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Quantificazione e caratterizzazione dell'intero genoma dell'RNA di SARS-CoV-2 in campioni di acque reflue e aria

Published: June 30, 2023 doi: 10.3791/65053
Automatic Translation
1,2,3, 4,5,6, 3, 3, 1,2, 1,2, 1,2, 2,3, 4,5, 1,2
1Institute of Sustainable Processes, University of Valladolid, 2Department of Chemical Engineering and Environmental Technology, University of Valladolid, 3Department of Public Health Microbiology, National Laboratory of Health, Environment and Food, 4ICBAS - School of Medicine and Biomedical Sciences, Porto University, 5Epidemiology Research Unit (EPIUnit), Instituto de Saúde Pública da Universidade do Porto, 6Laboratório para a Investigação Integrativa e Translacional em Saúde Populacional (ITR)

Summary

Questo protocollo mira a quantificare l'RNA di SARS-CoV-2 in campioni di acque reflue e aria da utilizzare per studi epidemiologici basati sulle acque reflue e a valutare il rischio di esposizione a SARS-CoV-2 in aerosol interni ed esterni. Questo protocollo descrive anche un approccio di sequenziamento a modello lungo dell'amplicone piastrellato per la caratterizzazione dell'intero genoma di SARS-CoV-2.

Abstract

L'epidemiologia basata sulle acque reflue è emersa come un sistema di sorveglianza promettente ed efficace per SARS-CoV-2 e altre malattie infettive in molte nazioni. Il processo prevede in genere la concentrazione delle acque reflue, l'estrazione dell'acido nucleico, l'amplificazione di segmenti genomici selezionati e il rilevamento e la quantificazione del segmento genomico amplificato. Allo stesso modo, questa metodologia può essere sfruttata per rilevare e quantificare agenti infettivi, come il SARS-CoV-2, nei campioni d'aria. Inizialmente, si presumeva che il SARS-CoV-2 si diffondesse principalmente attraverso uno stretto contatto personale con le goccioline generate da un individuo infetto mentre parlava, starnutiva, tossiva, cantava o respirava. Tuttavia, un numero crescente di studi ha riportato la presenza di RNA SARS-CoV-2 nell'aria delle strutture sanitarie, stabilendo che la trasmissione per via aerea è una via praticabile per il virus. Questo studio presenta un insieme di protocolli consolidati per facilitare il rilevamento, la quantificazione e il sequenziamento ambientale dei virus sia dalle acque reflue che dai campioni d'aria.

Introduction

Nel dicembre 2019 è emersa una nuova malattia chiamata COVID-19, causata da un coronavirus precedentemente sconosciuto, SARS-CoV-21. La pandemia globale che ne è derivata ha rappresentato una sfida significativa per i laboratori clinici e di salute pubblica in tutto il mondo, poiché un gran numero di persone richiede test per valutare con precisione la trasmissione e la prevalenza del virus nella comunità. Tuttavia, in molte regioni, raggiungere il livello necessario di test in modo tempestivo e spazialmente completoè economicamente irrealizzabile 2,3. Gli attuali sistemi di sorveglianza basati sulla diagnostica clinica individuale si basano fortemente sulla gravità dei sintomi e sulla segnalazione individuale, nonché sulla misura in cui questi sintomi si sovrappongono alle malattie esistenti che circolano nella popolazione 4,5,6,7,8,9,10. Di conseguenza, un numero elevato di casi asintomatici contribuisce a una significativa sottostima del carico di malattia 7,11.

A causa di queste sfide, l'epidemiologia basata sulle acque reflue (WBE) per la sorveglianza COVID-19 è stata proposta come strategia di sorveglianza complementare. Il WBE è stato descritto per la prima volta nel 200112 ed è stato inizialmente utilizzato per rintracciare la cocaina e altre droghe illegali13. Questo approccio si basa sul presupposto che sia possibile calcolare la concentrazione iniziale di qualsiasi sostanza stabile nelle acque reflue ed escreta dall'uomo 8,12. WBE è stato implementato con successo in molti paesi come sistema di sorveglianza complementare ed efficiente per SARS-CoV-2 3,8,14,15,16. La maggior parte dei metodi per rilevare i virus umani in ambienti acquatici segue queste fasi: concentrazione, estrazione dell'acido nucleico, amplificazione del segmento genomico (o dei segmenti) scelti e rilevamento/quantificazione del segmento genomico amplificato3.

