AQRNA-seq per la quantificazione di piccoli RNA

Il sequenziamento di nuova generazione (NGS), noto anche come sequenziamento massivamente parallelo, è una tecnologia di sequenziamento del DNA che prevede la frammentazione del DNA, la legatura degli oligonucleotidi adattatori, l'amplificazione basata sulla reazione a catena della polimerasi (PCR), il sequenziamento del DNA e il riassemblaggio delle sequenze di frammenti in un genoma. L'adattamento dell'NGS all'RNA di sequenza (RNA-seq) è un approccio potente per identificare e quantificare i trascritti di RNA e le loro varianti¹. Gli sviluppi innovativi nei flussi di lavoro per la preparazione delle librerie di RNA e nelle pipeline di analisi bioinformatica, insieme ai progressi nella strumentazione di laboratorio, hanno ampliato il repertorio delle applicazioni RNA-seq, progredendo oltre il sequenziamento dell'esoma verso omiche funzionali avanzate come la profilazione dell'RNA non codificante², l'analisi di singole cellule³, la trascrittomica spaziale ^4,5, l'analisi di splicing alternativo⁶, tra gli altri. Questi metodi avanzati di RNA-seq rivelano funzioni complesse dell'RNA attraverso l'analisi quantitativa del trascrittoma in cellule e tessuti normali e malati.

Nonostante questi progressi nell'RNA-seq, diverse caratteristiche tecniche chiave limitano la potenza quantitativa del metodo. Sebbene la maggior parte dei metodi RNA-seq consenta una quantificazione precisa e accurata dei cambiamenti nei livelli di RNA tra variabili sperimentali (ad esempio, campioni biologici e/o stati fisiologici), non possono fornire confronti quantitativi dei livelli di molecole di RNA all'interno di un campione. Ad esempio, la maggior parte dei metodi RNA-seq non è in grado di quantificare con precisione il numero relativo di copie di singole molecole isoaccettori di tRNA in un pool cellulare di tRNA espressi. Come evidenziato nella pubblicazione complementare⁷, questa limitazione all'RNA-seq deriva da diverse caratteristiche della struttura dell'RNA e dalla biochimica della preparazione della libreria. Ad esempio, l'attività degli enzimi di ligazione utilizzati per legare i linker di sequenziamento delle estremità 3' e 5' alle molecole di RNA è fortemente influenzata dall'identità dei nucleotidi terminali dell'RNA e dei linker di sequenziamento. Ciò porta a grandi variazioni nell'efficienza delle legature dei linker e a profondi aumenti artefatti nelle letture del sequenziamento ^8,9,10.

Una seconda serie di limitazioni deriva dalle proprietà strutturali intrinseche delle molecole di RNA. In particolare, la formazione della struttura secondaria dell'RNA e i cambiamenti dinamici nelle dozzine di modifiche post-trascrizionali dell'RNA dell'epitrascrittoma possono causare la caduta o la mutazione della polimerasi durante la trascrizione inversa. Questi errori provocano una sintesi incompleta o troncata del cDNA o un'alterazione della sequenza dell'RNA. Sebbene entrambi questi fenomeni possano essere sfruttati per mappare strutture secondarie o alcune modifiche, degradano l'accuratezza quantitativa dell'RNA-seq se le successive fasi di preparazione della libreria non riescono a catturare cDNA troncati o se l'elaborazione dei dati elimina sequenze mutate che non corrispondono a un set di dati di riferimento^11,12. Inoltre, l'immensa diversità chimica, di lunghezza e strutturale dei trascritti di RNA, così come la mancanza di strumenti per frammentare uniformemente gli RNA lunghi, diminuisce l'applicabilità della maggior parte dei metodi RNA-seq a tutte le specie di RNA¹³.

Il metodo AQRNA-seq (absolute quantification RNA sequencing) è stato sviluppato per rimuovere molti di questi vincoli tecnici e biologici che limitano l'accuratezza quantitativa⁷. Riducendo al minimo le distorsioni sequenza-dipendenti nella cattura, nella legatura e nell'amplificazione durante la preparazione della libreria di sequenziamento dell'RNA, AQRNA-seq raggiunge una linearità superiore rispetto ad altri metodi, quantificando con precisione il 75% di una libreria di riferimento di 963 miRNA con un'accuratezza di 2 volte. Questa correlazione lineare tra sequenziamento, conteggio delle letture e abbondanza di RNA è osservata anche in un'analisi di un pool di standard di oligonucleotidi di RNA a lunghezza variabile e in riferimento a metodi ortogonali come il northern blotting. Stabilire la linearità tra il conteggio delle letture di sequenziamento e l'abbondanza di RNA consente ad AQRNA-seq di ottenere una quantificazione accurata e assoluta di tutte le specie di RNA all'interno di un campione.

Di seguito è riportata una descrizione del protocollo per il flusso di lavoro di preparazione della libreria AQRNA-seq e della pipeline di analisi dei dati a valle associata. Il metodo è stato applicato per chiarire le dinamiche dell'abbondanza di tRNA durante la dormienza indotta dalla fame e la successiva rianimazione nel modello di tubercolosi Mycobacterium bovis bacilli de Calmette et Guérin (BCG). I risultati sono stati presentati per la visualizzazione esplorativa dei dati di sequenziamento, insieme alle successive analisi di clustering e di espressione differenziale che hanno svelato modelli distinguibili nell'abbondanza di tRNA associati a vari fenotipi.

