Microiniezione mirata ed elettroporazione di organoidi cerebrali di primati per la modificazione genetica

Studiare lo sviluppo (pato)fisiologico e l'evoluzione della corteccia cerebrale è un compito formidabile che è ostacolato dalla mancanza di sistemi modello adeguati. In precedenza, tali studi erano limitati a modelli di coltura cellulare bidimensionale (come il progenitore neurale primario o le colture cellulari neuronali) e modelli animali evolutivamente distanti (come i roditori)^1,2. Mentre questi modelli sono utili per affrontare alcune domande, sono limitati nel modellare la complessità, la composizione del tipo di cellula, l'architettura cellulare e i modelli di espressione genica della neocorteccia umana in via di sviluppo in stati sani e malati. Queste limitazioni portano, ad esempio, alla scarsa traducibilità dei modelli murini di malattie umane alla situazione umana, come descritto per alcuni casi di microcefalia (ad esempio, Zhang et ^al.3). Recentemente, i primati transgenici non umani, che sono un modello evolutivamente, funzionalmente e morfologicamente più vicino dello sviluppo della neocorteccia umana, sono stati messi a fuoco 4,5,6,7,8 in quanto superano molti limiti dei modelli basati su colture cellulari e roditori. Tuttavia, l'uso di primati non umani nella ricerca non è solo molto costoso e richiede tempo, ma solleva anche preoccupazioni etiche. Più recentemente, lo sviluppo della tecnologia degli organoidi cerebrali 9,10 è emerso come un'alternativa promettente che risolve molti dei limiti dei precedenti modelli 11,12,13,14,15,16.

Gli organoidi cerebrali sono strutture multicellulari tridimensionali (3D) che emulano le caratteristiche principali della citoarchitettura e della composizione di tipo cellulare di una o più regioni cerebrali per una finestra temporale di sviluppo definita 11,12,13,14,17. Queste strutture 3D sono generate da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) o, se disponibili per le specie di interesse, da cellule staminali embrionali (ESC). In generale, due tipi di organoidi cerebrali possono essere distinti in base alla metodologia utilizzata: organoidi cerebrali non guidati e regionalizzati (guidati)¹⁸. Nel generare quest'ultimo tipo di organoidi, vengono fornite piccole molecole o fattori che guidano la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti in organoidi di una particolare regione del cervello (ad esempio, organoidi del proencefalo)¹⁸. Al contrario, negli organoidi non guidati, la differenziazione non è guidata dall'aggiunta di piccole molecole, ma piuttosto si basa esclusivamente sulla differenziazione spontanea delle iPSCs/ESC. Gli organoidi cerebrali risultanti sono costituiti da tipi di cellule che rappresentano diverse regioni del cervello (ad esempio, organoidi cerebrali)¹⁸. Gli organoidi cerebrali combinano molte caratteristiche chiave dello sviluppo cerebrale con una generazione relativamente efficiente in termini di costi e tempi da qualsiasi specie di interesse per la quale sono disponibili iPSC o ESC 11,12,13,14. Ciò rende gli organoidi cerebrali un modello eccellente per molti tipi di studi neurobiologici, che vanno dalle domande evolutive e di sviluppo alla modellizzazione delle malattie e ai test farmacologici^15,16. Tuttavia, affrontare tali domande utilizzando organoidi cerebrali dipende fortemente dalla disponibilità di diversi metodi per la modificazione genetica.

Un aspetto chiave dello studio dello sviluppo (pato)fisiologico della neocorteccia e della sua evoluzione è l'analisi funzionale dei geni e delle varianti geniche. Questo di solito è ottenuto dall'espressione (ectopica) e / o dal knock-down (KD) o knock-out (KO) di quei geni. Tali modificazioni genetiche possono essere classificate in modificazioni genetiche stabili e transitorie, nonché in modificazioni limitate o non limitate nel tempo e nello spazio. La modificazione genetica stabile è definita dall'introduzione di un'alterazione genetica nel genoma ospite che viene trasmessa a tutte le generazioni cellulari successive. A seconda del punto temporale della modificazione genetica, può interessare tutte le cellule di un organoide o può essere limitato a determinate popolazioni cellulari. Più frequentemente, la modificazione genetica stabile viene raggiunta negli organoidi cerebrali a livello iPSC / ESC applicando lentivirus, sistemi simili ai trasposoni e la tecnologia CRISPR / Cas9 (riveduta da, ad esempio, Fischer et al.17, Kyrousi et ^al.19 e Teriyapirom et ^al.20). Ciò ha il vantaggio che tutte le cellule dell'organoide cerebrale portano la modificazione genetica e che non è limitata temporalmente o spazialmente. Tuttavia, la generazione e la caratterizzazione di queste linee stabili iPSC/ESC richiedono molto tempo, spesso impiegando diversi mesi prima che i primi organoidi cerebrali modificati possano essere analizzati (esaminati ad esempio, da Fischer et al.17, Kyrousi et ^al.19, o Teriyapirom et ^al.20).

