Summary
我们提出了一种自动化的高通量方法，利用活细胞分析系统与膜通透性依赖性双染料方法相结合，对中性粒细胞胞外陷阱 （NET） 进行定量。
Abstract
中性粒细胞是髓系细胞，是先天免疫系统的重要组成部分。过去十年揭示了中性粒细胞在癌症、自身免疫性疾病和各种急性和慢性炎症性疾病的发病机制中发挥的额外关键作用，通过多种机制促进免疫失调的启动和持续，包括中性粒细胞胞外陷阱 （NET） 的形成，这是抗菌防御的关键结构。以无偏倚、可重复和有效的方式量化 NET 形成的技术的局限性限制了我们进一步了解中性粒细胞在健康和疾病中的作用的能力。我们描述了一种自动化、实时、高通量的方法，该方法使用活细胞成像平台与膜通透性依赖性双染料方法相结合，使用两种不同的 DNA 染料对细胞内和细胞外 DNA 进行成像。该方法能够帮助评估中性粒细胞生理学并测试可以靶向 NET 形成的分子。
Introduction
中性粒细胞胞外陷阱 （NET） 是响应各种炎症刺激而从中性粒细胞挤出的网状染色质结构。神经内分泌瘤由 DNA、组蛋白和各种抗菌蛋白/肽组成，可捕获和杀死传染性病原体并引发炎症反应1。
虽然神经内分泌瘤有利于宿主防御病原体，但它们作为各种自身免疫性疾病2、血栓形成3、代谢疾病4 和癌症转移性生长5 的潜在驱动因素而受到关注。因此，抑制神经内分泌瘤的形成是这些疾病的潜在治疗选择。然而，尽管一些有前途的 NET 靶向分子正在开发中 6，但仍然没有批准的疗法专门影响这种机制。这至少部分归因于缺乏客观、无偏倚、可重现和高通量的 NET 形成定量方法。
我们建立并报道了一种利用双色活细胞成像平台的新方法7,8。通过软件分析膜渗透性核染料和膜渗透性DNA染料染色的中性粒细胞的延时图像，并在多个时间点计算NET形成前和形成后中性粒细胞的数量。由于在 NET 形成过程中，由于 PKCα 介导的 Lamin B 和 CDK4/6 介导的 Lamin A/C 分解的调节会失去质膜的完整性9，因此形成 NET 的中性粒细胞被膜不可渗透的 DNA 染料染色，而健康的中性粒细胞则不会。该方法克服了先前报道的定量 NET 形成技术的问题，并以自动化方式提供无偏、高通量、可重现和准确的 NET 定量。
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Protocol
根据美国国立卫生研究院 （NIH） 机构审查委员会 （IRB） 批准的方案提供知情同意后，获得来自健康人类受试者的中性粒细胞。该协议遵循 NIH 人类研究伦理委员会的指导方针。
1.中性粒细胞的染色和测定板的制备
- 按照每个研究所的指南在适当的书面知情同意书下采集外周血，并使用任何所需的方法分离中性粒细胞。例如，Ficoll-葡聚糖方法10,11是从人外周血中分离中性粒细胞的常用方法。
注意：尽管此处讨论的方法使用人类中性粒细胞，但也可以使用类似的方案分析小鼠中性粒细胞。 - 在罗斯威尔公园纪念研究所（RPMI;见 材料表）1640培养基中以2.0×10 6 中性粒细胞/ mL重悬中性粒细胞，并将中性粒细胞悬浮液放入1.5mL离心管中。
注意：我们通常不向培养基中添加胎牛血清 （FBS），因为 FBS 中的白蛋白可以减少 NET的形成 12 ，而 FBS 中的热稳定核酸酶可以降解 NET13。 - 每 1.5 mL 中性粒细胞悬浮液添加 1 μL 的膜渗透性红色 DNA 染料（参见 材料表）。
