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Articolo metodologico

Isolamento e identificazione delle cellule di nicchia limbari

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DOI:

10.3791/65618

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27 ottobre 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 2Institute of Medicine Nursing, Hubei University of Medicine, 3Department of Ophthalmology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per isolare e identificare le cellule di nicchia limbare umane.

Abstract

Di seguito riportiamo una procedura standard per l'isolamento e l'identificazione delle cellule di nicchia limbare (LNC). Il tessuto di libus ottenuto da una banca degli occhi è stato utilizzato per l'isolamento degli LNC. Il tessuto è stato diviso in 12 pezzi in condizioni asettiche e digerito per 18 ore a 37 °C nell'incubatore di colture cellulari utilizzando la collagenasi A per ottenere cluster cellulari con LNC e cellule progenitrici epiteliali limbari. I cluster di cellule sono stati ulteriormente digeriti per 15 minuti a 37 °C utilizzando tripsina-EDTA allo 0,25% per ottenere singole cellule e quindi coltivati in terreno di coltura con cellule staminali embrionali modificate (MESCM) su una superficie di plastica rivestita con Matrigel al 5%. Le cellule sono state fatte passare dopo una confluenza del 70% e le LNC sono state identificate utilizzando l'immunofluorescenza, la PCR quantitativa in tempo reale (qPCR) e la citometria a flusso. Gli LNC primari sono stati isolati e attraversati più di 12 volte. L'attività di proliferazione dei LNC da P4 a P6 è stata la più alta. Le LNC esprimevano marcatori di cellule staminali più elevati rispetto alle BMMSC (SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR e PDGFRβ). Inoltre, i risultati hanno mostrato che gli LNC P4 esprimevano uniformemente VIM, CD90, CD105 e PDGFRβ, ma non Pan-CK, che potrebbe essere utilizzato come marcatore per l'identificazione degli LNC. L'analisi citofluorimetrica ha mostrato che circa il 95%, 97%, 92% e 11% degli LNC esprimeva rispettivamente CD73, CD90, CD105 e SCF, mentre erano rispettivamente il 68%, il 99%, il 20% e il 3% nelle BMMSC. Il processo standard per l'isolamento e l'identificazione degli LNC potrebbe fornire una base di laboratorio affidabile per l'uso diffuso degli LNC.

Introduzione

L'incidenza del deficit di cellule staminali epiteliali corneali (CESD), chiamato anche deficit di cellule staminali limbari (LSCD)1, e la rigenerazione epiteliale corneale (CES) stanno diventando sempre più urgenti a causa di infezioni e lesioni corneali. Se non adeguatamente trattata, la CESD può portare alla cecità che richiede il trapianto di cornea. Di conseguenza, la rigenerazione del CES sta diventando sempre più significativa. Esiste un gruppo di cellule di supporto chiamate cellule di nicchia limbare (LNC) che forniscono un supporto essenziale per la funzione CES. Le cellule staminali stromali limbari sono state isolate per la prima volta da Polisetty et al.2 e identificate da Xie et al.3 come LNC che sono localizzate nell'epitelio limbare sottostante e nello stroma del limbus. Le LNC sono le principali cellule staminali di supporto del bordo corneale e, con la funzione delle MSC derivate dal midollo osseo (BMMSC), potrebbero essere indotte a svilupparsi in cellule epiteliali corneali e cellule stromali corneali, ecc.3,4,5,6,7. Studi precedenti hanno dimostrato che le qualità delle cellule staminali delle LNC sono più primitive rispetto alle BMMSC8, che sono già ampiamente utilizzate in clinica. Le LNC possono anche diventare la prossima opzione praticabile dopo la MSC, soprattutto per il trattamento della CESD. In quanto importanti cellule di supporto per la CES, le LNC sono anche cellule staminali derivate dalla struttura "di nicchia" del limbus. Le LNC possono svolgere un ruolo chiave nella dedifferenziazione delle cellule epiteliali corneali mature (MCEC) in CES9. Tuttavia, gli studi sugli LNC sono ancora relativamente insufficienti e non c'è consenso sulla terminologia, l'isolamento, la purificazione, l'identificazione e le caratteristiche degli LNC. Alcuni ricercatori hanno chiamato cellule staminali stromali derivate da biopsia limbareLNC 10, cellule staminali mesenchimalilimbari 11, cellule staminali dei fibroblasti limbari12 e cellule stromali mesenchimali limbari13. Poiché le caratteristiche di crescita delle LNC non sono state descritte in dettaglio e a causa delle loro promettenti applicazioni scientifiche e cliniche, e potrebbero essere uno degli strumenti clinici più importanti in futuro, è necessario riassumere l'isolamento, la purificazione, l'identificazione e le caratteristiche delle LNC.