Al contrario, la modificazione genetica transitoria è definita dalla consegna di carico genetico (ad esempio, un plasmide di espressione genica) che non si integra nel genoma dell'ospite. Mentre questa modifica può, in linea di principio, essere trasmessa alle generazioni cellulari successive, il carico genetico consegnato sarà progressivamente diluito con ogni divisione cellulare. Pertanto, questo tipo di modificazione genetica è solitamente limitato temporalmente e spazialmente. La modificazione genetica transitoria può essere effettuata negli organoidi cerebrali da virus adeno-associati o mediante elettroporazione (esaminata da, ad esempio, Fischer et al.17, Kyrousi et ^al.19 e Teriyapirom et ^al.20), con quest'ultimo descritto in dettaglio in questo articolo. A differenza della modificazione genetica stabile, questo approccio è molto rapido ed economico. Infatti, l'elettroporazione può essere eseguita in pochi minuti e, a seconda della popolazione di cellule bersaglio, gli organoidi elettroporati sono pronti per l'analisi in pochi giorni (esaminati da, ad esempio, Fischer et al.17 e Kyrousi et ^al.19). Tuttavia, i cambiamenti morfologici grossolani dell'organoide cerebrale, come le differenze di dimensioni, non possono essere rilevati utilizzando questo metodo, poiché questo tipo di modificazione genetica è limitato temporalmente e spazialmente. Questa restrizione può anche essere un vantaggio, ad esempio, nel caso di studiare singole popolazioni cellulari all'interno dell'organoide o gli effetti sugli organoidi cerebrali in specifici punti temporali dello sviluppo (rivisti da, ad esempio, Fischer et al.17 e Kyrousi et ^al.19).

Un approccio classico per studiare la funzione genica durante lo sviluppo e l'evoluzione del cervello è l'elettroporazione in utero. L'elettroporazione in utero è una tecnica ben nota e utile per la veicolazione di costrutti di espressione genica nel cervello dei roditori 21,22,23 e del furetto ^24,25. In primo luogo, una soluzione contenente il costrutto o i costrutti di espressione di interesse viene microiniettata attraverso la parete uterina in un certo ventricolo del cervello embrionale, a seconda della regione da prendere di mira. Nella seconda fase, vengono applicati impulsi elettrici per trasfettare le cellule che rivestono direttamente il ventricolo mirato. Questo approccio non è limitato solo all'espressione ectopica o alla sovraespressione di geni, in quanto può essere applicato anche in studi KD o KO microiniettando forcine corte (shRNA) o CRISPR / Cas9 (sotto forma di plasmidi di espressione o ribonucleoproteine [RNP]), rispettivamente^26,27. Tuttavia, l'elettroporazione in utero di embrioni di topo, ratto e furetto ha le stesse limitazioni descritte sopra per questi modelli animali.

Idealmente, si vorrebbe eseguire l'elettroporazione in utero direttamente nei primati. Mentre questo è, in linea di principio, tecnicamente possibile, l'elettroporazione in utero non viene condotta nei primati a causa di preoccupazioni etiche, alti costi di manutenzione degli animali e piccole dimensioni della cucciolata. Per alcuni primati, come le grandi scimmie (compresi gli umani), questo non è affatto possibile. Tuttavia, questi primati hanno il più grande potenziale per lo studio dello sviluppo della neocorteccia umana (pato)fisiologica e della sua evoluzione. Una soluzione a questo dilemma è applicare la tecnica dell'elettroporazione agli organoidi cerebrali dei primati²⁸.

Questo articolo presenta un protocollo per l'elettroporazione di un sottotipo di organoidi cerebrali di primati, organoidi cerebrali di primati. Questo approccio consente la modificazione genetica rapida ed economica delle popolazioni cellulari all'interno delle strutture simili a ventricole degli organoidi. In particolare, descriviamo un protocollo unificato per la generazione di organoidi cerebrali di primati da iPSC umane (Homo sapiens), scimpanzé (Pan troglodytes), macaco rhesus (Macaca mulatta) e uistitì comune (Callithrix jacchus). Inoltre, descriviamo in dettaglio la tecnica di microiniezione ed elettroporazione e forniamo criteri "go" e "no-go" per eseguire l'elettroporazione di organoidi cerebrali di primati. Questo approccio è uno strumento efficace per studiare lo sviluppo (pato)fisiologico della neocorteccia e la sua evoluzione in un modello particolarmente vicino alla situazione umana.

1. Coltura delle iPSC dei primati

NOTA: Grazie alla sua robustezza, il metodo qui presentato può essere applicato a qualsiasi linea iPSC di primati. In questo articolo, descriviamo la produzione di organoidi cerebrali da linee iPSC umane (iLonza2.2)29, scimpanzé (Sandra A)³⁰, macaco rhesus (iRh33.1)²⁹ e uistitì comune (cj_160419_5)³¹. Le condizioni di coltura sono riassunte nella Tabella 1. Vedere la tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, i reagenti e le attrezzature utilizzate in questo protocollo.

1. Per la coltura delle rispettive iPSC, seguire le condizioni di coltura originariamente descritte. In generale, per il successo della generazione e dell'elettroporazione di organoidi cerebrali, utilizzare linee iPSC che non sono state coltivate per più di 90 passaggi. Inoltre, all'inizio della generazione di organoidi cerebrali, assicurarsi che le iPSC presentino caratteristiche di pluripotenza senza segni di differenziazione.

2. Generazione di organoidi cerebrali da iPSC di primati

NOTA: Il protocollo per la generazione di organoidi cerebrali si basa su una versione modificata 28,30,32,33 del protocollo originale degli organoidi cerebrali ^10,34 con alcune modifiche specie-specifiche (dettagliate di seguito).