Un altro ambiente importante per il rilevamento e la quantificazione del SARS-CoV-2 è quello dei campioni d'aria. Inizialmente, si pensava che il SARS-CoV-2 si trasmettesse principalmente attraverso uno stretto contatto personale con le goccioline respiratorie degli aerosol generati da una persona infetta mentre parlava, starnutiva, tossiva, cantava o respirava17. Tuttavia, diversi studi hanno iniziato a segnalare la presenza di RNA SARS-CoV-2 nell'aria, in particolare nelle strutture sanitarie e in altri spazi chiusi 18,19,20,21. È stata riscontrata la fattibilità del SARS-CoV-2 in campioni d'aria prelevati al chiuso negli ospedali e in altri spazi chiusi quando la concentrazione del virus era sufficientemente alta22,23,2 4. Gli studi all'aperto non hanno generalmente trovato prove di SARS-CoV-2, tranne che in spazi esterni affollati 21,25,26,27,28,29. A partire da ora, la trasmissione aerea di SARS-CoV-2 è stata riconosciuta come modalità di trasmissione30,31. Un recente studio di revisione mostra le differenze tra l'esterno, dove i rischi di trasmissione per via aerea sono minimi al di fuori delle aree affollate, e l'interno, dove i rischi maggiori potrebbero essere presenti in ambienti scarsamente ventilati in cui potrebbero essere presenti forti fonti (cioè il numero di persone infette). Un recente studio di revisione completo ha evidenziato le differenze sostanziali tra i rischi di trasmissione per via aerea in ambienti esterni rispetto a quelli interni, in particolare in aree affollate con scarsa ventilazione. Lo studio indica che il rischio di trasmissione per via aerea è minimo negli ambienti esterni, dove c'è un volume maggiore di aria disponibile per la diluizione e la dispersione delle particelle virali32. Questi risultati hanno importanti implicazioni per le politiche e le linee guida di salute pubblica relative al COVID-19. Riconoscendo le differenze significative nei rischi di trasmissione tra ambienti interni ed esterni, i responsabili politici possono sviluppare strategie più efficaci per mitigare la diffusione del virus e proteggere la salute pubblica.

Esistono diversi metodi e protocolli per il rilevamento, la quantificazione e il sequenziamento di SARS-CoV-2 da diversi campioni ambientali. Questo articolo sul metodo mira a presentare una combinazione di protocolli consolidati che consentono ai laboratori con diversi livelli di capacità di eseguire il rilevamento, la quantificazione e il sequenziamento ambientale di virus da acque reflue e campioni d'aria.

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Protocol

Tutti i metodi qui descritti sono stati pubblicati altrove e contengono piccole modifiche rispetto ai metodi originali.

1. Raccolta delle acque reflue e pre-trattamento dei campioni

NOTA: A causa delle basse concentrazioni di RNA SARS-CoV-2 nei campioni ambientali, l'implementazione di una fase di concentrazione è fondamentale per una rilevazione di successo33,34,35. Di seguito è descritto il primo metodo riportato per il rilevamento di SARS-CoV-2 nelle acque reflue36.

  1. Raccolta e concentrazione di campioni di acque reflue
    1. Raccogliere 1 litro di campione di acque reflue composito per 24 ore. Conservare il campione a 4 °C e procedere con il protocollo entro 24 ore.
    2. Omogeneizzare il campione agitando delicatamente il flacone. Raccogliere 70 mL in una provetta centrifuga da 100 mL o dividere il campione in due provette centrifughe da 50 mL.
    3. Spike 20 μL di mengovirus (3,2 x 103 copie/μL) a 70 mL di ciascun campione come controllo interno del processo di concentrazione. In alternativa, aggiungere 10 μL di mengovirus (3,2 x 103 copie/μL) in ciascuna provetta da centrifuga da 50 mL.
    4. Omogeneizzare il campione e centrifugare a 700 x g per 10 minuti per rimuovere particelle e organismi di grandi dimensioni (pellet).
    5. Utilizzare il surnatante risultante per la concentrazione con dispositivi di ultrafiltrazione centrifuga con un cutoff di 10 KDa centrifugando a 4.000 x g per 40 minuti a 4 °C. Eluire il concentrato centrifugando a 700 x g per 40 minuti e invertendo la posizione del dispositivo di ultrafiltrazione.
    6. Misurare il volume del concentrato risultante. Il volume cambierà a seconda della quantità di solidi presenti nel campione che intasano i filtri centrifughi. In questo studio, i volumi di concentrato ottenuti erano compresi tra 200 e 1.200 μL.
    7. Utilizzare il concentrato risultante per l'estrazione dell'RNA utilizzando un kit commerciale o un metodo interno. Per i campioni utilizzati in questo studio viene utilizzato un kit commerciale specifico per l'estrazione dell'RNA virale con un volume di eluizione di 50 μL.
    8. Misurare la concentrazione dell'RNA estratto con un kit di quantificazione dell'RNA fluorimetrico. Dividere l'RNA estratto in aliquote e congelare a -80 °C fino a nuova analisi.
      NOTA: Per ogni set di procedure di isolamento dell'RNA, deve essere incluso un controllo negativo dell'isolamento (NCI), contenente solo tamponi per rilevare possibili contaminazioni durante l'estrazione.
  2. Raccolta di campioni d'aria utilizzando un campionatore d'aria compatto Coriolis
    1. Scegliere una strategia di campionamento in base all'obiettivo della ricerca definendo la frequenza di campionamento e i luoghi di campionamento.
    2. Impostare la portata sul campionatore d'aria (in questo caso, 50 L/min per 30 min). Si prega di notare che una portata superiore a 200 L/min può degradare l'RNA virale, quindi si consiglia di utilizzare una portata inferiore a 200 L/min.
    3. Posizionare un cono sterile nel campionatore d'aria prima di iniziare la raccolta azionando l'avvio. Una volta terminato il campionamento, aggiungere 5-15 ml di soluzione fisiologica sterile tamponata con fosfato (PBS) nel cono. Vorticare delicatamente o agitare il campione a mano per 15 s. Conservare i campioni per un massimo di 24 ore a 4 °C o a -80 °C in criotubi.
    4. È possibile eseguire una fase di concentrazione opzionale. Pulisci e decontamina i coni dopo ogni esperimento usando la candeggina.
    5. Estrai l'RNA utilizzando un kit commerciale o un metodo interno. Per i campioni di questo studio, viene utilizzato un kit commerciale specifico per l'estrazione dell'RNA virale con un volume di eluizione di 50 μL.
    6. Misurare la concentrazione dell'RNA estratto con un kit di quantificazione dell'RNA fluorimetrico. Dividere l'RNA estratto in aliquote e congelare a -80 °C fino a nuova analisi.
      NOTA: Per ogni set di procedure di isolamento dell'RNA, deve essere incluso un controllo negativo dell'isolamento (NCI), contenente solo tamponi per rilevare possibili contaminazioni durante l'estrazione.

