Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Real-time meting van het mitochondriale bio-energetische profiel van neutrofielen

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/64971
Automatic Translation
1, 2,3, 1
1Department of Immunology, School of Medicine, UConn Health, 2Arthritis and Clinical Immunology Program, Oklahoma Medical Research Foundation, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Oklahoma Health Science Center

Summary

We beschrijven stapsgewijze protocollen die de mitochondriale ademhaling van muis en menselijke neutrofielen en HL60-cellen meten met behulp van de metabole extracellulaire fluxanalysator.

Abstract

Neutrofielen zijn de eerste verdedigingslinie en de meest voorkomende leukocyten bij de mens. Deze effectorcellen voeren functies uit zoals fagocytose en oxidatieve burst en creëren neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) voor microbiële klaring. Nieuwe inzichten in de metabole activiteiten van neutrofielen dagen het vroege concept uit dat ze voornamelijk afhankelijk zijn van glycolyse. Nauwkeurige meting van metabole activiteiten kan verschillende metabole behoeften van neutrofielen ontvouwen, waaronder de tricarbonzuur (TCA) cyclus (ook bekend als de Krebs-cyclus), oxidatieve fosforylering (OXPHOS), pentosefosfaatroute (PPP) en vetzuuroxidatie (FAO) onder fysiologische omstandigheden en in ziektetoestanden. Dit artikel beschrijft een stapsgewijs protocol en vereisten om de zuurstofverbruikssnelheid (OCR) te meten als een indicator van mitochondriale ademhaling op van het beenmerg afgeleide neutrofielen van muizen, van menselijk bloed afgeleide neutrofielen en de neutrofielachtige HL60-cellijn, met behulp van metabole fluxanalyse op een metabole extracellulaire fluxanalysator. Deze methode kan worden gebruikt voor het kwantificeren van de mitochondriale functies van neutrofielen onder normale en ziekteomstandigheden.

Introduction

Mitochondriën spelen een belangrijke rol in celbio-energetica, die adenosinetrifosfaat (ATP) genereert door oxidatieve fosforylering (OXPHOS). Daarnaast strekt de rol van mitochondriën zich uit tot de generatie en ontgifting van reactieve zuurstofsoorten, cytoplasmatische en mitochondriale matrixcalciumregulatie, cellulaire synthese, katabolisme en het transport van metabolieten in de cel1. Mitochondriale ademhaling is essentieel in alle cellen, omdat hun disfunctie kan leiden tot metabole problemen 2, waaronder hart- en vaatziekten3 en een breed scala aan neurodegeneratieve ziekten, zoals leeftijdsgebonden maculaire degeneratie4, de ziekte van Parkinson en Alzheimer5 en de ziekte van Charcot-Marie-Tooth2 A (CMT2A)6.

Elektronenmicroscopische studies op neutrofielen onthulden dat er relatief weinig mitochondriën7 zijn en dat ze sterk afhankelijk zijn van glycolyse voor hun energieproductie, omdat mitochondriale ademhalingssnelheden erg laag zijn8. Mitochondriën zijn echter cruciaal voor neutrofiele functies, zoals chemotaxis9 en apoptose10,11,12. Een eerdere studie onthulde een complex mitochondriaal netwerk in menselijke neutrofielen met een hoog membraanpotentiaal. Het mitochondriale membraanpotentiaalverlies is een vroege indicator van neutrofiele apoptose10. Behandeling met mitochondriale uncoupler carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone (CCCP) toonde significante remming in chemotaxis, samen met een verandering in mitochondriale morfologie 9,10.

Hoewel de primaire energiebron voor neutrofielen glycolyse is, leveren mitochondriën de ATP die neutrofiele activering initieert door de eerste fase van purinerge signalering te voeden, die Ca2 + -signalering verhoogt, mitochondriale ATP-productie versterkt en neutrofiele functionele responsen initieert13. Disfunctie van de mitochondriale ademhalingsketen resulteert in overmatige productie van toxische reactieve zuurstofsoorten (ROS) en leidt tot pathogene schade14,15,16. NETosis, het proces van het vormen van neutrofiele extracellulaire vallen (NET's), is een kritieke eigenschap van neutrofielen die hen helpt te vechten tegen pathogenen17 en bijdraagt aan vele pathologische aandoeningen, waaronder kanker, trombose en auto-immuunziekten18. Mitochondriaal afgeleide ROS dragen bij aan NETosis19, mitochondriaal DNA kan een onderdeel zijn van NETs18, en veranderde mitochondriale homeostase schaadt NETosis 20,21,22,23,24. Bovendien wordt tijdens normale differentiatie of rijping de metabole herprogrammering van neutrofielen omgekeerd door de glycolytische activiteit te beperken, en ze houden zich bezig met mitochondriale ademhaling en mobiliseren intracellulaire lipiden25,26.

De metabole extracellulaire fluxanalysator kan continu de mitochondriale ademhaling en glycolyse van levende cellen controleren en kwantificeren. De analyzer maakt gebruik van een 96-well plaatformaat sensorpatroon en twee fluoroforen om zuurstof (O2) concentratie en pH-veranderingen te kwantificeren. De sensorcartridge bevindt zich tijdens de test boven de celmonolaag en vormt een ~200 nm hoge microkamer. De optische vezelbundels in de analyzer worden gebruikt om de fluoroforen te prikkelen en de fluorescerende intensiteitsveranderingen te detecteren. Real-time veranderingen in O2-concentratie en pH worden automatisch berekend en weergegeven als zuurstofverbruikssnelheid (OCR) en extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR). Er zijn vier poorten op de sensorcartridge waarmee tijdens de testmetingen maximaal vier verbindingen in elke put kunnen worden geladen. Dit protocol richt zich op het kwantificeren van de mitochondriale ademhaling van muis- en menselijke neutrofielen, evenals de neutrofielachtige HL60-cellen, met behulp van de metabole extracellulaire fluxanalysator.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Gehepariniseerde volbloedmonsters werden verkregen van gezonde menselijke donoren na het verkrijgen van geïnformeerde toestemming, zoals goedgekeurd door de Institutional Review Board van UConn Health in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki. Alle dierproeven volgden de richtlijnen van de UConn Health Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) en goedkeuring voor het gebruik van knaagdieren werd verkregen van de UConn Health IACUC volgens de criteria die zijn uiteengezet in de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals van de National Institutes of Health. Mannelijke C57BL/6 muizen op de leeftijd van 6 weken werden gebruikt in deze studie.