Secondo un precedente studio14, le LNC sono presenti principalmente a livello dell'epitelio limbare sottostante e dello stroma del limbus. Questo protocollo include il trattamento del tessuto limbus utilizzando la collagenasi A, l'ottenimento di un cluster costituito da LEPC e LNC e la digestione in singole cellule con lo 0,25% di tripsina-EDTA (TE). Le LNC sono state quindi coltivate selettivamente in un terreno di cellule staminali embrionali modificate (MESCM) per essere purificate. Il protocollo riportato in questo documento è semplice e ha un'elevata efficienza nell'ottenere LNC umani in grandi quantità.

La procedura dettagliata di isolamento, coltura e identificazione dell'LNC è stata registrata nel video per gli scienziati interessati allo studio dell'LNC e può essere comodamente ripetuta quando necessario.

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Protocollo

Il tessuto Limbus proveniente da donatori di età compresa tra i 50 e i 60 anni è stato ottenuto dalla Banca degli Occhi della Croce Rossa, Tongji Hospital (Wuhan, Cina). Il protocollo è stato approvato dal Comitato Etico di Tongji ed è stato condotto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki.

1. Isolamento

  1. Ottenere il tessuto limbus dal mezzo di conservazione corneale a medio termine e operare in condizioni asettiche su un banco di lavoro ultra-pulito.
  2. Raschiare e rimuovere l'iride e l'endotelio intorno alla cornea utilizzando una lama rotonda chirurgica sterile.
  3. Tagliare il tessuto limbus in dodici pezzi di uguali dimensioni con una lama chirurgica con 1 mm di sinistra su entrambi i lati della cornea e della sclera.
  4. Trasferire i tessuti limbus su una piastra di coltura di 3,5 cm, aggiungere 1 ml di collagenasi A (2 mg/mL, in terreno DF-12), per immergere tutti i tessuti per la digestione.
  5. Mettere la piastra nell'incubatrice cellulare a 37 °C, digerire i tessuti limbari per 18 ore.
    NOTA: Le procedure di follow-up vengono solitamente eseguite il secondo giorno.
  6. Preparare una piastra di coltura a 6 pozzetti rivestita con matrice di membrana basale al 5% (Matrigel).
    1. Rivestire la matrice di membrana basale al 5% (disciolta in MESCM [Tabella 1]) sul fondo del pozzetto.
    2. Preparare puntali da 200 μL e 1 mL, una provetta centrifuga da 15 mL e una piastra da 6 pozzetti in una sacca sterilizzata.
    3. Mettere la sacca sterilizzata (compresi i puntali e la provetta centrifuga) e una nuova piastra a 6 pozzetti in un ambiente di -20 °C o -80 °C per 20 minuti. Scongelare la matrice della membrana basale in frigorifero a 4 °C.
    4. Estrarre i puntali preraffreddati, il tubo centrifugo e la piastra a 6 pozzetti dall'ambiente a -20 °C o -80 °C, quindi eseguire le seguenti operazioni sul banco di lavoro ultra-pulito.
    5. Trasferire 50 μL di matrice di membrana basale al 5% in 1 mL di MESCM utilizzando una punta da 200 μL e mescolarli delicatamente e in modo uniforme.
    6. Trasferire la matrice di membrana basale al 5% (disciolta in MESCM) in un pozzetto di una piastra di coltura a 6 pozzetti utilizzando la punta da 1 mL preraffreddata.
    7. Agitare delicatamente e orizzontalmente la piastra a 6 pozzetti, immergere la piastra di coltura a 6 pozzetti nell'incubatore cellulare a 37 °C per circa 1 ora, quindi eseguire il passaggio successivo.
  7. Dopo 18 ore di digestione, estrarre il tessuto limbare digerito dalla collagenasi A, rimarranno solo alcuni piccoli grappoli visibili e tessuti sclerali non digeriti.
    NOTA: La microscopia ad alto ingrandimento rivela un cluster composto da molte cellule densamente impacchettate (comprese le LNC).
  8. Utilizzare un puntale per pipette da 200 μL per staccare i cluster dai tessuti sclerali non digeriti sotto lo stereomicroscopio.
  9. Trasferire i grappoli sulla piastra di coltura da 3,5 cm e immergerli in TE allo 0,25%, quindi posizionare la piastra nell'incubatore cellulare per 15 minuti.
  10. Aggiungere 1 mL di MESCM con il 10% di siero knockout per arrestare la digestione cellulare e pipettare delicatamente su e giù per risospendere i cluster nelle singole cellule utilizzando un puntale per pipette da 1 mL.
  11. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta centrifuga da 15 mL e centrifugare a 200 x g per 5 min.
  12. Rimuovere il surnatante con cautela senza disturbare la precipitazione cellulare, quindi aggiungere 1 mL di MESCM per risospendere le cellule.
  13. Pipettare su e giù 2-3 volte fino a quando la precipitazione della cellula inferiore non è sospesa uniformemente nel MESCM utilizzando un puntale per pipette da 1 mL e prelevare una sospensione cellulare da 20 μL per il conteggio delle cellule.
  14. Trasferire la sospensione cellulare nella piastra a 6 pozzetti rivestita con matrice di membrana basale al 5% con un puntale per pipette da 1 mL e aumentare il volume di MESCM a 2,5 mL.
  15. Agitare delicatamente la piastra a 6 pozzetti orizzontalmente per distribuire uniformemente le cellule.
  16. Trasferire le cellule nell'incubatore di coltura dopo essere state sottoposte a imaging e registrate. Osservare e fotografare le cellule ogni giorno e cambiare il terreno ogni 3-4 giorni.