2. Quantificazione dell'RNA di SARS-CoV-2 mediante reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (RT-qPCR)

NOTA: Il protocollo seguente è conforme al pannello diagnostico RT-PCR37 del CDC 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV). Dividere la miscela primer/sonda in più aliquote per evitare cicli di congelamento e scongelamento.

  1. Preparare il mastermix di reazione per ogni bersaglio (mengovirus; SARS-CoV-2 [geni N1 e N2]) come nella Tabella 1, in una cappa pulita nella sala di preparazione dei reagenti. Miscelare la miscela primer/sonda e l'enzima per inversione cinque volte. In alternativa, pulsare di luce la miscela di primer/sonda e l'enzima cinque volte.
    NOTA: Mantenere freddi tutti i reagenti durante la preparazione e l'uso. Al fine di ridurre al minimo i cicli di gelo-disgelo, si consiglia vivamente di congelare in aliquote.
  2. Girare verso il basso (1.000 x g per 15-30 s) le provette per raccogliere il contenuto sul fondo e posizionare le provette in una griglia fredda o sul ghiaccio.
  3. Etichettare le provette per microcentrifuga da 1,5 mL per ogni target. Aggiungere a ciascuna provetta per microcentrifuga la quantità di ciascun reagente necessaria (volume per reazione, moltiplicatori per il numero di reazioni, compresi i controlli necessari). Mescolare pipettando su e giù e centrifugare per 5 secondi per raccogliere il contenuto sul fondo.
  4. Conservare le provette per microcentrifuga in un rack freddo ed erogare 15 μL in provette per PCR a strisce o in una piastra a 96 pozzetti in un rack di raffreddamento. Coprire la piastra e spostarla nell'area di manipolazione dell'acido nucleico (conservarla in una griglia di raffreddamento).
  5. Scongelare un'aliquota di RNA estratto e vorticare delicatamente per 5 s. Pipettare 5 μL di RNA (oltre a 5 μL di controllo non stampo [NTC], controllo negativo dell'isolamento [NCI] e controllo positivo [PC]) a ciascun pozzetto di reazione o provetta contenente il mastermix precedentemente preparato. Cambiare spesso i guanti se necessario per evitare la contaminazione incrociata.
  6. Coprire l'intera piastra o le provette di reazione e vorticare delicatamente. Centrifugare (1.000 x g per 15-30 s) la piastra o le provette PCR.
  7. Iniziare la RT-qPCR da 25 μL con le seguenti condizioni cicliche: trascrittasi inversa a 45 °C per 10 min; attivazione della polimerasi a 95 °C per 10 min; 45 cicli di denaturazione a 95 °C per 15 s; e ricottura/prolungamento a 60 °C per 45 secondi.
  8. Calcolare l'efficienza di recupero dei controlli del mengovirus come riportato da Conte et al.38:
    Equation 1 × 100

3. Varianti di sequenziamento nelle acque reflue e analisi dei dati

NOTA: Il protocollo descritto è un protocollo modificato creato da Quick et al.39,40. Utilizza due set di primer per l'amplificazione del genoma di SARS-CoV-2 mediante metodologia di piastrellatura PCR: primer ARTIC e primer VarSkip. Viene utilizzata una combinazione di primer per garantire la migliore copertura del genoma e per ridurre al minimo la possibilità che nuove mutazioni causino il fallimento dei primer di un tipo. In generale, il protocollo è diviso in tre parti: trascrizione inversa (RT) e generazione di ampliconi, preparazione della libreria di sequenziamento e sequenziamento e analisi dei dati.

