med hjälp av pincett; Den återstående matstrupen skärs upp och inkuberas i termolysin för att separera epitelskiktet från stroma. Epitelet och stroma separeras, mals mekaniskt och smälts enzymatiskt till encellssuspensioner. Dissocierade celler färgas sedan och förbereds för FACS. (C) Tvärsnitt av matstrupen avlägsnad från muscularis externa som visar PdgfrαH2BeGFP+ fibroblaster i stroma. INTEGRIN-β4 (ITGβ4) och E-CADHERIN (ECAD) dubbla positiva celler är epiteliala stamceller i matstrupen. Skalstapel = 100 μm. (D) Representativt flödescytometridiagram över epitelcellisolering som visar procentandelen levande celler (övre panelen) från alla enskilda celler. Den nedre panelen visar procentandelen isolerade ITGβ4+ ECAD+ stamceller (Prog.) från alla levande celler. (E) Representativt flödescytometridiagram över stromacellsisolering som visar procentandelen levande celler (övre vänstra panelen). Representativa flödescytometridiagram som visar procentandelen isolerade DPP4+ fibroblaster (Fibr.; övre högra panelen) och Pdgfrα+ fibroblaster (nedre vänstra panelen) för alla levande celler. 70% av Pdgfrα+ fibroblasterna är också DPP4+ (nedre högra panelen). (F) Representativt flödescytometridiagram för stroma som visar endast DPP4+-celler (2,5%), DPP4+ PDGFRα+-celler (37,5%) och PDGFRα+-celler (17,7%). Procentandelarna är av alla levande celler. (G) Celler med enbart epitel placeras i en matriskupol i närvaro av 50 ng/μL EGF, 100 ng/μL NOGGIN och 250 ng/μL RSPO (ENR), eller tillsammans med fibroblaster i närvaro av EGF och en låg koncentration av RSPO (25 ng/μl). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Representativa resultat av organoida samkulturer. (A) Brightfield-bilder som visar tillväxten av organoiderna från dag 1 till dag 6. Ljusfältsbilderna med organoiderna samodlade med PdgfrαH2BeGFP+ fibroblaster visar också den nukleära eGFP-signalen. Skalstapel = 25 μm. (B) Brightfield-bilder av hela matriskupolen dag 6. Den vänstra kolumnen visar organoida samkulturer odlade i närvaro av Pdgfrα+ fibroblaster i ER low eller E low Rlowmedium. Den mellersta kolumnen visar organoida samkulturer odlade i närvaro av DPP4+ fibroblaster i ER low ellerE low Rlow medium. Den högra kolumnen visar organoidmonokulturer odlade i ENR-medium. ENR-medium = EGF (50 ng/μL), NOGGIN (100 ng/μL) och RSPO (250 ng/μL). ERlåg = EGF och 25 ng/μL RSPO. E lågRlåg = 5 ng/μL EGF och 25 ng/μL RSPO. Skalstapel = 500 μm. (C) Diagram som visar organoidbildningseffektiviteten (%) (dvs. procentandelen celler som bildar organoider under olika odlingsförhållanden). Varje punkt representerar en matriskupol och stapeln representerar medelvärdet av alla punkter per villkor. (D) Ljusfält och fluorescerande bild av dag 6 organoider samodlade med PdgfrαH2BeGFP+ fibroblaster. PdgfrαH2BeGFP+ fibroblaster finns i hela kupolen, fästa vid organoiderna (pilspetsen) och obundna men i kontakt med organoiderna (full pil). Skalstapel = 250 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Protokoll för färgning av hela berget för studier av fibroblast-organoidinteraktioner . (A) Schematisk översikt över hela immunofluorescensprotokollet. AB = antikropp. (B) Immunofluorescensbild av orensad färgning av hela fästet som visar en minskad transparens och penetration av laserljuset jämfört med de rensade organoiderna. Frånvaron av en spacer resulterar i utplattning av organoiden och förlust i organoidmorfologi. (C) Hela monteringsbilder av de samodlade organoiderna visar organoidernas 3D-ytor med VIMENTIN+ fibroblaster (Fibr.) lindade runt och i nära kontakt med organoiden. 3D-tvärsnitt och 2D-planbilder visar organoidens lumen. Skalstapel = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Hela monteringsbilder avslöjar distinkta basala och suprabasala cellpopulationer. (A) Helmonterad färgning av mono- och samodlade organoider med PdgfrαH2BeGFP+ fibroblaster som visar KRT14+ basalceller i det yttre skiktet och KRT13+ differentierade suprabasala celler. Skalstapel = 50 μm. (B) Helmonterad färgning av mono- och samodlade organoider med PdgfrαH2BeGFP+ fibroblaster som visar TRP63+ basalceller i det yttre skiktet och KLF4+ differentierade suprabasala celler. Skalstapel = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Tabell som beskriver organoidodlingsmediekomponenterna. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Video 1: PdgfrαH2BeGFP+ fibroblast lindad runt och i nära kontakt med organoiden. Videon åtföljer den övre panelen i figur 3C. Skalstången i figur 3C är 50 μm och organoiden är ~ 120 μm i diameter. VIMENTIN visas i vitt, E-CADHERIN i rött, PdgfrαH2BeGFP i grönt och DAPI i blått. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 2: DPP4+ fibroblast lindad runt och i nära kontakt med organoiden. Videon åtföljer den nedre panelen i figur 3C. Skalstången i figur 3C är 50 μm och organoiden är ~ 120 μm i diameter. VIMENTIN visas i vitt, E-CADHERIN i rött och DAPI i blått. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Discussion
Protokollet som presenteras här etablerar en in vitro-modell för att undersöka funktionella esofageala epitelial-fibroblastinteraktioner.
