Lesione da congelamento nel muscolo massetere del topo per stabilire un modello di fibrosi muscolare orofacciale

I muscoli orofacciali sono fondamentali nelle attività fisiologiche quotidiane come la masticazione, la parola, la respirazione e l'espressione facciale¹. Nelle deformità orofacciali congenite, tuttavia, questi muscoli mostrano alterazioni atrofiche e fibrotiche, che portano a una compromissione della salute corporea e della cognizione sociale². La chirurgia ricostruttiva facciale rimane il trattamento di prima linea, ma fino al 30-70% dei pazienti postoperatori soffre ancora di perdita muscolare e disfunzione muscolare ^3,4 Il fallimento della rigenerazione muscolare orofacciale è stato attribuito a fattori intrinseci, che non possono essere corretti dalla sola chirurgia.

L'emergere dei muscoli orofacciali è una novità evolutiva, che accompagna la complessa testa dei vertebrati e il cuore a camera ^5,6. A differenza delle loro controparti degli arti di derivazione somite, i muscoli orofacciali originano dall'arco branchiale⁷. Questi caratteri filogenetici e ontogenetici possono predisporli a comportamenti rigenerativi distinti⁸. È stato riportato che il muscolo massetere (MAS) ha sviluppato una grave fibrosi nel momento in cui il muscolo tibiale anteriore (TA) si è completamente rigenerato dopo l'esposizione nella stessa entità della lesione ^1,9. Tuttavia, il meccanismo alla base della rigenerazione rimane poco compreso.

In questo studio, è stato stabilito un modello di lesione da congelamento del muscolo massetere del topo per facilitare l'indagine sulla rigenerazione del muscolo orofacciale. Abbiamo scelto 14 giorni dopo l'infortunio come punto temporale per valutare il fenotipo della fibrosi poiché era il primo punto temporale in cui era rilevabile una divergenza distinguibile tra due muscoli. La rigenerazione completa della MAS dopo l'infortunio richiede almeno 40 settimane¹. Coerentemente, questo studio ha rivelato una notevole deposizione di collagene a seguito di lesione da congelamento di MAS rispetto alla regolare rigenerazione del TA a 14 giorni dopo l'infortunio. Con l'aiuto di questo modello, è possibile effettuare ulteriori studi meccanicistici sull'atrofia muscolare e sulla fibrosi, che a loro volta aiuteranno lo sviluppo di potenziali vie terapeutiche per promuovere la rigenerazione muscolare orofacciale dopo l'intervento chirurgico.

Tutte le procedure sugli animali in questo studio sono state esaminate e approvate dal Comitato Etico della West China School of Stomatology, Sichuan University (WCHSIRB-D-2020-114). I topi maschi C57BL/6 (5 settimane di età) sono stati allevati in una struttura a umidità controllata (53 ± 2%) e a temperatura controllata (23 ± 2 °C) e hanno seguito un ciclo luce/buio di 12 ore. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, reagenti e strumenti utilizzati in questo protocollo.