  1. Trascrizione inversa e generazione di ampliconi
    1. Assicurarsi che i campioni in ingresso abbiano un valore di soglia di ciclo qPCR (Ct) noto per diluirli correttamente in acqua di grado PCR. Il valore Ct si ottiene durante la quantificazione con qPCR. Le diluizioni sono le seguenti: se il valore di Ct è 12-15, diluire i campioni 1:100; se il valore di Ct è 15-18, diluire i campioni 1:10; se il valore Ct è 18-35, non diluire il campione. I campioni al di sopra di un valore Ct di 35 hanno un'alta probabilità di non funzionare.
    2. In una piastra PCR, pipettare 16 μL di ciascun campione nella sua posizione sulla piastra. Aggiungere 4 μL di mastermix a trascrizione inversa (RT) (5x). Coprire la piastra e avviare la reazione PCR con le seguenti condizioni: 25 °C per 2 minuti, 55 °C per 20 minuti e 95 °C per 1 minuto.
    3. Preparare diluizioni da 10 μM di ciascun set di primer (pool ARTIC A e pool B e VarSkip pool A e pool B). Preparare il mastermix per ogni set di primer (ARTIC set A e B e VarSkip set A e B) come da Tabella 2. Ne risulteranno quattro mastermix.
    4. Su una nuova piastra PCR, pipettare 20 μL di mastermix a ciascun pozzetto corrispondente. Aggiungere 5 μL del campione RT a ciascuna miscela.
      NOTA: Ogni campione avrà quattro miscele di reazione: il pool ARTIC A e B e il pool VarSkip A e B.
    5. Coprire la piastra e avviare la reazione PCR come segue: attivazione della polimerasi a 98 °C per 30 s; 35 cicli di denaturazione a 98 °C per 15 s; e ricottura/prolungamento a 65 °C per 4 min. Girare verso il basso (1.000 x g per 15-30 s) il piatto. Combina i pool di reazione ARTIC e combina separatamente i pool di reazione VarSkip. Ogni campione avrà due reazioni amplicone da 50 μL.
    6. Aggiungere 50 μL di reagente a base di microsfere per la purificazione PCR a ciascun pozzetto e miscelare bene mediante pipettaggio. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
      NOTA: Prima di ogni utilizzo, mescolare energicamente il reagente di purificazione PCR per risospendere le perle.
    7. Posizionare la piastra su un supporto di separazione magnetica e attendere che le perle formino un pellet e che il liquido si chiarisca (~5 min). Pipettare ed eliminare il surnatante. Tenere la piastra PCR sul supporto magnetico.
    8. Mantenendo la piastra PCR sul supporto magnetico, aggiungere 200 μL di etanolo all'80% a ciascun campione senza toccare il pellet di microsfere. Rimuovere l'etanolo.
    9. Ripetere il passaggio precedente. Lasciare scoperta la piastra sul supporto magnetico per 30 secondi per consentire all'etanolo di evaporare.
    10. Rimuovere la piastra dal supporto magnetico e aggiungere 15 μL di acqua per PCR a ciascun campione. Risospendere il pellet mediante pipettaggio. Incubare a temperatura ambiente per 2 min.
    11. Riposizionare la piastra sul supporto magnetico e lasciare che le perline si inumidiscano (2 min). Pipettare con cura 15 μL di surnatante da ciascun campione su una nuova piastra PCR.
    12. Misurare la concentrazione di ciascun campione con un kit di quantificazione dell'RNA fluorimetrico. Prelevare circa 50 ng di ciascun campione in 12,5 μL per passare alla fase successiva. Se necessario, diluire il campione in acqua per PCR.
  2. Preparazione della libreria
    1. Aggiungere 1,75 μL di tampone di reazione dal kit di preparazione della libreria di DNA Illumina e 0,75 μL di miscela enzimatica a ciascun campione. Coprire brevemente la piastra, vorticare e girare verso il basso (1.000 x g per 15-30 s). Incubare a 21°C per 5 min e a 65 °C per 5 min.
    2. In una nuova piastra, pipettare 3 μL di acqua per PCR per ciascun campione a una nuova piastra PCR. Aggiungere 0,75 μL dei campioni preparati, 1,25 μL di codici a barre per la preparazione della libreria di sequenziamento e 5 μL di mastermix di DNA ligasi T4. Miscelare bene mediante pipettaggio, centrifugare brevemente (1.000 x g per 15-30 s) in centrifuga e incubare a 21 °C per 20 min e a 65 °C per 10 min.
      NOTA: Se si utilizzano meno di 25 campioni, raddoppiare tutti i volumi in questa fase.
    3. Raggruppare tutti i campioni aggiungendo 10 μL di ciascun campione alla stessa provetta a basso legame di legame. Portare 480 μL al passaggio successivo.
    4. Aggiungere 192 μL di reagente a base di microsfere per la purificazione PCR al pool e miscelare bene mediante pipettaggio. Incubare a temperatura ambiente per 10 min.
    5. Posizionare il tubo su un supporto magnetico e attendere che il surnatante si liberi e che si formi una pallina di perline. Rimuovere il surnatante. Rimuovere il tubo dal supporto magnetico.
    6. Aggiungere 700 μL di tampone per frammenti corti (SFB) e miscelare mediante pipettaggio. Riposizionare sul supporto magnetico e attendere che il pellet si formi e che il liquido si chiarisca (~5 min). Pipettare il surnatante e scartarlo.
    7. Ripetere il passaggio precedente. Lasciare il tubo sul supporto magnetico. Aggiungere 100 μL di etanolo all'80% senza toccare il cordone. Pipettare l'etanolo e lasciare asciugare il cordone per 30 secondi.
      NOTA: Non lasciare che il tallone si asciughi eccessivamente.
    8. Rimuovere la provetta dal supporto magnetico e aggiungere 35 μL di acqua per PCR. Miscelare mediante pipettaggio e incubare a temperatura ambiente per 2 min. Posizionare il tubo sul supporto magnetico e lasciare che il tallone si inumidisca e il liquido si liberi. Pipettare 35 μL del surnatante in una nuova provetta.