1. Voorbereiding van de 96-well plaat voor de metabole extracellulaire flux assay

  1. Een sensorpatroon is verpakt bovenop de speciaal ontworpen 96-well plaat voor de metabole extracellulaire fluxtest. Hydrateer de patroon door deze voorzichtig op te tillen en plaats 200 μL/put kalibratiemedium in elk putje van de onderliggende plaat. Plaats de patroon over de plaat met kaliber in een niet-CO2, bevochtigde, 37 °C incubator 's nachts om te hydrateren.
  2. Gebruik op basis van het celtype een specifieke coating voor de kweekplaat om de celhechting te garanderen. Voor menselijke neutrofielen - ongedifferentieerde en gedifferentieerde HL60-cellen - bedekt de 96-well-plaat met steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) met 50 μL 5 μg / ml gezuiverd muis anti-humaan CD18-antilichaam (Kloon TS1/18) bij 4 °C gedurende de nacht. Voor neutrofielen van muizen bekleedt u de 96-wells plaat met 25 μL van 22,4 μg/ml Cell Tak bij pH 8,0 in 0,1 M NaHCO3 bij kamertemperatuur (RT) gedurende 20 minuten.
  3. Was de borden tweemaal met 200 μL steriele PBS.
  4. Voeg volledig medium toe aan de hoekputten (A1, A12, H1 en H12) van de celkweekplaat (zonder cellen) voor achtergrondcorrectie in de celkweekplaten tijdens het zaaien.
    OPMERKING: Verdamping tijdens het coaten en kalibreren kan het volume van de kalibratiemedia en de normalisatie beïnvloeden. Gebruik een bak of kamer met steriel met water bevochtigd weefsel en plaats de plaat met het kaliber erboven om verdamping te voorkomen.

2. Bereiding en zaaien van cellen

  1. Bereiding van het testmedium
    1. Bereid testmedium door 1 mM pyruvaat, 10 mM glucose en 2 mM glutamine toe te voegen aan dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM).
  2. Isolatie van neutrofielen van muizen uit beenmerg
    1. Isoleer neutrofielen van muizen uit het beenmerg met behulp van de Mouse Neutrophil Enrichment Kit, volgens de instructies van de fabrikant.
    2. Verdoof de muizen door intraperitoneale (i.p.) injectie van ketamine (125 mg / kg) en xylazine (12,5 mg / kg) en euthanaseer de muizen vervolgens door cervicale dislocatie.
    3. Oogst de dijbenen en scheenbenen, zoals eerder beschreven27. Snijd kort de huid af om het been bloot te leggen met de spieren. Snijd het heupgewricht af om het been van het lichaam te verwijderen. Verwijder vervolgens de spieren om het dijbeen en het scheenbeen te verzamelen.
    4. Snijd de kleinere uiteinden van de dijbenen en scheenbenen. Houd de gesneden uiteinden naar beneden, plaats ze in een centrifugebuis van 0,5 ml met twee naaldponsgaten van 25 G met spuitnaalden in de bodem en plaats de buis van 0,5 ml in een centrifugebuis van 1,5 ml (figuur 1A). Voeg 50 μL PBS toe aan de buis van 0,5 ml om het uitdrogen van beenmergcellen te voorkomen.
    5. Centrifugeer bij 5.900 × g bij RT gedurende 15 s om het beenmerg op de bodem van de buis van 1,5 ml te verzamelen. Resuspendie van de beenmergcellen met 1 ml DMEM. Voeg 50 μL rattenserum uit de kit toe, meng voorzichtig door pipetteren en breng de celsuspensie over in een 5 ml polystyreenkweekbuis.
    6. Voeg 50 μL verrijkingscocktail uit de Mouse Neutrophil Enrichment Kit toe en incubeer gedurende 15 min bij RT. Centrifugeer bij 300 × g bij RT gedurende 5 min.
    7. Resuspendeer de cellen met 1 ml DMEM, voeg 50 μL biotineselectiecocktail uit de kit toe, meng voorzichtig door pipetteren en incubeer gedurende 15 minuten bij RT.
    8. Voeg 150 μL vortexed magnetische deeltjes uit de kit toe, meng voorzichtig door pipetteren en incubeer gedurende 10 minuten bij RT.
    9. Voeg ~ 1,3 ml DMEM toe, meng voorzichtig door pipetteren, plaats de buis gedurende 3 minuten in de magneet en breng het supernatant met gezuiverde muisneutrofielen over naar een nieuwe 5 ml polystyreencultuurreageerbuis door de oorspronkelijke buis samen met de magneet om te keren.
    10. Centrifugeer bij 300 × g bij RT gedurende 5 min. Na het verwijderen van het supernatant door vacuümaspiratie, resuspensie van de cellen met 1 ml testmedium.
    11. Tel de cellen handmatig met behulp van een hemocytometer.
    12. Stel de celdichtheid in op 1,1 × 106 cellen/ml door het toevoegen van testmedium, zaad 180 μL van de neutrofielensuspensie van de muis (2 ×10 5 cellen) per put in de voorbereide 96-putplaat (stappen 1.2-1.4) en centrifugeer de plaat bij 300 × g bij RT gedurende 3 minuten zonder rem om een goede hechting van de cellen aan de onderkant van de plaat te garanderen.
    13. Incubeer de plaat in een niet-CO2, bevochtigde, 37 °C incubator gedurende 1 uur om de cellen vooraf in evenwicht te brengen met het testmedium.
      OPMERKING: De zuiverheid van de neutrofielen is van cruciaal belang voor de test, omdat het een mogelijke vertekening is. De zuiverheid van de neutrofielenisolatie van de muis is 69,9% -88,7% volgens dit protocol. Er zijn andere methoden voor het isoleren van neutrofielen uit het beenmerg van muizen, zoals dichtheidsgradiëntcentrifugatie28. Er zijn ook alternatieve neutrofiele isolatiekits van andere leveranciers, gebaseerd op de negatieve magnetische selectie met behulp van de monoklonale antilichamen tegen antigenen die niet tot expressie komen op neutrofielen.
  3. Isolatie van menselijke neutrofielen uit perifeer bloed
    1. Voeg 8 ml polysaccharide-oplossing toe aan een centrifugebuis van 15 ml en leg vervolgens 4 ml perifeer bloed op de polysaccharide-oplossing zonder te mengen.
    2. Centrifugeer bij 550 × g bij 20 °C gedurende 30 min. Laat de rotor vertragen op 1.
      OPMERKING: De scheidingstijd van neutrofielen kan variëren tussen donoren. Het is minimaal 30 minuten en een extra 10-20 minuten kan nodig zijn als neutrofielenscheiding niet succesvol is.
    3. Observeer de scheiding van plasma/bloedplaatjes en mononucleaire cellen na de centrifugatie, zoals weergegeven in figuur 1B. Verwijder voorzichtig de bovenste gele vloeistof aan de bovenkant (plasma en bloedplaatjes) en de bovenste troebele band (mononucleaire cellen) zonder de onderste troebele band (neutrofielen) te verstoren met behulp van een pipet van 1 ml.
    4. Verzamel de onderste troebele band en ~ 3-4 ml van de heldere vloeistof eronder in een nieuwe centrifugebuis van 15 ml met 10 ml PBS.
    5. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 400 × g bij 20 °C en verwijder het supernatant door vacuümaspiratie.
    6. Resuspendeer de cellen met 5 ml PBS en centrifugeer bij 300 × g bij 20 °C gedurende 5 minuten.
    7. Na het verwijderen van het supernatant, resuspendien de cellen met 1 ml testmedium.
    8. Tel de cellen handmatig met behulp van een hemocytometer.
      OPMERKING: Aangezien erytrocyten in het bloed geen mitochondriën hebben, heeft erytrocytenbesmetting geen invloed op de mitochondriale stresstesttest en voorkomt neutrofiele activering / priming29,30. Erytrocyten moeten tijdens het tellen van de cellen worden gelyseerd om een nauwkeurige neutrofielenconcentratie te krijgen. Voeg 10 μL van de celsuspensie toe aan 891 μL gedeïoniseerd water gedurende 10-30 s om de erytrocyten te lyseren en voeg vervolgens 99 μL 10x PBS toe om de osmotische druk in evenwicht te brengen, waardoor lysis van de neutrofielen wordt vermeden.
    9. Pas de celdichtheid aan op 2,2 × 106 cellen / ml door testmedium toe te voegen, zaad 180 μL menselijke neutrofielen (~ 4 ×10 5) per put in de voorbereide 96-putplaat en centrifugeer de plaat op 300 × g bij RT gedurende 3 minuten zonder rem om een goede hechting van de cellen aan de onderkant van de plaat te garanderen.
    10. Incubeer de plaat in een niet-CO2, bevochtigde, 37 °C incubator gedurende 1 uur om de cellen vooraf in evenwicht te brengen met het testmedium.
      OPMERKING: De zuiverheid van neutrofielen is van cruciaal belang voor de test, omdat het een potentiële vertekening is. De zuiverheid van menselijke neutrofielenisolatie is 86,6% -96,8%. Er zijn andere dichtheidsgradiëntcentrifugatiemethoden voor het isoleren van neutrofielen uit menselijk bloed, waaronder Percoll-isolatie en een combinatie van Ficoll-isolatie en dextran-sedimentatie31.
  4. HL60-celkweek en neutrofielgerichte differentiatie
    1. Onderhoud HL60-cellen in Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium met 10% foetaal runderserum (FBS), 100 μg / ml penicilline, 100 μg / ml streptomycine en 250 ng / ml amfotericine B bij 37 °C en 5% CO2.
    2. Voor neutrofielgerichte differentiatie, handhaaf de HL60-cellen (gesuspendeerde cellen) in een T25-kolf op een dichtheid van 1 × 10 5 cellen / ml in RPMI-1640-medium met 10% FBS, 100 μg / ml penicilline, 100 μg / ml streptomycine, 250 ng / ml amfotericine B en 1,3% dimethylsulfoxide (DMSO) bij 37 °C en5 % CO2 gedurende 6 dagen.
    3. Tel op de dag van de test de cellen handmatig met behulp van de hemocytometer, centrifugeer gedifferentieerde of ongedifferentieerde HL60-cellen bij 300 × g bij RT gedurende 5 minuten, was eenmaal met DMEM en resuspendien de cellen met het testmedium om een celdichtheid van 1,39 × 106 cellen / ml te krijgen.
    4. Zaai 180 μL gedifferentieerde of ongedifferentieerde HL60-cellen (~ 2,5 × 105) per put in de voorbereide 96-putplaat en centrifugeer de plaat bij 300 × g bij RT gedurende 3 minuten zonder rem om een goede hechting van de cellen aan de onderkant van de plaat te garanderen.
    5. Incubeer de plaat in een niet-CO2, bevochtigde, 37 °C incubator gedurende 1 uur om de cellen vooraf in evenwicht te brengen met het testmedium.
      OPMERKING: Bevestig de volledige hechting van cellen met behulp van een microscoop vóór de volgende stap.