Epitelskiktet separeras från stroma, vilket möjliggör ett optimerat dissociationsprotokoll för både epitel- och stromalfacket. Trots optimering av epiteldissociationsprotokollet förblir vävnadsklumpar uppenbara. Pipettering upp och ner kraftigt var 15: e minut minskar antalet och storleken på klumpar avsevärt. Andra protokoll använder trypsin för att ytterligare dissociera epitelskiktet 5,6. Här rekommenderas inte användning av trypsin, eller ökning av dissociationstiden ytterligare, eftersom detta tenderar att resultera i minskad epitelcellviabilitet och organoidbildande effektivitet. I motsats till epitelet dissocieras stroma lätt och 30 min i dissociationslösning resulterar i en encellssuspension med ~ 90% fibroblastlivskraft (figur 1E). Att utesluta separationssteget epitel-stomal i protokollet ökar dissociationstiden avsevärt, vilket resulterar i en minskad fibroblastviabilitet och ett lägre utbyte av epitelceller. Dessutom ger separering av epitelet från stroma en möjlighet att bestämma cellnummer för varje population och blanda epitelceller och fibroblaster från olika muslinjer när man ställer in samkulturerna.
Att studera fibroblastfunktion på organoidtillväxt är en vanlig metod inom stamcellsbiologi 9,10,11,15,16. Etablerade samodlingsmedier kompletteras antingen med DMEM kompletterat med 10% fosterkalvserum (FCS)9,15 eller tillväxtfaktorreducerat medium10,16. I detta protokoll används det tillväxtfaktorreducerade mediet för att efterlikna förhållandena i stamcellsnischen in vivo, där fibroblaster i stort sett är vilande. FCS är ett tillväxtfaktorrikt serum som resulterar i aktivering och proliferation av fibroblaster i samkulturerna, vilket sannolikt motsvarar ett fibroblastcelltillstånd som skiljer sig från in vivo-tillståndet. Genom att utesluta FCS och minska tillväxtfaktorerna, så att mediet ensamt (ERlågt) inte stöder organoidtillväxt och inte stimulerar fibroblastproliferation, är det möjligt att isolera fibroblasternas effekt på organoidtillväxten. I detta medium avlägsnas NOGGIN och RSPO reduceras till ett minimum (10% RPSO). Både NOGGIN och RSPO har visat sig vara väsentliga för esofageal organoidtillväxt6. EGF behölls i samodlingsmediet, eftersom det inte stöder organoidtillväxt i sig. Fibroblaster kan emellertid också stödja organoidtillväxt i ett EGF-reducerat medium (E low Rlow; Figur 2B,D).
Organoida samkulturer kan inte upprätthållas genom passaging eftersom fibroblaster förloras under trypsinisering. Organoid passaging inkluderades emellertid i protokollet eftersom esofageala organoider kan bibehållas, expanderas och användas för ytterligare experiment som monokulturer. Passaged organoider från monokulturer kan användas för att skapa samkulturer med nyligen isolerade fibroblaster. En nackdel med att använda primära celler är antalet möss som behövs för att skapa flera organoida samkulturer. När man fokuserar på små subpopulationer av fibroblaster är antalet erhållna samkulturer begränsat. I andra protokoll expanderas fibroblaster först i kultur innan de används för att skapa organoida samkulturer10. Fibroblaster ändrar dock morfologi och identitet under passaging, vilket visas genom att använda primära hud- och hjärtfibroblaster17,18. Konventionell 2D-passaging av esofageal fibroblaster resulterar i både morfologi- och fenotypförändringar, vilket visar att in vitro-anrikning av fibroblaster inte är lämplig för samkulturer som syftar till att fenokopiera den endogena stamcellsnischen.