    9. Misurare la concentrazione di RNA della libreria aggregata. Pipettare il volume necessario per raggiungere una quantità di 30-50 ng di RNA e riempirlo con acqua di grado PCR per raggiungere un volume finale di 30 μL.
    10. Preparare la miscela di reazione di legatura dell'adattatore: 30 μL della libreria aggregata, 5 μL di Adapter Mix II, 10 μL del tampone di reazione di legatura (5x) e 5 μL di DNA ligasi T4. Miscelare mediante pipettaggio e centrifugazione (1.000 x g per 15-30 s). Incubare a temperatura ambiente per 10 min.
    11. Aggiungere 20 μL del reagente a base di microsfere per la purificazione PCR e miscelare mediante pipettaggio. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
    12. Posizionare il tubo sul supporto magnetico e attendere che si formi il pellet di perline e che il surnatante diventi incolore. Pipettare con cura ed eliminare il surnatante.
    13. Rimuovere dal supporto magnetico e aggiungere 125 μL di SFB. Mescolare mediante pipettaggio e riposizionare sul supporto magnetico per separare le perline. Quando il liquido è limpido, pipettare ed eliminare il surnatante.
    14. Ripetere il passaggio precedente. Lasciare il tubo aperto sul supporto magnetico per 30 secondi per far evaporare parte del liquido rimanente.
    15. Rimuovere la provetta dal supporto magnetico e aggiungere 15 μL di tampone di eluizione. Mescolare bene pipettando e centrifugare brevemente (1.000 x g per 15-30 s). Incubare a temperatura ambiente per 5 min. Posizionare sul supporto magnetico per 2 min.
    16. Pipettare 15 μL del surnatante in una nuova provetta a basso legame di legame. Questa è la libreria finale. Misurare la concentrazione con un kit di quantificazione del DNA fluorimetrico.
      NOTA: Nel passaggio successivo, sono necessari 12 μL. Se la concentrazione è molto elevata ed è necessario meno di 12 μL della libreria, riempire fino a 12 μL con il reagente tampone di eluizione.
  3. Caricamento e sequenziamento delle celle di flusso
    1. Inserire la cella di flusso (R9.4.1) nel dispositivo di sequenziamento del DNA e dell'RNA in tempo reale.
    2. Preparare la miscela di adescamento aggiungendo 30 μL di reagente FLT (Flush Tether) a una provetta di reagente Flush Buffer (FB). Vortice per mescolare e centrifugare (1.000 x g per 15-30 s).
    3. Aprire il coperchio della porta di adescamento. Utilizzando una pipetta da 1.000 μL, impostare su 200 μL e inserire il puntale nella porta di adescamento. Ruotare la rotella di impostazione del volume e aumentare il volume fino a quando non si vede il liquido nella punta. Scartare la punta.
      NOTA: Ruotare la rotellina solo fino a quando non si vedono alcuni μL di liquido nella punta. L'estrazione di quantità maggiori potrebbe danneggiare la cella di flusso.
    4. Aggiungere lentamente 800 μL della miscela di adescamento alla porta di adescamento, facendo attenzione a non introdurre bolle. Attendere 5 min.
    5. Nel frattempo, preparare le librerie per il caricamento. Miscelare 37,5 μL del tampone di sequenziamento, 25,5 μL del tampone di caricamento e 12 μL della libreria.
      NOTA: Miscelare il tampone di caricamento prima del pipettaggio. Le perle in questo reagente si depositano molto rapidamente.
    6. Aprire il coperchio della porta. Pipettare 200 μL della miscela di adescamento nella porta di adescamento.
      NOTA: Durante il pipettaggio nella porta di adescamento con la porta del coperchio aperta, si noteranno piccole gocce provenienti dalla porta del campione. Pipettare abbastanza lentamente in modo che la porta del campione possa aspirare le gocce senza fuoriuscire.
    7. Prima di caricare la libreria preparata, miscelare bene mediante pipettaggio. Utilizzando una pipetta da 100 μL impostata su 75 μL, inserire la libreria e la pipetta goccia a goccia nella porta del campione. Non toccare la porta e attendere che ogni goccia venga assorbita nella porta prima di caricare la goccia successiva per evitare che il liquido trabocchi.
    8. Chiudere la porta del coperchio e la porta di adescamento. Aprire il software e avviare l'esperimento di sequenziamento. Selezionare basecalling On. Per una libreria con 96 campioni multiplexati, 10-12 ore di sequenziamento sono di solito sufficienti per generare dati sufficienti.
      NOTA: Utilizzando il software, è possibile inserire il foglio campione in formato .csv. Il foglio di esempio richiede i seguenti dati: flow_cell_id, position_id, sample_id, experiment_id, flow_cell_product_code e kit. È necessario l'ID della cella di flusso (elencato sul lato della cella di flusso) insieme al kit utilizzato. Per il protocollo suggerito, è necessario selezionare il kit LSK109.
  4. Analisi dei dati di sequenziamento
    1. Inserire le letture fastq compresse nel flusso di lavoro wf-artic41. Eseguire il flusso di lavoro separatamente con due diversi schemi di primer (ARTIC/V4.1 e NEB-VarSkip/v1a). Due". primertrimmed.rg.sorted.bam" vengono creati per ogni campione.
    2. Unire i file BAM in un unico file con il comando "samtools merge"42. Inserire il file BAM unito nello strumento Freyja, lasciando le impostazioni predefinite, per recuperare le abbondanze relative del lignaggio43.
    3. Per creare un file FASTA, inserire il file BAM unito negli strumenti "samtools mpileup" e "ivar" con le impostazioni predefinite44,45. Per la chiamata di mutazione, caricare il file FASTA nello strumento Nextclade46,47.