Figure 1
Figuur 1: Schematisch diagram van de isolatie van beenmergcellen en neutrofielen. (A) Het oogsten van beenmergcellen van een muis en (B) het isoleren van neutrofielen uit menselijk bloed. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Celtype Cellen per put Verbindingen/reagentia Concentratie van werkoplossing Injectievolume naar poorten Eindconcentratie in putten
Neutrofielen van muizen 2 × 105 Oligomycine 25 μM 20 μL 2,5 μM
FCCP 7,5 μM 17,6 μL 0,61 μM
Rotenon Antimycine A mengsel 10 μM 24 μL 1 μM
Menselijke neutrofielen 4 × 105 Oligomycine 10 μM 20 μL 1 μM
FCCP 12,5 μM 22 μL 1,25 μM
Rotenon Antimycine A mengsel 10 μM 24 μL 1 μM
Ongedifferentieerde of gedifferentieerde HL60-cellen 2.5 × 105 Oligomycine 25 μM 20 μL 2,5 μM
FCCP 15 μM 22 μL 1,5 μM
Rotenon Antimycine A mengsel 10 μM 24 μL 1 μM

Tabel 1: Celaantallen en reagensconcentraties voor de mitochondriale stresstest.

3. Bereiding van verbindingen in de mitochondriale stresstestkit

  1. Open de mitochondriale stresstestkit en bereid de reagentia voor.
    OPMERKING: De verschillende concentraties van de werkoplossing, het injectievolume in de putten en de eindconcentraties in de putten van oligomycine, carbonylcyanide p-trifluoromethoxyfenylhydrazon (FCCP) en rotenon/antimycine Een mengsel dat wordt gebruikt voor neutrofielen van muizen, menselijke neutrofielen en HL60-cellen zijn weergegeven in tabel 1.
    1. Bereid oligomycine-stamoplossing door oligomycine te reconstitueren met 630 μL testmedium om een stamoplossing van 100 μM te verkrijgen.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de stockoplossing op dezelfde dag te gebruiken.
      1. Bereid oligomycine-werkoplossing voor neutrofielen- en HL60-celtests bij muizen door 630 μL stamoplossing te mengen met 1.890 μL testmedium om een werkoplossing van 25 μM te verkrijgen.
      2. Bereid oligomycine-werkoplossing voor de humane neutrofielentest door 300 μL stamoplossing te mengen met 2.700 μL testmedium om een werkoplossing van 10 μM te verkrijgen.
        OPMERKING: De binding van oligomycine aan de Fo-basisplaatsubeenheid van de Fo/F1 ATPase (ATP-synthase) voorkomt het opnieuw binnendringen van protonen in mitochondriën en remt de ATP-synthese32. Dit vermindert de elektronenstroom door de elektronentransportketen en de OCR aanzienlijk. De elektronenstroom stopt echter niet volledig als gevolg van protonlekkage over het binnenste mitochondriale membraan33.
    2. Bereid FCCP-stamoplossing door FCCP te reconstitueren met 720 μL testmedium om een stamoplossing van 100 μM te verkrijgen.
      1. Bereid werkoplossing voor de neutrofielentest van de muis door 300 μL stamoplossing te mengen met 3.700 μL testmedium om een werkoplossing van 7,5 μM te verkrijgen.
      2. Bereid werkoplossing voor de humane neutrofielentest door 375 μL stockoplossing te mengen met 2,625 μL testmedium om een werkoplossing van 12,5 μM te verkrijgen.
      3. Bereid werkoplossing voor de HL60-celtest door 720 μL stamoplossing te mengen met 4.080 μL testmedium om een werkoplossing van 15 μM te verkrijgen.
        OPMERKING: De toevoeging van FCCP onthult de maximale capaciteit van de mitochondriën om OXPHOS te gebruiken. Het is een lipide-oplosbaar, zwak zuur doorlaatbaar voor mitochondriën resulteert in de dissipitatie van transmembraanpotentiaal. Het ontladen van de protongradiënt over het mitochondriale binnenmembraan en het omleiden van de protonflux van Fo/F1 ATP-synthase resulteert in mitochondriale ontkoppeling. Dit ontkoppelingseffect verhoogt abrupt het mitochondriale zuurstofverbruik om de protongradiënt34 te behouden.
    3. Bereid rotenon/antimycine A-stamoplossing door het rotenon/antimycine A-mengsel met 540 μL testmedium te reconstitueren om een stamoplossing van 50 μM te verkrijgen.
      1. Bereid rotenon/antimycine A-werkoplossing voor alle testen door 540 μL stamoplossing te mengen met 2.160 μL testmedium om een werkoplossing van 10 μM te verkrijgen.
        OPMERKING: Rotenon blokkeert complex I door de elektronenoverdracht van de ijzer-zwavelcentra in complex I naar ubiquinon te remmen, terwijl antimycine A complex III van de elektronentransportketen blokkeert, wat leidt tot een blokkade van OXPHOS met een beperkte synthese van ATP35. Daarbij onthult dit niet-mitochondriale ademhaling36,37.
  2. Laad de patroon met reagentia; laad bereid oligomycine, FCCP en rotenon/antimycine A-mengsel in respectievelijk de A-, B- en C-poorten in de patroon voor injecties (figuur 2). Gebruik de beschikbare sjablooninzet samen met de cartridge om het laden van reagentia naar de poorten te vergemakkelijken. Vul de ongebruikte poorten met 20 μL testmedium.
    1. Voor de neutrofielentest bij muizen laadt u 20 μL oligomycine (25 μM; elke put van de 96-wellplaat heeft aan het begin 180 μL testmedium, dus de uiteindelijke concentratie is 2,5 μM) in de A-poorten. Laad 17,6 μL FCCP (7,5 μM; eindconcentratie: ~0,61 μM) in de B-poorten. Laad 24 μL rotenon/antimycine A-mengsel (10 μM; eindconcentratie: ~1 μM) in de C-poorten.
    2. Voor de humane neutrofielentest laadt u 20 μL oligomycine (10 μM; elke put van de 96-wellplaat heeft aan het begin 180 μL testmedium, dus de uiteindelijke concentratie is 1 μM) in de A-poorten. Laad 22 μL FCCP (12,5 μM; eindconcentratie: ~1,25 μM) in de B-poorten. Laad 24 μL rotenon/antimycine A-mengsel (10 μM; eindconcentratie: ~1 μM) in de C-poorten.
    3. Voor de HL60- en dHL60-celtest laadt u 20 μL oligomycine (25 μM; elke put van de 96-wellplaat heeft aan het begin 180 μL testmedium, dus de uiteindelijke concentratie is 2,5 μM) in de A-poorten. Laad 22 μL FCCP (15 μM; eindconcentratie: ~1,5 μM) in de B-poorten. Laad 24 μL rotenon/antimycine A-mengsel (10 μM; eindconcentratie: ~1 μM) in de C-poorten.
      OPMERKING: Pipetteer de geneesmiddeloplossing in de haven zonder de bodem van de poort aan te raken. Tik niet op de plaat na het laden om lekkage te voorkomen, omdat de vloeistoffen worden vastgehouden door de capillaire krachten. De achtergrondputten van de kweekplaat en de poorten op de sensorpatroon worden geladen met testmedium of met dezelfde laadpoort van reagentia als in de monsterputten om het effect van reagentia op de achtergrondwaarden te normaliseren. De reagentia moeten aan de respectieve poorten worden toegevoegd zonder de patroon van de kalibranthoudende gebruiksplaat op te tillen om luchtafsluiting te voorkomen. Vul de laatste poort van alle putten met het medium zoals weergegeven in figuur 2.

Figure 2
Figuur 2: De mitochondriale spanningstestpatroon en hun injectiepoorten. De afbeelding toont de cartridge van de mitochondriale stresstest en een vergrote afbeelding van het laden van individuele geneesmiddelen / medium naar de poorten. Afkorting: FCCP = carbonylcyanide p-trifluoromethoxy fenylhydrazone. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Het uitvoeren van de mitochondriale stresstest