2. Identificazione dei LNC

  1. Colorazione a immunofluorescenza
    1. Digerire gli LNC dal fondo della piastra utilizzando 1 mL 0,25% TE per 5 minuti nell'incubatore cellulare a 37°C.
    2. Terminare la digestione aggiungendo 1 mL di MESCM (contenente siero knockout), centrifugare la sospensione cellulare a 200 x g per 5 minuti e aspirare con cura il surnatante.
    3. Aggiungere 1 mL di MESCM per risospendere le cellule in sospensione. Preparare una sospensione cellulare da 80 μL (4 × 103 cellule per vetrino) per 4 vetrini (20 μL/vetrino) e utilizzare il sistema di centrifuga per depositare le cellule sui vetrini del microscopio secondo le istruzioni del produttore.
    4. Fissare le cellule (incollate ai vetrini nel passaggio 3) utilizzando paraformaldeide al 4% per circa 10 minuti, quindi permeabilizzare le cellule sui vetrini con Triton X-100 allo 0,2% in PBS per 15 minuti.
    5. Bloccare le cellule per 1 ora con albumina sierica bovina al 2% (BSA) prima di incubarle con anticorpi primari (Pan-CK [1:1000], Vim [1:100], CD90 [1:100], CD105 [1:200], SCF [1:100], PDGFRβ [1:100]) su un agitatore per una notte a 4 °C. Dopo l'incubazione, rimuovere gli anticorpi primari non legati lavando (5 min/lavaggio, 3 volte) i vetrini con PBST (PBS + 0,1% Tween 20).
    6. Incubare gli anticorpi secondari corrispondenti (anticorpo IgG anti-topo asino TRITC [1:1000], anti-coniglio asino IgG FITC [1:500], asino anti-topo IgG 488 [1:300], asino anti-coniglio IgG 594 [1:400]) per 1 ora con anticorpi IgG non specifici adatti a loro. Rimuovere l'anticorpo secondario non legato utilizzando PBST (5 min/lavaggio, 3 volte).
    7. Controcolorare i nuclei con 5 μg/mL di DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindolo ) e sigillare i vetrini.
    8. Eseguire l'imaging a fluorescenza utilizzando un microscopio a fluorescenza (ingrandimento: 400x; Tempo di esposizione: 50 ms).
  2. Reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (qPCR)
    1. Prendi il kit di isolamento dell'RNA per estrarre l'RNA totale secondo le istruzioni del produttore.
    2. Utilizzare un kit di trascrizione del cDNA ad alta capacità per trascrivere inversamente 1-2 μg di RNA totale in cDNA.
    3. Eseguire la trascrizione inversa (42 °C, 2 min; 50 °C, 85 min) e la qPCR (95 °C, 5 min; 95 °C, 10 s, 40 cicli) in una soluzione di 20 μL contenente cDNA (100 ng), TaqMan Gene Expression Assay Mix (1 μL), Universal PCR Master Mix (10 μL) e ddH2O (fino a 20 μL).
    4. Utilizzare la tecnica TC comparativa (ΔΔCT)4,9 per esaminare l'espressione genica relativa.