1. Semina di iPSC per generare corpi embrioidi (EB)
   1. Una volta che le iPSC hanno raggiunto l'80%-90% di confluenza, lavarle con soluzione salina tamponata fosfato (DPBS) di Dulbecco e aggiungere 500 μL di sostituto della tripsina ricombinante o 1 mL di miscela proteolitica e collagenolitica.
      NOTA: Tipicamente, le iPSC vengono coltivate in un piatto di coltura cellulare da 60 mm per ottenere circa 900.000 cellule, che è sufficiente per generare 96 organoidi cerebrali. Il numero di cellule può essere regolato in base al numero di organoidi necessari. Essere consapevoli del fatto che non tutti gli organoidi cerebrali generati potrebbero essere adatti per l'elettroporazione.
   2. Incubare il piatto a 37 °C per 2 minuti per staccare le cellule.
      NOTA: potrebbero essere necessari fino a 2 minuti aggiuntivi di incubazione a 37 °C a seconda della linea iPSC o dell'enzima utilizzato. Si consiglia di esaminare il piatto al microscopio per assicurarsi che le cellule abbiano iniziato a staccarsi.
   3. Aggiungere 1,5 mL di terreno di coltura iPSC preriscaldato (37 °C) per arrestare la reazione e pipettare su e giù 7x-10x (non più di 10x) per dissociare le cellule dal piatto di coltura cellulare e ottenere una sospensione unicellulare.
   4. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da centrifuga da 15 mL e centrifugare le celle a 200 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.
   5. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 2 ml di terreno di coltura iPSC integrato con 50 μM Y27632 o 50 μM di composto pro-sopravvivenza.
   6. Utilizzare 10 μL della sospensione cellulare per contare le cellule utilizzando una camera di Neubauer.
   7. Regolare la sospensione cellulare a una concentrazione di 9.000 cellule per 150 μL (60.000 cellule/ml) utilizzando terreno di coltura iPSC integrato con 50 μM Y27632 o 50 μM di composto pro-sopravvivenza.
   8. Per generare corpi embrioidi (EB), seminare 150 μL della sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra ultra-bassa di attacco a 96 pozzetti. Durante il pipettaggio, agitare delicatamente il tubo contenente la sospensione cellulare per evitare che le cellule si sedimentino.
   9. Coltivare gli EB in atmosfera umificata al 5% di CO₂ e al 95% di aria a 37 °C (0 giorni dopo la semina [dps]). Non disturbare gli EB entro le prime 24 ore dopo la semina.
      NOTA: Le EB generate da iPSC uistitì devono essere coltivate in atmosfera umificata in condizioni ipossiche (5% CO 2, 5% O 2 e 90% N ₂) a 37 °C.
   10. Dopo ~48 ore (2 dps), cambiare il terreno in terreno di coltura iPSC senza Y27632/composto pro-sopravvivenza. Rimuovere 100 μL di terreno per pozzetto e aggiungere 150 μL di terreno fresco preriscaldato (37 °C) senza Y27632. Vai riga per riga.
   11. Eseguire ulteriori cambi di mezzo a giorni alterni; rimuovere 150 μL di terreno da ciascun pozzetto e aggiungere 150 μL di terreno fresco preriscaldato (37 °C) senza Y27632/composto pro-sopravvivenza per pozzetto.
       NOTA: Dopo 4-5 dps, la periferia degli EB dovrebbe diventare traslucida.
2. Induzione del neuroectoderma
   NOTA: In generale, gli EB di buona qualità dovrebbero avere contorni lisci e bordi traslucidi in questa fase. I punti temporali dell'induzione neurale differiscono leggermente tra le specie di primati e le linee iPSC. Nel caso delle linee cellulari qui utilizzate (vedi sezione 1 e tabella dei materiali), l'induzione neurale per gli EB di uistitì di solito deve essere iniziata a 4 dps, per il macaco rhesus a 5 dps e per gli EB umani e scimpanzé a 4-5 dps (Figura 1A), a seconda dello stato degli EB (vedi sopra).
   1. Rimuovere 150 μL di terreno da ciascun pozzetto della prima fila della piastra a 96 pozzetti e aggiungere 150 μL di mezzo di induzione neurale preriscaldato (37 °C) (vedere Tabella 2) per pozzetto nella stessa fila.
   2. Continuare a cambiare il mezzo come descritto sopra riga per riga per l'intera piastra a 96 pozzetti. Eseguire ulteriori modifiche del mezzo di induzione neurale (NIM) a giorni alterni rimuovendo 150 μL di NIM da ciascun pozzetto e aggiungendo 150 μL di NIM fresco preriscaldato (37 °C).