NOTA: La Figura 1 fornisce un'illustrazione grafica delle procedure coinvolte nella preparazione della libreria AQRNA-seq. Informazioni dettagliate sui reagenti, le sostanze chimiche e le colonne/kit utilizzati nella procedura sono disponibili nella Tabella dei materiali. Si raccomanda di eseguire una valutazione completa della purezza, dell'integrità e della quantità dei campioni di RNA in ingresso utilizzando (i) l'elettroforesi su gel di agarosio al 3%, (ii) strumenti di elettroforesi automatizzati per il controllo della qualità dei campioni di biomolecole (vedere la Tabella dei materiali) e (iii) la spettrofotometria UV-Visibile e/o la quantificazione fluorimetrica. E' obbligatorio mantenere tutte le reazioni e le master mix su ghiaccio, se non diversamente specificato. Trasportare i reagenti (ad es. enzimi) in celle frigorifere da e verso lo stoccaggio a -20 °C per preservarne la durata di conservazione ed evitare cicli multipli di congelamento-scongelamento degli intermedi di libreria.

1. Defosforilazione degli RNA

NOTA: La rimozione del 5'-fosfato (P; donatore) impedisce l'autolegatura al 3'-idrossile (OH; accettore) degli RNA. I linker non si auto-legano poiché la loro estremità 3' viene modificata per incorporare una dideossicitidina (Linker 1) o uno spaziatore (Linker 2). I linker possono essere legati solo unendo il loro 5'-P al 3'-OH degli RNA o cDNA.

1. Preparare la reazione di defosforilazione in una provetta PCR sterile (ad es. provetta da 200 μl o 500 μl) aggiungendo fino a 2 μl del campione di RNA, 0,5 μl di inibitore della RNasi 40 U/μl, 1 μl di standard interno da 0,5 μM (Tabella 1), 0,5 μl di tampone di reazione 10x T4 RNA ligasi, 1 μl di fosfatasi alcalina di gamberetti 1 U/μl, e sufficiente acqua priva di RNasi per portare il volume complessivo a 5 μL.
   NOTA: Per i campioni tipici, 75 ng di RNA (o circa 2 pmol per un RNA di 80 nt) sono considerati sufficienti per la quantificazione di piccoli RNA utilizzando questo protocollo.
2. Incubare a 37 °C per 30 minuti per defosforilare gli RNA e poi a 65 °C per 5 minuti per inattivare l'enzima e denaturare gli RNA. Conservare i campioni a 4 °C per almeno 10 minuti per evitare la rinaturazione.

2. Legatura del linker 1 all'estremità 3' degli RNA

1. Preparare la reazione di legatura del Linker 1 in una provetta PCR sterile aggiungendo 5 μL di RNA defosforilato (prodotti della fase 1), 0,5 μL di inibitore della RNasi 40 U/μL, 1 μL di 100 μM Linker 1 (Tabella 1), 3 μL di ATP 10 mM, 2,5 μL di tampone di reazione 10x T4 RNA ligasi, 15 μL di PEG8000 (soluzione al 50%), 2 μL di 30 U/μL di Rna ligasi 1 T4 e 1 μL di acqua priva di RNasi.
   NOTA: I reagenti possono essere trasformati in master mix per facilitare l'elaborazione dei campioni. Non includere PEG8000 e T4 RNA ligasi 1 nella miscela master.
2. Incubare a 25 °C per 2 ore e poi a 16 °C per 16 ore per legare il Linker 1 agli RNA.
3. Purificare in colonna gli RNA legati al Linker-1. Utilizzare un kit per il recupero e la pulizia del DNA/RNA (vedere la Tabella dei materiali).
   NOTA: Questo protocollo di purificazione della colonna si applica a tutte le successive purificazioni della colonna utilizzando lo stesso kit. I kit che utilizzano la tecnologia di filtrazione su gel per rimuovere i terminatori del colorante dalle reazioni di sequenziamento (vedere la Tabella dei materiali) non possono essere utilizzati qui, poiché PEG8000 è incompatibile con i filtri in gel di tali kit. Si consiglia di conservare un'aliquota (1,2 μL) di ciascun campione dopo la purificazione. Quando necessario, queste aliquote possono essere utilizzate per controllare l'efficienza della legatura eseguendo un analizzatore di acidi nucleici commerciale. Conservare i campioni purificati rimanenti in ghiaccio o a -20 °C fino a ulteriori passaggi.
   1. Per un volume del campione < 50 μl, aggiungere acqua priva di RNasi per portarlo a 50 μl. Aggiungere 2 volumi del tampone legante l'oligo (fornito nel kit) a 1 volume del campione. Aggiungere 8 volumi di etanolo al 100% a 1 volume del campione.
   2. Caricare il campione (fino a 750 μl alla volta) su una colonna posta all'interno di una provetta di raccolta da 2 mL (fornita nel kit). Per legare gli RNA alla colonna, centrifugare a 10.000 x g per 30 s e scartare il flusso (cioè il liquido nella provetta di raccolta). Riposizionare la colonna nella provetta di raccolta.
   3. Per lavare via le impurità dalla colonna, aggiungere 750 μl del tampone di lavaggio del DNA (fornito nel kit) alla colonna. Centrifugare a 10.000 x g per 30 s ed eliminare il flusso. Riposizionare la colonna nella provetta di raccolta.
   4. Centrifugare alla massima velocità (ad esempio, 16.000 x g per una microcentrifuga da banco) per un ulteriore 1 minuto per rimuovere il tampone di lavaggio del DNA residuo.
   5. Per eluire gli RNA, spostare con cautela la colonna in una provetta sterile da 1,5 mL, aggiungere acqua priva di RNasi alla colonna. Utilizzare un volume maggiore del necessario durante l'eluizione degli RNA per tenere conto della potenziale perdita di volume durante il processo di eluizione. Ad esempio, se sono necessari 15 μl per la fase successiva, aggiungere 17 μl di acqua priva di RNasi per l'eluizione. Centrifugare a 10.000 x g per 30 s.

