L'esperimento qui utilizzato mostra un metodo di docking molecolare combinato con il saggio di spostamento termico cellulare per prevedere e convalidare l'interazione tra piccole molecole e bersagli proteici.
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Articolo metodologico
Previsione e validazione del bersaglio proteico di un composto a piccola molecola
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le proteine sono fondamentali per la fisiologia umana, con i loro bersagli cruciali nella ricerca e nello sviluppo di farmaci. L'identificazione e la convalida di bersagli proteici cruciali sono diventate parte integrante dello sviluppo di farmaci. Il docking molecolare è uno strumento computazionale ampiamente utilizzato per studiare il legame proteina-ligando, specialmente nel contesto delle interazioni farmaco-bersaglio proteico. Per la verifica sperimentale del legame e per accedere direttamente al legame del farmaco e del suo bersaglio, viene utilizzato il metodo del saggio di spostamento termico cellulare (CETSA). Questo studio mirava a integrare il docking molecolare con CETSA per prevedere e convalidare le interazioni tra farmaci e bersagli proteici vitali. In particolare, abbiamo previsto l'interazione tra xantilina e proteina Keap1 e la sua modalità di legame attraverso l'analisi di docking molecolare, seguita dalla verifica dell'interazione utilizzando il saggio CETSA. I nostri risultati hanno dimostrato che la xantilina potrebbe stabilire legami idrogeno con specifici residui amminoacidici della proteina Keap1 e ridurre la termostabilità della proteina Keap1, indicando che la xantilina potrebbe interagire direttamente con la proteina Keap1.
Introduzione
Le proteine sono macromolecole molto importanti negli organismi viventi e possiedono una vasta gamma di funzioni uniche all'interno delle cellule, come la composizione della membrana, la formazione del citoscheletro, l'attività enzimatica, il trasporto, la segnalazione cellulare e il coinvolgimento nei meccanismi intracellulari ed extracellulari 1,2,3. Le proteine manifestano le loro funzioni biologiche principalmente attraverso interazioni specifiche con una varietà di molecole, tra cui altre proteine, acidi nucleici, ligandi di piccole molecole e ioni metallici
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Protocollo
1. Scaricare le strutture di xantalina e Keap1
- Apri il database PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/), inserisci xantalina (piccola molecola), quindi premi Cerca e fai clic su Il primo risultato. Fare clic su Download e fare clic su Salva sotto struttura 2D per salvare il composto in formato .sdf.
- Scarica la struttura cristallina della proteina.
- Aprire il database UniProt (https://www.uniprot.org/), immettere Keap1 e fare clic su Cerca. Fare clic su Umano sotto organismi popolari nella colonna di sinistra, quindi fare ....
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Risultati
L'analisi di docking molecolare ha predetto l'interazione tra xantitina e proteina Keap1. La Figura 2 mostra la formazione di legami idrogeno tra xantitina e residui amminoacidici Gly-367 e Val-606 della proteina Keap1, con una lunghezza del legame idrogeno di 2,17 Å per Gly-367 e 2,13 Å per Val-606. Inoltre, il punteggio di docking calcolato di -5,69 kcal/mol indica una buona affinità di legame tra xantitina e proteina Keap1.
Il metodo CETSA ha mostrato che il le.......
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Discussione
L'identificazione dei bersagli della malattia e la scoperta e lo sviluppo di farmaci sono strettamente interconnessi27. Mirando con precisione a bersagli specifici, è possibile sviluppare farmaci candidati per trattare particolari malattie in modo più efficace, riducendo al minimo gli effetti collaterali associati ai farmaci28,29. I bersagli più comunemente usati sono i bersagli proteici30. Tuttavia, l'identificazio.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dalla National Natural Science Foundation of China (82004031) e dal Sichuan Science and Technology Program (2022NSFSC1303). Esprimiamo il nostro grande apprezzamento a Jiayi Sun dell'Istituto Innovativo di Medicina e Farmacia Cinese, Università di Medicina Tradizionale Cinese di Chengdu, per l'assistenza con il western blot.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,45 μ m Membrana di fluoruro di polivinilidene | Millipore | PR05509 | |
| Etanolo anidro | Sostanze chimiche Chron | 64-17-5 | |
| Albumina sierica bovina | BioFroxx | 4240GR100 | |
| Miscele di inibitori della proteasi ad ampio spettro Boster | Biological Technology Co., Ltd | AR1193 | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| Reagente a chemiluminescenza potenziato | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0018S | |
| Anticorpo GAPDH | ProteinTech Group Co., Ltd | 10494-1-AP | |
| Strumento di imaging su gel | E-BLOT | Touch Imager Pro | |
| Strumento di PCR a gradiente | Biometra TADVANCED | Biometra Tadvanced 96SG | |
| Centrifuga | di congelamento ad alta velocitàBeckman Coulter | Allegra X-30R | |
| Rafano perossidasi coniugato affiniPure anticorpo di capra | ProteinTech Group Co., Ltd | SA00001-2 | |
| Alcool isopropilico | Chron chemicals | 67-63-0 | |
| Keap1 anticorpo | Zen BioScience Co., Ltd | R26935 | |
| Bagno di metallo | Analytik Jena | TSC | |
| Metanolo | Chron chemicals | 67-56-1 | |
| Ncmblot tampone di trasferimento rapido (20×) | NCM Biotech Co., Ltd | WB4600 | |
| Omni-Easy OneStep PAGE gel preparazione rapida kie | Epizyme Biotech Co., Ltd | PG212 | |
| Soluzione salina tampone fosfato | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0021 | |
| Prestained Color Protein Marker | Biosharp | BL741A | |
| Sistema di elettroforesi per blotting proteico | Bio-Rad | MiniPROTEANÒ Tetra Cell | |
| RAW264.7 cella | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | C7505 | |
| RAW264.7 terreno specifico per cellule | Procell Life Science& Technology Co., Ltd | CM-0597 | |
| SDS-PAGE tampone di caricamento delle proteine | Boster Biological Technology Co., Ltd | AR1112-10 | |
| SDS-PAGE polvere tampone in esecuzione | Servicebio | G2018 | |
| Tris polvere salina tamponata | Servicebio | G0001 | |
| Tween 20 | BioFroxx | 1247ML100 | |
| Bagno d'acqua | Memmert | WNE10 | |
| Depuratore d'acqua | Millipore | Milli- IQ 7005 | |
| Xanthatin | ChemConst Biotechnology Co., Ltd | CONST210706 |
Riferimenti
- Soleymani, F., Paquet, E., Viktor, H., Michalowski, W., Spinello, D. Protein-protein interaction prediction with deep learning: A comprehensive review. Computat Struct Biotechnol J. 20, 5316-5341 (2022).
- Du, X., et al. Insights ....
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Ristampe e permessi
