Modelli proteici dinamici indotti dalla luce su membrane modello

La formazione di pattern proteici sulle membrane cellulari all'interno delle regioni subcellulari dà origine a numerosi processi biologici, tra cui la migrazione, la divisione e la comunicazione localizzata da cellula a cellula ^1,2. Questi modelli proteici sono regolati nello spazio e nel tempo e sono altamente dinamici. La replicazione di tali modelli proteici nelle cellule sintetiche è essenziale per imitare i processi cellulari che ne derivano e per ottenere una migliore comprensione di come funziona tale regolazione a livello molecolare. Analogamente a quanto osservato per le membrane nelle cellule viventi, i metodi per generare modelli proteici su membrane artificiali devono catturare la loro dinamica e fornire un controllo spazio-temporale preciso.

Tra i vari stimoli, la luce si distingue per fornire il massimo controllo spazio-temporale e diversi vantaggi aggiuntivi³. Grazie alla regolazione con la luce, è semplice illuminare l'area desiderata in qualsiasi momento con una precisione senza pari. Inoltre, la luce offre un'elevata sintonizzabilità in quanto è possibile regolare sia l'intensità della luce che la durata dell'impulso. Inoltre, la luce visibile è innocua per le biomolecole, comprese le proteine, ed è anche possibile indirizzare più funzionalità con diverse lunghezze d'onda. Quindi, gli approcci sensibili alla luce basati sulla luce visibile emergono come strade promettenti per la regolazione controllata e biortogonale dei pattern proteici nello spazio e nel tempo ^4,5,6. L'utilizzo di coppie di proteine fotocommutabili dall'optogenetica, che agiscono come dimerizzatori inducibili dalla luce, fornisce un metodo semplice per reclutare proteine specifiche nelle membrane. In particolare, sono stati formati con successo pattern proteici su membrane artificiali utilizzando l'interazione attivata dalla luce blu tra iLID (dimero inducibile dalla luce migliorata, basato sul dominio LOV2 fotocommutabile da Avena sativa) e Nano (SspB wild-type)^7,8, il sistema SpyTag inducibile dalla luce blu (BLISS)⁹, il tetramero proteico CarH¹⁰ verde sensibile alla luce e l'interazione inducibile dalla luce rossa tra PhyB e PIF6¹¹.

È stato dimostrato che l'interazione fotocommutabile tra iLID e Nano⁵ può essere utilizzata per foto-pattern di proteine su membrane modello utilizzando la luce blu⁷. L'interazione iLID/Nano è reversibile al buio, altamente specifica e opera in condizioni fisiologiche. L'ancoraggio di iLID su modelli di membrana lipidica, come le vescicole unilamellari giganti (GUV) o i doppi strati lipidici supportati (SLB), consente il reclutamento regolato dalla luce di Nano in queste membrane, che è reversibile al buio. In particolare, abbiamo osservato che l'introduzione di un dominio disordinato all'N-terminale di iLID (risultante in una proteina chiamata disiLID) come legame a una membrana lipidica modello migliora l'efficienza del reclutamento dei nano e la dinamica di reversione⁸.

Utilizzando l'interazione disiLID/Nano, abbiamo sviluppato un metodo per generare pattern ad alto contrasto di proteine di interesse (POI) nano-fuse su SLB e sulle membrane esterne dei GUV. Questo metodo consente la creazione di pattern proteici con una notevole risoluzione spaziale e temporale e un'elevata reversibilità in pochi minuti. Il protocollo dettagliato delinea il processo per il reclutamento locale delle proteine su membrane artificiali. In particolare, ciò si ottiene immobilizzando una versione biotinilata di disiLID su SLB e GUV attraverso l'interazione biotina-streptavidina (SAv). Successivamente, Nano marcato in fluorescenza (mOrange-Nano) viene reclutato in queste membrane funzionalizzate disiLID sotto illuminazione a luce blu. Il nostro protocollo sperimentale offre un approccio semplice e adattabile per ottenere il reclutamento localizzato delle proteine nelle membrane. È importante sottolineare che questa metodologia non si limita alle interfacce SLB e GUV riportate o a mOrange-Nano; può essere esteso ad altri materiali funzionalizzati con disiLID e proteine fuse a Nano.