      NOTA: Da questo momento in poi, gli EB di uistitì dovrebbero essere coltivati nelle stesse condizioni degli altri EB primati (atmosfera umificata di 5% CO₂ e 95% aria a 37 °C).
3. Incorporazione nella matrice della membrana basale
   NOTA: Una volta che gli EB hanno sviluppato un neuroepitelio pronunciato, traslucido, organizzato radialmente sulla superficie, è necessario fornire supporto strutturale per lo sviluppo di strutture simili a ventricoli. Ciò si ottiene incorporando gli EB in una matrice di membrana basale. A causa delle differenze nei tassi di sviluppo, gli EB di marmoset e macaco rhesus sono pronti per l'incorporazione già a 7 dps, mentre gli EB umani e scimpanzé sono solitamente incorporati a 8-9 dps. Per semplicità, la matrice della membrana basale si riferisce solo a Matrigel in questo protocollo. Tuttavia, Geltrex può essere utilizzato come sostituto.
   1. In preparazione per l'incorporamento, forbici sterilizzate UV, pinze, un piccolo rack per tubi da 0,2 ml e da tre a sei quadrati di parafilm trattati con etanolo al 70% (vol/vol) sotto la cappa a flusso laminare per 15 minuti. Lasciare che la matrice della membrana basale si scongeli sul ghiaccio per diverse ore (~ 1,5 ml di matrice della membrana basale sono di solito sufficienti per 96 EB).
      NOTA: Tenere sempre la matrice della membrana basale sul ghiaccio.
   2. Create una griglia di fossette 4 x 4 sul parafilm. Posizionare la griglia del parafilm sul rack del tubo da 0,2 mL in modo che il lato avvolto in carta sia rivolto verso l'alto e premere delicatamente un dito guantato contro ciascun foro del rack.
   3. Rimuovere la carta e tagliare la griglia della fossetta dal quadrato del parafilm usando le forbici per regolarne le dimensioni per adattarla a un piatto di coltura cellulare da 60 mm. Riposizionare il parafilm con fossette sul rack del tubo da 0,2 mL per fornire una base per la generazione di goccioline della matrice della membrana basale.
   4. Utilizzando una pipetta con una punta di pipetta tagliata da 200 μL, trasferire con attenzione gli EB uno dopo l'altro dal pozzetto del piatto di coltura alle fossette del parafilm.
   5. Dopo aver spostato 16 EB nella rete, prendere una nuova punta per pipetta da 200 μL e rimuovere il mezzo rimanente dalle fossette.
   6. Pipettare una goccia (~15 μL) di matrice di membrana basale su ciascuna fossetta contenente un EB.
   7. Prendere una punta di pipetta da 10 μL e spostare rapidamente gli EB al centro di ciascuna goccia senza disturbare i bordi delle goccioline.
   8. Posizionare il parafilm con le fossette con le gocce di matrice della membrana basale in un piatto di coltura cellulare da 60 mm e incubare per 15-30 minuti a 37 °C per consentire alla matrice di polimerizzare.
   9. Per staccare gli EB incorporati nella matrice dal parafilm, aggiungere 5 ml di mezzo di differenziazione (DM) senza vitamina A ( vedere Tabella 2) al piatto e capovolgere il parafilm con una pinza in modo che il lato con gli EB sia rivolto verso il fondo del piatto.
   10. Agitare delicatamente il piatto per far sì che le gocce della matrice della membrana basale contenenti gli EB si stacchino dal parafilm. Se alcuni di essi sono ancora attaccati, prendi un bordo del quadrato del parafilm usando una pinza e arrotolalo rapidamente verso il centro del piatto più volte.
   11. Coltura degli organoidi cerebrali su uno shaker orbitale a 55 rpm in atmosfera umificata al 5% di CO₂ e al 95% di aria a 37 °C. Tienili in DM senza vitamina A con cambiamenti medi a giorni alterni. Per indurre la produzione di neuroni, passare al DM con vitamina A (acido retinoico, RA) dopo 13 dps per organoidi cerebrali di uistitì e macaco rhesus o 14-15 dps per organoidi cerebrali umani e scimpanzé (Figura 1A). Da questo punto in poi, cambia il mezzo ogni 3-4 giorni.
       NOTA: Per supportare la sopravvivenza neuronale, il DM con vitamina A può essere integrato con 20 μg/mL di neurotrofina umana 3 (NT3), 20 μg/mL di fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF) e 1 μL/mL di matrice di membrana basale da 40 dps in poi.