1. Lesione da congelamento

1. Anestesia: sedare i topi con batuffoli di cotone imbevuti di isoflurano e iniettare tiletamina-zolazepam per via intraperitoneale alla dose di 50 mg/kg. L'analgesia pre e post-operatoria è stata fornita mediante iniezione intraperitoneale di meloxicam alla dose di 1 mg/kg. Proteggi i loro occhi con un unguento veterinario. Durante l'intera procedura è stato posizionato un termoforo mantenuto a 38 °C sotto il telo chirurgico per fornire supporto termico all'animale. Fissare i topi con del nastro adesivo dopo averli appoggiati su un fianco su un tavolo chirurgico (Figura 1). Valutare la sufficienza dell'anestesia in base alla perdita del riflesso palpebrale, del riflesso raddrizzante e del riflesso di ritiro del pedale.
   NOTA: Quando si applica l'anestesia isofluorane, tenere il mouse in una mano e il batuffolo di cotone imbevuto di isofluorano nell'altra. Assicurati di tenere il batuffolo di cotone a distanza dall'animale per evitare disagio e irritazioni cutanee.
2. Depilazione preoperatoria: utilizzare un rasoio elettrico per radere i peli del polpaccio e del viso del topo e applicare la pasta depilatoria con un batuffolo di cotone sulla pelle, coprendo il muscolo massetere e il muscolo tibiale anteriore. Dopo 1-2 minuti, lavare via la pasta con una salvietta chirurgica a base di etanolo (Figura 2A e Figura 2G). I siti chirurgici sono stati disinfettati con tre cicli di scrub a base di iodio ed etanolo al 75%.
   NOTA: Il rasoio elettrico da solo non era sufficiente per la depilazione, soprattutto nella zona del massetere. Quando si applica la pasta depilatoria, è importante non utilizzare una pasta eccessiva. Strofinare delicatamente la pelle quando si lava via la pasta per evitare ustioni cutanee.
3. Esposizione al campo chirurgico: coprire con teli chirurgici prima della procedura chirurgica. Per il muscolo MAS, palpare prima lungo il bordo inferiore della mandibola. A 5 mm dal bordo, praticare un'incisione di 7 mm lungo la linea che collega la commessura orale al trago (la linea tratteggiata indica la posizione dell'incisione nella Figura 2B).
4. Per il muscolo TA, palpare prima lungo il polpaccio per individuare il bordo anteriore dell'osso della tibia. Tagliare 2 mm posteriormente al bordo attraverso la pelle con un bisturi, partendo dal ginocchio e terminando alla caviglia (la linea tratteggiata indica la posizione dell'incisione nella Figura 2H). Per ogni topo, se il MAS e il muscolo TA sul lato sinistro sono feriti, utilizzare l'altro muscolo sul lato controlaterale come controllo.
   NOTA: Questo taglio è molto superficiale per garantire che i muscoli non vengano feriti durante l'incisione. L'incisione sul viso non deve essere troppo vicina al trago. In caso contrario, la ghiandola parotide sarà esposta, portando a un sanguinamento eccessivo durante il successivo processo di congelamento.
5. Congelamento del ghiaccio secco: Tenere un pezzo di ghiaccio secco con una pinza preraffreddata lungo gli assi lunghi dei muscoli MAS e TA (Figura 2C e Figura 2I, rispettivamente). Posizionare il ghiaccio secco direttamente sulla superficie del muscolo per 5 s. Confermare che il muscolo appaia rigido e bianco pallido subito dopo aver rimosso il ghiaccio secco (Figura 2D e Figura 2J) ma che ritorni al suo colore e consistenza normali entro 22-25 s, in modo simile al muscolo adiacente illeso (Figura 2E e Figura 2K).
   NOTA: Le pinze che trattengono il ghiaccio secco devono essere preraffreddate per evitare una rapida sublimazione del ghiaccio secco. Un timer è obbligatorio per condurre la lesione da congelamento di 5 s e contare il tempo di recupero di 22-25 s del muscolo. Qualsiasi muscolo con tempo di recupero inferiore a 22 s o superiore a 25 s deve essere abbandonato. Questo passaggio richiede pratica.
6. Chiusura della ferita: dopo il recupero totale del muscolo, chiudere la ferita cutanea con almeno tre punti di sutura 7-0 (Figura 2F e Figura 2L).
7. Rianimazione: Quando la sutura è completa, posizionare i topi nella gabbia con supporto termico e monitorarli continuamente fino a quando tutti i riflessi di raddrizzamento non sono stati recuperati.

2. Raccolta muscolare

1. Eutanasia dei topi con un sovradosaggio di isoflurano, seguito da lussazione cervicale. Prelevare i muscoli MAS e TA su entrambi i lati per l'analisi istologica.
2. Dissezione muscolare MAS: Tagliare la pelle sul viso del topo e rimuovere la ghiandola parotide per esporre la parte posteriore del muscolo MAS. Sezionare la MAS dal suo attacco anteriore fino al suo attacco posteriore sulla mandibola. L'area tratteggiata bianca indica la parte esposta della MAS (Figura 3A).
   NOTA: Il muscolo MAS è composto da compartimenti profondi e superficiali, entrambi strettamente attaccati alla superficie della mandibola. Assicurarsi di premere le forbici sulla mandibola durante la dissezione per garantire il completo isolamento della MAS. Attenzione a distinguere lo zigomatico-mandibolare dalla MAS per i suoi confini tra lo zigomatico e la mandibola.
3. Dissezione muscolare TA: Tagliare la pelle dalla caviglia al ginocchio e rimuovere la fascia per esporre il muscolo TA. Usa la punta della pinza per microdissezione per isolare il tendine dell'AT e fallo scorrere fino al ginocchio per rompere le fibre che si attaccano alla tibia. Quindi, tagliare il tendine della caviglia (Figura 3B).
   NOTA: Per il muscolo TA, ci sono alcuni tendini muscolari attorno alla caviglia del topo; ci vorrebbe pratica per discernere il tendine di TA, che è il più grande e il più vicino alla tibia.
4. Preraffreddamento isopentano: Preparare due barili isolanti; Riempi la botte piccola con isopentano e la botte grande con azoto liquido. Posizionare il fusto piccolo all'interno del fusto grande 10 minuti prima della dissezione muscolare (Figura 3D).
5. Preparazione dello stampo per l'incorporamento: creare uno stampo cilindrico di carta stagnola per ogni campione e riempirlo con un composto per la temperatura di taglio ottimale (OCT).
6. Fresco congelato: immergere il muscolo nell'OCT, tenendolo perpendicolare al composto OCT (Figura 3C). Utilizzare un portaaghi per trasferire lo stampo nell'isopentano preraffreddato. Attendere 40 s affinché l'OCT diventi bianco e solido (Figura 3D).
   NOTA: Assicurarsi che la posizione dello stampo non sia troppo bassa. In caso contrario, l'isopentano si mescolerà con l'OCT e comprometterà il processo di congelamento muscolare. Il livello di OCT nello stampo dovrebbe essere paragonabile all'altezza del campione muscolare. Evitare una quantità eccessiva di OCT per garantire un congelamento rapido ed efficiente.
7. Conservazione dei campioni: Conservare i campioni di muscolo freschi congelati in piastre a 24 pozzetti chiaramente etichettate. Sezionare immediatamente i campioni o conservarli a -80 °C per un uso a lungo termine.