1. Preparazione sperimentale

1. Estrarre e purificare il biotinilato-disiLID (b-disiLID) e il mOrange-Nano (vedi Tabella dei Materiali) seguendo le procedure precedentemente riportate ^7,8.
2. Preparare miscele lipidiche in fiale di vetro con la composizione lipidica e le concentrazioni selezionate. Innanzitutto, sciogliere i lipidi nel cloroformio per ottenere una soluzione lipidica finale con una concentrazione di 1 mg/mL.
   1. Miscelare i lipidi in modo da ottenere una composizione di 94,9 mol% 2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC), 5 mol% 1,2-dioleoyl-sn-glicero-3-fosfoetanolamminaN-(cap biotinyl) sale sodico (DOPE-biotin) e 0,1 mol% 1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyannine (DiD) (vedi Tabella dei materiali).
      NOTA: La miscela lipidica può essere regolata con rapporti variabili e concentrazione di DOPE-biotina e/o diversi coloranti di membrana. La concentrazione raccomandata di DOPE-biotina (5 mol%) consente la formazione di uno strato di streptavidina ad alta densità (SAv) nelle fasi successive.
3. Preparare piccole vescicole unilamellari (SUV) seguendo i metodi precedentemente riportati ^7,8,12. Per questo passaggio, si consiglia di preparare SUV con un diametro ≤100 nm.
4. Per questo studio viene utilizzato il metodo della sonicazione. Per prima cosa, far evaporare la soluzione di cloroformio nel flaconcino di vetro con un flusso di azoto mentre si ruotano i flaconi in modo da formare un sottile film lipidico. Successivamente, rimuovere il cloroformio residuo per almeno 1 ora sotto vuoto.
   1. Reidratare il film essiccato in acqua ultrapura con una concentrazione finale di 1 mg/mL di lipidi mediante vortex. Infine, sonicare la soluzione ottenuta per 10 minuti fino a quando la soluzione opaca diventa limpida.
      NOTA: Conservare la miscela lipidica in una provetta da microcentrifuga in frigorifero per un massimo di 2 settimane. È possibile utilizzare anche diversi metodi di preparazione dei SUV (ad esempio, il metodo di estrusione), purché le dimensioni dei SUV finali siano ≤ 100 nm.

2. Reclutamento di mOrange-Nano in SLB funzionalizzati con disiLID

1. Aggiungere 150 μl di NaOH 2 M in ciascun pozzetto della camera con fondo in vetro a 18 pozzetti a μ vetrini (vedere la tabella dei materiali) e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. Successivamente, rimuovere il NaOH e lavare i pozzetti 3-5 volte prima con 150 μL di acqua ultrapura, e poi 3 volte con 150 μL di tampone (10 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl) contenente 10 mM CaCl₂.
2. Aggiungere 15 μL di SUV appena preparati (concentrazione madre 1 mg/mL in acqua) nei pozzetti contenenti 150 μL di tampone con 10 mM di CaCl₂ per avere una diluizione di circa un fattore 10 dei SUV nel tampone. Lasciare incubare i SUV per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo il tempo di incubazione, si formeranno SLB biotinilati.
3. Lavare gli SLB almeno 7 volte con tampone (10 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl) senza CaCl₂ rimuovendo prima la soluzione e successivamente aggiungendo un nuovo tampone in ogni passaggio. Si consiglia di utilizzare 80 μl di tampone per ogni fase di lavaggio.
   NOTA: Un lavaggio ottimale degli SLB si ottiene pipettando più volte la soluzione fresca su e giù senza toccare la superficie. Il pipettaggio della soluzione nei pozzetti contenenti gli SLB di nuova formazione deve essere delicato per ridurre la formazione di piccole bolle d'aria che danneggerebbero gli SLB formati. Da questo momento in poi, i pozzetti dovrebbero contenere un volume sufficiente di tampone per evitare che gli SLB si secchino.
4. Per l'ulteriore funzionalizzazione degli SLB biotinilati con SAv, aggiungere una soluzione di SAv a una concentrazione finale di 250 nM e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, rimuovere l'eccesso di SAv lavandolo con un tampone (10 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl) almeno 5 volte.
5. Da questo momento in poi, tenere i campioni sotto una luce rossa protettiva per evitare la fotoattivazione indesiderata delle proteine fotocommutabili. Aggiungere b-disiILD (vedi Tabella dei materiali) a una concentrazione finale di 1 μM nel pozzetto. Dopo 30 minuti di incubazione a temperatura ambiente, rimuovere le proteine in eccesso lavando con tampone almeno 5 volte.
6. Aggiungere mOrange-Nano (vedi Tabella dei materiali) a una concentrazione finale di 200 nM e mantenere il campione al buio coprendolo con un foglio di alluminio.
7. Posizionare il vetrino da μ sotto il microscopio a fluorescenza e regolare le impostazioni di imaging. Impostare il laser a 552 nm per l'eccitazione di mOrange-Nano. Regolare l'intervallo di emissione per ottimizzare il segnale mOrange. La fotoattivazione di disiLID si ottiene con un laser a 488 nm, utilizzando impulsi luminosi con intervalli di 2,58 s.