3. Caratterizzazione dei LNC

  1. Conteggio delle cellule (emocitometro)
    1. Digerire gli LNC dal fondo della piastra utilizzando lo 0,25% di TE per 5 minuti nell'incubatore cellulare a 37 °C.
    2. Terminare la digestione aggiungendo 1 mL di MESCM (contenente siero knockout), centrifugare la sospensione cellulare a 200 x g per 5 minuti e aspirare con cura il surnatante.
    3. Aggiungere 1 mL di MESCM per risospendere le cellule, quindi prelevare 10 μL di sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 0,5 mL. Aggiungere un volume uguale di soluzione colorante blu Trypan allo 0,4%.
    4. Posizionare una sospensione cellulare colorata da 10 μL sull'area di conteggio dell'emocitometro e coprirla con un vetrino coprioggetti per il conteggio.
      NOTA: Il numero di celle nelle cinque aree del quadrato centrale è definito come "A"; il numero di celle in 1 mL è calcolato come 5A × 104 × 2.
  2. Esame dei marcatori LNC e BMMSC con citometria a flusso15
    1. Rilevare l'espressione di SCF, CD73, CD90 e CD105 nelle LNC e nelle BMMSC utilizzando la citometria a flusso 15 (2-4 ×10 6 eventi/campione, 2.000 cellule sono state ottenute da ciascuno dei campioni, per un totale di 550.000 cellule che sono state gateed contemporaneamente).
    2. Raccogliere e colorare le cellule a 20-30 °C per 15 minuti in un tampone bloccante (3% BSA e 0,05% Tween-20 in PBS) utilizzando anticorpi premarcati (SCF [1:50], CD70 [1:50], CD90 [1:50] e CD105 [1:50]) secondo le istruzioni del kit.
    3. Eseguire l'analisi FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorting) utilizzando un citometro a flusso. In questo studio sono stati utilizzati i software FACS Diva e FlowJo. Per ogni campione, registrare 10.000 eventi e controllare e analizzare le cellule vive.

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Risultati

Crescita di LNC
Le LNC sono state isolate con successo secondo il metodo di digestione della collagenasi A (2 mg/mL) di digestione del tessuto corneosclerale, come descritto sopra (Figura 1). Coerentemente con uno studioprecedente riportato 3, dopo la digestione della collagenasi A, sono stati visualizzati al microscopio cluster simili a bruchi (Figura 2). La proporzione di cellule fusiformi aumentava gradualmente con ...

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Discussione

La trasparenza corneale è tipicamente mantenuta dalla disposizione e dalla distribuzione regolare di piccole fibre (25-30 nm di diametro) nello stroma corneale, che è fondamentale per una normale acuità visiva16. Ci sono 253 milioni di persone ipovedenti in tutto il mondo, 36 milioni delle quali sono cieche17. L'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) considera la cecità corneale uno dei rischi più gravi per la vista umana, rappresentando il 5,1% di tutti i casi di cecit...