  1. Schakel de metabole analysator en computer in, open de Wave-software en klik op Heater On om de machine ten minste 5 uur van tevoren op 37 °C in te stellen. Na het bereiken van de temperatuur toont de linkerbenedenhoek van de golfsoftware zich klaar.
  2. Open een sjabloon voor de mitochondriale stresstestkit in de software. Klik op Groepsdefinitie in de bovenste menubalk.
  3. Stel elke definitie aan de linkerkant afzonderlijk in, zoals injectiestrategieën, voorbehandelingen, testmedia en (gebruikte biomateriaal) celtypen.
  4. Klik op injectiestrategieën aan de linkerkant, klik vervolgens op Toevoegen en geef de injectieconditie de naam Humane neutrofielen/Muisneutrofielen/HL60. Selecteer poort A-D door op elk te klikken en klik op Verbinding toevoegen en voer oligomycine / FCCP / rotenonantimycine A in met de respectieve concentraties (tabel 1).
  5. Klik op voorbehandeling aan de linkerkant, klik vervolgens op Toevoegen en noem ze afzonderlijk als CD18 en Cell Tak. Klik op het gebruikte biomateriaal aan de linkerkant, klik vervolgens op Toevoegen en noem ze als menselijke neutrofielen, muisneutrofielen en HL60 / dHL60 met zaaidichtheid.
  6. Definieer de groepen door te klikken op Groep toevoegen (bijvoorbeeld voor de menselijke neutrofielentest) en door te klikken op de onderliggende definitie (bijvoorbeeld injectiestrategieën volgens tabel 1-Menselijke neutrofielen, voorbehandeling als CD18 en celtype als menselijke neutrofielen).
  7. Klik op Plaatkaart in het bovenste menu om alle groepen te observeren, met definities aan de linkerkant en de plaatkaart aan de rechterkant. Sleep en zet neer om elk putje aan de groep toe te voegen met behoud van de vier hoekputten als Achtergrond (standaard).
  8. Stel het protocol in door op Protocol in het bovenste menu te klikken en definieer drie cycli van baseline, oligomycine, FCCP, rotenon en antimycine A-mengsel door de tijd in te stellen op Mengen als 3 min, Rust als 0 min en Meting als 7 min.
  9. Ga naar de pagina Test uitvoeren , geef de samenvatting van het project op ter referentie en klik op Start Run.
  10. Geef de locatie op om de bestanden op te slaan, zodat alle resultaten worden opgeslagen na voltooiing van de test.
  11. Wacht na het automatisch laden van de test tot de lade is geopend om de sensorcartridge en -plaat met 200 μL kaliber te plaatsen (stap 1.1). Stel de richting van de streepjescode van de cartridge naar rechts in. Voer de kalibratie uit door op Ik ben klaar te klikken, wat ongeveer 20 minuten duurt.
  12. Klik na de kalibratie op Open Tray. Vervang de plaat door de cel-seeded plaat en klik op Load Cell Plate om door te gaan met de assay.
  13. Na het voltooien van de test worden de gegevens automatisch opgeslagen. Klik op Resultaten bekijken en exporteer deze als een spreadsheet of ander analysesoftwarebestand.
  14. Grafiek en analyseer de gegevens (figuur 3 en figuur 4).
  15. Bereken ademhalingsparameters, waaronder basale mitochondriale ademhaling, protonlekgekoppelde ademhaling, ATP-gekoppelde ademhaling, maximale ademhaling, reserve ademhalingscapaciteit en niet-mitochondriale ademhaling (figuur 4A) 38,39,40,41.
    1. Bereken de basale mitochondriale ademhaling door de OCR-waarde gemeten na toevoeging van rotenon/antimycine A-mengsel af te trekken van de OCR voordat oligomycine wordt geïnjecteerd (figuur 4A, a).
    2. Bereken de protonlekgekoppelde ademhaling door de OCR-waarde na rotenon/antimycine A-mengselinjectie af te trekken van de OCR-waarde gemeten na oligomycine-injectie (figuur 4A,b).
    3. Schat de ATP-gekoppelde ademhaling door het verschil te berekenen tussen de basale mitochondriale ademhaling en protonlekgekoppelde ademhaling. Trek de eerste OCR-waarde gemeten na oligomycine-injectie af van de eerste OCR-waarde vóór oligomycine-injectie (figuur 4A,c).
    4. Maximale ademhaling is de maximale ademhalingssnelheid die een cel kan bereiken na het toevoegen van FCCP. Bereken dit door de OCR-waarde na rotenon/antimycine A-mengselinjectie af te trekken van de OCR-waarde gemeten na FCCP-injectie (figuur 4A,d).
    5. Reserve ademhalingscapaciteit verwijst naar de capaciteit van een cel om te voldoen aan de hogere energievraag via OXPHOS. Bereken dit door het verschil te vinden tussen de maximale ademhaling en de basale mitochondriale ademhaling (figuur 4A, e).
    6. Niet-mitochondriale ademhaling is de hoeveelheid zuurstof die wordt verbruikt door niet-mitochondriale bronnen. Meet dit na toevoeging van rotenon/antimycine A-mengsel (figuur 4A,f).
  16. Voer statistische analyse uit met behulp van de t-test van Student om verschillende ademhalingsparameters van ongedifferentieerde en gedifferentieerde HL60-cellen te vergelijken. Beschouw p < 0,05 als statistisch significant.
    OPMERKING: Replicaties met OCR- of ECAR-waarden onder nul worden beschouwd als een fout in de monstervoorbereiding, samengestelde injectie of meting. Ze zijn uitgesloten van toekomstige analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Representatieve OCR-dynamiek wordt getoond met de mitochondriale ademhalingsveranderingen in reactie op oligomycine, FCCP en rotenon / antimycine Een mengsel van muisneutrofielen (figuur 3A), menselijke neutrofielen (figuur 3B) en ongedifferentieerde en gedifferentieerde HL60-cellen (figuur 3C). In alle cellen verlaagt oligomycinebehandeling de OCR-waarde door het protonkanaal van ATP-synthase te remmen; FCCP-behandeling herstelt de OCR-waarde door de elektronenstroom en het zuurstofverbruik te verhogen om het membraanpotentiaal te behouden en maximale ademhaling te bereiken; en rotenon/antimycine Een mengselbehandeling elimineert mitochondriale ademhaling door de complexen I en III van de elektronentransportketen te blokkeren.

We zagen dat HL60-cellen na neutrofielgerichte differentiatie een verminderde mitochondriale ademhaling vertoonden (figuur 3C). Na het kwantificeren van verschillende ademhalingsparameters, hierboven vermeld, vertoonden gedifferentieerde HL60-cellen significant lagere basale mitochondriale (figuur 4B) ademhaling, protonlekgekoppelde ademhaling (figuur 4C), ATP-gekoppelde ademhaling (figuur 4D) en niet-mitochondriale ademhaling (figuur 4G). De maximale ademhaling (figuur 4E) in gedifferentieerde HL60-cellen was verhoogd, maar niet significant. De reserve ademhalingscapaciteit (figuur 4F) was aanzienlijk toegenomen.

Figure 3
Figuur 3: Representatieve grafieken met de dynamische veranderingen van OCR tijdens de mitochondriale stresstesttest. (A) Gemiddelde ± SD van n = 3 replicaties van muisneutrofielen. (B) Gemiddelde ± SD van n = 3 replicaties van menselijke neutrofielen. (C) Gemiddelde ± SD van n = 3 replicaties van ongedifferentieerde (HL60, blauwe) en gedifferentieerde (dHL60, rode) HL60-cellen. Afkorting: OCR = zuurstofverbruik. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Ademhalingsparameters verkregen uit OCR-dynamica. (A) Schema dat laat zien hoe (a) basale mitochondriale ademhaling, (b) protonlekgekoppelde ademhaling, (c) ATP-gekoppelde ademhaling, (d) maximale ademhaling, (e) reserve ademhalingscapaciteit en (f) niet-mitochondriale ademhaling moet worden berekend. (B-G) Gemiddelde ± SD van n = 3; (B) basale mitochondriale ademhaling, (C) protonlekgekoppelde ademhaling, (D) ATP-gekoppelde ademhaling, (E) maximale ademhaling, (F) reserve ademhalingscapaciteit en (G) niet-mitochondriale ademhaling van ongedifferentieerde (HL60) en gedifferentieerde (dHL60) HL60-cellen. ns (niet-significant) p > 0,05, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001 door de t-toets van de ongepaarde student. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De standaardprocedure die de mitochondriale ademhaling van neutrofielen meet met behulp van de metabole extracellulaire fluxanalysator wordt beperkt door vele factoren, waaronder celaantal, celgroei en levensvatbaarheid. Elke concentratie van de verbinding varieert tussen het type en de bron van de cellen in deze test. Oligomycine en rotenon/antimycine A worden meestal gebruikt in een vergelijkbare concentratie bij de meeste celtypen. Omdat de door FCCP geïnduceerde maximale ademhalingsfrequentie echter varieert tussen verschillende cellen, is zorgvuldige titratie van FCCP vereist om de concentratiete optimaliseren 42. Het is ook beter om sequentiële toevoegingen van FCCP uit te voeren tijdens de optimalisatie. Hoewel de metabole extracellulaire fluxanalysator de geneesmiddelen onder luchtdruk43 in de plaat injecteert, beperkt de ondoordringbaarheid van het celmembraan voor sommige mitochondriale complexremmers het gebruik ervan in het geval van intacte cellen in vergelijking met geïsoleerde mitochondriën44. Het laden in de havens moet zorgvuldig worden uitgevoerd om kruisbesmetting te voorkomen. De substraatconcentratie (bijv. glucose, pyruvaat, glutamine) in het medium kan ook de mitochondriale activiteit beïnvloeden en moet worden geoptimaliseerd.

