Colorazione immunoistochimica multiplex per tessuto di carcinoma polmonare incluso in paraffina

L'amplificazione del segnale della tiramina (TSA), che ha una storia di oltre 20 anni, è una classe di tecniche di analisi che utilizzano la perossidasi di rafano (HRP) per la marcatura in situ ad alta densità di antigeni bersaglio ed è ampiamente applicata nei saggi di immunoassorbimento enzimatico (ELISA), nell'ibridazione in situ (ISH), nell'immunoistochimica (IHC) e in altre tecniche per la rilevazione di antigeni biologici. migliorare in modo sostanziale la sensibilità del segnale rilevato¹. La colorazione policromatica opalina basata sulla tecnologia TSA è stata recentemente sviluppata e ampiamente utilizzata in diversi studi 2,3,4,5. La colorazione tradizionale a immunofluorescenza (IF) fornisce ai ricercatori uno strumento semplice per il rilevamento e il confronto della distribuzione delle proteine nelle cellule e nei tessuti di vari organismi modello. Si basa sul legame anticorpo-antigene-specifico e comprende approcci diretti e indiretti⁶. L'immunocolorazione diretta prevede l'uso di un anticorpo primario coniugato con fluorofori contro l'antigene di interesse, che consente la rilevazione diretta della fluorescenza utilizzando un microscopio a fluorescenza. L'approccio di immunocolorazione indiretta prevede l'applicazione di un anticorpo secondario coniugato con fluorofori contro l'anticorpo primario non coniugato ^6,7.

I metodi tradizionali di colorazione a immunofluorescenza a etichetta singola possono colorare solo uno, due o, in alcuni casi, tre antigeni nei tessuti, il che rappresenta una delle principali limitazioni nell'estrazione delle ricche informazioni contenute nelle sezioni di tessuto. L'interpretazione dei risultati quantitativi dipende spesso dall'osservazione visiva e dalla quantificazione accurata da parte di software di imaging, come ImageJ. Esistono limitazioni tecniche, come la restrizione delle specie di anticorpi, i segnali deboli dell'etichetta fluorescente e la sovrapposizione dei colori dei coloranti fluorescenti (Tabella 1). La tecnica Opal multiplex IHC (mIHC) si basa sulla derivazione TSA, che consente la colorazione multiplex e la marcatura differenziale di più di 7-9 antigeni sulla stessa sezione di tessuto, senza restrizioni sull'origine dell'anticorpo primario, ma richiede un'elevata specificità dell'anticorpo corrispondente contro l'antigene. La procedura di colorazione è simile a quella della normale colorazione a immunofluorescenza, ad eccezione di due differenze: ogni ciclo di colorazione prevede l'uso di un solo anticorpo e viene aggiunta una fase di eluizione dell'anticorpo. Gli anticorpi legati all'antigene da legami non covalenti possono essere rimossi mediante eluizione a microonde, ma il segnale fluorescente TSA legato alla superficie dell'antigene da legami covalenti viene mantenuto.

Le molecole di tiramina (T) attivate marcate con il colorante sono altamente arricchite a livello dell'antigene bersaglio, consentendo un'efficiente amplificazione del segnale fluorescente. Ciò consente la marcatura diretta dell'antigene senza interferenze anticorpali e quindi la marcatura multicolore può essere ottenuta dopo più cicli di colorazione ^8,9,10 (Figura 1). Sebbene questa tecnologia produca immagini affidabili e accurate per lo studio della malattia, la creazione di un'utile strategia di colorazione con immunoistochimica fluorescente multiplex (mfIHC) può richiedere molto tempo e impegnatività a causa della necessità di un'ampia ottimizzazione e progettazione. Pertanto, questo protocollo del pannello multiplex è stato ottimizzato in un coloratore IHC automatizzato con un tempo di colorazione più breve rispetto a quello del protocollo manuale. Questo approccio può essere applicato e adattato direttamente da qualsiasi ricercatore per studi di immuno-oncologia su campioni di tessuto umano fissati in formalina e inclusi in paraffina (FFPE)¹¹. Inoltre, i metodi per la preparazione dei vetrini, l'ottimizzazione degli anticorpi e la progettazione multiplex saranno utili per ottenere immagini robuste che rappresentino accurate interazioni cellulari in situ e per abbreviare il periodo di ottimizzazione per l'analisi manuale¹².