- 在室温下在黑暗中孵育5分钟。在室温下以2500× g 离心5分钟并除去上清液。
- 将中性粒细胞重悬于1mL RPMI中，然后在室温下以2500× g 离心5分钟并除去上清液。重复 2 次（总共洗涤 3 次）。
- 将中性粒细胞重悬于 1 mL RPMI 中并使用细胞计数器计数。将中性粒细胞悬浮液稀释至 1.5 x 105 中性粒细胞/mL。
- 每 1 mL 中性粒细胞悬浮液加入 4 μL 1：100 预稀释的膜不渗透绿色 DNA 染料（参见 材料表）。
- 将每孔 100 μL 中性粒细胞悬浮液放入经透明组织培养处理的 96 孔板中（参见 材料表）。将每个条件一式三份设置。
注意：我们之前已经表明7 ，如果将中性粒细胞放置在有或没有聚-L-赖氨酸涂层的平板中，则该方法在NET形成和定量方面没有差异。因此，使用组织培养处理的平板对于这种方法就足够了。 - 加入 100 μL 含有刺激试剂的 RPMI，含或不含抑制剂，或在各自孔中加入任何其他目标试剂。通过加入500nM佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）或2.5μM钙离子载体（A23187），始终使用阳性对照孔，此处使用30μM AKT抑制剂。
- 将板放入装在5%CO2培养箱中的活细胞分析系统（参见材料表）中。
注意： 在此步骤几分钟后，板的顶部和底部可能会出现冷凝水。这可能会妨碍正常成像。在扫描开始之前彻底擦拭并清除冷凝水。将印版放入机器中，启动软件，输入扫描协议，然后在第一次扫描前擦拭印版。
2. 扫描板可视化 NET 形成的中性粒细胞
- 启动软件（有关软件详细信息 ，请参阅材料表 ）。按左上角的 + 启动 Add Vessel 。
- 选择 Scan on Schedule （按计划扫描）。 选择 New。
注意：创建后，通过选择 “复制上一个 ”并在下一个屏幕上选择存储的协议来运行相同的扫描协议。 - 选择 “标准”。将扫描设置设置为：逐个单元格选项：无;图像通道：相位、绿色（采集时间：200 ms）、红色（采集时间：400 ms）;目标：20 倍。
- 从列表中选择正在使用的板。选择将孔板放置在活细胞成像系统托盘上的容器位置。
- 选择存在样品的孔，并决定每个孔要拍摄多少张图像。根据每孔的图像数量，生成板的估计扫描持续时间。通常，每孔 4 张图像就足够了;但是，这可能因扫描的条件和频率而异。
- 通过单击 “创建板图 ”输入每个孔的信息（例如，细胞类型和化合物），以提供研究的名称。
注意：可以使用软件中的板图编辑器提前准备和保存板图。在此步骤中，可以导入保存的板图数据。如果需要，可以跳过输入板图信息，稍后再执行。也可以在不输入板布局信息的情况下获得数据。但是，建议输入板信息，以便于后续分析。 - 在下一个屏幕上，选择 “基本分析器 ”作为分析类型，然后从下拉列表中选择 “分析协议 ”，该列表显示以前使用的分析定义（而不是扫描协议）。绿色和红色的光谱解混可以保持在0.0%。
注意：如果需要，可以跳过此步骤。 - 计划扫描。对于这里的实验，每15-20分钟扫描一次，持续8小时。通过拖动屏幕顶部的白色和灰色条来设置扫描的开始时间。