3. Preparazione dei GUV

1. Preparare una soluzione al 5% (p/v) di alcool polivinilico (PVA, cfr. tabella dei materiali) (MW: 145 000 g/mol) con 100 mM di saccarosio in acqua ultrapura, mescolando per una notte a 80 °C a 400 giri/min.
2. Preparare una soluzione lipidica in cloroformio con la composizione desiderata (concentrazione finale 10 mg/mL). Per questo metodo, si raccomanda una composizione composta da 10 mg/mL di POPC, 10 mol% di 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerolo) (POPG), 2 mol% di DOPE-biotina e 1 mol% di DiD (vedi Tabella dei materiali).
3. Prepara i GUV con la tecnica di idratazione ^7,8. Per prima cosa, stendere 40 μl della soluzione PVA preparata come uno strato sottile omogeneo sopra un vetrino di vetro da 60 mm x 24 mm, preferibilmente con un puntale per pipetta. Successivamente, asciugare lo strato sottile a 50 °C per 30 minuti.
4. Stendere 5 μL della soluzione lipidica con un ago sullo strato di PVA e lasciare asciugare a 30 °C per 1 ora.
5. Assemblare una camera sul vetrino funzionalizzato utilizzando un distanziatore (~40 mm × 24 mm × 2 mm, vedere la Tabella dei materiali) e un secondo vetrino.
6. Aggiungere 1 mL di tampone di reidratazione (10 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl) nella camera per 1 ora a temperatura ambiente per formare GUV. Dopo 1 ora, capovolgere la camera e picchiettare delicatamente sulle superfici di vetro con la punta di una pipetta.
7. Rimuovere con cautela il vetrino su un lato per aprire la camera di costruzione e raccogliere i GUV con una pipetta.
8. Mettere la soluzione in un tubo di plastica e lasciare riposare i GUV per 2 ore.

4. Reclutamento di mOrange-Nano in GUV funzionalizzati disiLID

1. Aggiungere una soluzione di SAv ai GUV appena raccolti e lasciare riposare per 30 minuti a temperatura ambiente.
   NOTA: I seguenti passaggi devono essere eseguiti con luce rossa protettiva per evitare la fotoattivazione del disiLID.
2. Aggiungere 1 μM di b-disiLID alla soluzione GUVs e posizionare il campione per 30 minuti al buio, coprendolo con un foglio di alluminio.
3. Pretrattare una camera con fondo in vetro a 18 pozzetti da μ vetrini con 150 μL di soluzione BSA (3% p/v in acqua) per 10 minuti. Quindi, rimuovere la soluzione BSA e lavare i pozzetti con 150 μL di acqua ultrapura 3 volte.
4. Aggiungere 145 μL di 200 nM di mOrange-Nano in tampone (10 mM Tris pH 7,4, 100 mM NaCl) al pozzetto.
5. Quindi, aggiungere 5 μL di GUV decorati con b-disiLID alla soluzione e attendere ~15 minuti affinché i GUV si depositino.
6. Posizionare il vetrino da μ sotto il microscopio confocale. Eccitare il campione a 552 nm per visualizzare la fluorescenza mOrange (λ_ex = 557 nm; λ_em = 576 nm) e a 638 nm per visualizzare DiD (λ_ex = 644 nm; λ_em = 665 nm) nelle membrane GUV. Il reclutamento di mOrange-Nano viene attivato con impulsi di luce blu (488 nm, intensità 1%) ogni 5,3 s al fine di ridurre al minimo gli effetti indesiderati del fotosbiancamento.
   NOTA: Le lunghezze d'onda di eccitazione possono essere adattate in base al tipo di microscopio in uso. Altre lunghezze d'onda di eccitazione comuni disponibili per i microscopi sono i laser a 532 nm o 561 nm e 633 nm, 647 nm, 639 nm o 640 nm.