Färgning av hela berget ger ett verktyg för att upprätthålla och visualisera fibroblast-organoidinteraktion. Det bör noteras att även om inte alla organoider kommer att ha fibroblaster direkt fästa vid dem, är de flesta organoider i kontakt med fibroblaster (se figur 2C). För att upprätthålla epitelial-fibroblastinteraktioner är det viktigt att hantera organoiderna med försiktighet och undvika kraftig pipettering, virvelning och höghastighetsspinning. Optimal fixering är viktig för att upprätthålla 3D-vävnadsarkitektur, samt behålla endogen fluorescens. En 30 minuters fixering räcker för att behålla H2BeGFP-signalen och är optimal för antikropparna som används i detta protokoll, men detta kan variera mellan fluoroforerna och antikropparna som används. Rensning av organoiderna minskar ljusspridningen och förbättrar visualiseringen av hela 3D-strukturen avsevärt. Eftersom organoiderna är små är rensningen enkel och snabb; Att avbilda hela organoider med hjälp av laserskanningskonfokalmikroskopi kan dock vara tidskrävande, eftersom flera Z-staplar måste göras. Konfokalmikroskop, som den snurrande skivan, kan användas för att minska bildtiden.
Sammantaget ger esofageala organoider odlade i närvaro av fibroblaster ett värdefullt verktyg för att förstå aspekter av matstrupen stamcellsnisch. Dessutom ger helmonterad röjning en tillgänglig metod för att visualisera interaktionen mellan fibroblaster och organoider.
Disclosures
Författarna förklarar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av ERC StG TroyCAN (851241). E.E. är postdoktor vid Cancerfonden. M.G. är Ragnar Söderberg Fellow och Cancerfonden Junior Investigator. Vi är tacksamma för det tekniska biståndet från Karolinska Institutets core faciliteter, inklusive Biomedicum Flow Cytometry Core Facility, Biomedicum Imaging Core (BIC) och Comparative Medicine Biomedicum (KMB) djuranläggning. Vi tackar medlemmarna i Genander-labbet för att noggrant ha läst och kommenterat protokollet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher (Gibco) | 17504001 | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | fisher scientific | 356231 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855-100ML | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher (Gibco) | 11320074 | |
| DPBS | Thermo Fisher (Gibco) | 14190250 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher (Gibco) | 35050061 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermo Fisher (Gibco) | 14175-129 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno | 017-000-121 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher (Gibco) | 15140122 | |
| Triton X-100 solution | Merck | 93443-100ML | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher (Gibco) | 25200-056 | |
| Chemicals, Peptides, and recombinant proteins | |||
| DAPI Solution | Thermo Fisher | 62248 | |
| Dissociation solution: 0.25 mg/ml Liberase TM, 0.25 mg/ml Dnase in HBSS | |||
| Dnase I | Sigma-Aldrich | 11284932001 | |
| Formaldehyde, 37%, with 10-15% methanol | Sigma-Aldrich | 252549-1L | |
| Liberase | Sigma-Aldrich | 5401127001 | |
| N-Acetyl-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-25G | |
| Noggin murine | Peprotech | 250-38 | |
| RapiClear 1.47 | SunJin Lab | #RC147001 | |
| Recombinant Mouse EGF Protein, CF | R&D systems | 2028-EG-200 | |
| R-spondin-1 murine | Peprotech | 315-32 | |
| SYTOX Blue Dead Cell Stain | Thermo Fisher | S34857 | |
| Thermolysin | Sigma-Aldrich | T7902-25MG | |
| Y-27632 dihydrochloride | Sigma-Aldrich | Y0503-5MG | |
| Plastic & Glassware | |||
| Corning Sterile Cell Strainers 40um | VWR | 15360801 | |
| Corning Sterile Cell Strainers 70um | VWR | 431751 | |
| Menzel Deckgläser/ cover slips | Thermo Fisher | Q10143263NR15 | |
| SafeSeal reaction tube, 1.5 mL, PP | Sarstedt | 72.706 | |
| Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes 0.6 mL | Thermo Fisher | 3446 | |
| SuperFrost Slides | VWR | 631-9483 | |
| Tools | |||
| 0.05 mm 4 circular well iSpacer | SunJin Lab | #IS204 | |
