Previsione e validazione del bersaglio proteico di un composto a piccola molecola

Le proteine sono macromolecole molto importanti negli organismi viventi e possiedono una vasta gamma di funzioni uniche all'interno delle cellule, come la composizione della membrana, la formazione del citoscheletro, l'attività enzimatica, il trasporto, la segnalazione cellulare e il coinvolgimento nei meccanismi intracellulari ed extracellulari ^1,2,3. Le proteine manifestano le loro funzioni biologiche principalmente attraverso interazioni specifiche con una varietà di molecole, tra cui altre proteine, acidi nucleici, ligandi di piccole molecole e ioni metallici ^1,4. I ligandi sono piccoli composti molecolari che si legano specificamente alle proteine di un organismo. L'interazione tra proteine e ligandi avviene in siti specifici sulla proteina, chiamati siti di legame, noti anche come tasche di legame⁵. Nella ricerca in chimica farmaceutica, l'attenzione si concentra sull'identificazione di proteine chiave che sono chiaramente associate a malattie, che fungono da bersagli per i farmaci⁶. Pertanto, acquisire una profonda comprensione dei siti di legame tra proteine e ligandi è della massima importanza per promuovere la scoperta, la progettazione e la ricerca di farmaci ^7,8.

Il docking molecolare è uno strumento computazionale ampiamente utilizzato per lo studio del legame proteina-ligando, che impiega le strutture tridimensionali di proteine e ligandi per esplorare le loro modalità e affinità di legame primarie durante la formazione di complessi stabili ^9,10,11. L'applicazione della tecnologia di docking molecolare è nata negli anni '1970. Sulla base del principio di accoppiamento di serratura e chiave e utilizzando gli algoritmi del software di docking molecolare, è possibile determinare l'interazione tra composti e bersagli molecolari analizzando i risultati dell'attracco. Questo approccio consente la previsione dei siti di legame attivi sia per il composto che per la molecola bersaglio. Di conseguenza, facilita l'identificazione di una conformazione di legame ottimale (qui chiamata modello di legame) per le interazioni ligando-recettore, che è cruciale per comprendere la meccanica di questi impegni molecolari 12,13,14,15. Mentre il docking molecolare fornisce preziose previsioni basate su computer delle interazioni ligando-recettore, è importante notare che si tratta di risultati preliminari. Di conseguenza, un'ulteriore verifica sperimentale è essenziale per confermare queste interazioni.

Il saggio di spostamento termico cellulare (CETSA), inizialmente proposto dal team di ricerca di Pär Nordlund nel 2013, funge da metodo per convalidare le interazioni farmaco-proteina bersaglio. Questa tecnica testa specificamente la stabilità termica delle proteine bersaglio indotta dal legame farmacologico, fornendo un approccio pratico per confermare le interazioni molecolari 16,17,18. Questo approccio si basa sul principio fondamentale che il legame del ligando avvia uno spostamento termico all'interno delle proteine bersaglio ed è applicabile a un'ampia gamma di campioni biologici, inclusi lisati cellulari, cellule viventi intatte e tessuti ^19,20. CETSA supporta l'impegno diretto del bersaglio di piccole molecole in cellule intatte rilevando la stabilizzazione termodinamica delle proteine dovuta al legame del ligando e collegando la risposta fenotipica osservata al composto bersaglio^21,22. Tra le varie metodologie derivate dal CETSA, il Western Blot-CETSA (WB-CETSA) è considerato un approccio classico. Dopo la preparazione del campione con il metodo CETSA, viene utilizzata l'analisi western blot per rilevare alterazioni nella stabilità termica della proteina bersaglio. Ciò consente la determinazione precisa delle interazioni farmaco-proteina all'interno dei sistemi cellulari^17,23.

