Presentiamo un protocollo per visualizzare direttamente le attività metaboliche nelle cellule regolate da aminoacidi utilizzando la microscopia a diffusione Raman stimolata (DO-SRS) con ossido di deuterio (acqua pesante D2O), che è integrata con la microscopia a fluorescenza di eccitazione a due fotoni (2PEF).
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Articolo metodologico
Imaging chimico bioortogonale del metabolismo cellulare regolato da amminoacidi aromatici
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli amminoacidi aromatici essenziali (AAA) sono elementi costitutivi per sintetizzare nuove biomasse nelle cellule e sostenere le normali funzioni biologiche. Ad esempio, un'abbondante fornitura di AAA è importante per le cellule tumorali per mantenere la loro rapida crescita e divisione. Con questo, c'è una crescente domanda di un approccio di imaging altamente specifico e non invasivo con una preparazione minima del campione per visualizzare direttamente come le cellule sfruttano gli AAA per il loro metabolismo in situ. Qui, sviluppiamo una piattaforma di imaging ottico che combina il sondaggio all'ossido di deuterio (D2O) con lo scattering Raman stimolato (DO-SRS) e integra DO-SRS con fluorescenza di eccitazione a due fotoni (2PEF) in un singolo microscopio per visualizzare direttamente le attività metaboliche delle cellule HeLa sotto regolazione AAA. Collettivamente, la piattaforma DO-SRS fornisce un'elevata risoluzione spaziale e specificità di proteine e lipidi di nuova sintesi in singole unità cellulari HeLa. Inoltre, la modalità 2PEF può rilevare segnali di autofluorescenza di nicotinammide adenina dinucleotide (NADH) e flavina in modo label-free. Il sistema di imaging qui descritto è compatibile sia con modelli in vitro che in vivo , che è flessibile per vari esperimenti. Il flusso di lavoro generale di questo protocollo include la coltura cellulare, la preparazione dei terreni di coltura, la sincronizzazione cellulare, la fissazione cellulare e l'imaging dei campioni con le modalità DO-SRS e 2PEF.
Introduzione
Essendo aminoacidi aromatici essenziali (AAA), la fenilalanina (Phe) e il triptofano (Tryp) possono essere assorbiti dal corpo umano per sintetizzare nuove molecole per sostenere le normali funzioni biologiche1. Phe è necessario per la sintesi di proteine, melanina e tirosina, mentre Tryp è necessario per la sintesi di melatonina, serotonina e niacina 2,3. Tuttavia, il consumo eccessivo di questi AAA può sovraregolare il bersaglio nei mammiferi della via della rapamicina (mTOR), inibire la proteina chinasi attivata da AMP e interferire con il metabolismo mitocondriale, alterando collett....
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Protocollo
1. Preparazione dei supporti
- Preparare 10 mL di AAA di controllo e AAA in eccesso nel mezzo Eagle modificato (DMEM) di Dulbecco contenente il 50% di D2O.
- Per i mezzi di controllo, misurare e miscelare 10 mg di polvere DMEM con 4,7 mL di acqua bidistillata (ddH2O) in un tubo conico da 15 ml. La polvere DMEM contiene tutti gli aminoacidi a concentrazioni standard. Vortice completo e capovolgere il tubo per assicurarsi che la soluzione sia ben miscelata. Aggiungere 4,7 ml di D2O, 0,5 ml di siero fetale bovino (5% FBS) e 0,1 ml di penicillina/streptomicina (1%). Vortice completo e capovolgere il tubo per a....
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Risultati
L'aggiunta di AAA in eccesso a concentrazioni 15x al terreno di coltura cellulare contenente D2O al 50% ha prodotto bande Raman C-D distinte di lipidi e proteine di nuova sintesi nelle cellule HeLa (Figura 2B). Esperimenti precedenti sono stati eseguiti con diversi livelli di concentrazione, come 2x e 5x, e sebbene i dati non siano presentati, la concentrazione 15x ha prodotto le bande Raman C-D più distinte di lipidi e proteine appena sintetizzati. In particolare, studiando le go.......