| Dumont #5 forceps, biology tip | F.S.T | 11252-20 | |
| ImmEdge Pen | VectorLaboratories | H-4000 | |
| Spring Scissors Angled to Side Ball Tip 8mm Cutting Edge | F.S.T | 15033-09 | |
| Instruments | |||
| Confocal microscope Stellaris 5 | Leica | ||
| Dissection microscope ZEISS Stemi 305 | Zeiss | ||
| FACS ARIA III | BD Biosciences | ||
| Conjugated Antibodies for FACS | |||
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD104 Antibody Clone: 346-11A |
123608 | 123608 | |
| APC anti-mouse CD26 (DPP-4) Antibody | H194-112 | H194-112 | |
| PE/Cy7 anti-mouse/human CD324 (E-Cadherin) Antibody | 147310 | 147310 | |
| Antibodies for Immunofluorescence | |||
| CD104 (ß-integrin 4) Clone: 346-11A |
BioLegend | 553745 | |
| Cytokeratin 14 | Acris Antibodies (AbD Serotec) | BP5009 | |
| Cytokeratin13 Clone: EPR3671 |
abcam | ab92551 | |
| E-cadherin (CD324) Clone: 2.40E+11 |
Cell Signaling Technology | 3195 | |
| Keratin 5 Polyclonal Chicken Antibody, Purified Clone: Poly9059 |
BioLegend | 905901 | |
| p63 Clone: 4a4 |
abcam | ab735 | |
| Recombinant Anti-KLF4 antibod Clone: EPR20753-25 |
abcam | ab214666 | |
| Vimentin | Sigma-Aldrich | AB5733 | |
| Secondary antibodies | |||
| Donkey anti-species* antibodies with fluorophore of choice | Jackson Immuno |
References
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
- Lohmussaar, K., et al. Patient-derived organoids model cervical tissue dynamics and viral oncogenesis in cervical cancer. Cell Stem Cell. 28 (8), 1380-1396 (2021).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Smukler, S. R., et al. The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin. Cell Stem Cell. 8 (3), 281-293 (2011).
- Zheng, B., et al. A new murine esophageal organoid culture method and organoid-based model of esophageal squamous cell neoplasia. iScience. 24 (12), 103440 (2021).
- DeWard, A. D., Cramer, J., Lagasse, E. Cellular heterogeneity in the mouse esophagus implicates the presence of a nonquiescent epithelial stem cell population. Cell Reports. 9 (2), 701-711 (2014).
- Kasagi, Y., et al. The esophageal organoid system reveals functional interplay between notch and cytokines in reactive epithelial changes. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (3), 333-352 (2018).
- Plikus, M. V., et al. Fibroblasts: Origins, definitions, and functions in health and disease. Cell. 184 (15), 3852-3872 (2021).
- McCarthy, N., et al. Distinct mesenchymal cell populations generate the essential intestinal BMP signaling gradient. Cell Stem Cell. 26 (3), 391-402 (2020).
- Cordero-Espinoza, L., et al. Dynamic cell contacts between periportal mesenchyme and ductal epithelium act as a rheostat for liver cell proliferation. Cell Stem Cell. 28 (11), 1907-1921 (2021).
- Pastula, A., et al. Three-dimensional gastrointestinal organoid culture in combination with nerves or fibroblasts: a method to characterize the gastrointestinal stem cell niche. Stem Cells International. 2016, 3710836 (2016).
- Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).
- McGinn, J., et al. A biomechanical switch regulates the transition towards homeostasis in oesophageal epithelium. Nature Cell Biology. 23 (5), 511-525 (2021).
- Zhang, Y., Bailey, D., Yang, P., Kim, E., Que, J. The development and stem cells of the esophagus. Development. 148 (6), (2021).
- Ohlund, D., et al. Distinct populations of inflammatory fibroblasts and myofibroblasts in pancreatic cancer. The Journal of Experimental Medicine. 214 (3), 579-596 (2017).
- Pentinmikko, N., et al. Notum produced by Paneth cells attenuates regeneration of aged intestinal epithelium. Nature. 571 (7765), 398-402 (2019).
- Janson, D., Rietveld, M., Willemze, R., El Ghalbzouri, A. Effects of serially passaged fibroblasts on dermal and epidermal morphogenesis in human skin equivalents. Biogerontology. 14 (2), 131-140 (2013).
- Landry, N. M., Rattan, S. G., Dixon, I. M. C. An improved method of maintaining primary murine cardiac fibroblasts in two-dimensional cell culture. Scientific Reports. 9 (1), 12889 (2019).