3. Elettroporazione di organoidi cerebrali di primati

NOTA: Da un punto di vista tecnico, l'elettroporazione degli organoidi cerebrali può essere condotta non appena le strutture simili a ventricole sono abbastanza pronunciate da essere mirate mediante microiniezione. La finestra temporale ottimale per l'elettroporazione dipende dalla domanda biologica e dalla popolazione cellulare di interesse. Ad esempio, se i progenitori apicali (AP) sono l'obiettivo principale, allora gli organoidi cerebrali a circa 30 dps sono già adatti. Se i progenitori basali (BP) o i neuroni sono i bersagli principali, dovrebbero essere utilizzati organoidi cerebrali più vecchi di oltre 50 dps (vedi, ad esempio, Fischer et ^al.28).

1. Preparazione della configurazione dell'elettroporazione
   NOTA: L'efficienza dell'elettroporazione è fortemente influenzata dalle dimensioni e dalla concentrazione del plasmide elettropolato (vedere la sezione di discussione per i dettagli).
   1. Preparare una quantità sufficiente di miscela di elettroporazione per il controllo e il gene di interesse (GOI), ad esempio, 10 μL di miscela di elettroporazione per ciascun controllo e GOI per elettroporare circa 30 organoidi cerebrali per condizione.
      NOTA: Per la composizione delle miscele di elettroporazione, vedere Tabella 3.
   2. Precaldo (non sterile) Miscela modificata Eagle di Dulbecco / miscela nutritiva F-12 (DMEM / F12) e DM con vitamina A a 37 ° C. Preparare una piccola spatola e forbici fini e normali e spruzzare gli strumenti con etanolo al 70% (vol/vol).
      NOTA: I seguenti passaggi possono essere eseguiti in condizioni sterili o non sterili poiché il DM contiene antibiotici (vedere Tabella 2). Nella nostra esperienza, l'assenza di sterilità non ha mai causato alcuna contaminazione.
   3. Preparare piatti di coltura cellulare da 35 mm e collegare la camera dell'elettrodo a piastra di Petri all'elettroporatore.
      NOTA: le camere per elettrodi a piastre di Petri sono disponibili in commercio. Tuttavia, possono essere facilmente prodotti in modo economico (vedere il file supplementare 1).
   4. Utilizzando le punte dei microcaricatori, riempire gli aghi per microiniezione con 8 μL di ciascuna miscela di elettroporazione. Tagliare le punte degli aghi usando forbici sottili prima del primo utilizzo per ottenere un flusso stabile. Tuttavia, rimuovere solo una piccola parte della punta, poiché una punta smussata e larga può danneggiare gravemente gli organoidi.
      NOTA: Gli aghi per microiniezione sono disponibili in commercio come aghi per microiniezione pre-tirati o possono essere tirati in laboratorio se è disponibile un estrattore di aghi. Seguire le istruzioni del produttore dell'estrattore di aghi per generare aghi per microiniezione con una lunga conicità e un diametro della punta di 10 μm.
2. Microiniezione ed elettroporazione
   1. Al microscopio, scegli cinque organoidi cerebrali con bordi lisci e strutture simili a ventricoli chiaramente visibili. Spostarli in un piatto di coltura cellulare da 35 mm contenente DMEM/F12 preriscaldato (37 °C) utilizzando una punta di pipetta tagliata da 1.000 μL.
      NOTA: Scegliere organoidi cerebrali con strutture simili a ventricole pronunciate e accessibili (vedere Figura 1B).
   2. Per iniettare una struttura simile a un ventricolo, inserire con attenzione l'ago attraverso la sua parete e infonderlo con la miscela di elettroporazione fino a quando non è visibilmente riempito. Non applicare una pressione eccessiva sulle strutture simili a ventricole per evitare che scoppino. Procedere con sei-otto strutture simili a ventricole di ciascun organoide cerebrale in questo modo.
      NOTA: Se l'ago si ostruisce durante il processo di microiniezione, la punta deve essere leggermente tagliata.
   3. Trasferire un organoide cerebrale microiniettato nella camera dell'elettrodo della piastra di Petri con una piccola quantità di DMEM/F12. Disporre l'organoide in modo che le superfici delle strutture simili a ventricole microiniettate siano rivolte verso l'elettrodo collegato al polo positivo dell'elettroporatore.
      NOTA: Orientare le strutture in questo modo assicura che le cellule siano trasfettate sul lato della struttura simile a un ventricolo che non è influenzata da una struttura adiacente.
   4. Elettroporare gli organoidi cerebrali uno per uno utilizzando le seguenti impostazioni: 5 impulsi di 80 V, una durata dell'impulso di 50 ms e un intervallo di 1 s. Spostare gli organoidi elettroporati in un nuovo piatto di coltura cellulare da 35 mm riempito con DMEM/F12 preriscaldato (37 °C).
      NOTA: le impostazioni di elettroporazione potrebbero dipendere dall'elettroporatore ad onda quadra disponibile. Queste impostazioni sono ottimizzate per il sistema di elettroporazione di riferimento. L'aumento della tensione può portare allo spostamento delle celle.
   5. Procedere allo stesso modo con i successivi cinque organoidi cerebrali utilizzando la seconda miscela di elettroporazione (ad esempio, GOI).
      NOTA: Ripetere i punti 3.2.1-3.2.5 fino a raggiungere il numero desiderato di organoidi cerebrali elettroporati.
   6. Se la microiniezione e l'elettroporazione sono state condotte in condizioni non sterili, trasferire gli organoidi elettroporati in un piatto di coltura cellulare sterile da 35 mm sotto una cappa a flusso laminare spostando il minor DMEM/F12 possibile nel nuovo piatto di coltura cellulare.
3. Ulteriore coltura e fissazione di organoidi cerebrali
   1. Coltura degli organoidi elettroporati in DM con vitamina A su uno shaker orbitale a 55 rpm in atmosfera umificata al 5% di CO₂ e al 95% di aria a 37 °C.
   2. Il giorno successivo all'elettroporazione, controllare gli organoidi cerebrali per un'elettroporazione di successo con un microscopio a fluorescenza invertita convenzionale.
      NOTA: A seconda della lunghezza dell'ulteriore coltura dopo l'elettroporazione, sono interessate diverse popolazioni cellulari all'interno dell'organoide cerebrale (vedere anche la sezione dei risultati rappresentativi).
   3. Procedere con le applicazioni a valle dopo aver coltivato gli organoidi cerebrali elettroporati per un periodo di tempo adatto alla questione biologica di interesse.
      NOTA: Gli organoidi cerebrali elettroporati possono essere elaborati per diverse applicazioni a valle (ad esempio, fissazione per colorazione a immunofluorescenza o congelamento a scatto per l'isolamento dell'RNA e qRT-PCR). Qui, descriviamo la fissazione di organoidi cerebrali elettroporati.
   4. Trasferire gli organoidi elettroporati in una provetta conica da centrifuga da 15 ml utilizzando una punta per pipetta tagliata da 1.000 μl e rimuovere il mezzo in eccesso.
   5. Aggiungere una quantità sufficiente di paraformaldeide (PFA) al 4% in DPBS (pH 7,5) e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
      ATTENZIONE: Il PFA è classificato come cancerogeno per l'uomo e può causare danni irreparabili alla salute. Ulteriori misure precauzionali tra cui guanti e occhiali in nitrile sono fortemente raccomandate.
   6. Aspirare il PFA, aggiungere 5 ml di DPBS, agitare un po 'e aspirare il DPBS. Ripeti questa operazione 2x. Conservare gli organoidi in DPBS a 4 °C fino a ulteriore utilizzo.
      NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui, poiché gli organoidi cerebrali fissati con PFA possono essere conservati a 4 °C per diversi mesi. Gli organoidi elettroporati fissati con PFA possono essere analizzati mediante criosezione e colorazione a immunofluorescenza ^10,28 o colorazione e pulizia a montaggio intero ^35,36. Per immagini di esempio, vedere la sezione dei risultati rappresentativi (vedere la Tabella 4 per i dettagli sugli anticorpi).