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Discussione
L'imaging DO-SRS e 2PEF è stato applicato per studiare la dinamica metabolica in vari modelli ex vivo, tra cui Drosophila e tessuti umani 21,22,23,24,26,27,33. La modalità di imaging utilizzata in questo studio integra la microscopia DO-SRS e 2PEF, che può superare altri metodi di i.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti o altri conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Dr. Yajuan Li e Anthony Fung per il loro supporto tecnico e il laboratorio Fraley per la linea cellulare. Riconosciamo i fondi iniziali di UCSD, NIH U54CA132378, NIH 5R01NS111039, NIH R21NS125395, NIHU54DK134301, NIHU54 HL165443 e Hellman Fellow Award.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 10 ml di pipette sierologiche | Avantor (by VWR) | 75816-100 | https://us.vwr.com/store/product?keyword=75816-100 |
| Provetta da centrifuga conica da 15 mL | VWR | 89039-664 | https://mms.mckesson.com/product/1001859/VWR-International-89039-664 |
| 16% di formaldeide, senza metanolo | ThermoFisher Scientific | 28906 | |
| https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/28906 piastra | a 24 pozzettiFisherbrand | FB0112929 | https://www.fishersci.com/shop/products/24-well-tc-multidish-100-cs/FB012929#?keyword=FB012929 |
| Filtro per siringa da 25 mm, 2 & m PES | Foxx Life Sciences | 381-2216-OEM | https://www.foxxlifesciences.com/collections/pes-syringe-filters/products/381-2216-oem?variant=16274336003 |
| 460 nm Cubo | filtro Olympus | OCT-ET460/50M32 | |
| Adattatori CA dell'alimentatore per LD OBIS 6 Laser Remote | Olympus | Alimentazione al laser | |
| Filtro passa-banda | KR Electronics | KR2724 | 8 MHz |
| Terminatore BNC 50 Ohm | Mini circuiti | STRM-50 | |
| Cavo BNC | Thorlabs | 2249-C | , BNC maschio/maschio |
| Specchio dielettrico a banda larga | Thorlabs | BB1-E03 | 750 - 1100 nm |
| Condensatore centrifugo | |||
| Olympus | |||
| Cover Glass | Corning | 2850-25 | Alimentatore |
| CC | https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2b/NL/en/Glassware/Cover-Glass/Corning%C2%AE-Square-%231%C2%BD-Cover-Glass/p/2850-25 TopWard | 6302D | |
| Dichroic Mount | Thorlabs | KM100CL | |
| Reagente per colture cellulari di dimetilsolfossido | mpbio | 196055 | https://www.mpbio.com/0219605525-dimethyl-sulfoxide-cf'aquila |
| modificata di Dulbecco' s Medium senza metionina, treonina e piruvato di sodio | MilliporeSigma | 38210000 | https://www.usbio.net/media/D9800-22/dulbeccorsquos-mem-dmem-wsodium-bicarbonate-wo-methionine-threonine-sodium-pyruvate-powder Con bicarbonato di sodio e senza metionina, treonina e piruvato di sodio. |
| Dulbecco' s Aquila modificata' s Medium | Corning | MT10027CV | https://www.fishersci.com/shop/products/dmem-dulbecco-s-modified-eagle-s-medium-4/MT10027CV#:~:text=Dulbecco's%20Modified%20Eagle's%20Medium%20 |
| FIJI ImageJ | ImageJ | Versione 1.53t 24 agosto 2022 | https://imagej.net/software/fiji/downloads |
| Acqua pesante (ossido di deuterio) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | 7732-18-5 | https://shop.isotope.com/productdetails.aspx?itemno=DLM-4-1L |
| Celle Hela | ATCC | CCL-2 | https://www.atcc.org/products/ccl-2 |
| Emocimetro | MilliporeSigma | Z359629-1EA | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/z359629?gclid=Cj0KCQiA37KbBhDgARIsAI zce15A5FIy0WS7I6ec2KVk QPXVMEqlAnYis_bKB6P6lr SIZ-wAXOyAELIaAhhEEAL w_wcB& gclsrc = aw.ds |
| Filtro passa-banda ad alto diametro | esterno Tecnologia cromatica | ET890 / 220m | Filtra il raggio di Stokes e trasmette il raggio della pompa |
| HyClone Fetale Siero Bovino (FBS) | Cytiva | SH300880340 | https://www.fishersci.com/shop/products/hyclone-fetal-bovine-serum-u-s-standard-4/SH300880340 |
| HyClone Trypsin 0.25% (1x) Soluzione | Cytiva | SH30042.02 | https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/cell-culture-and-fermentation/reagents-and-supplements/cell-disassociation-reagents/hyclone-trypsin-protease-p-00445 |