La xantitina è un composto bioattivo isolato dalla pianta Xanthium L. con proprietà antinfiammatorie, che è stato utilizzato nella medicina tradizionale cinese per trattare malattie come la sinusite nasale e l'artrite^24,25. La proteina 1 associata a ECH (Keap1) è un componente del complesso proteico multi-subunità ubiquitina ligasi Cullin-RING E3 basato su Cullin3 e un importante regolatore dell'omeostasi redox intracellulare, che influenza l'intensità e la durata della risposta infiammatoria modulando lo stato redox intracellulare²⁶. In questo studio, abbiamo prima utilizzato il docking molecolare per studiare l'interazione tra xantilina (piccola molecola) e proteina Keap1, con l'obiettivo di prevedere la loro modalità di legame. Successivamente, abbiamo utilizzato il metodo CETSA per convalidare questa interazione valutando l'impatto della xantilina sulla stabilità termica della proteina Keap1.

1. Scaricare le strutture di xantalina e Keap1

1. Apri il database PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/), inserisci xantalina (piccola molecola), quindi premi Cerca e fai clic su Il primo risultato. Fare clic su Download e fare clic su Salva sotto struttura 2D per salvare il composto in formato .sdf.
2. Scarica la struttura cristallina della proteina.
   1. Aprire il database UniProt (https://www.uniprot.org/), immettere Keap1 e fare clic su Cerca. Fare clic su Umano sotto organismi popolari nella colonna di sinistra, quindi fare clic su La prima voce denominata Q14145 nella colonna di destra.
   2. Fare clic su Struttura sotto la funzione nella colonna di sinistra, trovare la struttura con ID PDB: 2FLU e fare clic su RCSB-PDB. Fare clic su Scarica file e selezionare Formato PDB per scaricare la struttura cristallina della proteina Keap1.