Afgezien van de medicijnconcentraties is de celzaaidichtheid ook een kritische parameter bij het verkrijgen van een goede OCR-waarde. De optimale celzaaidichtheid varieert per celtype en het wordt aanbevolen om verschillende zaaidichtheden te gebruiken in voorbereidende experimenten om de effectiviteit van de meting te testen. Nauwkeurige celtelling is verplicht om de variabiliteit tussen groepen te verminderen en de juiste coatingmaterialen voor de kweekplaat moeten worden getest om de hechting van cellen aan de onderkant van de plaat te garanderen. Centrifugatie van de kweekplaat met een snelheid van 300 × g bij RT gedurende 5 minuten zonder rem helpt de snelle sedimentatie en bevestiging van de cellen. Voor het zaaien van de cellen is voldoende wassen wenselijk na het aanzuigen van het coatingmateriaal.

Het zaaien van cellen wordt uitgevoerd door cellen aan de onderrand te pipetteren, om randeffecten te voorkomen en een uniforme verspreiding van de cellen te garanderen45. De cellen worden op 37 °C gehouden en minstens 1 uur laten rusten om het randeffectte minimaliseren 46. Het wordt aanbevolen om ze vóór de meting in een niet-CO 2-incubator te houden om de celkweekplaat te ontgassen, omdat het zuurstofgehalte in het gasmengsel kan verschillen afhankelijk van het experiment en het celtype, met verschillende hypoxiewaarden voor verschillende weefsels en celtypen47. Het testmedium moet op de dag van de bepaling worden bereid (70 ml medium is voldoende voor de test). Normalisatie van de gegevens met het celnummer kan worden uitgevoerd met behulp van de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyl-2,5-tetrazoliumbromide (MTT) assay, de nucleaire fragmentatietest met Hoechst, de celtellingstest of eiwit- of DNA-kwantificeringstests48. Aangezien verschillende mitochondriale remmers worden gebruikt, moet de levensvatbaarheid van cellen worden beschouwd als een factor voor het resultaat. Het wordt aanbevolen om aan het einde van de test een levensvatbaarheidstest voor cellen uit te voeren om een mogelijk cytotoxisch effect van de gebruikte geneesmiddelen uit te sluiten.

Naast OCR kan de metabole extracellulaire fluxanalysator ook ECAR meten, wat vaak wordt gebruikt bij het kwantificeren van glycolyse49. In de mitochondriale stresstest weerspiegelen de ECAR-waarden echter de zuurgraad die wordt gegenereerd door zowel glycolyse als de tricarbonzuurcyclus (via CO2) in mitochondriale ademhaling. Om de glycolyse te meten, wordt een glycolysestresstestkit aanbevolen. Aanvankelijk toont de OCR voorafgaand aan de toevoeging van de verbindingen de basale ademhaling van de neutrofielen. Basale ademhaling treedt op als gevolg van de protonen die van de mitochondriale matrix naar de intermembraanruimte worden getransporteerd en door het binnenste mitochondriale membraan gaan, afhankelijk van de binnenste mitochondriale membraansamenstelling. Basale ademhaling is goed voor ~30%-50% van de stofwisseling van rustende cellen 1,50.

Berekeningen op basis van de basale ademhaling van de test zouden de variabiliteit tussen groepen en soorten cellen kunnen verminderen. Normalisatie van de gegevens is bereikt door vergelijking met de basale ademhaling zonder de toevoeging van geneesmiddelen, waardoor normaliserende veranderingen mogelijk zijn, afhankelijk van het aantal cellen en de bankfout op de test. Reserve ademhalingscapaciteit is het verschil tussen maximale OCR en basale OCR en is een indicator van hoe dicht de cellen functioneren bij hun bio-energetische limiet. Een afname van de maximale ademhaling duidt op een verminderd elektronentransport in de ademhalingsketen van complexen I en II naar complexen III en IV, en uiteindelijk naar moleculaire zuurstof. Figuur 4A toont de schematische weergave van de berekeningen van de test.

De toename van de reserverespiratoire capaciteit geeft aan dat cellen goed kunnen reageren op verdere energiebehoeften, wat een voorwaarde is in het geval van neutrofielen, omdat ze bij activeringin respiratoire burst terechtkomen 51,52,53,54,55. ECAR-gegevens van de mitochondriale stresstest kunnen echter niet de glycolysesnelheid van de neutrofielen weergeven. Op de gegevens kunnen bepaalde beoordelingen worden gemaakt; de verlaging van de ECAR-waarden in zowel muis- als humane neutrofielen na de toevoeging van rotenon en antimycine A impliceert bijvoorbeeld dat de ECAR-waarden vóór de toevoeging van deze complexe I- en III-remmers voornamelijk te wijten zijn aan CO2-productie uit de TCA-cyclus. In het geval van cellijnen zijn de ECAR-waarden constant na de toevoeging van rotenon en antimycine A, wat suggereert dat de ECAR-waarden vóór de toevoeging te wijten zijn aan glycolyse45.

Mitochondriale aandoeningen zijn klinische aandoeningen die worden gekenmerkt door defecte OXPHOS. In het geval van neutrofielen is de meting van de OCR laag vanwege geen celproliferatie, laag mitochondriaal aantal en vroege senescentie56. Bij neurodegeneratieve aandoeningen extravaseren neutrofielen naar amyloïde-β (Aβ) afzettingsgebieden. Het Aβ42-peptide activeert integrineactivering en snelle neutrofiele adhesie57. Tijdens apoptose geven neutrofiele mitochondriën proapoptotische eiwitten af in het cytosol58. Er is ook aangetoond dat de migratiesnelheid van neutrofielen wordt verminderd en dat chemotaxis wordt afgeschaft bij behandeling met CCCP9. Dit suggereert de mogelijke rol van mitochondriën en mitochondriale ademhaling in de neutrofielenfunctie. Mitochondriale activiteiten in verschillende celtypen onder vele pathologische aandoeningen zijn gemeld en gekoppeld aan pathogenese, zoals Alzheimer5, schizofrenie59, chronische ademhalingsziekten60, bipolaire stoornissen, sepsis, diabetici, astma, pulmonale hypertensie en sikkelcelziekte. Opkomende therapieën, zoals het verbeteren van de flux van de ademhalingsketen door het gebruik van antioxidanten (bijv. CoQ10, idebenone, alfa-liponzuur, vitamine C en E) en / of cofactoren (bijv. Riboflavine, thiamine) en de toediening van mitochondriale substraten zoals L-carnitine, zijn gebruikt bij de behandeling van mitochondriale aandoeningen. Deze behandelingen zijn echter niet gestandaardiseerd en zijn mogelijk niet effectief61. Een niet-invasieve gestandaardiseerde methodologie, zoals het gebruik van de metabole extracellulaire fluxanalysator, om mitochondriale functies in ziekterelevante cellen, zoals neutrofielen, te kwantificeren, zou kunnen dienen als een diagnostische biomarker in therapeutica.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen concurrerend financieel belang te hebben.