| Sistema laser SRS integrato | Fisica applicata & Elettronica, Inc. | picoEMERALD | picoEMERALD fornisce un impulso di uscita a 1031 nm con larghezza dell'impulso di 6 ps e frequenza di ripetizione di 80 MHz, che funge da fascio di Stokes. Il fascio raddoppiato di frequenza a 532 nm viene utilizzato per seminare in modo sincrono un oscillatore parametrico ottico (OPO) a picosecondi per produrre un treno di impulsi bloccato in modalità con larghezza di impulso di cinque ~ 6 ps (il raggio idler dell'OPO è bloccato con un filtro interferometrico). La lunghezza d'onda di uscita dell'OPO è regolabile da 720– 950 nm, che funge da raggio della pompa. L'intensità del fascio di Stokes a 1031 nm è modulata sinusoidalmente da una EOM integrata a 8 MHz con una profondità di modulazione superiore al 90%. Il fascio della pompa è sovrapposto spazialmente al fascio di Stokes utilizzando uno specchio dicroico all'interno di picoEMERALD. La sovrapposizione temporale tra gli impulsi di pompa e quelli di Stokes è ottenuta con uno stadio di ritardo incorporato e ottimizzata dal segnale SRS di D2O puro al microscopio. |
| Microscopio a scansione laser invertito | Olympus | FV1200MPE | |
| IX3-CBH Scatola di controllo | Olympus | Control il microscopio a scansione laser | |
| Montaggio a specchio cinematico | Thorlabs | POLARIS-K1-2AH | 2 regolatori esagonali a basso profilo |
| L-fenalynine | Sigma | P5482-25G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5482 |
| L-Triptofano | Sigma | T8941-25G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8941 |
| LabSpec 6 | Horiba XploRA | N/A | https://www.horiba.com/gbr/scientific/products/detail/action/show/Product/labspec-6-spectroscopy-suite-software-1843/ |
| Lock-In | Zurich Instruments | N/A | https://www.zhinst.com/americas/en/products/shfli-lock-in-amplifier |
| Divisore di fascio dicroico passa-lungo | Semrock | Di02-R980-25x36 | Laser 980 nm BrightLine divisore di fascio dicroico piatto laser a bordo singolo |
| MATLAB | MathWorks | Versione: R2022b | https://www.mathworks.com/products/new_products/latest_features.html |
| vetrini per microscopio | Fisherbrand | 12-550-003 | |
| https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-selectfrost-microscope-slides-9/12550003#?keyword=12-550-003 Software di imaging per microscopia | Olympus | FluoView | |
| MPLN 100x, Olympus | Olympus | MPLAPON | https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11364 |
| MPLN 50x, Olympus | Olympus | MPLAPON | https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11363 |
| NA Condensatore d'olio | Olympus | 6-U130 | https://www.hitechinstruments.com/Product-Details/olympus-achromatic-aplanatic-high-na-condneser |
| Smalto per unghie | Wet n Wild | B01EO2G5O4 | https://www.amazon.com/dp/B01EO2G5O4/ref=cm_sw_r_api_i_E609VVDWW HHQP38FXXDC_0 |
| Origin OriginLab | Origin 2022b (9.95) | https://www.originlab.com/index.aspx?go=PRODUCTS/Origin | |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/p-2379782 |
| PBS 1x (soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco) | Thermofischer - Gibco | 14040117 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040117?SID=srch-hj-14040117 |
| Penicillina/Streptomicina | Thermofischer - Gibco | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
| Periscopio | Thorlabs | RS99 | Include le unità superiore e inferiore, Ø Palo da 1" e forcella di serraggio. |
| PicoEmerald System | A.P.E | N/A Scatola | |
| schermata con connettori BNC | Pomona Electronics | 2902 | Scatola in alluminio con coperchio, rivelatore a fotodiodo Si BNC femmina/femmina |
| Costruito | casa | N/A | DYI Distanziatori |
| wafer | |||
| Grace Bio-Labs | 654008 | https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654008/ | |
| Spettroscopia Raman spontanea | Horiba XploRA | N/A | https://www.horiba.com/int/products/detail/action/show/Product/xploratm-plus-1528/ |
| Microscopia a diffusione Raman stimolata | Costruito in casa | N/A | |
| Touch Pannello controller | Olympus | Controlla la direzione X-Y del microscopio a scansione laser | |
| Trypan Blue 0,4% (0,85% NaCl) | Lonza | 17-942E | https://bioscience.lonza.com/lonza_bs/US/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000181876/Trypan-Blue%2C-0-4%25-Solution" |
| Pinzetta | Kaverme - Amazon | B07RNVXXV1 | https://www.amazon.com/Precision-Anti-Static-Electronics-Laboratory-Jewelry-Making/dp/B07RNVXXV1" |
| Due fotoni eccitazione fluorescenza microscopia | casa | n / a | |
| pesatura carta... | VWR | 12578-165 | https://us.vwr.com/store/product/4597617/vwr-weighing-paper |
| Zurich LabOneQ Software | Zurich Instruments | Controlla l'amplificatore lock-in Zurich |
Riferimenti
- Wu, G. Functional amino acids in nutrition and health. Amino Acids. 45 (3), 407-411 (2013).
- Wei, Z., Liu, X., Cheng, C., Yu, W., Yi, P. Metabolism of amino acids in cancer. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 603837(2020).
- Parthasarathy, A., et al.
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Ristampe e permessi