2. Attracco molecolare

1. Creare una nuova cartella denominata molecular docking sul desktop e salvare le strutture xantitina (piccola molecola) e Keap1 (proteina) scaricate in questa cartella.
   NOTA: il nome e il percorso della cartella devono essere in inglese.
2. Aprire il software Maestro, fare clic su File, selezionare Cambia directory di lavoro, fare clic su Desktop, fare doppio clic per selezionare la cartella di ancoraggio molecolare appena creata e fare clic su Scegli opzioni.
3. Lavorazione di piccole molecole
   1. Fare clic su Opzioni file e importa strutture, fare clic su Desktop, fare doppio clic sulla cartella di aggancio molecolare, fare clic su File struttura xantalina, quindi fare clic su Apri per importare il file di piccole molecole.
   2. Fare clic su Attività nell'angolo in alto a destra del software e selezionare l'opzione LigPrep . Utilizzare le strutture dell'area di lavoro; il resto dei parametri sono i parametri predefiniti e fare clic su Esegui per eseguire l'elaborazione di piccole molecole.
4. Elaborazione della struttura proteica
   1. Fare clic sulle opzioni File e Importa strutture , fare clic su Desktop e fare doppio clic sulla cartella Molecular Docking . Fare clic sul file della struttura proteica Keap1 , quindi fare clic su Apri per importare il file della struttura proteica.
   2. Fare clic su Attività nell'angolo in alto a destra del software e selezionare l'opzione Preparazione guidata delle proteine . Selezionare la casella Prima di eliminare le acque oltre i 5 Å dai gruppi Het e immettere un pH di 7,4+/-0,0. Fare clic su Pre-elaborazione, quindi su Perfeziona, quindi su Ottimizza > Rimuovi acque > Riduci a icona.
   3. Fare clic sull'attività successiva quando l'attività precedente è stata completata. Fare clic su Attività e selezionare l'opzione Sitemap , utilizzare le impostazioni predefinite per tutti i parametri e fare clic su Esegui.
   4. Fare clic sulle opzioni File e Importa strutture , fare clic su Desktop, fare doppio clic sulla cartella di ancoraggio molecolare e aprire la cartella denominata sitemap_1. Fare clic sul primo file denominato Sitemap_1_out.maegz, quindi fare clic su Apri.
   5. Fare doppio clic sul punto per selezionare sitemap_1_protein nell'area di lavoro, quindi fare clic su Sitemap_1_site_1 per selezionarlo . Fare clic su Attività e selezionare l'opzione Generazione griglia recettore .
      NOTA: I siti proteici previsti dalla mappa del sito sono classificati in base al punteggio, con il sito con il punteggio più alto al primo posto.
   6. Selezionare l'opzione Voce in recettore, con i parametri rimanenti invariati. Fare clic sulla pallina bianca nella struttura della proteina per generare una scatola di aggancio di dimensioni predefinite e modificare il nome del lavoro in glide-grid_2FLU. Fare clic su Esegui.
5. Docking molecolare
   1. Fare clic su Attività e selezionare l'opzione Ligand Docking . Selezionare Receptor Grid As dal file e fare clic su Sfoglia. Fare clic su Desktop, fare doppio clic sulla cartella di aggancio molecolare, fare doppio clic sul file di scorrimento grid_2FLU, fare clic su Glide-grid_2FLU.zip file, quindi fare clic su Apri.
   2. Fare clic su Usa ligandi da file > sfogliare > desktop. Fare doppio clic sulla cartella di ancoraggio molecolare, fare doppio clic sul file ligprep_1, fare clic sul file Ligprep_1-out.maegz e quindi fare clic su Apri.
   3. Fare clic su Impostazioni e selezionare l'opzione Precisione come XP (precisione extra), modificare il nome del lavoro in planata-dock_XP_2FLU e fare clic su Esegui.
6. Visualizzare i risultati dell'ancoraggio
   1. Fare clic sulle opzioni File e Importa strutture , fare clic su Desktop e fare doppio clic sulla cartella Molecular Docking . Fare doppio clic sul file glide-dock_XP_2FLU , fare clic sul file glide-dock_XP_1_pv.maegz e quindi fare clic su Apri.
   2. Fare doppio clic sul punto per selezionare il ligando nell'area di lavoro, quindi fare clic per selezionare sitemap_1_protein. Fare clic su Tabella, scorrere verso l'estrema destra e visualizzare il punteggio in Punteggio di ancoraggio.
7. Visualizzazione dei risultati 2D
   1. Fare doppio clic sul punto per selezionare il ligando nell'area di lavoro, quindi fare clic per selezionare anche sitemap_1_protein. Fare clic su Interazione ligando > Visualizza e selezionare la casella Legenda LID .
   2. Fai clic su File, scegli Salva screenshot, inserisci 6000 alla larghezza, deseleziona la casella Sfondo trasparente e fai clic su OK. Fare clic su Desktop, assegnare al file il nome 2D-xanthatin-2FLU e salvare l'immagine.
8. Visualizzazione dei risultati 3D
   1. Fare doppio clic sul punto per selezionare il ligando nell'area di lavoro, quindi fare clic per selezionare anche sitemap_1_protein.
   2. Fare clic su L in Selezione rapida per selezionare piccole molecole, quindi fare clic su Stile. Fare clic sulla seconda linea nello stile per modificare la dimensione del legame della piccola molecola e fare clic sugli atomi di colore per cambiare il colore della piccola molecola.
   3. Selezionate la piccola molecola nella figura, fate clic con il pulsante destro del mouse, selezionate Espandi selezione e scegliete 4 Å. Fare clic su Applica etichette con stile per visualizzare le etichette.
   4. Fare clic sulla seconda riga dello stile per modificare la dimensione dei legami degli amminoacidi e fare clic sugli atomi di colore per cambiare il colore degli amminoacidi.
   5. Fare clic su Avanti > Inverti, tenere premuto il tasto Ctrl e fare clic sulla prima posizione dell'occhio sotto lo stile per mostrare solo gli amminoacidi con le etichette.
   6. Fare clic su Stile > nastri per mostrare la proteina come stile del nastro e fare clic su Modifica nastro sotto i nastri per cambiare il colore del nastro.
   7. Fare clic su Interazioni nell'angolo in basso a destra dello schermo, fare clic con il tasto destro del mouse e deselezionare contatti/conflitti.
   8. Cerca misura nelle attività, seleziona Distanza e fai clic sui due atomi collegati dalla linea tratteggiata gialla (legame idrogeno) sullo schermo per misurare le lunghezze dei legami idrogeno.
   9. Tieni premuta la rotellina del mouse per ruotare la proteina, regolare la proteina al centro dello schermo e assicurarti che ogni etichetta di amminoacido sia visibile.
   10. Fai clic su Area di lavoro > Salva immagine con nome e fai clic sul desktop. Salva l'immagine come 600 dpi per impostazione predefinita, assegna al file il nome 3D-xanthatin-2FLU, scegli il tipo di file in formato tiff e salva l'immagine.