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Representative Results

I risultati riassunti nella Tabella 3 mostrano esempi di rilevamento e quantificazione dell'RNA di SARS-CoV-2 in campioni di acque reflue e aria utilizzando il metodo descritto in questo articolo. I campioni di acque reflue sono stati raccolti da impianti di trattamento delle acque reflue in Spagna e Slovenia e sono stati considerati positivi se il Ct era inferiore a 40 in almeno due delle tre repliche, con quantificazione considerata valida se il Ct aveva una variazione inferiore al 5%. In Spagna e Portogallo sono stati raccolti campioni di aria interna ed esterna e sono state applicate le stesse regole. Per i campioni d'aria sono stati utilizzati duplicati, non triplicati come per i campioni di acque reflue, poiché lo scopo dello studio era quello di rilevare l'RNA del SARS-CoV-2 e non di quantificarlo. Inoltre, un'esecuzione RT-qPCR è stata considerata valida solo se tutti i controlli utilizzati (come descritto in questo protocollo) si sono comportati come previsto e se non sono state osservate deviazioni significative nel controllo dell'RNA del mengovirus. Per questi campioni, l'efficienza di recupero del mengovirus variava tra il 13,7% e il 19,7%. L'inibizione è stata valutata diluendo l'RNA estratto dieci volte e 100 volte e confrontando i risultati RT-qPCR risultanti, nonché utilizzando un kit commerciale. Le istruzioni per ciascun kit di controllo dell'inibizione devono essere seguite come descritto dai produttori.

I campioni di acque reflue avevano una deviazione standard dall'1,91% al 13,98% tra i triplicati e variavano da 3,05 x 10 3 a 2,83 x 108 copie di geni/L. I campioni di aria variavano da 6,17 x 103 a 5,48 x 109 con una deviazione standard tra i duplicati compresa tra lo 0,54% e il 10,95%. Questo è in accordo con gli studi precedenti 6,48,49,50.

Come descritto in questo protocollo, i campioni sono stati sequenziati e un esempio di tre risultati sequenziati è riassunto nella Tabella 4 e nella Figura 1. In tutti e tre i campioni, il lignaggio BA.5.x è stato assegnato come il più diffuso dallo strumento Freyja (95,3%, 95,4% e 99,8%).