Acknowledgments

We erkennen Dr. Anthony T. Vella en Dr. Federica Aglianoin van de afdeling Immunologie van UConn Health voor hun training in het gebruik van de metabole extracellulaire fluxanalysator, en Dr. Lynn Puddington van de afdeling Immunologie van UConn Health voor haar ondersteuning van de instrumenten. We erkennen Dr. Geneva Hargis van UConn School of Medicine voor haar hulp bij het wetenschappelijk schrijven en redigeren van dit manuscript. Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health, National Heart, Lung, and Blood Institute (R01HL145454), National Institute of General Medical Sciences (R35GM147713 and P20GM139763), een startup-fonds van UConn Health en een Career re-entry fellowship van de American Association of Immunologists.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
37 °C non-CO2 incubator Precision Economy Model 2EG Instrument
Biorender Software Application
Centrifuge Eppendorf Model 5810R Instrument
Corning Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive Corning 102416-100 Reagent
EasySep Magnet STEMCELL 18000 Magnet
EasySepMouse Neutrophil Enrichment kit STEMCELL 19762A Reagents
Graphpad Prism 9 Software Application
Human Serum Albumin Solution (25%) GeminiBio 800-120 Reagents
Ketamine (VetaKet) DAILYMED NDC 59399-114-10 Anesthetic
PBS Cytiva SH30256.01 Reagents
Plate buckets Eppendorf UL155 Accessory
PolymorphPrep PROGEN 1895 (previous 1114683) polysaccharide solution
Purified mouse anti-human CD18 antibody Biolegend 302102 Clone TS1/18
RPMI 1640 Medium Gibco 11-875-093 Reagents
Seahorse metabolic extracellular flux analyzer Agilent XFe96 Instrument
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit Agilent 103015-100 mitochondrial stress test Kit
Swing-bucket rotor Eppendorf A-4-62 Rotor
Vactrap 2 Vacum Trap Fox Lifesciences 3052101-FLS Instrument
Wave Software Application
XF 1.0 M Glucose Solution Agilent 103577-100 Reagent
XF 100 mM Pyruvate Solution Agilent 103578-100 Reagent
XF 200 mM Glutamine Solution Agilent 103579-100 Reagent
XF DMEM medium Agilent 103575-100 Reagent
XFe96 FluxPak Agilent 102601-100 Material
Xylazine (AnaSed Injection) DAILYMED NDC 59399-110-20 Anesthetic