3. Rimozione delle metilazioni post-trascrizionali da parte dell'AlkB demetilasi

NOTA: AlkB è un enzima batterico che rimuove i gruppi metilici da alcuni, ma non da tutti, i nucleotidi metilati nel DNA e nell'RNA. La rimozione di diversi tipi di ribonucleotidi metilati nell'RNA previene la caduta della trascrittasi inversa per consentire letture più complete e l'identificazione dei siti di modifica. Questo passaggio deve essere controllato a un pH basso per evitare una degradazione inaspettata degli RNA.

1. Preparare una soluzione madre di 1 M di 2-chetoglutarato sciogliendo 1,4611 g di 2-chetoglutarato (146,11 g per M) in 10 mL di acqua priva di RNasi. Filtro Sterilizzare la soluzione attraverso un filtro per siringa da 0,2 μm. Aliquotare la soluzione madre in provette sterili da 2 mL e conservare a -20 °C.
2. Preparare una soluzione madre di 0,5 M di acido L-ascorbico sciogliendo 0,88 g di acido L-ascorbico (176,12 g per M) in 10 mL di acqua priva di RNasi. Filtro Sterilizzare la soluzione attraverso un filtro per siringa da 0,2 μm. Aliquotare la soluzione madre in provette sterili da 2 mL e conservare a -20 °C.
3. Preparare una soluzione madre di solfato ferroso di ammonio 0,25 M esaidrato sciogliendo 0,9835 g di solfato ferroso di ammonio esaidrato (392,14 g per M) in 10 mL di acqua priva di RNasi. Filtro Sterilizzare la soluzione attraverso un filtro per siringa da 0,2 μm. Aliquotare la soluzione madre in provette sterili da 2 mL e conservare a -20 °C.
4. Preparare una soluzione madre di 1 M di HEPES sciogliendo 2,383 g di HEPES (238,30 g per M) in 10 mL di acqua priva di RNasi. Regolare il pH della soluzione a 8 utilizzando NaOH e sterilizzare la soluzione con un filtro a siringa da 0,2 μm. Aliquotare la soluzione madre in provette sterili da 2 mL e conservare a -20 °C.
5. Preparare un tampone di reazione AlkB 2x. Per produrre 10 mL di tampone, combinare 1,5 μL di 1 M 2-chetoglutarato (prodotto nella fase 3.1), 80 μL di acido L-ascorbico 0,5 M (prodotto nella fase 3.2), 6 μL di solfato ferroso di ammonio 0,25 M esaidrato (prodotto nella fase 3.3), 100 μL di 10 mg/mL BSA, 1000 μL di 1 M HEPES (prodotto nella fase 3.4; aggiungere per ultimo), e 8812,5 μL di acqua priva di RNasi. Filtro Sterilizzare il tampone attraverso un filtro per siringa da 0,2 μm.
   NOTA: Il tampone di reazione AlkB 2x deve essere preparato fresco immediatamente prima di ogni esperimento a causa della labilità chimica dei componenti.
6. Preparare la reazione di digestione di AlkB in una provetta sterile per PCR aggiungendo 20 μl di RNA legati al Linker-1 (prodotti della fase 2), 50 μl del tampone di reazione 2x AlkB (prodotto nella fase 3.5), 2 μl di AlkB demetilasi, 1 μl di inibitore della RNasi e 27 μl di acqua priva di RNasi.
7. Incubare a temperatura ambiente per 2 ore per rimuovere le metilazioni post-trascrizionali dagli RNA.
8. Per rimuovere AlkB dalla reazione, seguire i passaggi descritti di seguito.
   1. Per una separazione di fase pulita, aggiungere 50 μL di acqua priva di RNasi nella reazione AlkB, quindi aggiungere 100 μL di fenolo: cloroformio: alcol isoamilico 25:24:1 (pH = 5,2).
   2. Agitare a mano per 10 s, quindi centrifugare a 16.000 x g per 10 min. Assicurarsi che il rotore della centrifuga da banco sia compatibile con le provette per PCR. Se necessario, utilizzare gli adattatori.
   3. Trasferire gli RNA (cioè lo strato acquoso sopra, circa 140 μL) in una provetta sterile da 1,5 mL. Se il cloroformio (cioè lo strato inferiore) viene miscelato allo strato acquoso, centrifugare nuovamente con le stesse impostazioni.
   4. Aggiungere 100 μL di cloroformio agli RNA estratti per rimuovere il fenolo residuo. Agitare a mano per 10 s, quindi centrifugare a 16.000 x g per 10 min.
   5. Trasferire gli RNA (cioè lo strato acquoso sulla parte superiore; circa 120 μL) in una provetta sterile da 1,5 mL.
9. Purificare in colonna gli RNA estratti. Utilizzare un kit per il recupero e la pulizia del DNA/RNA (vedere la Tabella dei materiali). Seguire il protocollo descritto al punto 2.3 per eseguire la purificazione della colonna.