L'mfIHC comprende principalmente l'acquisizione di immagini e l'analisi dei dati. In termini di acquisizione di immagini, i campioni colorati con complessi marcati multicolore devono essere rilevati con apparecchiature di imaging spettrale professionali per identificare i vari segnali di colore misti e ottenere immagini ad alto rapporto segnale-rumore senza interferenze dovute all'autofluorescenza dei tessuti. Le attuali apparecchiature per l'imaging spettrale comprendono principalmente microscopi confocali spettrali e sistemi di imaging tissutale multispettrale. Il sistema di imaging tissutale multispettrale è un sistema di imaging professionale progettato per l'analisi quantitativa di sezioni di tessuto e la sua caratteristica più importante è l'acquisizione di informazioni spettrali di immagine, che forniscono sia informazioni sulla struttura morfologica che sulla mappatura ottica di campioni di tessuto biologico^13,14. Ogni pixel nell'immagine spettrale contiene una curva spettrale completa e ogni colorante (compresa l'autofluorescenza) ha il suo spettro caratteristico corrispondente, che consente la registrazione completa e l'identificazione accurata di segnali multietichetta misti e sovrapposti.

In termini di analisi dei dati, i campioni marcati multicolore sono estremamente complessi a causa della struttura morfologica e delle cellule costituenti i campioni di tessuto. Il software ordinario non è in grado di identificare automaticamente i diversi tipi di tessuto. Pertanto, il software intelligente di analisi quantitativa dei tessuti viene utilizzato per l'analisi quantitativa dell'espressione dell'antigene in regioni specifiche 15,16,17,18.

Soprattutto, la colorazione a immunofluorescenza multimarca fusa con l'imaging multispettrale e la tecnologia di analisi patologica quantitativa presenta i vantaggi di un gran numero di bersagli di rilevamento, di una colorazione efficace e di un'analisi accurata, e può quindi migliorare significativamente l'accuratezza dell'analisi istomorfologica, rivelare la relazione spaziale tra le proteine con risoluzione a livello cellulare e aiutare a estrarre informazioni più ricche e affidabili da campioni di sezioni di tessuto¹⁹ (Tabella 1).

Il protocollo è approvato dalle linee guida del Comitato Etico del West China Hospital, Sichuan University, Cina. I campioni di tessuto del cancro al polmone sono stati ottenuti durante l'intervento chirurgico nel Centro per il cancro al polmone presso l'ospedale della Cina occidentale ed è stato ottenuto il consenso informato da ciascun paziente.

1. Preparazione della sezione tissutale

1. Preparazione FFPE
   1. Immergere i tessuti clinici in una soluzione di formalina neutra per più di 72 ore.
   2. Completare il processo di disidratazione dei tessuti utilizzando xilene e soluzioni alcoliche classificate²⁰.
   3. Eseguire l'inclusione manuale della paraffina e il sezionamento dei tessuti con uno spessore della sezione di 4 μm. Utilizzare vetrini per microscopio di adesione per assicurarsi che le fette di tessuto non cadano.
   4. Cuocere i vetrini in forno a 65 °C per 2 ore per assicurarsi che il tessuto e i vetrini siano asciutti. Conservare in una scatola per vetrini a temperatura ambiente.
2. Pretrattamento della sezione tissutale
   1. Pretrattare i vetrini di tessuto in forno a 65 °C per 5 minuti, quindi immergerli in sequenza in soluzioni di xilene per 2 x 15 minuti, soluzioni di etanolo anidro per 2 x 15 minuti, soluzione di etanolo al 90% per 10 minuti, soluzione di etanolo all'85% per 10 minuti, soluzione di etanolo all'80% per 10 minuti e soluzione di etanolo al 75% per 10 minuti, Segue il lavaggio dei vetrini con acqua sterilizzata per 3 x 1 min.
      NOTA: Questa tecnica sperimentale può essere utilizzata solo per il tessuto FFPE, non per il tessuto congelato o fresco, poiché il processo di riparazione multipla dell'antigene ad alta temperatura provoca la caduta del tessuto dal vetrino.