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: a key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795 (2019).
  2. Noguchi, M., Kasahara, A. Mitochondrial dynamics coordinate cell differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 500 (1), 59-64 (2018).
  3. Zhu, L., et al. Correlation between mitochondrial dysfunction, cardiovascular diseases, and traditional Chinese medicine. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2020, e2902136 (2020).
  4. Kaarniranta, K., et al. Mechanisms of mitochondrial dysfunction and their impact on age-related macular degeneration. Progress in Retinal and Eye Research. 79, 100858 (2020).
  5. Onyango, I. G., Khan, S. M., Bennett, J. P. Mitochondria in the pathophysiology of Alzheimer's and Parkinson's diseases. Frontiers in Bioscience. 22 (5), 854-872 (2017).
  6. Loiseau, D., et al. Mitochondrial coupling defect in Charcot-Marie-Tooth type 2A disease. Annals of Neurology. 61 (4), 315-323 (2007).
  7. Zucker-Franklin, D. Electron microscopic studies of human granulocytes: structural variations related to function. Seminars in Hematology. 5 (2), 109-133 (1968).
  8. Karnovsky, M. L. The metabolism of leukocytes. Seminars in Hematology. 5 (2), 156-165 (1968).
  9. Bao, Y., et al. mTOR and differential activation of mitochondria orchestrate neutrophil chemotaxis. The Journal of Cell Biology. 210 (7), 1153-1164 (2015).
  10. Fossati, G., et al. The mitochondrial network of human neutrophils: role in chemotaxis, phagocytosis, respiratory burst activation, and commitment to apoptosis. Journal of Immunology. 170 (4), 1964-1972 (2003).
  11. Pryde, J. G., Walker, A., Rossi, A. G., Hannah, S., Haslett, C. Temperature-dependent arrest of neutrophil apoptosis. Failure of Bax insertion into mitochondria at 15 degrees C prevents the release of cytochrome c. The Journal of Biological Chemistry. 275 (43), 33574-33584 (2000).
  12. Maianski, N. A., Mul, F. P. J., van Buul, J. D., Roos, D., Kuijpers, T. W. Granulocyte colony-stimulating factor inhibits the mitochondria-dependent activation of caspase-3 in neutrophils. Blood. 99 (2), 672-679 (2002).
  13. Bao, Y., et al. Mitochondria regulate neutrophil activation by generating ATP for autocrine purinergic signaling. The Journal of Biological Chemistry. 289 (39), 26794-26803 (2014).
  14. Chouchani, E. T., et al. Ischaemic accumulation of succinate controls reperfusion injury through mitochondrial ROS. Nature. 515 (7527), 431-435 (2014).
  15. Hayashi, G., Cortopassi, G. Oxidative stress in inherited mitochondrial diseases. Free Radical Biology and Medicine. 88, 10-17 (2015).
  16. Mailloux, R. J. An update on mitochondrial reactive oxygen species production. Antioxidants. 9 (6), 472 (2020).
  17. Abuaita, B. H., et al. The IRE1α stress signaling axis is a key regulator of neutrophil antimicrobial effector function. Journal of Immunology. 207 (1), 210-220 (2021).
  18. Lood, C., et al. Neutrophil extracellular traps enriched in oxidized mitochondrial DNA are interferogenic and contribute to lupus-like disease. Nature Medicine. 22 (2), 146-153 (2016).
  19. Douda, D. N., Khan, M. A., Grasemann, H., Palaniyar, N. SK3 channel and mitochondrial ROS mediate NADPH oxidase-independent NETosis induced by calcium influx. Proceedings of the National Academy of Sciencesa. 112 (9), 2817-2822 (2015).
  20. Monteith, A. J., et al. Altered mitochondrial homeostasis during systemic lupus erythematosus impairs neutrophil extracellular trap formation rendering neutrophils ineffective at combating Staphylococcus aureus. Journal of Immunology. 208 (2), 454-463 (2022).
  21. Monteith, A. J., Miller, J. M., Beavers, W. N., Juttukonda, L. J., Skaar, E. P. Increased dietary manganese impairs neutrophil extracellular trap formation rendering neutrophils ineffective at combating Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 90 (3), 0068521 (2022).
  22. Monteith, A. J., et al. Mitochondrial calcium uniporter affects neutrophil bactericidal activity during Staphylococcus aureus infection. Infection and Immunity. 90 (2), 0055121 (2022).
  23. Cao, Z., et al. Roles of mitochondria in neutrophils. Frontiers in Immunology. 13, 934444 (2022).
  24. Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. The Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).
  25. Fan, Z., Ley, K. Developing neutrophils must eat…themselves. Immunity. 47 (3), 393-395 (2017).
  26. Riffelmacher, T., et al. Autophagy-dependent generation of free fatty acids is critical for normal neutrophil differentiation. Immunity. 47 (3), 466-480 (2017).
  27. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936 (2016).
  28. Swamydas, M., Isolation Lionakis, M. S. purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of Visualized Experiments. (77), e50586 (2013).
  29. Gerner, M. C., et al. Packed red blood cells inhibit T-cell activation via ROS-dependent signaling pathways. The Journal of Biological Chemistry. 296, 100487 (2021).
  30. Zhang, Z. -W., et al. Red blood cell extrudes nucleus and mitochondria against oxidative stress. IUBMB Life. 63 (7), 560-565 (2011).
  31. Kuhns, D. B., Priel, D. A. L., Chu, J., Zarember, K. A. Isolation and functional analysis of human neutrophils. Current Protocols in Immunology. 111, 1-16 (2015).
  32. Hearne, A., Chen, H., Monarchino, A., Wiseman, J. S. Oligomycin-induced proton uncoupling. Toxicology In Vitro. 67, 104907 (2020).
  33. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio-Protocol. 8 (10), e2850 (2018).