Il protocollo qui descritto consente la generazione efficiente di organoidi cerebrali da linee iPSC umane, scimpanzé, macaco rhesus e uistitì comune con minime alterazioni temporali richieste tra le specie (Figura 1A). Questi organoidi possono essere elettroporati nell'intervallo da 20 dps a 50 dps, a seconda dell'accessibilità delle strutture simili a ventricole e dell'abbondanza della popolazione cellulare di interesse. Tuttavia, prima dell'elettroporazione, è importante determinare se gli organoidi cerebrali sono di qualità sufficiente per essere elettroporati.

Un organoide cerebrale ideale per l'elettroporazione dovrebbe mostrare strutture simili a ventricoli luminose pronunciate alla periferia, nessun segno di degenerazione (ad esempio, cellule che si staccano, nucleo apoptotico allargato) e una morfologia sana generalmente compatta (ad esempio, nessuna escrescenza eccessiva) (Figura 1B, "Vai"). È preferibile scegliere organoidi cerebrali con strutture grandi, ben organizzate simili a ventricole per colpire un numero maggiore di cellule. Se la zona periferica di un organoide è scura e non mostra strutture sporgenti, si raccomanda di non utilizzarla per l'elettroporazione, poiché le microiniezioni precise potrebbero essere compromesse dalla mancanza di segnali visivi (Figura 1B, "No-go"). Per ottenere una morfologia organoide cerebrale ottimale, è essenziale garantire che i passaggi critici come l'induzione del neuroectoderma e l'incorporazione della matrice siano tempestivi. I problemi riguardanti la morfologia degli organoidi cerebrali derivano tipicamente dalla mancata formazione di gemme neuroectoderma e/o neuroepiteliali. Ciò è normalmente causato da tempi non ottimali dell'induzione neurale e / o dall'incorporamento della matrice della membrana basale e può essere risolto regolando i tempi di questi passaggi (ulteriori suggerimenti per la risoluzione dei problemi per la formazione di organoidi cerebrali possono essere trovati in Lancaster e Knoblich34).

Dopo l'elettroporazione, una prima valutazione del suo successo e della sua efficienza può essere condotta dopo 12 ore, quando l'espressione GFP delle cellule trasfettate diventa rilevabile con un microscopio a fluorescenza invertita convenzionale. Idealmente, in questa fase, più strutture simili a ventricole emettono fluorescenza verde brillante localizzata su uno dei loro lati (Figura 2A). Ciò indica l'elevata precisione ed efficienza della procedura. Gli organoidi cerebrali elettroporati con successo delle quattro diverse specie di primati (cioè umano, scimpanzé, macaco rhesus e uistitì comune) mostrano modelli simili positivi alla GFP all'interno delle strutture simili a ventricoli mirate (Figura 2A). Inoltre, dopo la fissazione e la criosezione di organoidi cerebrali di primati elettroporati, le strutture ventricolari elettroporate con successo di tutte e quattro le specie mostrano colonne di cellule GFP-positive all'interno della zona ventricolare radialmente organizzata e densamente imballata (VZ) (Figura 2B). La quantificazione delle cellule DAPI-positive che erano anche GFP-positive in tali regioni degli organoidi cerebrali di scimpanzé e uistitì 2 giorni dopo l'elettroporazione (17 ventricoli da 12 organoidi quantificati) ha mostrato che, in media, circa un terzo delle cellule (33%, SD ± 12%) sono state elettroporate con successo.

Le elettroporazioni subottimali sono contrassegnate da un piccolo numero di cellule GFP-positive all'interno della struttura ventricolare (Figura 3A) o da alcune cellule GFP-positive distanti da qualsiasi struttura simile al ventricolo (Figura 3B). Un basso numero di cellule GFP-positive è causato da uno scarso assorbimento plasmidico. Ciò potrebbe essere dovuto a una bassa concentrazione di plasmidici causata da una quantità insufficiente di miscela di elettroporazione microiniettata o a impulsi elettrici che non sono ben diretti, che possono essere causati da un posizionamento non ottimale degli organoidi cerebrali nella camera dell'elettrodo della piastra di Petri. Un basso numero di cellule GFP-positive distanti da qualsiasi struttura simile a un ventricolo è causato dall'elettroporazione di cellule postmitotiche all'interno dell'organoide cerebrale (ad esempio, neuroni) a causa di una microiniezione imprecisa. Queste elettroporazioni subottimali devono essere escluse da qualsiasi ulteriore analisi.

L'identificazione affidabile dei tipi cellulari presenti negli organoidi cerebrali si basa, tra le altre cose, sulla posizione della cellula all'interno di una struttura simile a un ventricolo, che richiede una definizione di confine tra VZ e SVZ / zona arricchita di neuroni. Questo confine può essere identificato dall'organizzazione radiale e dalle caratteristiche di alta densità dei nuclei cellulari del VZ (vedere la colorazione DAPI nella Figura supplementare S1). La conferma del confine VZ/SVZ può essere effettuata mediante colorazione con immunofluorescenza per marcatori progenitori neurali come PAX6 o SOX2, che sono espressi praticamente da tutte le cellule VZ (AP) e da alcune cellule SVZ (BP). La presenza di una zona arricchita di neuroni può essere convalidata dalla colorazione con immunofluorescenza per marcatori neuronali come la β-tubulina di classe III (TUJ1) o NeuN (Figura supplementare S1).