2. Ottimizzazione dell'anticorpo primario

NOTA: Gli esperimenti IHC convenzionali sono stati utilizzati per determinare le condizioni di incubazione per i singoli anticorpi, includendo principalmente la concentrazione di anticorpi e le condizioni di riparazione dell'antigene. Fare riferimento alle condizioni nel manuale di istruzioni dell'anticorpo.

1. Utilizzare una concentrazione di anticorpi leggermente superiore all'intervallo di concentrazione raccomandato e ai valori intermedi.
2. Ottimizza le routine del tampone di recupero dell'antigene PH6 e PH9 in base alla posizione di espressione della proteina. Utilizzare PH9 per le proteine espresse nel nucleo e utilizzare una delle due proteine di routine (PH6 o PH9) per le altre proteine.

3. Metodo di colorazione mIHC

NOTA: La colorazione mIHC opale è uno dei metodi mIHC disponibili. In questo protocollo sperimentale a 5 colori, poiché ogni campione di tessuto deve essere colorato con quattro anticorpi, sono necessarie quattro incubazioni di anticorpi primari, incubazioni di anticorpi secondari e incubazioni cromogeniche di amplificazione del segnale TSA, nonché cinque ripristini di antigeni. Infine, vengono eseguite la colorazione con 4'6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) e la sigillatura dell'agente di scoppio antifluorescente.

1. Preparazione del reagente principale
   NOTA: Determinare la quantità di reagente da aggiungere in base alle dimensioni dei vetrini di tessuto. Utilizzare un volume sufficiente a coprire completamente la sezione del tessuto (generalmente, 50-150 μL per vetrino). Le soluzioni di lavoro necessarie per l'esperimento sono preparate come segue:
   1. Soluzione di lavoro tampone di lavaggio: diluire 20 volte tampone di lavaggio a 1:20 con acqua bidistillata e conservare a temperatura ambiente.
   2. Soluzione tampone PH6: Diluire 100x tampone PH6 a 1:100 con acqua bidistillata. Preparare prima dell'uso e conservare a temperatura ambiente.
   3. Soluzione tampone PH9: Diluire 50x tampone PH9 a 1:50 con acqua bidistillata. Preparare prima dell'uso e conservare a temperatura ambiente.
   4. Polimero HRP: Preparare questa soluzione pronta all'uso solo per gli anticorpi primari di origine di coniglio e topo.
   5. Soluzione di lavoro al fluoroforo: ricostituire ogni polvere di fluoroforo (tranne il fluoroforo 780) in 75 μL di DMSO. Prima di ogni procedura, diluire il fluoroforo in 1x diluente di amplificazione a 1:100. Scartare la parte non utilizzata della soluzione di lavoro al fluoroforo.
   6. Soluzione di lavoro Fluorophore 780: Ricostituire TSA-DIG in 75 μL di DMSO e la polvere di fluoroforo 780 in 300 μL di acqua bidistillata. Prima della procedura, diluire TSA-DIG in 1x diluente di amplificazione a 1:100 e diluire il fluoroforo 780 con il diluente Ab a 1:25.
   7. Soluzione di lavoro DAPI: Diluire la soluzione DAPI a 1:50 con acqua bidistillata o PBS. Preparare prima dell'uso e conservare a 4 °C per non più di 48 ore.
      NOTA. Lavare i vetrini solo con acqua bidistillata e soluzione di lavoro tampone di lavaggio appena preparata durante questo esperimento di colorazione a fluorescenza multietichetta. Le sezioni di tessuto non devono entrare in contatto con l'acqua del rubinetto; I contaminanti nell'acqua del rubinetto possono aderire alle sezioni di tessuto e causare l'autofluorescenza. Tenere i campioni lontani dalla luce per tutta la durata dell'esperimento.
2. Recupero dell'antigene
   1. Mettere i vetrini in una scatola per colorare e riparare e riempirla con soluzione tampone PH6 o PH9, coprire con il coperchio e riscaldare in forno a microonde per 2 x 8 minuti al 100% della potenza.
      NOTA: Aggiungere acqua bidistillata alla scatola di riparazione durante il processo di riscaldamento per evitare un'eccessiva evaporazione che può causare l'essiccazione delle fette.
   2. Lasciare raffreddare i vetrini a temperatura ambiente prima di procedere (30-60 min).
   3. Lavare i vetrini 3 x 2 minuti con acqua bidistillata. Utilizzare una penna barriera idrofobica per circondare la sezione di tessuto sul vetrino.
3. Inceppamento
   1. Immergere le sezioni di tessuto nel tampone di lavaggio, coprire con una soluzione bloccante e incubare i vetrini in una camera umidificata a temperatura ambiente per 10 minuti.
4. Incubazione di anticorpi primari
   1. Rimuovere la soluzione bloccante dai vetrini e coprire le sezioni di tessuto con la soluzione di lavoro dell'anticorpo primario. Incubare i vetrini in camera umidificata per 1 ora a 37 °C nell'incubatrice o per una notte a 4 °C in frigorifero.
      NOTA: Non lasciare che i vetrini si asciughino.
5. Introduzione del polimero HRP
   1. Lavare i vetrini in una soluzione tampone di lavaggio per 3 x 2 minuti. Aggiungere Polymer HRP direttamente goccia a goccia sulle sezioni di tessuto e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
      NOTA: Per i vetrini conservati in frigorifero, tenerli a temperatura ambiente per circa 30 minuti prima del lavaggio per rimuovere l'anticorpo primario.
6. Generazione di amplificazione del segnale della tiramina (TSA)
   1. Lavare il vetrino con una soluzione tampone di lavaggio per 3 x 2 minuti, aggiungere la soluzione di lavoro al fluoroforo direttamente goccia a goccia sulle sezioni di tessuto e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Lavare il vetrino con una soluzione tampone di lavaggio per 3 x 2 min.
7. Procedura speciale per fluoroforo 780
   NOTA: Il fluoroforo 780 è debole ed è regolarmente posizionato all'ultimo posto nello schema di corrispondenza dei colori dell'intero esperimento. Il fluoroforo 780 non è normalmente utilizzato in questo protocollo sperimentale, ma a causa della sua specificità, sono elencate le sue fasi sperimentali.
   1. Introduzione di TSA-DIG
      1. Lavare il vetrino con una soluzione tampone di lavaggio per 3 x 2 minuti, aggiungere la soluzione di lavoro TSA-Drg goccia a goccia sulle sezioni di tessuto e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
   2. Trattamento a microonde
      1. Lavare i vetrini con una soluzione tampone di lavaggio per 3 x 2 min.
      2. Metti i vetrini in una scatola per colorare e riparare, riempila con la soluzione di riparazione, copri con il coperchio e riscalda in un forno a microonde per 2 x 8 minuti al 100% della potenza. Lasciare raffreddare i vetrini a temperatura ambiente prima di procedere (30-60 min).
      3. Lavare i vetrini per 3 x 2 minuti con acqua bidistillata.
   3. Generazione del segnale Fluorophore 780
      1. Immergere le sezioni in tampone di lavaggio, coprire con soluzione di lavoro fluorophore 780 e incubare i vetrini in una camera umidificata per 1 ora a temperatura ambiente.
      2. Lavare i vetrini con una soluzione tampone di lavaggio per 3 x 2 min.
         NOTA: NON eseguire il trattamento a microonde dopo questo passaggio.
   4. Utilizzare il fluoroforo 780 come ultima fase dell'intero flusso di lavoro e quindi colorare i nuclei direttamente con la soluzione di lavoro DAPI.
      NOTA: Saltare il passaggio 3.7 se non si utilizza fluorophore 780.
8. Trattamento a microonde
   NOTA: Questo passaggio a microonde rimuove il complesso HRP primario-secondario e riespone gli antigeni, consentendo l'introduzione dell'anticorpo primario successivo.
   1. Mettere i vetrini in una scatola per colorare e riparare, riempirla con la soluzione tampone PH6 o PH9, coprire con il coperchio e riscaldare in un forno a microonde per 2 x 8 minuti al 100% della potenza.
   2. Lasciare raffreddare i vetrini a temperatura ambiente prima di procedere (30-60 min). Lavare i vetrini 3 x 1 min con acqua bidistillata.
   3. Immergere i vetrini nella soluzione di lavoro tampone di lavaggio per 2 min. Eseguire la successiva incubazione degli anticorpi.
9. Successiva incubazione degli anticorpi
   1. Ripetere i passaggi 3.2-3.8 (tranne il passaggio 3.7).
10. Colorazione nucleare cellulare e sigillatura tissutale
    1. Coprire le sezioni di tessuto con la soluzione di lavoro DAPI e incubare i vetrini in una camera umidificata per 5 minuti a temperatura ambiente. Lavare i vetrini per 3 x 2 minuti con acqua bidistillata.
    2. Rimuovere le gocce d'acqua dai vetrini, aggiungere 10-20 μL di quencher antifluorescenza a ciascun vetrino e sigillare i vetrini con un vetro di copertura per microscopio.
    3. Conservare i vetrini finiti a 4 °C, al riparo dalla luce, per più di 1 mese.
       NOTA: Fare attenzione ad evitare bolle d'aria.

4. Impostare il controllo negativo

1. Elaborare i vetrini di controllo negativo come i vetrini contenenti tessuto, ma senza l'aggiunta di reagenti come anticorpi primari, anticorpi secondari, reagenti TSA e DAPI, che vengono utilizzati per rimuovere l'autofluorescenza tissutale durante la scansione della pellicola.

5. Scansione completamente automatica di vetrini di tessuto

NOTA: L'apparecchiatura utilizzata per l'imaging spettrale è un analizzatore di quantificazione tissutale multispettrale completamente automatizzato e la visualizzazione dell'imaging e dell'analisi di vetrini a 5 colori può essere eseguita utilizzando il sistema di riferimento (vedere la tabella dei materiali). Il sistema utilizza l'imaging multispettrale per la miscelazione quantitativa di più fluorofori e l'autofluorescenza tissutale.

1. Impostare manualmente il tempo di esposizione e il programma di scansione per ciascun canale di fluorescenza e verificare che lo strumento abbia completato l'esposizione e la scansione completamente automatiche dei vetrini di tessuto.
   NOTA: La superficie del vetrino deve essere pulita e priva di pellicole d'acqua. Attenzione alla quantità di sigillante: una quantità eccessiva farà scivolare il vetrino coprioggetto e lo strumento riporterà un errore.

6. Analisi della fluorescenza

1. Fare doppio clic sul software (vedere la Tabella dei materiali), trascinare il file di immagine a fluorescenza multicolore ottenuto dalla scansione originale nel software e impostare il tipo di immagine su fluorescenza.
2. Fare clic sul pulsante Luminosità e contrasto e controllare i canali sul pannello. Fare clic all'esterno e quindi sul canale per selezionare il canale di fluorescenza di interesse. Trascinare il display Min e il display Max per regolare la luminosità e il contrasto di ciascun canale.
3. Dopo l'analisi, determinare la vista da salvare, fare clic su Mostra panoramica diapositiva e Mostra posizione cursore per rimuovere questi due contenuti, mantenere la barra della scala e fare clic su File | Esporta snapshot | Contenuto del visualizzatore corrente per esportare un file png.
   NOTA: Ogni canale di fluorescenza e una figura unita devono essere esportati per analisi future.
4. Per un'ulteriore analisi della positività delle cellule bersaglio, utilizzare il software di identificazione e segmentazione delle cellule²¹ (vedere la tabella dei materiali).

Abbiamo ottimizzato lo schema di corrispondenza dell'anticorpo primario CD8 e dei fluorofori. Entrambi i set di risultati di fluorescenza corrispondevano esattamente alle stesse condizioni di incubazione dell'anticorpo nel gruppo sperimentale, ad eccezione del cambiamento nel fluoroforo abbinato all'anticorpo. Come mostrato nella Figura 2, c'era una differenza significativa nella corrispondenza dei canali delle cellule T CD8+ con il fluoroforo 480 e il fluoroforo 690. Il canale con il fluoroforo 690 mostra uno sfondo fluorescente estremamente forte: l'ampia area di fluorescenza irregolare rossa all'interno del cerchio giallo mostra il colore, che causa una grande interferenza nell'analisi di localizzazione delle cellule T CD8+ (Figura 2C,D). Tuttavia, il canale con fluoroforo 480 mostra una positività molto specifica della membrana cellulare CD8 e nessun fondo fluorescente. Pertanto, i cerchi gialli mostrano una membrana cellulare positiva molto chiara (Figura 2A), che illustra pienamente l'importanza della corrispondenza degli anticorpi e dei canali di fluorescenza in questo protocollo.

È stata esaminata la distribuzione dei macrofagi e delle cellule T citotossiche nei tessuti di carcinoma squamoso polmonare non a piccole cellule ed è stata verificata l'espressione della proteina caratteristica HMGCS1 nelle cellule tumorali e nelle cellule immunitarie. Come mostrato nella Figura 3, le immagini sono state derivate da QuPath 0.3.2. Il pannello mIHC era costituito dai fluorofori 480, 520, 620, 690 e DAPI, e i corrispondenti marcatori anticorpali erano CK5/6, un marcatore per le cellule di carcinoma squamoso polmonare; CD8, un marcatore per le cellule T; CD68, un marcatore per i macrofagi; e HMGCS1, che è specifico per le cellule tumorali plasma-positive. I macrofagi e le cellule T CD8+ hanno mostrato una forte infiltrazione e sono stati distribuiti intorno e all'interno dei focolai di carcinoma squamoso, mentre HMGCS1 è stato ampiamente espresso nel plasma delle cellule di carcinoma squamoso, mostrando una forte positività delle cellule tumorali.

Figura 1: Il flusso di lavoro della colorazione immunoistochimica multiplex per il tessuto FFPE. Abbreviazione: FFPE = formalina-fissata e paraffin-embedded. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Ottimizzazione dei protocolli di corrispondenza per CD8 e fluorofori. C'è stata una differenza significativa nella corrispondenza dei canali delle cellule T CD8+ con fluoroforo 480 e fluoroforo 690. Barre di scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Colorazione immunoistochimica multiplex nel carcinoma squamoso polmonare. La distribuzione dei macrofagi e delle cellule T citotossiche nei tessuti di carcinoma squamoso polmonare non a piccole cellule e l'espressione della proteina caratteristica HMGCS1 nelle cellule tumorali e nelle cellule immunitarie. CK5/6 è un marcatore per le cellule di carcinoma squamoso polmonare; CD8 è un marcatore per le cellule T; CD68 è un marcatore per i macrofagi; e HMGCS1 è specifico per le cellule plasma-positive delle cellule tumorali. Barre di scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Confronto tra la tecnologia di immunofluorescenza multi-marcatura Opal e la tecnologia di immunofluorescenza tradizionale.

Tutti gli autori dichiarano che non sussistono conflitti di interesse.