4. Rimozione del linker in eccesso 1

NOTA: Si consiglia di conservare un'aliquota (1,2 μL) di ciascun campione dopo la purificazione. Quando necessario, queste aliquote possono essere utilizzate per verificare l'efficienza della digestione di RecJf eseguendo un analizzatore di acidi nucleici commerciale. Procedere immediatamente con i campioni purificati alla trascrizione inversa.

1. Preparare la reazione di deadenilazione in una provetta sterile per PCR aggiungendo 15 μL di RNA legati al Linker-1 (prodotti della fase 3), 1 μL di inibitore della RNasi 40 U/μL, 2 μL di 10x tampone 2 (vedere la Tabella dei materiali) e 2 μL di 50 U/μL di 5'-deadenilasi.
2. Incubare a 30 °C per 1 ora per rimuovere l'adenina all'estremità 5' del Linker 1. Aggiungere 2 μL di 30 U/μL di RecJf nella reazione di deadenilazione.
3. Incubare a 37 °C per 30 minuti per digerire l'eccesso di Linker 1. Aggiungere altri 2 μL di 30 U/μL di RecJf nella reazione.
4. Incubare a 37 °C per 30 minuti per continuare la digestione del Linker 1 in eccesso e poi a 65 °C per 20 minuti per denaturare l'enzima.
5. Purificare in colonna gli RNA legati al Linker-1. Utilizzare un kit che utilizza la tecnologia di filtrazione su gel per rimuovere i terminatori del colorante dalle reazioni di sequenziamento (vedere la Tabella dei materiali), poiché è efficace nella rimozione di residui corti (ad esempio, oligonucleotidi con una lunghezza da 2 a 10 bp). Seguire i passaggi descritti di seguito per la purificazione.
   1. Preparare le colonne con filtro in gel secondo il protocollo del produttore. Posizionare una colonna in una provetta sterile da 1,5 ml e caricare la colonna con 24 μl di campione.
   2. Per purificare gli RNA, centrifugare a 800 x g per 3 min e scartare la colonna. Gli RNA purificati si trovano nell'eluente.

5. Reazione di trascrizione inversa (RT)

NOTA: La seguente configurazione della reazione RT (vedi Tabella dei materiali) segue il protocollo del produttore, con piccole modifiche per consentire la compatibilità AQRNA-seq.

1. Preparare la reazione di ricottura del primer RT in una provetta PCR sterile aggiungendo 24 μL di RNA stampo (prodotti della fase 4), 1 μL di primer RT da 2 μM (Tabella 1) e 1 μL di dNTP (10 mM di ciascun tipo di nucleotidi).
2. Incubare a 80 °C per 2 minuti per ricuocere i primer RT sugli RNA stampo, quindi raffreddare immediatamente con ghiaccio per 2 minuti.
3. Preparare la reazione RT aggiungendo 6 μL di tampone di reazione RT 5x, 1 μL di inibitore della RNasi 40 U/μL e 1 μL di trascrittasi inversa nella provetta di reazione di ricottura.
4. Incubare a 50 °C per 2 ore per trascrivere al contrario i modelli di RNA, quindi a 70 °C per 15 minuti per inattivare l'enzima. I prodotti RT (cioè gli ibridi RNA-cDNA) possono essere conservati a 4 °C o -20 °C durante la notte.

6. Idrolisi dell'RNA

1. Aggiungere 1 μl di 5 M NaOH nell'ibrido RNA-cDNA (prodotti dal passaggio 5). Incubare a 93 °C per 3 minuti per idrolizzare il filamento di RNA dell'ibrido RNA-cDNA.
2. Aggiungere 0,77 μl di HCl 5 M per neutralizzare la reazione. Dopo aver aggiunto l'HCl, scorri per mescolare e gira lungo il tubo. La neutralizzazione è istantanea.
   NOTA: Si consiglia di testare la quantità precisa di 5 M HCl necessaria per neutralizzare 1 μL di NaOH (ad esempio, utilizzando strisce di pH) in condizioni tamponate.
3. Purificare in colonna i cDNA a singolo filamento. Utilizzare un kit per il recupero e la pulizia del DNA/RNA (vedere la Tabella dei materiali). Seguire il protocollo descritto al punto 2.3 per eseguire la purificazione della colonna.
   NOTA: I kit che utilizzano la tecnologia di filtrazione del gel per rimuovere i terminatori del colorante dalle reazioni di sequenziamento (vedere la Tabella dei materiali) non possono essere utilizzati qui a causa della variazione di pH nei passaggi precedenti.
4. Aspirare rapidamente i cDNA purificati a < 5 μL e quindi aggiungere acqua priva di RNasi per riportare il volume a 5 μL. Fare attenzione a non aspirare rapidamente i cDNA fino a completarne l'asciugatura.
5. Trasferire i cDNA purificati in una provetta PCR sterile. I cDNA purificati possono essere conservati a -20 °C per un massimo di 1 settimana.