La durata della coltura di organoidi cerebrali dopo l'elettroporazione dipende dalla questione biologica e dalle popolazioni cellulari di interesse. In uno studio recente, è stato dimostrato che diverse lunghezze di ulteriore coltura dopo l'elettroporazione influenzano diverse popolazioni cellulari negli organoidi cerebrali degli scimpanzé, che vanno dagli AP ai neuroni dello strato superiore24. Qui, mostriamo risultati simili per gli organoidi elettroporati. In particolare, 2 giorni dopo l'elettroporazione, le cellule GFP-positive sono localizzate quasi esclusivamente nel VZ e sono anche positive per PAX6 - un marker per le cellule progenitrici neurali - indicando che queste cellule sono AP o BP neonatali (Figura 4A). Se il periodo di coltura dopo l'elettroporazione viene esteso a 10 giorni, le cellule GFP-positive sono localizzate nelle regioni basali (cioè la SVZ e la zona arricchita di neuroni) (Figura 4B,C). Queste cellule possono (oltre al segnale GFP) anche essere positive per PAX6 (Figura 4B), che è indicativo di BP, o NeuN (Figura 4C), che è indicativo di neuroni. Risultati simili possono essere ottenuti per organoidi cerebrali elettroporati umani e macachi rhesus. In sintesi, diversi tipi di progenitori, così come i neuroni, possono essere presi di mira con successo da questa tecnica.

Quasi tutti i dati precedentemente mostrati sono stati derivati dall'immunocolorazione delle sezioni istologiche generate da organoidi cerebrali elettroporati. Tuttavia, un altro modo elegante per analizzare questi organoidi è quello di eseguire immunocolorazione a montaggio intero seguita da pulizia ottica35,36. Ciò consentirebbe la ricostruzione 3D degli organoidi cerebrali elettroporati per ottenere un'impressione della distribuzione 3D delle cellule GFP-positive. La Figura 5 e il Video 1 mostrano un esempio rappresentativo del segnale GFP in un organoide cerebrale elettropolato ottico.

In sintesi, il protocollo di elettroporazione qui descritto fornisce un modo preciso ed efficiente per introdurre modificazioni genetiche transitorie in diversi tipi di progenitori e neuroni di organoidi cerebrali derivati da diverse linee di iPSC dei primati.