Figure 1
Figura 1: Prevalenza del lignaggio SARS-CoV-2 in campioni selezionati di acque reflue. I lignaggi sono stati assegnati utilizzando lo strumento Freyja. Il riepilogo dei numeri di prevalenza non raggiunge necessariamente il 100%, poiché alcuni dati non sono di qualità sufficiente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Reagenti e volumi da aggiungere di ciascuno per preparare il mastermix per la quantificazione di SARS-CoV2 mediante RT-qPCR. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Reagenti e volumi da aggiungere di ciascuno per preparare il mastermix per amplificare i genomi completi di SARS-CoV-2 nei campioni. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 3: Riepilogo dei risultati della quantificazione RT-qPCR dell'RNA di SARS-CoV-2 da campioni di acque reflue e aria. Il gene N1 è stato utilizzato per la quantificazione e l'N2 è stato utilizzato per la conferma (positiva o negativa). I risultati sono espressi in copie/L. Clicca qui per scaricare questa Tabella.

Tabella 4: Mutazioni rilevate e prevalenza del lignaggio. I lignaggi sono stati assegnati utilizzando lo strumento Freyja e in base alle mutazioni di interesse trovate utilizzando Nextclade. Viene mostrata la copertura del genoma per ogni campione. Il riepilogo dei numeri di prevalenza non raggiunge necessariamente il 100%, poiché alcuni dati non sono di qualità sufficiente. Clicca qui per scaricare questa tabella.

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Discussion

Il rilevamento e la quantificazione microbici e virali mediante metodi (RT-)qPCR hanno ottenuto un'ampia accettazione grazie alla loro notevole sensibilità. Tuttavia, queste tecniche devono affrontare numerose sfide durante l'analisi dei campioni ambientali. I campioni di acque reflue contengono un'abbondanza di sostanze inibitorie che possono distorcere le misurazioni e generare risultati fuorvianti. Per affrontare queste limitazioni e migliorare la precisione, è stato concepito, progettato e implementato un protocollo complesso. Questo protocollo è stato adattato combinando protocolli della letteratura scientifica e per affrontare in modo specifico le restrizioni inerenti ai metodi qPCR incorporando una serie di controlli rigorosi in ogni fase del processo. Integrando queste rigorose misure di controllo della qualità, questo protocollo offre una soluzione solida alle sfide affrontate dai metodi di rilevamento e quantificazione basati sulla qPCR in campioni ambientali complessi51,52. Il controllo negativo dell'isolamento (NCI) e il controllo non stampo (NTC) sono strumenti essenziali per valutare la probabilità di contaminazione durante l'estrazione dell'RNA e la reazione RT-qPCR. Inoltre, l'integrazione dell'RNA di controllo del mengovirus fornisce un mezzo cruciale per valutare la variabilità tra i campioni, nonché l'efficienza della fase di concentrazione e gli effetti inibitori degli agenti presenti in campioni ambientali complessi. In ogni reazione RT-qPCR, devono essere inclusi controlli positivi per confermare l'efficacia del processo di amplificazione. È fondamentale monitorare attentamente ogni fase del protocollo, compresi i tempi di conservazione e di elaborazione dei campioni. La degradazione dei campioni può essere influenzata dalla temperatura e dalla complessa composizione delle acque reflue, rendendo indispensabile conservare i campioni a una temperatura di 4 °C e processarli entro 24 ore. Aderendo a queste rigorose misure di controllo della qualità, i ricercatori e gli operatori sanitari pubblici possono analizzare con sicurezza e precisione i campioni ambientali per scoprire informazioni vitali sulle popolazioni microbiche e virali e comprendere meglio l'impatto dei fattori ambientali sulla salute umana48.

La selezione di bersagli di RNA per il rilevamento di SARS-CoV-2 è un fattore critico che può influire sulla sensibilità dei test RT-qPCR. In questo studio, gli autori hanno valutato i target RdRp, E, N1 e N2 e hanno scoperto che i saggi RdRp ed E avevano una sensibilità inferiore rispetto ai saggi N1 e N2, in linea con la ricerca precedente53. I saggi N1 e N2 utilizzano sonde a doppio quencher, che hanno dimostrato di migliorare la loro sensibilità nei saggi (RT-)qPCR54. Questi motivi hanno portato alla decisione di utilizzare N1 per la quantificazione e N2 come conferma della presenza di RNA, al fine di eliminare dubbi quando si riscontrano concentrazioni molto basse. Le discrepanze osservate tra i target RT-qPCR sono state precedentemente riportate36.

Diversi studi hanno impiegato protocolli simili e hanno riportato il successo del rilevamento e della quantificazione dell'RNA di SARS-CoV-2 nelle acque reflue durante la pandemia COVID-19in corso 6,48,49,55,56. Le concentrazioni di RNA SARS-CoV-2 riportate sono in accordo con quelle riportate in questo studio e nel protocollo 48,50,55. Alcuni di questi studi hanno esplorato la relazione tra i casi attivi e le concentrazioni dei geni bersaglio della RT-qPCR, in particolare N1 e N2 6,36,49,50,55,57,58,59. Per ridurre la variabilità delle concentrazioni geniche ottenute, è stato proposto di moltiplicare le concentrazioni sperimentali per la velocità di flusso al momento del campionamento per ottenere la carica virale iniziale36. Questo approccio è stato incorporato nel progetto VATar COVID-19 in Spagna, un sistema nazionale di monitoraggio per il COVID-19 nelle acque reflue60.