3. Coltura cellulare e preparazione del campione CETSA

1. Coltura cellulare
   1. Aggiungere 5 x 10⁶ cellule RAW264.7/mL in una piastra di coltura da 100 mm e incubare con 6 mL di terreno DMEM con il 10% di FBS e l'1% di soluzione antibiotico-antimicotica a 37 °C, 95% di umidità e 5% di CO₂. Prepara tre piatti ed esegui l'esperimento quando le cellule raggiungono l'80% di confluenza.
2. Preparazione del campione CETSA
   1. Aspirare il vecchio terreno, aggiungere 2 ml di soluzione salina tampone fosfato (PBS) riscaldata a temperatura ambiente in ogni piatto e lavare 2 volte.
   2. Aggiungere 2 ml di PBS a ciascuna piastra di cellule, mescolare le cellule e raccogliere le cellule in due provette da microcentrifuga da 1,5 ml. Centrifugare a 377 x g per 3 min a temperatura ambiente.
   3. Eliminare il surnatante e risospendere le cellule con 2 mL di PBS contenente l'1% di miscele di inibitori della proteasi ad ampio spettro. Dividere in singole provette da microcentrifuga con 1 mL di sospensione cellulare ciascuna.
   4. Congelare le provette per microcentrifuga in azoto liquido fino a renderle bianche, quindi scongelarle immediatamente a bagnomaria a 37 °C e ripetere 3 volte. Centrifugare a 12.000 x g a 4 °C per 10 min.
   5. Prelevare due provette per microcentrifuga, una con 100 μM di xantitina e una con un volume uguale di DMSO, e aggiungere 450 μl di surnatante centrifugato a ciascuna provetta, incubare a 37 °C per 30 minuti.
   6. Aggiungere il surnatante delle due provette per microcentrifuga a 14 provette per PCR a un volume di 60 μL/provetta e riscaldare simultaneamente le provette a temperature variabili (45 °C, 48 °C, 51 °C, 54 °C, 57 °C, 60 °C e 63 °C) per 3 minuti, con due provette per PCR a ciascuna temperatura, per i gruppi DMSO e xantatina, rispettivamente.
   7. Per il gruppo non riscaldato, prelevare il surnatante da ciascuna delle due provette per microcentrifuga e aggiungerlo a 14 provette per PCR, 7 per il gruppo DMSO e 7 per il gruppo xantina, in un volume di 60 μl ciascuna. Non riscaldare i campioni qui.
   8. Raffreddare i tubi a temperatura ambiente per il gruppo riscaldato. Centrifugare tutte le provette (riscaldate e non riscaldate) a 12.000 x g per 10 minuti a 4 °C e prelevare 48 μL di surnatante da ciascuna provetta in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 mL. Aggiungere 12 μl di tampone di caricamento proteico SDS-PAGE in ciascuna provetta, agitare per mescolare bene e riscaldare a bagnomaria a 100 °C per 5 minuti.
      NOTA: I campioni CETSA preparati devono essere conservati a -80 °C e analizzati mediante western blot entro 1 settimana.