  34. Nath, S. The molecular mechanism of ATP synthesis by F1F0-ATP synthase: a scrutiny of the major possibilities. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 74, 65-98 (2002).
  35. Heinz, S., et al. Mechanistic investigations of the mitochondrial complex I inhibitor rotenone in the context of pharmacological and safety evaluation. Scientific Reports. 7 (1), 45465 (2017).
  36. Hytti, M., et al. Antimycin A-induced mitochondrial damage causes human RPE cell death despite activation of autophagy. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 1583656 (2019).
  37. Malecki, M., Kamrad, S., Ralser, M., Bähler, J. Mitochondrial respiration is required to provide amino acids during fermentative proliferation of fission yeast. EMBO Reports. 21 (11), e50845 (2020).
  38. Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).
  39. Marchetti, P., Fovez, Q., Germain, N., Khamari, R., Kluza, J. Mitochondrial spare respiratory capacity: Mechanisms, regulation, and significance in non-transformed and cancer cells. The FASEB Journal. 34 (10), 13106-13124 (2020).
  40. Nicholas, D., et al. Advances in the quantification of mitochondrial function in primary human immune cells through extracellular flux analysis. PLoS One. 12 (2), e0170975 (2017).
  41. Tur, J., et al. Mitofusin 2 in macrophages links mitochondrial ROS production, cytokine release, phagocytosis, autophagy, and bactericidal activity. Cell Reports. 32 (8), 108079 (2020).
  42. Benz, R., McLaughlin, S. The molecular mechanism of action of the proton ionophore FCCP (carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone). Biophysical Journal. 41 (3), 381-398 (1983).
  43. Wettmarshausen, J., Perocchi, F. Assessing calcium-stimulated mitochondrial bioenergetics using the seahorse XF96 analyzer. Methods in Molecular Biology. 1925, 197-222 (2019).
  44. Forkink, M., et al. Mitochondrial hyperpolarization during chronic complex I inhibition is sustained by low activity of complex II, III, IV and V. Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (8), 1247-1256 (2014).
  45. Methods for Reducing Cell Growth Edge Effects in Agilent Seahorse XF Cell Culture Microplates. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/user-manual-methods-for-reducing-cell-growth-edge-effect-cell-analysis-5994-0240en-agilent.pdf (2019).
  46. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
  47. Wu, D., Yotnda, P. Induction and testing of hypoxia in cell culture. Journal of Visualized Experiments. (54), e2899 (2011).
  48. Normalisation of Seahorse XFe96 metabolic assaysto cell number with Hoechst stain using well-scan mode on the CLARIOstar Plus. BMG Labtech. , Available from: https://www.bmglabtech.com/cn/normalisation-of-seahorse-xfe96-metabolic-assays-to-cell-number-with-hoechst-stain/ (2020).
  49. Yetkin-Arik, B., et al. The role of glycolysis and mitochondrial respiration in the formation and functioning of endothelial tip cells during angiogenesis. Scientific Reports. 9 (1), 12608 (2019).
  50. Jastroch, M., Divakaruni, A. S., Mookerjee, S., Treberg, J. R., Brand, M. D. Mitochondrial proton and electron leaks. Essays in Biochemistry. 47, 53-67 (2010).
  51. Jandl, R. C., et al. Termination of the respiratory burst in human neutrophils. The Journal of Clinical Investigation. 61 (5), 1176-1185 (1978).
  52. Azevedo, E. P., et al. A metabolic shift toward pentose phosphate pathway is necessary for amyloid fibril- and phorbol 12-myristate 13-acetate-induced neutrophil extracellular trap (NET) formation. The Journal of Biological Chemistry. 290 (36), 22174-22183 (2015).
  53. Six, E., et al. AK2 deficiency compromises the mitochondrial energy metabolism required for differentiation of human neutrophil and lymphoid lineages. Cell Death & Disease. 6 (8), e1856 (2015).
  54. Kumar, S., Dikshit, M. Metabolic insight of neutrophils in health and disease. Frontiers in Immunology. 10, 2099 (2019).
  55. Rodríguez-Espinosa, O., Rojas-Espinosa, O., Moreno-Altamirano, M. M. B., López-Villegas, E. O., Sánchez-García, F. J. Metabolic requirements for neutrophil extracellular traps formation. Immunology. 145 (2), 213-224 (2015).
  56. Invernizzi, F., et al. Microscale oxygraphy reveals OXPHOS impairment in MRC mutant cells. Mitochondrion. 12 (2), 328-335 (2012).
  57. Zenaro, E., et al. Neutrophils promote Alzheimer's disease-like pathology and cognitive decline via LFA-1 integrin. Nature Medicine. 21 (8), 880-886 (2015).
  58. Maianski, N. A., et al. Functional characterization of mitochondria in neutrophils: a role restricted to apoptosis. Cell Death and Differentiation. 11 (2), 143-153 (2004).
  59. Bergman, O., Ben-Shachar, D. Mitochondrial oxidative phosphorylation system (OXPHOS) deficits in schizophrenia. Canadian Journal of Psychiatry. 61 (8), 457-469 (2016).
  60. Zhou, W., Qu, J., Xie, S., Sun, Y., Yao, H. Mitochondrial dysfunction in chronic respiratory diseases: implications for the pathogenesis and potential therapeutics. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 5188306 (2021).
  61. Hirano, M., Emmanuele, V., Quinzii, C. M. Emerging therapies for mitochondrial diseases. Essays in Biochemistry. 62 (3), 467-481 (2018).

Tags

Immunologie en infectie Nummer 196
Real-time meting van het mitochondriale bio-energetische profiel van neutrofielen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pulikkot, S., Zhao, M., Fan, Z.… More

Pulikkot, S., Zhao, M., Fan, Z. Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils. J. Vis. Exp. (196), e64971, doi:10.3791/64971 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter