Articolo metodologico

Tecnica real-time ad alto rendimento per quantificare la formazione di trappole extracellulari di neutrofili nei neutrofili umani

DOI:

10.3791/66051

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1 dicembre 2023

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1Systemic Autoimmunity Branch, National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (NIAMS), National Institutes of Health (NIH)

In questo articolo

Sommario

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Presentiamo un metodo automatizzato ad alto rendimento per quantificare le trappole extracellulari dei neutrofili (NET) utilizzando il sistema di analisi delle cellule vive, accoppiato con un approccio a doppio colorante dipendente dalla permeabilità della membrana.

Abstract

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I neutrofili sono cellule di linea mieloide che costituiscono una parte cruciale del sistema immunitario innato. L'ultimo decennio ha rivelato ulteriori ruoli chiave che i neutrofili svolgono nella patogenesi del cancro, delle malattie autoimmuni e di varie condizioni infiammatorie acute e croniche, contribuendo all'inizio e alla perpetuazione della disregolazione immunitaria attraverso molteplici meccanismi, tra cui la formazione di trappole extracellulari per neutrofili (NET), che sono strutture cruciali nella difesa antimicrobica. I limiti delle tecniche per quantificare la formazione di NET in modo imparziale, riproducibile ed efficiente hanno limitato la nostra capacità di comprendere ulteriormente il ruolo dei neutrofili nella salute e nelle malattie. Descriviamo un metodo automatizzato, in tempo reale e ad alto rendimento per quantificare i neutrofili sottoposti a formazione di NET utilizzando una piattaforma di imaging di cellule vive accoppiata con un approccio a doppio colorante dipendente dalla permeabilità della membrana che utilizza due diversi coloranti di DNA per visualizzare il DNA intracellulare ed extracellulare. Questa metodologia è in grado di aiutare a valutare la fisiologia dei neutrofili e testare molecole in grado di colpire la formazione di NET.

Introduzione

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Le trappole extracellulari dei neutrofili (NET) sono strutture di cromatina simili a ragnatele estruse dai neutrofili in risposta a vari stimoli infiammatori. I NET sono composti da DNA, istoni e varie proteine/peptidi antimicrobici, che intrappolano e uccidono gli agenti patogeni infettivi e invocano risposte infiammatorie1.

Sebbene i NET siano utili per la difesa dell'ospite contro gli agenti patogeni, hanno attirato l'attenzione come potenziale motore di varie malattie autoimmuni2, trombosi3, malattie metaboliche4 e crescita metastatica dei tu....

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Protocollo

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I neutrofili da soggetti umani sani sono stati ottenuti dopo che il consenso informato è stato fornito secondo il protocollo approvato dall'Institutional Review Board (IRB) del National Institutes of Health (NIH). Il protocollo segue le linee guida del comitato etico per la ricerca umana del NIH.

1. Colorazione dei neutrofili e preparazione della piastra di analisi

  1. Prelevare il sangue periferico con un adeguato consenso informato scritto seguendo le linee guida di ciascun istituto e isolare i neutrofili utilizzando qualsiasi metodo desiderato. Ad esempio, il metododi Ficoll-destrano 10....

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Risultati

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Questo metodo fornisce immagini a contrasto di fase, fluorescenti rosse (colorante permeabile alla membrana) e fluorescenti verdi (colorante impermeabile alla membrana) scattate in ogni punto temporale. Insieme al processo di formazione del NET, si osservano cambiamenti morfologici nelle immagini a contrasto di fase e fluorescenti rosse e, una volta violata la membrana, si può osservare la fluorescenza verde (Figura 1). In questo saggio, i neutrofili che formano NET sono generalmente rotondi.......

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Discussione

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Gli attuali metodi per quantificare i NET ex vivo presentano diversi inconvenienti che limitano la nostra capacità di studiare neutrofili, NET e potenziali bersagli terapeutici in modo imparziale e ad alto rendimento10,14. Ad esempio, il conteggio diretto delle cellule che formano NET dopo la colorazione immunofluorescente, considerato il gold standard per la quantificazione dei NET, è a basso rendimento e dipende dalla visione soggettiva dell'operatore........

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

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Ringraziamo la Sezione di Imaging Luminoso dell'Ufficio di Scienza e Tecnologia dell'Istituto Nazionale di Artrite e Malattie Muscoloscheletriche e della Pelle del National Institutes of Health. Questa ricerca è stata supportata dal Programma di Ricerca Intramurale del National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases del National Institutes of Health (ZIA AR041199).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Inibitore AKTCalbiochem124028
Piastra trasparente a 96 pozzettiCorning3596
Sistema di analisi di cellule viveSartoriusN/AIncucyte Software (v2019B)
Colorante verde DNA impermeabile alla membrana Thermo Fisher ScientificS7020
Colorante rosso nucleareEnzoENZ-52406Il pellet di neutrofili diventa bluastro dopo la colorazione.
RPMIThermo Fisher Scientific11835030Rosso fenolo contenente RPMI può essere utilizzato.

Riferimenti

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  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  2. Wigerblad, G., Kaplan, M. J. Neutrophil extracellular traps in systemic autoimmune and autoinflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 23 (5), 274-288....

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Formazione di NETquantificazione ad alta produttivitimaging di cellule vivedoppi coloranti per DNApermeabilit di membranaimaging a contrasto di fasescreening di farmacianalisi automatizzata

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