7. Legatura del linker 2 all'estremità 3' dei cDNA

1. Preparare la reazione di legatura del Linker 2 in una provetta PCR sterile aggiungendo 5 μL di cDNA (prodotti della fase 6), 1 μL di 50 μM Linker 2 (Tabella 1), 2 μL di tampone di reazione 10x T4 DNA ligasi, 1 μL di 10 mM ATP, 9 μL di PEG8000 (soluzione al 50%) e 2 μL di 400 U/μL di DNA ligasi T4.
   NOTA: I reagenti possono essere trasformati in miscela master per facilitare l'elaborazione dei campioni. Non includere PEG8000 e DNA ligasi T4 nella miscela master.
2. Incubare a 16 °C per 16 ore per legare Linker 2 ai cDNA.
3. Purificare in colonna i cDNA legati al Linker-2. Utilizzare un kit per il recupero e la pulizia del DNA/RNA (vedere la Tabella dei materiali). Seguire il protocollo descritto al punto 2.3 per eseguire la purificazione della colonna.

8. Rimozione del Linker 2 in eccesso

1. Preparare la reazione di deadenilazione in una provetta PCR sterile aggiungendo 16 μL di cDNA legato al Linker-2, 2 μL di tampone 2 kit 10x e 2 μL di 5'-deadenilasi 50 U/μL. Incubare a 30 °C per 1 ora per rimuovere l'adenina all'estremità 5' del Linker 2.
2. Aggiungere 2 μL di 30 U/μL di RecJf nella reazione di deadenilazione. Incubare a 37 °C per 30 minuti per digerire l'eccesso di Linker 2. Aggiungere altri 2 μL di 30 U/μL di RecJf nella reazione.
3. Incubare a 37 °C per 30 minuti per continuare la digestione del Linker 2 in eccesso e poi a 65 °C per 20 minuti per denaturare l'enzima.

9. Amplificazione PCR dei cDNA con primer di sequenziamento

1. Assegnare i primer PCR ai campioni. Ogni campione necessita di una combinazione unica di primer diretti e inversi (Tabella 1) per un multiplexing efficace.
2. Aggiungere acqua priva di RNasi per portare il volume del campione a 25 μl. Conservare 5 μl di ciascun campione in una provetta sterile per PCR come backup nel caso in cui la PCR debba essere ripetuta.
3. Preparare la reazione PCR (vedere la tabella dei materiali per il kit PCR) aggiungendo 20 μl di cDNA (prodotti dalla fase 8), 1 μl di primer diretto da 2,5 μM, 1 μl di primer inverso da 2,5 μM, 25 μl di tampone DNA polimerasi 2x, 2 μl di acqua priva di RNasi e 1 μl di DNA polimerasi.
   NOTA: I reagenti possono essere trasformati in miscela master per facilitare l'elaborazione dei campioni. Non aggiungere DNA polimerasi alla miscela master.
4. Eseguire la PCR con una denaturazione iniziale a 94 °C per 1 minuto, seguita da 18 cicli di denaturazione a 98 °C per 20 s - ricottura a 58 °C per 20 s - estensione a 68 °C per 1 min.
   NOTA: Non eseguire l'amplificazione PCR oltre l'intervallo lineare. Un totale di 18 cicli sarà ottimale per la maggior parte degli esperimenti, ma questo può dipendere dal contesto.
5. Aspirare rapidamente i prodotti PCR a meno di 25 μL e quindi aggiungere acqua priva di RNasi per riportare il volume a 25 μL. Trasferire 5 μL dei prodotti PCR in una provetta sterile da 0,5 mL per controllare la distribuzione dimensionale (vedere il passaggio 9.6). Conservare i restanti 20 μl dei prodotti PCR a -20 °C fino a ulteriori passaggi.
6. Controllare la distribuzione dimensionale dei prodotti PCR come descritto di seguito.
   1. Preparare il gel di agarosio al 3% nel tampone TAE.
      NOTA: In questo protocollo, il bromuro di etidio (EtBr) viene utilizzato per la colorazione su gel post-elettroforesi (vedere il passaggio 9.6.5). In questa fase è possibile aggiungere colorazioni di DNA appropriate alla soluzione in gel o utilizzarle successivamente per la colorazione del gel.
   2. Mescolare 1 μl di colorante di caricamento 6x in 5 μl di prodotti PCR (dal passaggio 9.5) e caricare il gel con la miscela.
   3. Caricare 5 μL di scale di DNA nel pozzetto prima del primo campione e nel pozzetto dopo l'ultimo campione. Utilizzare scale DNA da 50 bp o 100 bp per consentire una migliore discriminazione dimensionale dei prodotti PCR tra 150 bp e 300 bp.
   4. Eseguire l'elettroforesi su gel per individuare i prodotti PCR. La condizione di esecuzione appropriata può dipendere dal contesto. Qui, far funzionare a 120 V, 400 mA per 75 minuti per una lastra di gel di 17,78 cm (larghezza) x 10,16 cm (altezza) x 1 cm (spessore).
   5. Metti il gel in una scatola e riempi la scatola con acqua deionizzata (DI) fino a quando il gel non è completamente immerso. Aggiungere 10 μL di EtBr nell'acqua deionizzata imbevendo il gel. Avvolgere la scatola con un foglio di alluminio e posizionarla su uno shaker. Macchiare il gel per 30 minuti agitandolo.
   6. Gettare i rifiuti contenenti EtBr in una bottiglia di rifiuti posta in una cappa aspirante. Sciacquare una volta il gel con acqua deionizzata e gettare l'acqua contenente EtBr nel flacone dei rifiuti.
   7. Riempi la scatola con acqua deionizzata fino a quando il gel non è completamente immerso. Avvolgere la scatola con un foglio di alluminio e posizionarla su uno shaker. Lavare il gel per 10 minuti agitandolo.
   8. Gettare l'acqua contenente EtBr nella bottiglia di scarico nella cappa aspirante. Utilizzare un gel imager per visualizzare le bande. Acquisisci un'immagine ad alta risoluzione del gel.

10. Purificazione in gel

1. Preparare il gel di agarosio al 3% nel tampone TAE. Preparare un gel di 1 cm di spessore con pettini larghi (1 mm di spessore; 5 mm di larghezza; 15 mm di profondità), in modo tale che ogni pozzetto possa contenere almeno 25 μL di miscela di colorante per il caricamento del campione.
2. Miscelare 4 μl di colorante di caricamento 6x con 20 μl di prodotti PCR (dal passaggio 9.5) e caricare il gel con la miscela. Lasciare corsie vuote tra i campioni per ridurre al minimo la contaminazione incrociata durante l'escissione del gel.
3. Caricare le scale del DNA, eseguire l'elettroforesi del gel, colorare e lavare il gel e scattare immagini del gel come descritto nel passaggio 9.6.
4. Asportare i blocchi di gel che contengono prodotti PCR entro l'intervallo di dimensioni target. Per ridurre al minimo la contaminazione con i dimeri del primer (175 bp linker senza inserti), estrarre i prodotti della PCR con dimensioni superiori a 195 bp (175 bp linker + 20 bp miRNA).
5. Purificare i prodotti PCR utilizzando l'estrazione con gel. Utilizzare un kit di estrazione del gel (vedi Tabella dei materiali). Il protocollo di purificazione si basa sul protocollo del produttore, con piccole modifiche per la compatibilità con AQRNA-seq. Tutte le fasi di centrifugazione devono essere condotte a 17.900 x g per 1 minuto utilizzando una centrifuga da banco a temperatura ambiente, se non diversamente specificato. Segui i passaggi descritti di seguito.
   1. Misurare il peso dei blocchi di gel all'interno dei tubi. Aggiungere 6 volumi di Buffer QG (forniti nel kit) a 1 volume di blocco di gel (1 mg di gel equivale a circa 1 μL).
   2. Incubare a 50 °C per 10 minuti o fino alla completa dissoluzione dei blocchi di gel. Tubi a vortice ogni 2 minuti per facilitare la dissoluzione del gel. Dopo aver sciolto il gel, la miscela dovrebbe assomigliare al colore del Buffer QG senza il gel disciolto. Se il colore è arancione o viola, aggiungere 10 μl di acetato di sodio 3 M (pH = 5,0) e mescolare accuratamente.
   3. Aggiungere 1 volume di gel di isopropanolo alla miscela e mescolare accuratamente. Inserire una colonna centrifuga in una provetta di raccolta da 2 mL (fornita nel kit).
   4. Per legare il DNA, applicare il campione (fino a 750 μL ogni volta) alla colonna e centrifugare. Scartare il flusso passante e riposizionare la colonna nella stessa provetta di raccolta. La quantità massima di gel per colonna centrifuga è di 400 mg.
   5. Aggiungere 500 μl di tampone QG alla colonna e centrifugare. Scartare il flusso passante e riposizionare la colonna nella stessa provetta di raccolta.
   6. Per lavare le impurità, aggiungere 750 μL di Buffer PE (fornito nel kit) alla colonna, lasciare riposare la colonna per 5 minuti e centrifugare. Scartare il flusso passante e riposizionare la colonna nella stessa provetta di raccolta. Centrifugare nuovamente per rimuovere il tampone di lavaggio residuo.
   7. Posizionare la colonna in una provetta sterile da 1,5 mL. Per eluire il DNA, aggiungere 30 μL di Buffer EB (fornito nel kit) al centro della membrana della colonna, lasciare riposare la colonna per 4 minuti e centrifugare.
   8. Accelerare l'aspirazione e risospendere i prodotti PCR purificati con gel in 12 μL di Buffer EB.
6. Misurare la concentrazione delle librerie costruite mediante spettrofotometria UV-Visibile e/o quantificazione fluorimetrica.

11. Sequenziamento della libreria

1. Inviare le librerie costruite a un centro di sequenziamento esterno per la valutazione della qualità e il sequenziamento Illumina. Per garantire una sensibilità sufficiente nella mappatura quantitativa di piccoli paesaggi di RNA, optare per il sequenziamento paired-end con letture di 75 bp da ciascuna direzione (ad esempio, PE75), puntando ad almeno 1,5 M di letture di sequenze grezze in ciascuna direzione per ciascun campione. Utilizzare primer personalizzati (Tabella 1) per il sequenziamento NextSeq, ma questo è facoltativo per il sequenziamento su MiSeq.
   NOTA: Il sequenziamento può essere eseguito utilizzando le piattaforme MiSeq o NextSeq500. La scelta della piattaforma può dipendere dalla natura dei campioni e dal conteggio totale dei campioni.

12. Pipeline di analisi dei dati

NOTA: La Figura 2 fornisce un'illustrazione grafica delle procedure semplificate coinvolte nella pipeline di analisi dei dati, che prende le letture delle sequenze grezze (in formato FASTQ) come input e genera una matrice di abbondanza con righe che rappresentano i membri di piccole specie di RNA di interesse e colonne che rappresentano i campioni. Per il sequenziamento paired-end, ogni campione corrisponde a due file FASTQ, uno per le letture dirette e l'altro per le letture inverse. La pipeline completa di analisi dei dati, con tutti gli script associati e un manuale con annotazioni dettagliate per ogni passaggio, è disponibile su GitHub (https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git).