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Dichiarazioni

Nessuno degli autori dispone di informazioni finanziarie rilevanti.

Ringraziamenti

Grazie a Wei Wang, Lingjuan Xu e Rong Liu per la guida su questo lavoro, Yongyao Tan, Bihui Jin, Chunxiu You e Li Guigang per aver fornito parte del materiale, Guanyu Su per aver scritto il manoscritto, Xiao Zhou, Yihong Xiong e Huatao Xie per aver corretto il manoscritto e Guigang Li per la sua guida completa. Questo studio è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (n. 82070936, 81470606, 81570819), dal progetto di ricerca scientifica sulla salute e la pianificazione familiare della provincia di Hubei (n. WJ2017M073), I dieci migliori progetti di ricerca medica traslazionale dell'ospedale di Tongji (n. 2016ZHYX20), Progetto di formazione di giovani pionieri medici nella città di Wuhan (n. 2015whzqnyxggrc10), Programma di reclutamento di talenti globali (G2022154028L), Progetto della Commissione sanitaria nazionale della provincia di Hubei nel 2022 (WJ2021ZH0005) e Fondazione per la costruzione di soggetti del dipartimento finanziario dell'Hubei nel 2022 (42000022815T000000102)

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
4',6-Diamidino-2-FenilindoloThermoFisherD13065μ g/mL
Amfotericina BSigmaV9009191,25 μ g/mL
Anti-CD73Abcamab2021221:50
Albumina sierica bovinaMERCKA1933-CD105
Proteintech67075-1-Ig1:200
CD105Abcamab1140521:50
CD90Proteintech66766-1-Ig1:100
CD90Abcamab3077361:50
Incubatore cellulareShanghai LishenK1119K4644HF90 (HT)
Sistema di centrifugaStatSpin StatSpin CytoFuge12-Collagenase
ARoche101035780012 mg/mL
Microscopio confocaleZeissLSM700-Piastra
colturavirya350035635 mm
DME/F-12 1:1 (1x) cytivaSH30023.0190%
Anticorpo secondario anti-topo d'asino (H+L)ThermoFisherA160161:1000
Anticorpo secondario anti-coniglio d'asino (H+L)ThermoFisher315681:1000
FACS Diva sofwareBD BiosciencesCitometro
ad albero BD BiosciencesBecton Dickinson LSRII-
Microscopio a fluorescenzaolympuscx31 
GentamicinaSigmaG191450 μ Emocitometro g/mL
MERCKZ359629Bright-Line
Kit di trascrizione del cDNA ad alta capacitàThermoFisher4374966
Microscopio a contrasto di fase invertito  UOPDSZ2000X
ITS (insulina, transferrina, selenito di sodio)SigmaI31465 μ g/mL di insulina, 5 μ g/mL di transferrina, 5 ng/mL di selenito di sodio
Sostituzione del siero KnockOut SR per ESC/iPSCgibco10828-02810%
MatrigelBioCoat
356234-Pan-CKAbcamab77531:1000
ParaformaldeideNoninBioNBS01354,00%
ParaformaldeideMKBioMM-15054%
PDGFRβAbclonalA14441:100
Strumento di PCR quantitativa a fluorescenza in tempo realeApplied BiosystemsStep One
Plus-Recombinant Human FGF-basicPeprotech100-18B4 ng/mL
Recominant Human Leukemia Inhibitory Factor (Lif)Peprotech300-0510 ng/mL
RNeasy Mini RNA Isolation KitQiagen74104-
SCFBiossbs-0545R1:100
SCFAbcamab526031:50
StereomicroscopioZEISSSteREO Discovery. V8
Lama rotonda chirurgica sterileCareforde29500taglia 10
TaqMan Gene Expression Assay MixApplied Biosystems4448489
Triton X-100MERCKX1000,20%
Trypan blueThermoFisher152500610,40%
Tripsina-EDTAGenviewGP31080,25%
Tween 20MERCKP9416-Ultra
Clean BenchLaiTeLT20200705SW-CJ-IFDG
PCR Master MixApplied Biosystems4304437
Vim Abcamab925471:100
di a flusso stellare Universal

Riferimenti

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