3. Analisi istologica

1. Utilizzare un criostato per tagliare sezioni spesse 10 μm dal campione muscolare su vetrini trattati in superficie.
2. Immergere i vetrini nell'acetone ghiacciato per 20 minuti e asciugarli all'aria nella cappa aspirante per 20 minuti.
3. Lavare i vetrini per 3 x 5 minuti con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
   NOTA: Da questo passaggio in poi, i vetrini sono stati conservati in una camera di umidità per evitare che si asciugassero.
4. Colorazione rosso Sirius
   1. Preparare la soluzione di lavoro Sirius Red sciogliendo 0,5 g di polvere Sirius Red in 500 mL di acido picrico saturo.
   2. Colorare i vetrini con la soluzione di lavoro Sirius Red per 1 ora a temperatura ambiente.
   3. Lavare i vetrini per 2 x 5 minuti con acido acetico allo 0,5%.
   4. Dopo il processo di colorazione, i campioni devono essere disidratati prima in etanolo al 95% per 15 s, seguiti da disidratazione in etanolo anidro per 1 minuto. Il passaggio finale prevede il montaggio del vetrino con balsamo neutro.
5. Colorazione immunoistologica
   1. Permeabilizzare le sezioni con Triton 0,3% in PBS per 20 minuti a temperatura ambiente, seguito da un lavaggio PBS.
   2. Per la colorazione con Pax7, bloccare le sezioni con il reagente fornito con il kit di riferimento; per la colorazione con laminina e Pdgfrα, bloccare con il 5% di albumina sierica bovina (BSA) e il 5% di siero d'asino in PBS per 1 ora a temperatura ambiente.
   3. Incubare le sezioni con anticorpi primari contro Pax7, laminina e Pdgfrα per una notte a 4 °C, quindi lavare con PBS per 3 x 5 minuti.
   4. Incubare le sezioni con anticorpi secondari coniugati con colorante fluorescente per 1 ora a temperatura ambiente, quindi lavare con PBS per 3 x 5 minuti.
   5. Incubare con 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per 3 min a temperatura ambiente, quindi lavare con PBS per 3 x 5 min.
   6. Posizionare il mezzo di montaggio sulla sezione, posizionare il vetrino coprioggetti sopra e utilizzare lo smalto per unghie per sigillare il vetrino coprioggetti.

La colorazione HE e Sirius Red (Figura 4 e Figura S1 supplementare) ha rivelato la completa rigenerazione muscolare dell'AT in questo modello di lesione da congelamento. Al contrario, la MAS mostrava un'alterata rigenerazione delle miofibre e un'eccessiva deposizione di matrice extracellulare. L'istologia dei muscoli MAS e TA intatti è mostrata nella Figura 4A, B, dove le miofibre sono allineate e l'area fibrotica è apparsa solo nello spazio interstiziale e tra diversi fasci. Mentre il muscolo TA è rimasto in gran parte la stessa struttura muscolare del suo controllo intatto a 14 giorni dall'infortunio (Figura 4G-J), la struttura del muscolo MAS era gravemente disturbata (Figura 4C-F). Le aree fibrotiche sono apparse al posto di quasi tutte le fibre muscolari nelle sezioni trasversali anteriore, media e posteriore del muscolo MAS (Figura 4C-F).

La colorazione immunoistologica di Pax7 (Figura supplementare S2) e Pdgfrα ha facilitato ulteriori indagini rispettivamente sulle cellule satelliti muscolari (MuSC) e sui progenitori fibro-adipogenici (FAP). Nel muscolo MAS, a 14 dpi, apparivano nuclei densamente popolati ma senza MuSC proporzionalmente aumentati (Figura 5A, B). Un gran numero di miofibre nucleate centralmente (mostrate dalla punta della freccia blu) sono state rilevate in TA a 14 dpi (Figura 5H), mentre il contorno delle miofibre era appena percettibile in MAS nell'area lesa (Figura 5E, F). Invece, è stata osservata l'infiltrazione di FAP Pdgfrα-positivi e miofibre di piccolo diametro di nuova formazione (indicate da frecce bianche) (Figura 5F).