1. Recupera le letture delle sequenze grezze dal centro di sequenziamento esterno e valuta la qualità del sequenziamento utilizzando programmi open source come FastQC¹⁴ o fastp¹⁵.
2. Crea una libreria di sequenze di riferimento in formato FASTA.
   NOTA: La chiave per l'adattabilità della pipeline a diverse classi di piccoli RNA è un'appropriata libreria di sequenze di riferimento. Per ottenere stime accurate dell'abbondanza dei membri di specifiche classi di RNA di interesse (ad esempio, miRNA), gli utenti sono tenuti a curare meticolosamente una libreria di sequenze di riferimento da utilizzare con la pipeline. Tutte le altre istruzioni per l'esecuzione della pipeline rimangono coerenti tra le diverse classi di piccoli RNA.
3. Creare una directory denominata AQRNA-seq per l'implementazione della pipeline di analisi dei dati e inserire tutti gli script, le letture delle sequenze filtrate per la qualità e la libreria delle sequenze di riferimento in questa directory. Segui le istruzioni dettagliate su GitHub (https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git) per preparare le sottodirectory e apportare le modifiche essenziali ai file per il targeting di diversi organismi e/o piccole specie di RNA, nonché la compatibilità del sistema operativo e/o dell'utilità di pianificazione dei processi.
4. Implementa la pipeline di analisi dei dati seguendo i passaggi descritti nel manuale su GitHub (https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git), che contiene descrizioni, file di input e output, nonché righe di comando per ogni passaggio. In sintesi, la pipeline comprende (i) il taglio delle sequenze linker e dei nucleotidi casuali dalle letture, (ii) il filtraggio delle letture in base alla loro lunghezza, (iii) la mappatura delle letture alle sequenze di riferimento, (iv) la risoluzione di mappature ambigue e (v) la generazione della matrice di abbondanza.

Mycobacterium bovis I BCG (bacilli di Calmette et Guérin) ceppo 1173P2 sottoposti a crescita esponenziale sono stati soggetti a una serie temporale (0, 4, 10 e 20 giorni) di carenza di nutrienti, seguita da una rianimazione di 6 giorni in un terreno ricco di sostanze nutritive, come precedentemente presentato in Hu et al.7. Piccoli RNA sono stati isolati da colture batteriche, con tre repliche biologiche, in ciascuno dei cinque punti temporali designati. Le librerie Illumina sono state costruite utilizzando il flusso di lavoro di preparazione delle librerie AQRNA-seq sopra descritto (Figura 1), seguito dal sequenziamento su un sequenziatore presso il BioMicro Center del Massachusetts Institute of Technology. I dati di sequenziamento sono stati quindi elaborati utilizzando la pipeline di analisi dei dati AQRNA-seq (Figura 2) personalizzata per la quantificazione dell'abbondanza di tRNA.

Dopo l'amplificazione PCR della libreria di cDNA con i primer di sequenziamento, in tutti i campioni è stata osservata la presenza di prodotti PCR con una dimensione di 175 coppie di basi (bp) (Figura 3A), suggerendo la formazione di dimeri di primer. Per mitigare il carry-over dei dimeri primer, i prodotti della PCR di dimensioni superiori a 195 bp sono stati asportati dal gel e purificati (Figura 3B).

Le letture delle sequenze filtrate e tagliate di qualità sono state mappate su una libreria di sequenze di riferimento personalizzata che include i 45 isoaccettori di tRNA, lo standard interno e le sequenze di controllo (ad esempio, 23S rRNA, 16S rRNA, 5S rRNA, rnpB e ssr). Gli isoaccettori di tRNA rappresentavano dal 10,5% al 40,2% delle letture totali mappate di un dato campione e mostravano un'abbondanza molto più elevata rispetto alle sequenze di controllo (Figura 4). È importante sottolineare che le proporzioni di lettura relativamente basse degli isoaccettori di tRNA potrebbero essere attribuite alla maggiore abbondanza relativa degli standard interni. Pertanto, le proporzioni di lettura degli isoaccettori di tRNA rispetto agli standard interni (Figura 4, blocchi di colore rosa vs verdi) possono essere controllate dall'operatore, regolando con precisione la quantità di standard interno inserito nella reazione.

I dati grezzi sull'abbondanza di tRNA sono stati normalizzati utilizzando il metodo della mediana dei rapporti implementato con la versione del pacchetto DESeq2 (di seguito denominata v) 1.36.016 in R Statistical Programming Environment (di seguito denominato R) v 4.2.117. Dopo la normalizzazione, si ottiene un panorama quantitativo di isoaccettori di tRNA in Mycobacterium bovis BCG durante un corso temporale di carenza di nutrienti e rianimazione (Figura 5).

Per rivelare cluster distinti di campioni con fenotipi diversi in base ai modelli di abbondanza degli isoaccettori di tRNA, è stata eseguita l'analisi delle componenti principali (PCA) sui dati normalizzati di abbondanza di tRNA utilizzando il pacchetto di statistiche v 4.2.117 in R (Figura 6). L'analisi ha distinto i campioni del giorno 0 e del giorno 6 di rianimazione dai campioni dei giorni 4, 10 e 20, suggerendo una notevole differenza nel panorama del tRNA di Mycobacterium bovis BCG coltivato in terreno privo di nutrienti e terreno ricco di nutrienti.