Come fase successiva degli studi di epidemiologia basati sulle acque reflue (WBE) COVID-19, i ricercatori hanno tentato di rilevare le mutazioni di SARS-CoV-2 nelle acque reflue per stimare la circolazione delle varianti preoccupanti all'interno delle comunità. Studi precedenti hanno dimostrato una forte correlazione tra le varianti identificate nelle acque reflue e quelle presenti contemporaneamente nella popolazione. Questi risultati suggeriscono che il monitoraggio basato sulle acque reflue potrebbe fungere da strumento prezioso per tracciare la diffusione delle varianti di SARS-CoV-261,62. WBE si è dimostrato molto promettente nel monitoraggio del SARS-CoV-2 e può essere utilizzato per lo sviluppo di future strategie di sorveglianza per le pandemie. Questo approccio è particolarmente utile nelle prime fasi di una pandemia, quando i test individuali sono limitati e molti casi possono essere asintomatici, e ha una strategia complementare alla sorveglianza clinica. Pertanto, il WBE può essere particolarmente utile in luoghi con bassa capacità economica che non possono permettersi altre strategie di sorveglianza più costose. Il metodo descritto può essere facilmente adattato ad altri virus che potrebbero essere rilevanti per il monitoraggio in futuro.

I risultati del campionamento dell'aria in ambienti interni ed esterni hanno rivelato che l'RNA di SARS-CoV-2 è presente in entrambi gli ambienti, sebbene in concentrazioni inferiori negli ambienti esterni 38,63,64. Questi risultati suggeriscono che le attività e le esposizioni in cui l'uso della mascherina e il distanziamento sociale sono difficili da mantenere, come mangiare, bere o partecipare a festival musicali, potrebbero rappresentare un rischio maggiore per la trasmissione di COVID-19. Per mitigare tali rischi, è fondamentale prendere in considerazione misure di ventilazione adeguate e l'uso di mascherine, soprattutto con l'emergere di nuove varianti preoccupanti e più trasmissibili, come le varianti Delta (B.1.617.2) e Omicron (B.1.1.529). Alla luce della revoca delle restrizioni COVID-19 in molte aree, si raccomanda di mantenere l'uso delle mascherine per ridurre al minimo la trasmissione comunitaria di SARS-CoV-2 e prevenire futuri focolai della malattia 5,21,26,65.

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Disclosures

Gli autori non hanno interessi economici concorrenti o altri conflitti di interesse.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato eseguito con il sostegno finanziario del governo regionale di Castilla y León e del programma FEDER (progetti CLU 2017-09, UIC315 e VA266P20).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adapter+A25+A2:D19+A2:D20+A2+A2:D19 Oxford Nanopore EXP-AMII001 Sequencing
AllPrep PowerViral DNA/RNA Kit Qiagen 28000-50 RNA extraction kit
AMPure XP Beckman Coulter A63880 PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up
ARTIC SARS-CoV-2 Amplicon Panel IDT 10011442 SARS-CoV-2 genome amplification
Blunt/TA Ligase Master Mix NEB M0367S Library preparation
CENTRICON PLUS­70 10KDA. Fisher Scientific 10296062 Concentration filters
CORIOLIS COMPACT AIR SAMPLER Bertin Technologies 083-DU001 Air sampler
Duran laboratory bottles Merck Z305200-10EA Sampling Bottles
Flow Cell (R9.4.1) Oxford Nanopore FLO-MIN106D Sequencing
General labarotory consumables (tubes, qPCR plates, etc)
Ligation Sequencing Kit Oxford Nanopore SQK-LSK109 Sequencing
LunaScript RT SuperMix Kit NEB E3010  cDNA synthesis
Mengovirus extraction control Kit Biomérieux KMG Concentration control
Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes Thermofisher 5011-0012 Sample storage
Native Barcoding Expansion 1-12 (PCR-free Oxford Nanopore EXP-NBD104 Barcoding
NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module NEB E7595 DNA repair
NEBNext VarSkip Short SARS-CoV-2 Primer Mixes NEB E7658 SARS-CoV-2 genome amplification
NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer NEB B6058S Sequencing 
Phosphate buffered saline Merck P4474 Collection buffer
Phosphate-buffered saline (PBS, 1X), sterile-filtered Thermofisher J61196.AP Elution of air samples
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix NEB M0494S hot start DNA polymerase
Qubit RNA HS Assay Kit Thermofisher Q32852 RNA quantitation
SARS-CoV-2 RUO qPCR Primer & Probe Kit IDT 10006713 Primer-Probe mix and qPCR positive control
TaqPath 1-Step RT-qPCR Master Mix Thermofisher A15299 RT-qPCR kit

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