4. Western blot

1. Preparazione del gel SDS-PAGE
   1. Sciacquare un piatto di vetro lungo e uno corto con acqua ultrapura. Posizionare le piastre nella fessura di bloccaggio, quindi su una tavola trasparente. Aggiungere acqua ultrapura e controllare le perdite per 10 minuti.
   2. Aggiungere 8 mL di soluzione gel inferiore e 8 mL di tampone gel inferiore in un matraccio conico e mescolare agitando delicatamente. Aggiungere 160 μl di promotore coagulante alla soluzione in gel e mescolare bene.
      NOTA: Il volume dello strato inferiore di adesivo non deve superare la linea verde sulla fessura di bloccaggio.
   3. Scolare l'acqua ultrapura dalle piastre e asciugarle con carta da filtro. Aggiungere la soluzione di gel inferiore preparata. Aggiungere 2 ml di alcol isopropilico e attendere 20 minuti per la solidificazione.
   4. Prelevare 2 mL di soluzione gel superiore e 2 mL di tampone gel superiore in un matraccio conico e mescolare agitando delicatamente il pallone.
   5. Rimuovere l'alcol isopropilico dallo strato di gel e tamponare l'alcol isopropilico in eccesso con carta da filtro.
   6. Aggiungere 40 μL di promotore coagulante alla soluzione di gel superiore miscelato, mescolare bene, quindi aggiungere tra le piastre di vetro lunghe e corte e inserire un pettine a 15 fori da 1,5 mm, attendere 20 min.
      NOTA: Il pettine deve essere inserito perpendicolarmente allo strato superiore, senza bolle d'aria tra il pettine e la soluzione.
2. Elettroforesi
   1. Aggiungere 1 litro di acqua ultrapura in un bicchiere, aggiungere una bustina di polvere tampone scorrevole SDS-PAGE, mescolare bene con una bacchetta di vetro e aggiungere il gel preparato all'unità di elettroforesi. Posizionare l'unità nella scatola ed estrarre il pettine.
   2. Marcatori di scongelamento e campioni CETSA a temperatura ambiente, vortice e spin down. Aggiungere 2,5 μl di marcatore al primo pozzetto e 20 μl di campioni CETSA a ciascuno dei pozzetti rimanenti secondo la sequenza predeterminata.
      NOTA: i campioni CETSA sono stati aggiunti successivamente secondo il trattamento termico descritto al punto 3.2.6 da 45 °C a 63 °C; è stato aggiunto prima il gruppo DMSO, poi il gruppo xantalina (Figura 1).
   3. Aggiungere la soluzione di elettroforesi rimanente all'unità di elettroforesi, chiudere il coperchio e inserire l'elettrodo, il polo positivo al polo positivo, il polo negativo al polo negativo.
   4. Accendere l'interruttore di alimentazione e regolare il voltage interruttore a 80 V per avviare l'elettroforesi.
3. Trasferimento a membrana
   1. Aggiungere 850 ml di acqua ultrapura, 100 ml di etanolo anidro e 50 ml di tampone a trasferimento rapido in un becher e mescolare bene. Preparare pannelli di schiuma, coltelli di plastica, pinzette, vassoi e dispositivi di trasferimento a membrana.
   2. Tagliare la membrana in PVDF in base alle dimensioni del gel, contrassegnarla e immergerla in metanolo per 30 s per attivarla.
   3. Versare la soluzione di trasferimento nel vassoio, posizionare e aprire i morsetti di trasferimento e posizionare un tampone di spugna e tre strati di carta da filtro di trasferimento.
   4. Interrompere l'elettroforesi e quindi aprire il coperchio della scatola dell'elettroforesi. Prendi il dispositivo per elettroforesi, versa la soluzione per elettroforesi e rimuovi la piastra. Posiziona la piastra sul pannello di schiuma, staccala delicatamente con un coltello di plastica e taglia il gel per visualizzare chiaramente il marcatore proteico e le proteine bersaglio.
   5. Tenere un lato del pennarello con una pinzetta, lavarlo in un vassoio contenente la soluzione transmembrana e adagiarlo su carta da filtro. Immergere la membrana in PVDF attivata nella soluzione di trasferimento, tenere il lato etichettato con una pinzetta e coprire il gel a faccia in giù.