Per profilare la dinamica dell'abbondanza di ciascun isoaccettore di tRNA nei cinque punti temporali designati, è stata eseguita un'analisi dell'espressione differenziale sui dati normalizzati di abbondanza di tRNA utilizzando il pacchetto DESeq2 v 1.36.0 in R (Figura 7). L'analisi ha rivelato che 17 delle 20 famiglie di isoaccettori contenevano isoaccettori che erano espressi in modo differenziale (cioè significativamente sovraregolati o sottoregolati) in almeno uno dei punti temporali, suggerendo un potenziale ruolo della regolazione del pool di tRNA nello stato persistente di Mycobacterium bovis BCG durante la tubercolosi.

Figura 1: Schema del flusso di lavoro di preparazione della libreria AQRNA-seq. I passaggi chiave delineati nel flusso di lavoro sono elencati al centro dello schema elettrico e collegati alle rispettive illustrazioni grafiche da linee tratteggiate. La descrizione dettagliata di ogni passaggio è disponibile nella sezione Protocollo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Schema della pipeline di analisi dei dati AQRNA-seq. I passaggi chiave delineati nella pipeline sono elencati al centro dello schema elettrico e collegati alle rispettive illustrazioni grafiche da linee tratteggiate. La descrizione dettagliata di ogni passaggio è disponibile su GitHub (https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Elettroforesi su gel di agarosio dei frammenti di cDNA dopo l'amplificazione PCR con primer di sequenziamento. (A) Immagine del gel prima dell'estrazione e della purificazione del gel. Le corsie 7 e 14 dal lato sinistro contengono 5 μL della scala di DNA da 50 bp, mentre le altre corsie contengono 20 μL di ciascuno dei 15 campioni. La localizzazione dimensionale dei prodotti PCR indica la loro massima concentrazione nell'intervallo da 175 bp (dimeri primer) a 300 bp (due primer + 120 bp 5S rRNA). (B) Immagine del gel dopo l'estrazione e la purificazione del gel. Per ogni campione, il blocco di gel tra 200 bp e 400 bp è stato asportato per ridurre al minimo la contaminazione dei dimeri del primer nella libreria di sequenziamento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Numero di letture di sequenze mappate correttamente alla libreria di sequenze di riferimento. L'asse x mostra i nomi dei campioni (ad esempio, D18-69XX) raggruppati per punto temporale (ad esempio, Giorno di Fame 0). Per ogni campione, il conteggio delle letture associato alle varie categorie di soggetti target viene rappresentato utilizzando blocchi di colore impilati uno sopra l'altro. I numeri situati al centro dei blocchi di colore rappresentano le proporzioni delle letture corrispondenti ai rispettivi soggetti target all'interno di un determinato campione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Panorama quantitativo degli isoaccettori di tRNA di Mycobacterium bovis BCG in vari punti temporali lungo il decorso temporale della fame e della rianimazione. I dati grezzi sull'abbondanza di tRNA sono stati normalizzati utilizzando il metodo della mediana dei rapporti. Qui, ogni riga rappresenta le abbondanze di tRNA normalizzate (asse y) come media ± errore standard per 3 repliche biologiche in ogni punto temporale. Sull'asse x, gli isoaccettori della stessa famiglia sono stati raggruppati e marcati con l'amminoacido corrispondente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Grafico del coseno quadrato di campioni derivati dall'analisi delle componenti principali (PCA). La PCA è stata eseguita sulla base dell'abbondanza normalizzata di tRNA. Il coseno quadrato indica l'importanza dei componenti principali per i campioni, e i campioni sono stati tracciati rispetto al coseno quadrato dei primi due componenti principali. I campioni sono stati etichettati utilizzando gli ID dei campioni e codificati a colori in base al punto temporale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Espressione differenziale degli isoaccettori di tRNA in diversi punti temporali. Le abbondanze normalizzate di tRNA sono state riassunte come medie (nodi di linea) ± errore standard (barre di errore) in 3 repliche biologiche. A causa della limitazione dello spazio, le condizioni sono state abbreviate come segue: S0-S20 = giorni di fame 0-20; R6 = 6° giorno di rianimazione. L'analisi dell'espressione differenziale è stata eseguita per ciascun isoaccettore di tRNA, confrontando vari punti temporali in modo a coppie utilizzando il test del rapporto di verosimiglianza e il test di Wald. Le lettere compatte sono state impiegate per rappresentare la significatività statistica, dove le abbondanze di un dato isoaccettore di tRNA nei punti temporali che condividono almeno una lettera comune non erano significativamente diverse l'una dall'altra. Ad esempio, l'abbondanza di tRNA-Lys-CTT-1-1 (nel pannello della lisina) era significativamente sottoregolata da S0 a S4 e da S4 a S10, ma non da S10 a S20. È stato poi regolamentato in modo significativo da S20 a R6. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Oligonucleotidi coinvolti nel flusso di lavoro di preparazione della libreria AQRNA-seq. Lo standard interno è l'RNA, mentre tutti gli altri oligonucleotidi sono DNA. I primer PCR e i primer di sequenziamento personalizzati elencati sono specifici per le piattaforme di sequenziamento. Ulteriori primer PCR possono essere progettati con nuove sequenze di indice. Clicca qui per scaricare questa tabella.

P.C.D. è inventore di due brevetti (PCT/US2019/013714, US 2019/0284624 A1) relativi all'opera pubblicata.