注意： 避免扫描过于频繁，否则机器可能因过热而无法正常工作。扫描时间不应超过每 24 小时 12 小时。如果扫描过于频繁，您可能会看到警报。 - 检查下一个屏幕上的扫描设置，然后按 添加到计划 开始扫描。等到扫描初始图像集以确认一切是否正常。
- 有时细胞可能没有正确聚焦。在这种情况下，请检查是否存在冷凝水（并相应地擦拭）、盘子是否正确设置在托盘上或盘子的位置是否正确指定等。如果细胞仍然漂浮并且尚未沉降到井底，请等待约 5 分钟后再进行扫描。
3. 设置分析定义以量化 NET
- 在“视图”选项卡上打开要分析的研究（容器）。按屏幕左侧的 启动分析 。选择 Create New Analysis Definition（创建新的分析定义）。
- 如果之前已执行过分析，则通过选择 “复制现有分析定义”（Copy Existing Analysis Definition） 来使用相同的分析定义，但稍作改动。在这种情况下，请转到步骤 3.3。如果在不进行任何更改的情况下使用分析，请选择 使用现有分析定义;不建议这样做，因为不同日期的检测之间的荧光水平可能会有所不同，并且通常需要进行一些小的校正。
- 选择 “基本分析器”。使用所有图像通道：相位、绿色、红色和重叠。
注意：虽然我们通常使用绿色和红色物体掩码来计算 NET，但当碎片很重要时，重叠物体掩码很有用。在这种情况下，重叠对象计数的数量将用作分子，而不是绿色对象计数（参见步骤 3.9）。如果使用重叠对象计数而不是绿色对象计数，则必须正确计数所有红色信号。调整红色信号的设置，以计算以后时间点拍摄的图像中所有红色信号低的红色物体，但不计算碎片。 - 选择 6 - 8 张代表性示例图像进行训练。对于此处的实验，请包含以下图像：
在 0 到 20 分钟之间拍摄的图像，以优化绿色信号设置，以补偿可能在非 NET 形成的中性粒细胞中产生的细微绿色信号
在 3-6 小时之间拍摄的最大 NET 图像（时间因使用的刺激而异）以优化绿色信号设置以定义 NET 形成的中性粒细胞
在 1 小时时间点附近拍摄的图像以计算总细胞数（用红色染料染色），因为核红信号在 1 小时时间点附近最强（当所有细胞都沉降到孔底时），并且由于细胞死亡而逐渐减少。
包含碎片的图像，以将其排除在计数之外。 - 设置分析定义。红色物体和绿色物体分别对应于所有中性粒细胞的细胞核和正在形成NET的细胞核。从以下示例开始，按 “预览当前 ”或 “全部预览”，然后调制每个参数以优化结果：
对于绿色：分割 - 背景减法：礼帽;半径：100μM;阈值：0.3 GCU;边缘分割：开;边缘灵敏度：-20;清理 - 孔填充：100 μm2;调整大小 0 像素;过滤器 - 面积：最小 20 μm2，最大 500 μm2;偏心率：最大0.97;平均强度：最小值 1.00
对于红色：分割 - 背景减法：礼帽;半径：10μM;阈值：1.0 GCU;边缘分割：ON;边缘灵敏度：-50;清理孔填充：50 μm2;调整大小 0 像素;过滤器-面积：最小 20 μm2，最大 400 μm2;平均强度：最小 1.5。- 如果不应形成神经内分泌瘤的中性粒细胞中出现过多的绿色信号（例如，0 分钟时未受刺激的中性粒细胞具有分叶细胞核），则可能是由于在绿色通道中检测到的红色信号溢出。在这种情况下，请返回步骤 3.1，打开屏幕左侧的图像 图层 ，然后使用 光谱解混从绿色通道中删除红色信号。
- 另一种选择是设置一个孔，用核红染料进行单次染色，以明确应从绿色通道中去除多少红色信号。另一方面，通常绿色信号渗入红色通道不会影响分析。