Figura 1: Una panoramica del sistema chirurgico. (A) Il topo è stato anestetizzato e fissato sul tavolo operatorio. I peli sono stati rimossi dal viso e dalla gamba sul lato sinistro. Un timer è stato utilizzato per monitorare il congelamento muscolare e il tempo di recupero. (B) Il ghiaccio secco, con un diametro di 3,5 mm e un'altezza di 6-12 mm, è stato preparato in un becher di vetro per il congelamento. Le pinze sono state preraffreddate in ghiaccio secco per un uso successivo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: La registrazione intraoperatoria della lesione da congelamento MAS e TA. (A) Depilazione per congelamento MAS. (B) Aprire la pelle per esporre il muscolo MAS. (C) Congelamento con ghiaccio secco lungo l'asse lungo della MAS. (D) La comparsa di MAS immediatamente dopo 5 secondi di congelamento. (E) La comparsa di MAS dopo 22-25 s di recupero. (F) Chiusura della ferita facciale. (G) Depilazione per il congelamento TA. (H) Aprire la pelle per esporre il muscolo TA. (I) Congelamento con ghiaccio secco lungo l'asse lungo dell'AT. (J) La comparsa di TA subito dopo 5 s di congelamento. (K) La comparsa di TA dopo 22-25 secondi di recupero. (L) Chiusura della ferita della gamba. Abbreviazioni: MAS = massetere; TA = tibiale anteriore. Le linee tratteggiate nelle figure 2B e 2H indicano la posizione delle incisioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Raccolta del muscolo MAS e TA. (A) La comparsa del muscolo MAS a 14 giorni dopo la lesione da congelamento. L'ovale tratteggiato rosso indica MAS; il triangolo tratteggiato bianco mostra l'esposizione del muscolo MAS. (B) La comparsa del muscolo TA a 14 giorni dopo la lesione da congelamento. L'ovale tratteggiato rosso indica TA. (C) Immergere il campione di muscolo nel composto OCT in modo perpendicolare. (D) Trasferire il campione muscolare in isopentano raffreddato con azoto. Abbreviazioni: MAS = massetere; TA = tibiale anteriore; OCT = temperatura di taglio ottimale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Analisi istologica dei muscoli MAS e TA. Colorazione rosso Sirio della sezione muscolare intatta (A-E) della MAS e delle sezioni anteriore, media e posteriore della MAS a 14 dpi. (F-J) Sezione muscolare intatta di TA e sezione anteriore, media e posteriore di TA a 14 dpi. Barra di scala = 100 μm. Abbreviazioni: MAS = massetere; TA = tibiale anteriore; dpi = giorni dopo l'infortunio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Analisi in immunofluorescenza dei muscoli MAS e TA. Immunocolorazione di Pax7 e DAPI (blu) in (A) MAS intatta, (B) MAS a 14 dpi, (C) TA intatta e (D) TA a 14 dpi. Immunocolorazione di laminina, Pax7 e DAPI (blu) in (E) MAS intatta, (F) MAS a 14 dpi, (G) TA intatta e (H) TA a 14 dpi. Barra della scala = 20 μm. Abbreviazioni: MAS = massetere; TA = tibiale anteriore; dpi = giorni dopo l'infortunio; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo. Le frecce bianche indicano la fibra rappresentativa di piccolo diametro della MAS. L'area tratteggiata blu e le frecce indicano le miofibre rigeneranti rappresentative e i nuclei centrali dell'AT. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare S1: Fibrosi persistente durante la rigenerazione muscolare. (A) Illustrazione schematica della rigenerazione muscolare TA e MAS indotta da lesione da congelamento. (B-G) Immagini rappresentative della colorazione con ematossilina ed eosina nelle sezioni trasversali dei muscoli TA e MAS in diversi momenti dopo l'infortunio. Barre di scala = 100 μm. Questa figura è riprodotta da Cheng et al.8. Abbreviazioni: MAS = massetere; TA = tibiale anteriore; dpi = giorni dopo l'infortunio. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S2: Compromissione del processo di miogenesi. (A) Immagini in immunofluorescenza di Pax7 (verde) e DAPI (blu) nel muscolo TA e MAS. (B) Quantificazione della percentuale di nuclei Pax7 positivi/DAPI. Barra della scala = 100 μm * Indica una differenza significativa rispetto al controllo muscolare intatto. # Indica una differenza significativa rispetto all'altro muscolo nello stesso momento. **P < 0,01, ##p < 0,01. Questa figura è riprodotta da Cheng et al.8. Abbreviazioni: MAS = massetere; TA = tibiale anteriore; dpi = giorni dopo l'infortunio; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo. Clicca qui per scaricare questo file.

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.