Le procedure descritte permettono la formazione di SLB per reclutare mOrange-Nano sulle membrane sintetiche. La formazione di mOrange-Nano definito sui SLB funzionalizzati con b-disiLID è mostrata in Figura 1A. Quando una regione di interesse (ROI) quadrata (24 μm × 24 μm) sull'SLB viene illuminata con luce blu a 488 nm, si osserva un rapido aumento del segnale di fluorescenza nel canale mOrange (mostrato in rosso) nella ROI entro 200 s. Il modello mostra bordi molto definiti e nitidi (Figura 1B), indicando un elevato controllo spaziale sull'area fotoattivata. L'interazione è rapida e completamente reversibile poiché l'illuminazione con luce blu viene interrotta. Questo metodo consente anche la formazione di modelli su diversi cicli di illuminazione (Figura 2). Cicli alternati di ~200 s di luce blu e 200 s di buio portano al reclutamento reversibile di mOrange-Nano nell'area selezionata per più volte con valori comparabili di intensità Δ di fluorescenza nei pattern.

La Figura 3 mostra la rappresentazione schematica della preparazione dei GUV. Il reclutamento di mOrange-Nano è stato osservato anche sui GUV. È dimostrato che i GUV posti al buio non mostrano una fluorescenza mOrange (Figura 4A). Poiché i GUV sono illuminati globalmente con luce blu, si osserva una fluorescenza mOrange, che si colocalizza con il colorante di membrana GUV (DiD). L'interazione è altamente reversibile poiché l'illuminazione è terminata. La quantificazione dell'intensità di mOrange sulla membrana GUV nel tempo mostra il reclutamento rapido ed efficace delle proteine, nonché la piena reversibilità (Figura 4B).

Figura 1: Immagini al microscopio a fluorescenza di SLB funzionalizzate con b-disiLID. Le immagini a fluorescenza in presenza di mOrange-Nano prima (A) e durante (B) l'illuminazione a luce blu locale (488 nm) nella ROI. Barra della scala = 20 μm. (C) Intensità di fluorescenza di mOrange misurata nel ROI per SLB funzionalizzati con b-disiLID (a = 200 s). La figura è adattata da Di Iorio et al.8. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Intensità di fluorescenza di mOrange reclutata nel ROI su SLB decorati con b-disiLID durante tre cicli di reclutamento. Dopo ogni fase di fotoattivazione, la fluorescenza mOrange-Nano è aumentata entro il ROI. Il modello raggiunge la saturazione entro 120 s e la fluorescenza diminuisce entro 120 s, quasi ai livelli di fondo. Non si osserva alcuna perdita di qualità del modello su diversi cicli di luce blu/buio. La figura è adattata da Di Iorio et al.8. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Rappresentazione schematica della preparazione dei GUVs utilizzando il metodo dell'idratazione delicata. Lo schema offre una rappresentazione visiva dei vari gradini e della camera costruita utilizzando due vetrini e un distanziatore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Misure al microscopio a fluorescenza del reclutamento dipendente dalla luce di mOrange-Nano su membrane GUVs. (A) Immagini a fluorescenza di un GUV funzionalizzato con disiLID in presenza di mOrange-Nano. In verde c'è il colorante di membrana dei GUV, e in rosso c'è la fluorescenza mOrange prima, durante e dopo l'illuminazione con luce blu. Barre di scala = 10 μm. (B) Intensità di fluorescenza di mOrange localizzata su GUV nel tempo. Dopo l'illuminazione, la fluorescenza mOrange (mostrata in rosso) sulla membrana lipidica raggiunge la massima intensità entro 60 s, con un aumento dell'intensità della fluorescenza di 5,9 volte. Quando l'illuminazione viene interrotta, la fluorescenza mOrange diminuisce fino a valori quasi pre-illuminazione entro 60 s (con un recupero del 90%). La figura è adattata da Di Iorio et al.8. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.