注意：如果对红色信号的灵敏度低，并且并非所有红色信号都捕获到在以后的时间点（例如，6 小时时间点）拍摄的图像中，这并不重要。每个图像中的最大红色物体计数数被视为图像中中性粒细胞的总数，并将在步骤 3.9 中用作分母。通常，核红信号在1小时时间点左右达到峰值，并由于细胞死亡而逐渐减弱（图1B）。因此，调整红色信号的设置，以正确计算具有最大红色信号的图像中的红色物体。
- 选择要分析的扫描时间和孔。通常，应分析所有时间点和孔。为分析定义提供标签。
- 检查摘要并启动分析。完成分析需要几个小时（持续时间取决于时间点和井的数量）。启动后，分析定义的名称将显示在“视图”选项卡中的研究名称下，完成后将显示完整日期。
- 完成后，通过双击分析定义的名称打开分析的算例。打开屏幕左侧的 图层 ，检查每个单元格是否正确标记。如果标记不正确，请返回步骤 3.1 并重复后续步骤。
- 单击屏幕左侧的 Graph Metrics 以导出数据。选择“绿色计数”、“红色计数”或“重叠计数（每张图像）”，然后选择要导出的时间点和孔。对于选择分组，如果扫描完成时所有孔都正确指定，请选择“板图重复”。
- 导出数据。使用适当的软件通过以下公式计算每个条件/时间点的 NET 形成细胞的百分比。
注意：分母是最大红色物体计数的原因是红色物体的数量在1小时左右的时间点达到峰值，并且由于细胞死亡而逐渐减少。
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Representative Results
该方法提供在每个时间点拍摄的相差、红色荧光（透膜染料）和绿色荧光（膜不渗透染料）图像。随着NET形成过程，在相差和红色荧光图像中观察到形态变化，一旦膜被破坏，就可以观察到绿色荧光（图1）。在该测定中，形成NET的中性粒细胞通常是圆形的，而不是形成网状结构。这是因为机器的分辨率不够高，无法捕获细小的网状结构和膜不透水的绿色染料，一旦膜被破坏，染色质就会释放出来。我们之前已经表明7 可以通过在孵育 4 小时后检索的 96 孔板中使用共聚焦成像来可视化 NET。
当正确设置分析定义时，图像中的所有中性粒细胞都被标记为红色物体，形成NET的中性粒细胞被标记为绿色物体（图2）。机器计算每个时间点的红色和绿色物体的数量。通过绘制每个时间点形成NET的中性粒细胞的百分比来可视化NET形成的时间过程（图3）。靶向NET形成的潜在分子（例如，AKT抑制剂）可以使用这种方法以高通量方式进行测试。
图1：经历NET形成的中性粒细胞的形态变化。 （A）用2.5μM钙离子载体刺激3小时的人外周血中性粒细胞。 （B）相差图像、红色通道（膜渗透性核染料）、绿色通道（膜渗透性DNA染料）和合并图像的代表性单细胞视图。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：显示中性粒细胞和神经内分泌瘤的软件识别的代表性图像。 用2.5μM钙离子载体刺激来自人类健康志愿者的中性粒细胞1小时。显示相差成像和每个信号或模板的叠加图像。细胞核用（A）膜渗透性红色染料染色，软件识别并计数（B）细胞核标记为蓝色，而NETs用（C）膜不渗透绿色染料染色，软件将其标记为（D）紫色。如果发生 （E） 过度感应或 （F） 感应不足，则可能需要更改参数。 请点击这里查看此图的较大版本.