      NOTA: Il lato contrassegnato con la membrana PVDF è il lato anteriore e prestare attenzione al fatto che non si generano bolle durante il processo di posizionamento.
   6. Posizionare due strati di carta da filtro di trasferimento e uno strato di tampone di spugna sulla membrana in PVDF, coprire e clamp le clip di trasferimento e inserirle nel serbatoio di trasferimento.
      NOTA: dal colore nero della clip di trasferimento al colore nero dello slot di trasferimento.
   7. Aggiungere la restante soluzione transmembrana nella cassetta transmembrana, coprire con il coperchio, da positivo a positivo, da negativo a negativo.
   8. Regolare la corrente a 400 mA, il tempo a 30 min, quindi premere Run per iniziare a trasferire la membrana a temperatura ambiente.
4. Inceppamento
   1. Aggiungere 2 L di acqua ultrapura in un flaconcino di vetro, aggiungere una bustina di polvere di TBS, quindi aggiungere 2 ml di Tween per preparare la soluzione TBST. Pesare la polvere di BSA per preparare una soluzione di BSA al 5% con TBST e aggiungere 6 ml di soluzione di BSA nella scatola di incubazione.
   2. Interrompere il trasferimento della membrana e quindi aprire la clip di trasferimento. Clamp il lato marcatore della membrana in PVDF e posizionarlo nella scatola di incubazione. Posizionare la scatola di incubazione su uno shaker e bloccare per 1,5 ore a temperatura ambiente.
5. Incubazione dell'anticorpo primario
   1. Preparare l'anticorpo primario (vedere la Tabella dei materiali per i dettagli) con una soluzione BSA al 5% a 1:1000, riciclare la soluzione BSA nella scatola dell'incubatrice e aggiungere 6 mL di anticorpo primario nella scatola di incubazione. Metti la scatola di incubazione in una scatola di schiuma con impacchi di ghiaccio e tienila su uno shaker per una notte.
6. Incubazione dell'anticorpo secondario
   1. Raccogliere l'anticorpo primario nella scatola di incubazione il giorno successivo, quindi aggiungere 6 ml di soluzione TBST e metterla su uno shaker a lavare per 5 minuti.
   2. Versare la soluzione TBST lavata e aggiungere fresca per il lavaggio; ripetere 5 volte e preparare l'anticorpo secondario con una soluzione BSA al 5% a 1:5000.
   3. Versare la soluzione TBST e aggiungere 6 mL di anticorpo secondario nella scatola di incubazione. Posizionare la scatola di incubazione su uno shaker e incubare per 1,5 ore a temperatura ambiente.
   4. Raccogliere l'anticorpo secondario (vedere la Tabella dei materiali per i dettagli), quindi aggiungere 6 ml di soluzione TBST e metterla su uno shaker a lavare per 5 minuti. Versare la soluzione TBST lavata e aggiungere fresca per il lavaggio; Ripeti 5 volte.
7. Esporre le strisce
   1. Conservare la soluzione TBST al termine dell'ultimo lavaggio. Prendi volumi uguali di reagenti chemiluminescenti A e B, agita e mescola bene. Proteggere la soluzione dalla luce.
   2. Aprire il sistema di imaging del gel, fare clic su Campioni, controllare la calibrazione, attendere il completamento della calibrazione, quindi fare clic su Marcatore, controllare la calibrazione.
   3. Raccogliere il lato del pennarello della striscia con una pinzetta e immergerlo completamente nella soluzione di reagente chemiluminescente. Clamp un lato del marcatore per posizionare la striscia a faccia in giù nella termocamera, chiudere il coperchio della termocamera, fare clic su Esposizione e impostare il tempo di esposizione su 1 s.
      NOTA: lo sviluppatore deve coprire completamente la striscia e lo sviluppo deve trovarsi in un ambiente buio.
   4. Fare clic su Salva, assegnare un nome all'immagine e salvarla come file .tif. Analizza la densità ottica del western blot. I valori di grigio di ciascuna temperatura nel gruppo DMSO sono stati confrontati con i valori di grigio di 45 °C e i valori di grigio di ciascuna temperatura nel gruppo xantalina sono stati confrontati con i valori di grigio della xanteina a 45 °C.