Figura 1: Panoramica schematica della generazione di organoidi cerebrali dei primati e criteri morfologici "go" e "no-go" per l'elettroporazione. (A) Cronologia della generazione e dell'elettroporazione degli organoidi cerebrali dei primati che evidenzia i diversi tempi delle fasi del protocollo per l'uomo e lo scimpanzé (blu), il macaco rhesus (viola) e l'uistitì (magenta). Si noti che la cronologia della cronologia non è in scala. (B) Immagini in campo chiaro di un organoide cerebrale umano adatto (immagine a sinistra, Go) e non adatto (immagine a destra, No-go) a 32 dps. Le punte delle frecce indicano esempi di strutture simili a ventricole adatte per la microiniezione. Le immagini sono state acquisite utilizzando un microscopio a fluorescenza invertita Zeiss Axio Observer.Z1 con obiettivo 2,5x. Barre della scala = 500 μm. Abbreviazioni: BDNF = fattore neurotrofico derivato dal cervello; dps = giorni dopo la semina; NT3 = neurotrofina 3; RA = acido retinoico. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Esempi di organoidi cerebrali di primati elettroporati con successo . (A) Immagini in campo chiaro (colonna sinistra), fluorescenza (colonna centrale) e unione (colonna destra) di 22 dps umani, 32 dps di scimpanzé, 32 dps di macaco rhesus e 31 dps di organoidi cerebrali di uistitì (dall'alto verso il basso) 15-48 ore dopo l'elettroporazione con il plasmide che esprime GFP. Le punte delle frecce nere indicano esempi di singole strutture simili a ventricoli elettroporate. Le immagini sono state acquisite utilizzando un microscopio a fluorescenza invertita Zeiss Axio Observer.Z1 con obiettivo 2,5x. Barre della scala = 500 μm. (B) Immunofluorescenza per GFP (verde) combinata con colorazione DAPI (ciano) di 32 dps umani, 34 dps di scimpanzé, 32 dps di macaco rhesus e 32 dps di organoidi cerebrali uistitì (dall'alto verso il basso) 2-4 giorni dopo l'elettroporazione con il plasmide che esprime GFP. Le punte delle frecce grigio chiaro indicano i bordi delle regioni elettroporate all'interno delle strutture simili a ventricoli. Le immagini sono state acquisite utilizzando un microscopio confocale Zeiss LSM 800 con obiettivo 10x. Barre della scala = 150 μm. Abbreviazioni: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo; dps = giorni dopo la semina; GFP = proteina fluorescente verde. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Esempi di organoidi cerebrali di primati elettroporati senza successo. (A,B) Immunofluorescenza per GFP (verde) combinata con colorazione DAPI (ciano) di un organoide cerebrale di macaco rhesus (A) 34 dps 4 giorni dopo l'elettroporazione con il plasmide che esprime GFP e di (B) un organoide cerebrale di macaco rhesus di 32 dps 2 giorni dopo l'elettroporazione con il plasmide che esprime GFP. Le punte di freccia grigio chiaro indicano le cellule elettroporate. Il contorno tratteggiato grigio chiaro indica il confine tra la zona VZ e SVZ / arricchita di neuroni di una struttura simile a un ventricolo adiacente alle cellule elettroporate. Le immagini sono state acquisite utilizzando un microscopio confocale Zeiss LSM 800 con obiettivo 10x. Barre della scala = 150 μm. Abbreviazioni: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo; dps = giorni dopo la semina; GFP = proteina fluorescente verde; SVZ = zona subventricolare; VZ = zona ventricolare. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Visualizzazione delle varie popolazioni cellulari presenti negli organoidi cerebrali dei primati dopo l'elettroporazione. (A-C) Doppia immunofluorescenza per GFP (verde) e PAX6 (A,B; magenta) o NeuN (C; magenta), in tutti i casi combinata con colorazione DAPI (ciano), di un organoide cerebrale marmoset di 32 dps 2 giorni dopo l'elettroporazione con il plasmide che esprime GFP, e (B,C) di un organoide cerebrale uistitì di 40 dps 10 giorni dopo l'elettroporazione con il plasmide che esprime GFP. Le punte delle frecce grigio chiaro indicano (A,B) celle doppie positive GFP+ e PAX6+ o (C) NeuN+. Le linee tratteggiate grigio chiaro indicano il confine tra la zona VZ e SVZ / arricchita di neuroni. Le immagini sono state acquisite utilizzando un microscopio confocale Zeiss LSM 800 con un obiettivo 20x. Barre della scala = 100 μm. Abbreviazioni: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo; dps = giorni dopo la semina; GFP = proteina fluorescente verde; NeuN = proteina dei nuclei neuronali; PAX6 = proteina della scatola 6 accoppiata; SVZ = zona subventricolare; VZ = zona ventricolare. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 5: Ricostruzione tridimensionale di immagini elettroporate mediante imaging confocale 3D di organoidi cerebrali di primati elettroporati dopo la pulizia ottica. Viste frontali (immagine a sinistra), ruotate di 45° (immagine centrale) e ruotate di 90° (immagine a destra) di un organoide cerebrale umano ricostruito in 3D elettroporate a 32 dps 2 giorni dopo l'elettroporazione con il plasmide che esprime GFP. Prima dell'imaging, l'organoide è stato eliminato otticamente sulla base del metodo 2Eci35. Una ricostruzione 3D dell'intero organoide elettropolato è stata generata da 269 sezioni ottiche (spessore 1 μM ciascuna) distanti 3,73 μm l'una dall'altra utilizzando un microscopio confocale Zeiss LSM 800 con un obiettivo 10x. Le immagini sono state elaborate per la ricostruzione 3D utilizzando le Fiji. Si noti che le immagini sono state prese dallo stesso organoide ricostruito in 3D mostrato nel Video 1. Barra della scala = 500 μm. Abbreviazione: GFP = proteina fluorescente verde. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Video 1: Un organoide cerebrale umano elettropolato ricostruito in 3D dopo la pulizia ottica. Video di un organoide cerebrale umano elettropolato 3D da 32 dps 2 giorni dopo l'elettroporazione con il plasmide che esprime GFP. Prima dell'imaging, l'organoide è stato eliminato otticamente sulla base del metodo 2Eci35. Una ricostruzione 3D dell'intero organoide elettropolato è stata generata da 269 sezioni ottiche (spessore 1 μM ciascuna) distanti 3,73 μm l'una dall'altra utilizzando un microscopio confocale Zeiss LSM 800 con un obiettivo 10x. Le immagini sono state elaborate per la ricostruzione 3D utilizzando le Fiji. Si noti che il video è stato preso dallo stesso organoide ricostruito in 3D mostrato nella Figura 5. Clicca qui per scaricare questo video.

Tabella 1: Condizioni di coltura per le iPSC dei primati utilizzate in questa pubblicazione. Abbreviazione: iPSCs = cellule staminali pluripotenti indotte.

Tabella 2: Composizione dei mezzi utilizzati per la generazione e la coltura di organoidi cerebrali dei primati.

Tabella 3: Composizione della miscela di elettroporazione (approccio plasmidi separato) per il controllo e il gene di interesse. Abbreviazione: GOI = gene di interesse.

Tabella 4: Anticorpi usati per la colorazione con immunofluorescenza.

Figura supplementare S1: Determinazione del bordo VZ/SVZ negli organoidi cerebrali dei primati elettroporati. Doppia immunofluorescenza per PAX6 (magenta) e TUJ1 (giallo) combinata con colorazione DAPI (ciano) di un organoide cerebrale uistitì di 32 dps 2 giorni dopo l'elettroporazione con il plasmide che esprime GFP. L'immunofluorescenza per GFP non è mostrata. Le linee tratteggiate grigio chiaro indicano il confine tra la zona VZ e SVZ / arricchita di neuroni. Le immagini sono state acquisite utilizzando un microscopio confocale Zeiss LSM 800 con un obiettivo 20x. Barra di scala = 100 μm. Abbreviazioni: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo; dps = giorni dopo la semina; PAX6 = proteina della scatola 6 accoppiata; SVZ = zona subventricolare; TUJ1 = classe III β-tubulina; VZ = zona ventricolare. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 1: Istruzioni per l'assemblaggio della camera di elettroporazione a piastre di Petri. Clicca qui per scaricare questo file.

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.