图3：NET形成中性粒细胞百分比的时间过程。 25 nM 佛波醇 12-肉豆蔻酸酯 13-乙酸酯 （PMA） 或 2.5 μM 钙离子载体刺激中性粒细胞以诱导 NET 或在 RPMI 中未刺激。加入30μM AKT抑制剂以阻断NET的形成。该软件每 20 分钟获取一次图像，持续 6 小时。NET形成细胞的百分比是通过将绿色物体计数（=NET形成细胞的数量）除以红色物体计数（=所有中性粒细胞的数量）来计算的。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
目前离体量化NETs的方法有几个缺点，限制了我们以无偏倚和高通量的方式研究中性粒细胞、NETs和潜在治疗靶点的能力10,14。例如，免疫荧光染色后直接计数 NET 形成细胞，被认为是定量 NET 的金标准，但通量低，取决于操作者的主观观点。检测膜不可渗透DNA染料荧光的平板测定法以客观和高通量的方式定量细胞外DNA作为NET的替代标记物，但由于该方法无法获得形态学信息，因此其他类型的细胞死亡释放的DNA可能被错误地视为NET。另一方面，该方法提供了NETs的高通量和客观定量7。鉴于可以获得有关中性粒细胞形态变化及其时间过程的信息，可以准确地将 NET 与其他类型的细胞死亡区分开来。最近的论文表明，神经内分泌瘤在各种疾病中的致病作用2,3,4,5，抑制神经内分泌瘤目前被认为是一个潜在的有希望的治疗靶点6。该方法将有利于以快速和公正的方式探索多种NET靶向分子。
成功量化有几个关键点。膜渗透性DNA结合染料的选择是正确成像的一个非常重要的因素。有些染料具有细胞毒性，而其他染料需要时间才能渗透到细胞核中。由于NET的形成相对较快，因此染料必须迅速渗透到细胞核中。考虑到这些因素，我们选择了一种核红染料（见 材料表）。每个孔中的细胞数量对于准确计数也很重要。如果太拥挤，每个中性粒细胞的绿色和红色信号会相互重叠，这使得很难单独计算每个中性粒细胞。
此方法存在一些限制。虽然该测定的测定内变异性非常好，但测定间的变异性尚不清楚。这是因为中性粒细胞，即使从同一供体中分离出来，所有条件都保持一致，在不同的日子里也会有不同的作用，并且在另一天进行的检测之间可能存在一些差异。因此，如果需要合并不同日期的数据，则有必要仔细设计测定方法：例如，每天包括来自疾病组和对照组的相同数量的样本。此外，尽管一旦定义了分析定义（步骤3），NET形成的评估是客观的，但定义本身的设置在某种程度上取决于每个操作员的主观观点。步骤 3.3 和 3.4 是排除主观判断并尽可能减少检测间变异性的关键步骤。此外，每次都必须包括阳性对照（例如，由 500 nM PMA 或 2.5 μM 钙离子载体刺激的中性粒细胞），以设置适当的临界值来计数所有 NET。
另一方面，必须注意的是，其他类型的细胞死亡可以算作神经内分泌瘤。当细胞膜被破坏，或DNA被释放到细胞外空间时，将观察到绿色信号。当细胞发生坏死性细胞死亡或凋亡细胞发生继发性坏死时，它们的 DNA 将被绿色染料7 染色。为了防止不准确地包括这些类型的细胞死亡，必须考虑时间过程和形态变化。虽然凋亡细胞通常需要 8 小时以上才能进行继发性坏死，但 NET 形成在刺激后 3-6 小时之间达到峰值15。通过相差成像可以看到明显的形态变化，这有利于细胞死亡类型的分化7。
总体而言，该方法使我们能够以高通量和客观的方式准确定量 NET。
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Disclosures
作者之间没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
我们感谢美国国立卫生研究院国家关节炎、肌肉骨骼和皮肤病研究所科学技术办公室的光成像科。这项研究得到了美国国立卫生研究院国家关节炎、肌肉骨骼和皮肤病研究所（ZIA AR041199）的校内研究计划的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AKT inhibitor | Calbiochem | 124028 | |
| Clear 96-well plate | Corning | 3596 | |
| Live cell analysis system | Sartorius | N/A | Incucyte Software (v2019B) |
| Membrane-impermeable DNA green dye | Thermo Fisher Scientific | S7020 | |
| Nuclear red dye | Enzo | ENZ-52406 | Neutrophil pellet becomes bluish after staining. |
| RPMI | Thermo Fisher Scientific | 11835030 | Phenol red containig RPMI can be used. |
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