L'analisi di docking molecolare ha predetto l'interazione tra xantitina e proteina Keap1. La Figura 2 mostra la formazione di legami idrogeno tra xantitina e residui amminoacidici Gly-367 e Val-606 della proteina Keap1, con una lunghezza del legame idrogeno di 2,17 Å per Gly-367 e 2,13 Å per Val-606. Inoltre, il punteggio di docking calcolato di -5,69 kcal/mol indica una buona affinità di legame tra xantitina e proteina Keap1.

Il metodo CETSA ha mostrato che il legame con la xantilina ha spostato la stabilità termica della proteina Keap1, confermando l'interazione tra la xantilina e la proteina Keap121. La Figura 3 indica che la xantilina sposta notevolmente la stabilità termica della proteina Keap1 all'interno dell'intervallo di temperatura compreso tra 48 °C e 57 °C, rispetto al gruppo DMSO. Per garantire un carico di campioni uniforme, in primo luogo, la densità di inoculazione cellulare in cui abbiamo eseguito gli esperimenti era coerente; in secondo luogo, i campioni cellulari del gruppo DMSO e del gruppo xantatina sono stati mescolati bene nelle piastre di coltura cellulare e poi sono stati equamente distribuiti in due provette da microcentrifuga, che hanno assicurato una quantità costante di campioni cellulari, e il volume di surnatante aggiunto a ciascuna provetta PCR era di 60 μL e, infine, il volume di ciascun campione caricato nel Western blot era di 20 μL, che garantiva un carico uguale per i campioni riscaldati. La degradazione delle proteine nei campioni a partire da circa 51 °C è dovuta principalmente a cambiamenti nella struttura delle proteine e reazioni chimiche accelerate causate dalle alte temperature. I risultati di cui sopra dimostrano che la xantilina potrebbe legarsi direttamente alla proteina Keap1.

Figura 1: Ordine di caricamento del western blot. La temperatura in ordine da sinistra a destra era di 45 °C, 48 °C, 51 °C, 54 °C, 57 °C, 60 °C e 63 °C.  La prima corsia è stata aggiunta con un indicatore; sono state utilizzate due corsie per ogni temperatura; la prima corsia era il gruppo DMSO e la seconda corsia era il gruppo xanthatin. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Interazione tra xantitina e proteina Keap1 (PDB: 2FLU). (A) La rappresentazione 2D del legame della xantalina a Keap1. (B) La visualizzazione 3D della xantilina e della proteina Keap1. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Effetto della xantilina sulla stabilità termica della proteina Keap1. (A) Gli effetti della xantilina sulla stabilità termica di Keap1 sono stati rilevati dal CETSA. (B) Le densità ottiche di Keap1 sono state normalizzate a quelle ottenute a 45 °C. I dati sono rappresentati come media ± SD. L'analisi statistica è stata eseguita mediante analisi unidirezionale della varianza (ANOVA unidirezionale). n = 3. *p < 0,05, **p < 0,01, p < 0,001, p < 0,0001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.